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Verfahren zur Herstellung von Adrenocorticotrophin mit verstärkter
subkutaner Wirksamkeit Die Erfindung betrifft die Herstellung von Adrenocorticotrophin
(im folgenden ACTH genannt) mit verstärkter subkutaner Wirksamkeit durch Bebrüten
eines ACTH-Extraktes mit Pyridoxin (auch Adermin oder Vitamin B6 genannt) bei einem
p$ von 3,5 bis 5,5 und einer Temperatur von 30 bis 150° C. Die besten Ergebnisse
werden jedoch erhalten bei einem pH zwischen 4,0 und 5,0,v orzugsweise 4,7 bis 4,8,
und einer Temperatur zwischen 75 und 125° C, vorzugsweise 90 und 100° C. Zweckmäßig
wird dabei dem ACTH-Extrakt Pyridoxinhydrochlorid zugesetzt und die erhaltene ACTH-Lösung
zusätzlich durch Zugabe eines organischen Reduktionsmittels mit mindestens einer
Sulfhydrylgruppe, vorzugsweise Cystein, stabilisiert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Verstärkung der subkutanen
Wirksamkeit jedes Adrenocorticotrophins verwendet werden, wenngleich es sich besonders
gut für die Verstärkung von Schaf-ACTH und noch besser für die Verstärkung von Rinder-ACTH
eignet. Zum Beispiel kann das Ausgangsmaterial jedes Säugetierhypophysengewebe sein,
wie Hypophysengewebe von Schweinen, Rindern und Schafen. Das Ausgangsmaterial kann
jedoch auch als Extrakt, z.B. Eisessigextrakt oder Acetontrockenpulver, oder auch
als rohes Corticotrophin vorliegen. Es kann auch ein nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift
2 669 536 (Bunding) vorgereinigter Extrakt, wonach die wäßrige ACTH-Lösung an einen
Ionenaustauscher, vorzugsweise Oxyzellulose, bei einem p$ von ungefähr 4,5 adsorbiert
und das adsorbierte ACTH mit einer wäßrigen Lösung mit einem pH von ungefähr 1 bis
1,5 eluiert wird, eingesetzt werden. Hierbei ergibt die Behandlung von Schweine-ACTH
ein Präparat, das bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung eine ACTH-Wirksamkeit
zeigt, die bedeutend größer ist, als sie auf Grund der erhöhten Reinheit erwartet
werden konnte. Die ACTH-M'irksamkeit dieses Präparates ist jedoch bei intravenöser
Verabreichung im wesentlichen so, wie sie auf Grund des verringerten- Gehaltes an
Festbestandteilen des Extraktes erwartet werden konnte. Es tritt also bei dem Bunding-Verfahren
lediglich eine Verbesserung der Wirksamkeit von Schweine-ACTH nach subkutaner Verabreichung
ein. Eine Verbesserung der Wirksamkeit von Rinder- und Schaf-ACTH erfolgt jedoch
nicht, so daß sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für die Verstärkung
der subkutanen Wirksamkeit von Rinder- und Schaf ACTH-Extrakten, die nach dem Bunding-Verfahren
gereinigt wurden, eignet. Darüber hinaus ist aber auch durch das beanspruchte Verfahren
eine Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit von ungefähr 20 bis 50 % des nach dem
Bunding-Verfahren erhaltenen Schweine-ACTH-Extraktes möglich.
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Eine weitere Möglichkeit zur Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit
nicht nur von Scliweine-ACTH, sondern auch von Rinder- und Schaf-ACTH ist gegeben,
wenn man den wäßrigen Extrakt bei einem pH von 5,5 bis 7,0 und einer Temperatur
von 50 bis 150° C bebrütet. Hierdurch wird die subkutane Wirksamkeit in der Größenordnung
von 150 bis 250 % verbessert.
