CN108918708B

CN108918708B - 一种磁性碳纳米管及其对猪肉中瘦肉精的萃取方法

Info

Publication number: CN108918708B
Application number: CN201810764655.4A
Authority: CN
Inventors: 连丽丽; 张鑫洋; 吕进义; 娄大伟; 高文秀; 张�浩; 王希越; 马先红
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2038-07-12
Also published as: CN108918708A

Abstract

本发明公开了一种磁性碳纳米管及其对猪肉中瘦肉精的萃取方法，本发明以FeSO₄·7H₂O、L‑半胱氨酸（Cys）和碳纳米管（CNT）为原料，制备得到磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT。使用所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT作为吸附剂，萃取猪肉中的瘦肉精（莱克多巴胺和盐酸克伦特罗），实现了对待测猪肉样品中瘦肉精的有效富集与分离，可大大提高现有猪肉中瘦肉精检测方法的灵敏度。

Description

一种磁性碳纳米管及其对猪肉中瘦肉精的萃取方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，特别涉及一种磁性碳纳米管及其对猪肉中瘦肉精的萃取方法。

背景技术

瘦肉精（莱克多巴胺和盐酸克伦特罗）是一种平喘药。该药物属于中度蓄积性药物，在动物组织内的蓄积与其剂量和给药持续时间有关，其残留量随停药期的延长逐渐下降。饲喂瘦肉精可以让猪的瘦肉率提高，带来更多的经济价值，但食用含有瘦肉精的猪肉对人体有危险的副作用，在中国，最早报道的瘦肉精中毒事件是1998年供港活猪引起的，之后此类事件也经常发生。目前，瘦肉精在我国已经禁用。

瘦肉精的检测方法有气相色谱-质谱联用法（2012年，分析和生物分析化学杂志《通过微量标记同位素模式反卷积和GC-EI-MS同时确认和测定尿中克伦特罗的常规方法的发展》）、高效液相色谱法（1999年，医药和生物医学分析杂志《血浆中克伦特罗的固相免疫亲和高效液相色谱法提取》）、酶标记免疫吸附测定法（2014年，农业与食品化学杂志《基于表面增强拉曼散射(SERS)的新型免疫色谱分析方法对新型激动剂苯乙醇胺a的超敏定量检测》）和毛细管电泳法（2008年，塔兰塔杂志《毛细管电泳-安培检测法测定尿中利尿剂的在线场放大样品堆积方法的建立》）等。但由于食品中的成分复杂，且需要检测的瘦肉精含量通常为痕量级，为提高检测准确性和灵敏性，需要对待测猪肉样品进行前处理。由于传统的固相萃取小柱存在有机溶剂消耗量大、特异性不强、价格贵、且只能使用一次的问题，需要开发对瘦肉精富集能力强、制备方法简单、价格低廉的新型萃取材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁性碳纳米管及其对猪肉中瘦肉精的萃取方法。利用所述磁性碳纳米管可实现猪肉样品中瘦肉精的萃取，可用于猪肉中痕量瘦肉精的快速、灵敏检测。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种磁性碳纳米管的制备方法，包括以下步骤：称取FeSO₄·7H₂O和L-半胱氨酸（Cys），分别溶于水中，完全溶解之后，迅速混合两种溶液，再向其中加入碱溶液，超声并不断搅拌，再加入碳纳米管（CNT），超声并不断搅拌，即制备得到磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT。

进一步的，所述制备方法还包括以下步骤：将制备得到的Fe₃O₄@Cys@CNT，依次用水、无水乙醇洗至洁净，再进行真空干燥处理。

进一步的，加入NaOH溶液后超声5-10min，加入碳纳米管后，继续超声5-20min。

进一步的，所述碱溶液为浓度为1mol/L-2 mol/L的氢氧化钠溶液。优选的，氢氧化钠溶液浓度为1mol/L。

本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用上述磁性碳纳米管萃取猪肉中瘦肉精的方法，包括以下步骤：

参照GB/T5009.192-2003第一法提取待测猪肉样品中的瘦肉精，得到含有瘦肉精的样品溶液，再用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至5-9，若有沉淀产生，再离心处理去除沉淀，向上清液中加入氯化钠，得到提取液；

