JP2008072904A - 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 - Google Patents
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Abstract
培養法によって得られた菌体について核酸増幅反応を利用した遺伝子検査を実施する場合において、食材成分による核酸の増幅反応の阻害を回避する方法と前記方法を用いた核酸増幅法を提供すること。
【解決手段】
汚染された食材に含まれる微生物由来の核酸を増幅する方法において、増菌培養法によって得られた菌体培養液を被検試料とし、前記被検試料に金属イオンを加えることによって、食材成分による核酸の増幅反応阻害を回避する方法。
【選択図】 なし
Description
(1)汚染された食材に含まれる微生物由来の核酸を増幅する方法において、増菌培養法によって得られた菌体培養液を被検試料とし、前記被検試料に金属イオンを加えることによって、食材成分による核酸の増幅反応阻害を回避する方法。
(2)さらに熱処理工程および遠心分離工程を加える(1)記載の方法。
(3)金属イオンが、鉄イオンであることを特徴とする(1)記載の方法。
(4)以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)食材に含まれる菌体を、食材ごと増菌培養する工程、
(b)前記増菌培養液に金属イオンを添加する工程、
(c)熱処理を行う工程、
(d)さらに遠心分離により上清を得る工程、
(e)前記上清中の核酸を増幅する工程。
(5)以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)食材に含まれる菌体を、食材ごと増菌培養する工程、
(b)前記増菌培養液を熱処理する工程、
(c)さらに遠心分離により上清を得る工程、
(d)前記上清中に金属イオンを含む核酸増幅試薬を添加する工程、
(e)次いで核酸を増幅する工程。
(6)金属イオンが、鉄イオンである(4)または(5)記載の方法。
(7)鉄イオンが、核酸増幅反応液中0.1〜0.8mmol/Lの濃度である(6)記載の方法。
(8)核酸を増幅する工程が、LAMP法である(4)または(5)記載の方法。
(1)試料の調製
牛レバー25gにプレストン培地100mLを加えて、室温で1分間ストマッカー処理した後、微好気条件下で42℃・24時間培養し20%牛レバー食材液を得た。この食材液に、カンピロバクター属菌( Campylobactor jejuni ATCC33291 )の濃度が、0(陰性対象)および60cfu/testになるように菌体を添加して菌希釈液を作製した。菌希釈液50μLを0.5mL容PCRチューブ(以下「PCRチューブ」と略)に採取し、次いで鉄イオン濃度が核酸増幅反応液中に0および0.083〜1.667mmol/Lになるように硫酸第一鉄水溶液10μLを添加し、次いで各々に0.05mol/L水酸化ナトリウム水溶液(以下「NaOH水溶液」)を50μL添加しボルテックスした。95℃で5分間加熱処理した後、4℃(もしくは氷上)に冷却した。スピンダウンした後に1mol/L Tris塩酸緩衝液(pH7.0)を10μL添加し、ボルテックスした後に遠心機プチはち Model 2816 型( WAKEN社製 )を用いて、25℃、2,000rpm、1分間の条件で遠心処理を行い、再度4℃(もしくは氷上)に冷却して得られた上清を試料とした。別に、食材(牛レバー)を添加しないプレストン培地に、60cfu/mLになるように菌体を添加して菌希釈液を作製した。次いで、各々にNaOH水溶液を添加し、同様の操作を行って作製した試料を陽性対照とした。
(2)核酸増幅反応
試料5μLを、Loopamp(商標登録)カンピロバクター検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )から調製したLAMP反応試薬20μL( Reaction Mix.12.5μL、Primer Mix.2.5μL、滅菌水4μLさらに Bst DNA polymerase 1μLを混合した溶液 )に添加し、リアルタイム濁度測定計LA−320C( テラメックス社製 )を用い、波長650nmおける濁度(吸光度)変化を指標として、65℃、1時間LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
実施例1.(1)で、硫酸第一鉄の代わりに、硫酸第二鉄、塩化第二鉄および硝酸第二鉄を用いて、試料溶液を調製した。濃度は、実施例1.同様に核酸増幅反応液中、鉄イオン濃度が0.083〜1.667mmol/Lになるように調整した。なお、牛レバー食材液には、濃度が60cfu/mLになるようにカンピロバクター属菌(実施例1と同様)を添加して菌希釈液を作製した。
(2)核酸増幅反応
実施例1.(2)同様に行った。
Claims (8)
- 汚染された食材に含まれる微生物由来の核酸を増幅する方法において、増菌培養法によって得られた菌体培養液を被検試料とし、前記被検試料に金属イオンを加えることによって、食材成分による核酸の増幅反応阻害を回避する方法。
- さらに熱処理工程および遠心分離工程を加える請求項1記載の方法。
- 金属イオンが、鉄イオンであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)食材に含まれる菌体を、食材ごと増菌培養する工程、
(b)前記増菌培養液に金属イオンを添加する工程、
(c)熱処理を行う工程、
(d)さらに遠心分離により上清を得る工程、
(e)前記上清中の核酸を増幅する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)食材に含まれる菌体を、食材ごと増菌培養する工程、
(b)前記増菌培養液を熱処理する工程、
(c)さらに遠心分離により上清を得る工程、
(d)前記上清中に金属イオンを含む核酸増幅試薬を添加する工程、
(e)次いで核酸を増幅する工程。 - 金属イオンが、鉄イオンである請求項4または5記載の方法。
- 鉄イオンが、核酸増幅反応液中0.1〜0.8mmol/Lの濃度である請求項6記載の方法。
- 核酸を増幅する工程が、LAMP法である請求項4または5記載の方法。
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