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Durch den erfindungsgemäßen Zusatz von Pyridoxin während des Bebrütens
wird gegenüber diesem Verfahren eine weitere Verbesserung erhalten, und zwar kann
die subkutane Wirksamkeit von ACTH-Extrakten um annähernd 400 °/o, j a sogar bis
zu 900 °/o gesteigert werden.
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Die Zeit, die notwendig ist, um bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
eine größtmögliche Wirkungssteigerung zu erzielen, ist abhängig von der Bebrütungstemperatur.
Bei Zimmertemperatur sind z. B. mehrere Monate notwendig, während der gleiche Effekt
bei einer Temperatur von ungefähr 100° C schon in wenigen Stunden eintritt. Die
Bebrütung soll jedoch bei einer Temperatur von mindestens 15° C durchgeführt werden;
bei der technischen Durchführung dieses Verfahrens kann die Bebrütungstemperatur
30 bis 150° C betragen. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Bebrütungs= temperatur
unter der Temperatur liegen muß, bei welcher die ACTH-Wirksamkeit zerstört wird.
Es wurde auch gefunden, daß mit ansteigender Reinheit des ACTH-Extraktes die für
die maximale Verbesserung der subkutanen Wirksamkeit erforderliche Zeit geringer
ist. Zum Beispiel kann ein entwässerter, saurer Extrakt mit 70°/oigem Aceton von
Hypophysengewebe bei einer
Temperatur von 100° C 6 bis 8 Stunden
benötigen, um eine maximale Verbesserung zu erhalten, während ein ACTH-Extrakt,
der nach dem oben beschriebenen Bunding-Verfahren gereinigt wurde, bei der gleichen
Temperatur nur ungefähr 1 bis 6 Stunden zur Bebrütung benötigt.
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Wie schon oben ausgeführt, wird durch den Zusatz von Pyridoxin während
der Bebrütung eine bedeutende Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit in einer beträchtlich
kürzeren Bebrütungszeit als ohne Pyridoxin erhalten. Zum Beispiel wird bei Rinder
ACTH, das nach dem Bunding-Verfahren gereinigt wurde, die maximale Verstärkung der
subkutanen Wirksamkeit bei 100° C in ungefähr 4 bis 6 Stunden erhalten, während
ohne Zugabe von Pyridoxin 8 bis 12 Stunden bei der gleichen Temperatur benötigt
werden.
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Die erfindungsgemäßen Vorteile können dabei mit jedem Pyridoxinderivat
erhalten werden. Vorzugsweise wird jedoch ein saures Derivat von Pyridoxin verwendet,
und es werden ganz besonders gute Ergebnisse mit Pyridoxinhydrochlorid erhalten.
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Die erfindungsgemäße Verbesserung wird schon erzielt, wenn zu der
wäßrigen Mischung von ACTH das Pyridoxin in einer Konzentration von mindestens 0,005
°/o (Gew./Vol.) zugegeben wird. Bessere Ergebnisse werden mit einer Pyridoxinkonzentration
von 0,05 bis 10 % und besonders gute mit einer Konzentration von 0,1 bis 3 °/o (Gew./Vol.)
erzielt, d. h., eine Konzentration von ungefähr 10/, (Gew./Vol.) ist für
die technischen Verfahren am besten geeignet.
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Die Einstellung des pH-Wertes der Pyridoxinreaktionsmischung auf 3,5
bis 5,5, vorzugsweise 4,7 bis 4,8, wird mit einem geeigneten Alkali, einer Säure
oder einem Puffergemisch, z. B. Salzsäure, Natriumhydroxyd, oder einer Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung
erreicht. Die Einstellung einer stark sauren Lösung des ACTH auf ein schwächer saures
pH, z. B. auf mindestens 5, kann zur Bildung eines Niederschlags führen. Der größere
Teil dieses Niederschlages wird während der Bebrütung wieder gelöst. Nach Beendigung
der Bebrütung ist es möglich, daß ein geringer Teil des unlöslichen Rückstandes
in der wäßrigen Mischung verbleibt. Dieser wird z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren
von der wäßrigen Lösung abgetrennt und so ein ACTH-Extrakt erhalten, der im neutralen
p"-Bereich, d. h. zwischen ungefähr 6,2 und 7,4 (physiologischer Bereich), vollkommen
löslich ist. Auch der abgetrennte unlösliche Rückstand kann noch eine geringe ACTH-Wirksamkeit
zeigen.