取上述提取液至棕色小瓶中，再加入上述的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT，涡旋萃取、磁性分离，弃去上清液；加入洗脱液再次涡旋洗脱、磁性分离，移取上清液在水浴下氮气吹干，即完成瘦肉精的萃取，定容再离心处理，取上清液液准备进行色谱分析。

进一步的，所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的添加量为1-7mg/mL。优选的，添加量为2mg/mL。

进一步的，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至7。

进一步的，所述涡旋萃取的时间为5-15min。优选的，涡旋萃取10min。

进一步的，所述洗脱液为醋酸：甲醇=15%：85%，涡旋洗脱时间为5-15min，优选的，涡旋洗脱10min。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT为管状，且非常细长，管内径约为5nm，管壁厚约为5nm，Fe₃O₄@Cys均匀的附在碳纳米管上，具备良好的吸附性能；

2、本发明所述的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的采用超声辅助氧化沉淀法制得，制备方法简单、省时，条件易控，制备时间小于30 min，合成设备只需超声仪，无需高温高压，由于在超声的条件下制得，碳纳米管表面的Fe₃O₄@Cys分散均匀，有利于萃取结果的一致性，制备的吸附剂可重复使用至少4次，重复性好，制与市售的SPE小柱（只能使用一次）相比，成本低、效果好、可重复使用，且猪肉基质复杂容易堵塞SPE柱，而磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的分散萃取过程避免了这一现象；

3、将磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT作为吸附剂，优化萃取时间、体系pH值、洗脱液、洗脱时间等条件，萃取猪肉中的瘦肉精（莱克多巴胺和盐酸克伦特罗），实现了对待测猪肉样品中瘦肉精的有效富集与分离，由于可大大提高现有猪肉中瘦肉精检测方法的灵敏度；

4、高氯酸对猪肉中瘦肉精的提取率高、干扰少，是目前最常使用的提取溶剂，但是高氯酸含有电负性基团，易于与金属金属配位和带正电荷的萃取材料发生电中和反应，而Fe₃O₄@Cys@CNT在高氯酸介质中的萃取效率不受影响、结果一致性好，与其他萃取材料相比具有明显的优势。

附图说明

图1为所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的红外光谱检测结果示意图；

其中，a-Fe₃O₄，b-Cys，c-Fe₃O₄@Cys@CNT；

图2为所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的TEM检测结果示意图；

图3为不同浓度NaOH溶液对萃取效率的影响示意图；

其中，a-1mol/L NaOH溶液，b-1.5mol/L NaOH溶液，c-2mol/L NaOH溶液；

图4为不同体系pH对萃取效率的影响示意图；

图5为不同磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT添加量对萃取效率的影响示意图；

图6为不同吸附时间对萃取效率的影响示意图；

图7为不同洗脱液对萃取效率的影响示意图；

其中，1-甲醇，2-乙腈，3-醋酸：甲醇=15%：85%，4-醋酸：乙腈=15%：85%，5-氨水：甲醇=10%：90%；

图8为不同洗脱时间对萃取效率的影响示意图；

图9为不同洗脱液体积对萃取效率的影响示意图；

图10为吸附剂使用次数对萃取效率的影响示意图；

图11为样品检测色谱图。

具体实施方式

使用的主要试剂与仪器：

超高效液相色谱仪UPLC H-Class 美国Waters仪器公司；超纯水仪 Milli-Q 美国Millipore公司；盐酸克伦特罗标准品德国DR；莱克多巴胺标准品 Sigma aldrich；乙腈色谱纯美国Fisher；甲醇色谱纯美国Fisher；三氟乙酸色谱纯阿拉丁；半胱氨酸分析纯阿拉丁；多壁碳纳米管分析纯阿拉丁；七水合硫酸亚铁分析纯北京化学试剂三厂；高氯酸分析纯天津政成化学制品有限公司。

实施例1

本实施例提供了一种磁性碳纳米管及其制备方法，包括以下步骤：称取1.668gFeSO₄·7H₂O和0.727g L-半胱氨酸（Cys，HSCH₂CH（NH₂）CO₂H），分别溶于30ml超纯水中，完全溶解之后，迅速混合两种溶液，再向其中加入48mL 1mol/L NaOH溶液，超声并不断搅拌10min，再加入0.3g碳纳米管（CNT），超声并不断搅拌20min，依次用超纯水，无水乙醇洗至洁净，60℃真空干燥4h，即制备得到磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT。