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Es wurde weiter gefunden, daß die Zugabe eines organischen Reduktionsmittels,
das mindestens eine Sulfhydrylgruppe enthält, zu der wäßrigen Lösung von ACTH und
Pyridoxin während des Bebrütens bei einem p$ von ungefähr 4,7 die Wirkung des Pyridoxins
aufhebt und so im wesentlichen keine Verstärkung der Wirksamkeit eintritt. Jedoch
kann das mit Pyridoxin erfindungsgemäß vorbehandelte ACTH durch Zugabe dieses Reduktionsmittels
stabilisiert werden. Das Reduktionsmittel kann z. B. ß-Mercaptoäthanol oder Thioglykolsäure
sein. Es eignet sich jedoch besonders Cystein, d. h. 1-Cysteinhydrochlorid oder
1-Cysteinbase. Die Stabilisierung der wäßrigen Lösung des ACTH wird erreicht, wenn
mindestens 0,025 °/o (Gew./Vol.) des Reduktionsmittels zugegeben werden. Wenn als
Reduktionsmittel Cystein verwendet wird, wird mit einer Konzentration von 0,5 bis
5 °/p Cystein eine bessere Stabilisierung erzielt, und besonders gute Ergebnisse
werden mit einer Konzentration von ungefähr 0,101'. Cystein erhalten. Um
eine gute Stabilisierung mit Cystein zu erhalten, soll der pH-Wert der mit Pyridoxin
vorbehandelten ACTH-Lösung im Bereich von 5,5 bis 7,5 sein. Wenn gewünscht, kann
zu der wäßrigen Lösung von ACTH und Pyridoxin auch noch Gelatine hinzugegeben werden,
um eine zusätzliche Verstärkung der ACTH-Wirksamkeit nach subkutaner Verabreichung
zu erhalten. Diese zusätzliche Verstärkung kann auch erhalten werden, wenn die Gelatine
in die wäßrige Lösung des mit Pyridoxin bebrüteten ACTH-Extraktes vor der Verabreichung
eingebracht wird.
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Bei diesem Verfahren beträgt die Gelatinekonzentration der Bebrütungsmischung
ungefähr 8 bis 40 °/o (Gew./Vol.), eine besonders geeignete Fließfähigkeit kann
mit teilweise hydrolisierter Gelatine in einer Konzentration von ungefähr 16 °/o
(Gew./Vol.) erhalten werden. Es kann aber auch eine Gelatine verwendet werden, deren
Gelierpunkt durch Hydrolyse auf weniger als 22° C gebracht wurde. Mit dieser wird
eine entsprechende Fließfähigkeit der Bebrütungsmischung mit einer Gelatinekonzentration
von mindestens 28 °/o und manchmal sogar mit 32 °/o erreicht. Die Gelatine wird
dabei hydrolysiert, indem sie ungefähr 15 bis 60 Minuten oder bis der gewünschte
Gelierpunkt erhalten wird bei einem Druck von 1 atü im Autoklav behandelt wird.
Zu der Bebrütungsmischung oder zu einer Lösung des mit Pyridoxin behandelten ACTH
können Konservierungsmittel, Propyl- oder Methyl-p-hydroxybenzoat oder eine Mischung
der beiden, hinzugegeben werden. Als Konservierungsmittel eignet sich auch besonders
eines, welches eine lokalanästhetische Wirkung hat, wie Phenol.
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Es ist selbstverständlich, daß die in diesem Verfahren verwendeten
Bestandteile für die parenterale Verabreichung an Menschen geeignet sein müssen,
wenn das erhaltene ACTH-Präparat für die menschliche Verwendung bestimmt ist, und
sie sollen für parenterale Verabreichung an Tiere geeignet sein, wenn das Produkt
als ein Veterinärprodukt verwendet werden soll.
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Die subkutane Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten ACTH kann
bestimmt werden nach dem Corticotrophin-Untersuchungsverfahren der US-Pharmacopeia,
Vol. XV (1955).
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert. Beispiel
I 300 mg eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten Rinder-ACTH werden in 150
ccm pyrogenfreiem Wasser suspendiert. Zu der erhaltenen Suspension werden 115 g
Pyridoxinhydrochlorid und 0,75g Phenol hinzugegeben. Diese Lösung hat ein pg von
3,0. Anteile dieser Lösung werden auf bestimmte p11-Werte eingestellt, und zwar
entweder mit 10°/oiger Salzsäure oder 10°/oiger Natronlauge. Jeder Teil, der 20
ccm beträgt, wird 2 Wochen bei einer Temperatur von 37° C bebrütet. Am Ende dieser
Inkubationszeit wird jedes Präparat durch das SCG-Verfahren unter Verwendung von
acht hypophysektomierten Ratten pro Präparat geprüft. Die analytischen Ergebnisse
sind folgende:
| pH des Präparates 1 Wirksamkeit (USP-Einheiten pro ccm) |
| 2,0 21,0 |
| 3,0 22,8 |
| 4,0 51,2 |
| 5,0 73,8 |
| 6,0 unwirksam |
| 7,0 unwirksam |
Diese Ergebnisse zeigen, daß das p$-Optimum für die Behandlung von nach dem Bunding-Verfahren
hergestellten Rinder-ACTH in einem Bereich von ungefähr
4,5 bis
5,0 ist, obwohl eine gewisse Wirkung auch mit einem p$ außerhalb dieses Bereiches
erhalten wird. Beispiel II 400 mg nach dem Bunding-Verfahren hergestelltes ACTH
werden in 14 ccm pyrogenfreiem destilliertem Wasser gelöst. Zu der erhaltenen Lösung
wird 1 g Pyridoxinhydrochlorid hinzugegeben und diese Lösung mit 10°loiger Natronlauge
auf ein pg von 4,7 eingestellt. Die Lösung wird dann in 5-ccm-Glasampullen gefüllt,
und zwar 2,5 ccm pro Ampulle. Die gefüllten Ampullen werden verschlossen in ein
siedendes Wasserbad eingetaucht. In Intervallen von j e einer Stunde wird ein Teil
der Ampulle aus dem Wasserbad herausgenommen. Jeder Teil wird zentrifugiert, und
1 ccm der überstehenden Flüssigkeit wird mit einer 16°/oigen wäßrigen Gelatinelösung,
die 0,5 °/a Phenol enthält, auf ein Volumen von 5 ccm verdünnt. Jedes Präparat wird
nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht hypophysektomierten Ratten pro
Präparat untersucht. Die analytischen Ergebnisse sind die folgenden:
| Bebrütungs- `'Virksamkeit der Ver- Berechnete Wirksamkeit |
| zeit suchsproben (USP- des Präparates (USP- |
| (Stunden) Einheiten pro ccm) Einheiten pro ccm) |
| 0 18,3 91,5 |
| 1 22,8 114,0 |
| 2 34,5 172,5 |
| 4 83,7 418,5 |
| 6 112,2 560,0 |
| 8 36,6 183,0 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine maximale Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit
von nach dem Bunding-Verfahren hergestellten Rinder-ACTH bei einem pg von 4,7 und
einer Temperatur von ungefähr 100°C in ungefähr 6 Stunden erreicht wird.