以下，通过红外光谱、X-射线衍射（XRD），透射电镜（TEM）等方法表征磁性Fe₃O₄@Cys@CNT的物化性能。

由图1可知，如a所示，在590cm^-1处有一强吸收峰，此处为Fe-O的特征吸收，证明Fe₃O₄已经制备成功；如b所示，2094cm^-1处为-V_sS-H吸收峰，而（c）Fe₃O₄@Cys@CNT在2094cm^-1是没有吸收峰，这是由于-V_sS-H参与配位生成了共价键Fe-S，1195cm^-1、1118cm^-1处为C-O、C-N吸收峰，1635cm^-1处强吸收峰为C=O和N-H，3438cm^-1处为-OH吸收峰，因此证明已经成功生成了Fe₃O₄@Cys@CNT。

由图2中a和b可知，Fe₃O₄@Cys分散性较好，呈椭圆形粒状，直径约为8-15nm。由图2中c和d可知，Fe₃O₄@Cys@CNT中碳纳米管为管状，且非常细长，管内径约为5nm，管壁厚约为5nm，Fe₃O₄@Cys则均匀的附在碳纳米管上。

实施例2

本实施例利用实施例1制备得到的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT萃取猪肉中瘦肉精的方法，包括以下步骤：

参照GB/T5009.192-2003第一法提取待测猪肉样品中的瘦肉精，得到含有瘦肉精的样品溶液25mL，再用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7，若有沉淀产生，再4500min/r离心处理10min去除沉淀，向上清液中加入8g氯化钠，得到提取液；

用上述提取液定容至50mL，取10mL上述提取液至棕色小瓶中，再加入20mg所述的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT，涡旋萃取10min，磁性分离，弃去上清液，加入3mL醋酸：甲醇=15%：85%洗脱液；再次涡旋洗脱10min，磁性分离，从磁性分离后在50℃水浴下氮气吹干，定容到1.5mL，再10000r/min离心处理10min，取上清液，即完成瘦肉精的萃取。

实施例3

考察不同碱溶液浓度对所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT对萃取效率的影响。

按照实施例1所述方法制备所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT，区别在于，NaOH溶液浓度分别选用1mol/L、1.5 mol/L、2 mol/L。由图3可知，在制备磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT时，当加入的NaOH溶液浓度介于1~2mol/L时，萃取效率并没有随着浓度的改变而改变，因此，本着节约的原则，在制备磁性碳纳米管时，应选择1 mol/L NaOH溶液。

实施例4

考察不同体系pH对磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，样品溶液pH值分别调节至3，5，7，9和11。如图4所示，当pH在5-9之间时，莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的萃取效率均没有多大的变化，因此在pH=5-9之间，体系pH对萃取效率的影响较小，本发明选择的体系pH=7。

实施例5

考察不同磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT用量对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的添加量分别为5mg、10mg、15 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70mg。如图5所示，在磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT质量为20mg时，莱克多巴胺和盐酸克伦特罗萃取效率均达到最大值，因此，本发明选择的最佳吸附剂质量为20mg。

实施例6

考察不同吸附时间对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，吸附时间分别为5min、10min、20 min、30 min、40 min。由图6可知，当吸附时间达到10min时，二者的萃取效率均达到最大，因此本发明选择的吸附时间为10min。

实施例7

考察不同洗脱液对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，洗脱液分别选择甲醇、乙腈、醋酸：甲醇=15%：85%、醋酸：乙腈=15%：85%和氨水：甲醇=10%：90%。由图7可知，醋酸：甲醇=15%：85%与醋酸：乙腈=15%：85的萃取效率最高，但考虑到乙腈毒性较大，因此本发明选择醋酸：甲醇=15%：85%作为洗脱液。

实施例8

考察不同洗脱时间对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，洗脱时间分别为5min、10min、20 min、30 min、40 min。由图8可知，盐酸克伦特罗的洗脱时间在5min时萃取效率已经达到了最大值，但莱克多巴胺的萃取效率在5-10min时，萃取效率还有略微的增高。因此，为保证较高的萃取效率，本发明选择洗脱10min。