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Beispiel III 4 ccm eines nach dem Bunding-Verfahren von Beispiel II
erhaltenen ACTH-Präparates (nach 6 Stunden Bebrütung im siedenden Wasserbad und
auf das Fünffache verdünnt mit einer 16°/oigen wäßrigen Gelatinelösung, die 0,5
°/o Phenol enthält) wird mit einer 16°/oigen wäßrigen Gelatinelösung, die 0,5 °/o
Phenol enthält, auf ein Volumen von 22 ccm verdünnt. Diese verdünnte Lösung wird
in 5-ccm-Ampullen gefüllt, und zwar 3 ccm pro Ampulle. Die gefüllten Ampullen werden
in einem siedenden Wasserbad bebrütet und in bestimmten Zeitabständen Anteile dieser
Ampullen aus dem Wasserbad herausgenommen. Der Inhalt dieser Ampullen wird nach
dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht hypophysektomierten Ratten pro Präparat
untersucht. Die analytischen Ergebnisse sind die folgenden:
| Bebrütungs- Wirksamkeit der Ver- BerechneteV4'irksamkeit |
| des anfänglichen |
| zeit suchsproben (USP- Präparates (USP- |
| (5tunden) Einheiten pro ccm) Einheiten pro ccm) |
| 0 11,2 318 |
| 0,5 10,2 280 |
| 1 13,4 368 |
| 2 11,8 325 |
| 3 10,2 280 |
| 4 14,0 385 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß bei fünffacher Verdünnung das 6 Stunden lang bebrütete
Produkt weitere 4 Stunden lang bebrütet werden kann, ohne daß ein bedeutender Verlust
der Wirksamkeit eintritt.
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Beispiel IV 210 ccm rohes Corticotrophin werden in 30 ccm pyrogenfreiem
destilliertem Wasser gelöst. Zu der erhaltenen Lösung werden 750 ccm Pyridoxinhydrochlorid
hinzugegeben und das pg dieser Lösung mit einer 10°/oigen Natronlauge auf 4,7 eingestellt.
Diese Lösung wird dann in 5-ccm-Glasampullen gefüllt, und zwar 1,5 ccm pro Ampulle.
Die gefüllten Ampullen werden verschlossen und in ein siedendes Wasserbad getaucht.
Teile dieses Ampulleninhaltes werden in bestimmten Zeitabständen aus dem Bad herausgenommen.
Die Präparate wurden nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht hypophysektomierten
Ratten pro Präparat geprüft. Die Ergebnisse sind die folgenden
| Bebrütungs- Wirksamkeit der Ver- BerechneteWirksamkeit |
| zeit suchsproben (USP- des Präparates (USP- |
| (Stunden) Einheiten pro ccm) Einheiten pro ccm) |
| 0 3,1 0,44 |
| 4 9,9 1,40 |
| 6 15,0 2,10 |
| 10 4,8 0,70 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine maximale Verstärkung von rohem Corticotrophin
bei einer Temperatur von ungefähr 100°C und einem pff von 4,7 in ungefähr 6 Stunden
erreicht wird.
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Beispiel V 13 ccm eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten Schweine-ACTH
werden mit 325 mg Pyridoxinhydrochlorid gemischt. Die erhaltene Lösung wird mit
10°/oiger Natronlauge auf ein pH von 4,7 eingestellt. Die Lösung wird in eine 50-ccm-Glasampulle
gefüllt. Die gefüllte Ampulle wird verschlossen in ein siedendes Wasserbad getaucht.
Anteile des Ampulleninhaltes werden in bestimmten Zeitabständen herausgenommen.
Jeder Anteil, der 1 ccm beträgt, wird mit 29 ccm einer 16°/eigen wäßrigen Gelatinelösung,
die 0,5 °/o Phenol enthält, verdünnt. Die Anteile werden nach dem SCG-Verfahren
unter Verwendung von acht Ratten pro Präparat untersucht. Die Ergebnisse sind die
folgenden:
| Bebrütungs- Wirksamkeit der Ver- BerechneteWirksamkeit |
| zeit suchsproben (USP- des Präparates (USP- |
| (Stunden) Einheiten pro ccm) Einheiten pro ccm) |
| 0 14,1 423 |
| 1 19,5 585 |
| 2 9,6 144 |
| 3 10,8 162 |
| 4 unwirksam unwirksam |
| 5 unwirksam unwirksam |
| 6 unwirksam unwirksam |
| 8 unwirksam unwirksam |
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine maximale Verstärkung des nach dem Bunding-Verfahren
hergestellten Schweine-ACTH bei einer Temperatur von 100°C und einem pH von 4,7
in ungefähr 1 Stunde erhalten wird. Beispiel VI Ein Schweine-ACTH-Präparat, das
nach dem Bunding-Verfahren hergestellt und in einer wäßrigen 16°/oigen Gelatinelösung
mindestens 2 Jahre gelagert wurde, wird nach dem folgenden Verfahren mit Pyridoxin
behandelt:
Diese ACTH-Gelatinelösung hat während der Lagerung ihre
Wirksamkeit verloren und enthält maximal 4 USP-Einheiten pro ccm. 100 ccm dieses
Präparates werden mit 10 g Pyridoxinhydrochlorid gemischt. Anteile der erhaltenen
Mischung werden auf bestimmte ausgewählte Wasserstoffionenkonzentrationen eingestellt
und2 Wochen bei einer Temperatur von 37°C bebrütet. Die bebrüteten Produkte wurden
nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht Ratten pro Präparat untersucht.
Die
Ergebnisse sind die folgenden
| pg des Produkts Wirksamkeit des Produkts |
| (USP-Einheiten pro ccm) |
| 3,5 11,1 |
| 4,5 14,7 |
| 5,5 .10,7 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirksamkeit des ACTH, die während der Lagerung
verlorenging, mit Pyridoxin wiederhergestellt werden kann.
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Beispiel VII 1 g eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten Rinder-ACTH
wird in 100 ccm py rogenfreiem destilliertem Wasser gelöst. Zu der erhaltenen Lösung
werden 2,5 g Pyridoxinhy drochlorid hinzugegeben und die Lösung mit einer 10°/oigen
Natronlauge auf ein pH von 4,7 eingestellt. Diese Lösung wird in Glasampullen abgefüllt,
und die gefüllten Ampullen werden verschlossen und 6 Stunden lang in einem siedenden
Wasserbad bebrütet. Das hierbei erhaltene Präparat hat eine Wirksamkeit von 306
USP-Einheiten pro ccm. Dieses Produkt wird in einem siedenden Wasserbad weitere
40 Minuten lang bebrütet, und das erhaltene Präparat hat eine Wirksamkeit von 391
USP-Einheiten pro ccm.
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50 ccm dieses mit Pyridoxin behandelten Präparates werden mit einer
160,ioigen wäßrigen Gelatinelösung, die 0,5 °/o Phenol enthält, auf 500 ccm verdünnt.
Das verdünnte Produkt wird verwendet zur Herstellung folgender Rezepturen: A. Ein
Anteil dieses mit Pyridoxin behandelten Produktes, und zwar 300 ccm, werden steril
filtriert und in 5-ccm-Glasampullen gefüllt, und zwar pro 5 ccm pro Ampulle.
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B. Zu 110 ccm des Produktes A «-erden 100 mg Cystein hinzugegeben
und die erhaltene Lösung steril filtriert. Die sterilisierte Lösung wird zu je 5
ccm in 5-ccm-Ampullen abgefüllt.
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C. Zu 100 ccm des mit Pyridoxin behandelten Produktes werden 30 ccm
einer 160/aigen wäßrigen-Gelatinelösung, die 0,50 ;'o Phenol enthält, und
110 mg kristallines Vitamin B12 hinzugegeben. Die erhaltene Lösung wird steril filtriert
und zu je 5 ccm in 5-ccm-Ampullen abgefüllt.
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D. Ein Rinder-ACTH-Präparat, erhalten nach dem Bunding-Verfahren,
das in einer 16°/oigen wäßrigen Gelatinelösung von p$ 6,5 enthalten ist, wird in
einer Menge von 210 ccm steril filtriert und zu je 5 ccm in 5-ccm-Ampullen abgefüllt
(Kontrolle).