实施例9

考察不同洗脱液体积对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，洗脱液的体积分别为1ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml、4 ml。由图9可知，在洗脱液体积为3mL时，萃取效率达到最大。因此，本发明洗脱过程加入的洗脱液体积为3mL。

实施例10

考察磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT重复性对萃取猪肉中瘦肉精萃取效率的影响。

按照实施例2所述方法萃取猪肉中的瘦肉精，区别在于，多次重复利用所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT。由图10可知，磁性碳纳米管在5次内对莱克多巴胺萃取具有很好的重复使用性，在4次内对盐酸克伦特罗萃取具有良好的重复使用性。因此，在4次以内，磁性碳纳米管对莱克多巴胺及盐酸克伦特罗的萃取能重复使用，且萃取效率的改变不会很大。

对比例

考察利用上述磁性碳纳米管萃取猪肉中瘦肉精的方法，对食品中瘦肉精检测的富集作用的效果。

称取不含有瘦肉精的猪肉样品10g（精确到0.01g），用20mL 0.1moL/L高氯酸溶液匀浆，置于烧杯中；然后置于超声波清洗器中超声20min，取出置于80℃水浴加热10min。取出后冷却，4500r/min离心15min。倾出上清液，沉淀用5mL 0.1mol/L高氯酸溶液洗涤，再离心，将两次上清液合并。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7±0.1，若有沉淀产生，再离心（4500min/r）10min，加入8g氯化钠，得提取液。

a处理——用上述提取液定容至50mL，取10mL进行实施例2所述的萃取处理，而后取上清液进行UPLC测定。

b处理——取200μL 10mg/L瘦肉精混标标准储备液加入上述提取液中，不萃取直接进行UPLC测定。

c处理——取200μL 10mg/L瘦肉精混标标准储备液，用上述提取液定容后进行实施例2所述的萃取处理，而后取上清液进行UPLC测定。

检测结果如图11所示，a样品没有检测峰，因此证明本方法具有较好的选择性，不会出现假阳性。b样品中莱克多巴胺的峰不明显，不易于定量及定性，盐酸克伦特罗的峰型虽然能够定性，但杂峰较多，对定量比较困难。c样品非常明显的能看出来莱克多巴胺及盐酸克伦特罗有单独的峰出现，且峰型良好，相比于b样品，c样品的峰型明显，易于定性及定量。

因此，证实经过本发明所述的萃取处理以后，对猪肉中的瘦肉精进行有效的富集，并且瘦肉精被吸附于磁性材料上，之后又被我们转移到了较小的溶液环境当中，证实本发明在富集并检测食品中瘦肉精含量方面获得理想效果。

Claims

1.一种磁性碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：称取FeSO₄·7H₂O和L-半胱氨酸（Cys），分别溶于水中，完全溶解之后，迅速混合两种溶液，再向其中加入NaOH溶液，超声并不断搅拌，再加入碳纳米管（CNT），超声并不断搅拌，即制备得到磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT。

2.根据权利要求1所述的磁性碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：将制备得到的Fe₃O₄@Cys@CNT，依次用水、无水乙醇洗至洁净，再进行真空干燥处理。

3.根据权利要求1所述的磁性碳纳米管的制备方法，其特征在于，加入NaOH溶液后超声5-10min，加入碳纳米管后，继续超声5-20min。

4.根据权利要求1或3所述的磁性碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述NaOH溶液为浓度为1mol/L-2 mol/L。

5.一种磁性碳纳米管，其特征在于，所述磁性碳纳米管由权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。

6.一种利用权利要求5所述磁性碳纳米管萃取猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

取上述提取液至棕色小瓶中，再加入权利要求5所述的磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT，涡旋萃取、磁性分离，弃去上清液；加入洗脱液再次涡旋洗脱、磁性分离，移取上清液在水浴下氮气吹干，即完成瘦肉精的萃取，定容再离心处理，取上清液准备进行色谱分析。

7.根据权利要求6所述的萃取猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述磁性碳纳米管Fe₃O₄@Cys@CNT的添加量为1-7mg/ml。

8.根据权利要求6所述的萃取猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，使用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至7。

9.根据权利要求6所述的萃取猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，涡旋萃取的时间为5-15min。

10.根据权利要求6所述的萃取猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述洗脱液为醋酸：甲醇=15%：85%，涡旋洗脱时间为5-15min。