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E. 210 ccm der Kontroll-ACTH-Gelatinelösung (Produkt D-, oben) werden
mit 210 mg Cystein gemischt. Die erhaltene Lösung wird steril filtriert und zu je
5 ccm in 5-ccm-Ampullen gefüllt.
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Jede der obigen Rezepturen wurde unter Verwendung von zwei Dreistufen-SCG-Prüfungen
analysiert. Ein Anteil jedes Produktes wurde 8 bis 16 Stunden lang bei einer Temperatur
von 100°C zur Stabilitätsbestimmung bebrütet. Diese bebrüteten Produkte werden durch
das SCG-Prüfungsverfahren unter Verwendung von acht Ratten pro Präparat untersucht.
Die Ergebnisse waren folgende
| Stabilisierungsbe- |
| Wirksamkeit Stimmung: 8 und 16 |
| Prä- (USP-Einheiten pro ccm) StundenBebrütungs- |
| parat zeit (USP-Einheiten |
| Prüfung (zwei Prüfung pro ccm) |
| Bestimmungen) Mittel 8 Std. I 16 Std. |
| A 34,8 4,0 30,3 2,6 17,7 10,5 |
| 28,0 2,4 i |
| B 33,6 6,4 33,4 4,3 15,8 12,9 |
| 33,3 -h 4,3 |
| C 39,0 6,9 31,2 3,4 8,1 6,0 |
| 28,4 4,0 |
| D 24,8 4,0 ' 26,1 2,1 9,4 5,1 |
| 26,5 zE 2,5 |
| E 32,0 ± 4,0 30,0 2,7 15,6 6,2 |
| 27,2 4- 3,2 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verstärkung der subkutanen Wirkung von ACTH in
Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Cystein oder kristallisiertes Vitamin B12
beibehalten wird.
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Beispiel VIII 2 g Rinder-ACTH, hergestellt nach dem Bunding-Verfahren,
werden in 220 ccm pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert. Zu der erhaltenen
Suspension werden 5 g Pyridoxinhydrochlorid zugegeben und die Suspension mit 10%iger
Natronlauge auf ein p$ von 4,7 eingestellt.
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Die Suspension wird in 50-ccm-Ampullen gefüllt und diese nach dem
Verschließen in siedendes Wasser getaucht, wo sie 6 Stunden und 40 Minuten lang
bebrütet werden. 1 ccm dieses bebrüteten Produkts wird mit 7 ccm 15°/Qiger wäßriger
Gelatinelösung, die 0,5
% Phenol enthält, verdünnt. Dieses Gelatinepräparat
zeigte bei der Analyse in der SCG-Prüfung, unter Verwendung von drei Stufen, eine
Wirksamkeit von 50,5 ± 7 USP-Einheiten pro ccm. Gegründet auf dieses Versuchsergebnis,
«-erden 200 ccm des bebrüteten Produktes mit 1600 ccm einer 16°%oigen wäßrigen Gelatinelösung,
die 0,5 1),i, Phenol enthält, verdünnt. Dieses verdünnte Präparat wurde durch ein
Ertel-Filter Nr. 8 steril filtriert und zu j e 5,4 ccm in 5-ccm-Ampullen abgefüllt.
Anteile der Ampulleninhalte wurden bei einer Temperatur von 100°C 8 bis 16 Stunden
lang zur Bestimmung der Stabilität geprüft. Diese Präparate wurden nach dem SCG-Prüfungsverfahren
in dem USP-intravenösen-Corticotrophin-Verfahren geprüft. Die Ergebnisse sind folgende:
| Präparat Wirksamkeit (USP-Einheiten pro ccm) |
| IV I SCG |
| Bebrütetes Präparat ............................... 15,2 ::L
3,2 39,6 ::L 5,2 |
| 53,9 8,8 Mittel = 44,6 ± 3,4 |
| 44,8 5,2 |
| Bebrütetes Präparat nach 8 Stundenbei 100°C ...... 9,3 22,0 |
| Bebrütetes Präparat nach 16 Stunden bei 100°C ...... 7,8 9,2 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß in einigen Fällen eine Verstärkung
der Wirksamkeit von ACTH nach intravenöser Verabreichung erhalten werden kann, zusätzlich
zu der Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit, und zwar werden bei Rinder-ACTH mit
einer Wirksamkeit von 10 intravenösen Einheiten pro mg (Sayers-Verfahren) und 10
U SP-Einheiten pro mg beide Wirksamkeiten verstärkt. Die intravenöse Wirksamkeit
stieg von 11 Einheiten pro ccm auf 15,2 ± 3,2 Einheiten, wogegen die USP-Einheiten
von 11 Einheiten pro ccm auf 44,6 =' 3,4 Einheiten pro ccm stiegen; oder mit anderen
Worten: die unter IV angegebene Wirksamkeit stieg von 10 Einheiten pro mg auf 13,7
Einheiten, und die USP-Wirksamkeit stieg von 10 USP-Einheiten pro mg auf 40 Einheiten
pro mg nach dem Bebrüten in der Wärme mit Pyridoxinhydrochlorid.
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Beispiel IX 200 mg eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten
Rinder-ACTH werden in 20 ccm pyrogenfreiem Wasser gelöst. Zu der erhaltenen Lösung
werden 500 mg Pyridoxinhydrochlorid hinzugegeben, und diese Lösung wird mit 20°/oiger
Natronlauge auf ein pH von 4,7 eingestellt. Diese Lösung wird in eine 30-ccm-Glasampulle
gefüllt und die gefüllte Ampulle in einem siedenden Wasserbad bebrütet. In bestimmten
Zeitabständen werden Anteile des Ampulleninhaltes entfernt. Diese Anteile werden
mit 16°/oiger wäßriger Gelatinelösung, die 0,5 °/o Phenol enthält, auf 1 : 10 verdünnt.
Die erhaltenen Präparate werden nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht
Ratten pro Präparat analysiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:
| Bebrütungs- Wirksamkeit der ''er- BerechneteSVirksamkeit |
| zeit suchsprobe (USP- des Präparates (USP- |
| (Stunden) Einheiten pro ccm) Einheiten pro ccm) |
| 0 13,5 135 |
| 3,5 18,6 186 |
| 4 47,6 476 |
| 4,5 40,4 - 5,2 404 |
| 8 24 240 |
| 10 13,6 136 |
10 ccm des nach dem obigen Verfahren nach 4,5 Stunden Bebrütung erhaltenen Präparates
werden mit 20°/oiger Natronlauge auf ein pH von 6,5 eingestellt. Zu dieser Lösung
werden 100 mg Cystein zugegeben. Die erhaltene Mischung wird in Glasampullen gefüllt.
Die gefüllten Ampullen werden in einem siedenden Wasserbad bebrütet. In bestimmten
Zeitabständen werden Teile dieses Ampulleninhaltes aus dem Bad entfernt, ihr Inhalt
mit 16°/oiger wäßriger Gelatinelösung, die 0,5 °/o Phenol enthält, auf 1 : 10 verdünnt.
Diese Präparate werden nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht Ratten pro
Präparat analysiert. Die Ergebnisse sind die folgenden
| Bebrütungs- Wirksamkeit der Ver- BerechneteWirksamkeit |
| zeit suchsprobe (USP- des Präparates (USP- |
| (Stunden) Einheiten pro ccm) - Einheiten pro ccm) |
| 0,5 35,2 352 |
| 3,5 93,6 936 |
| 5,5 29,1 291 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß nach dem Bunding-V erfahren erhaltenes Rinder-ACTH
mit Pyridoxin behandelt werden kann, uni die subkutane Wirksamkeit zu verstärken,
und daß das erhaltene Präparat mit Cystein bei einem p$ von 6,5 und einer Temperatur
von ungefähr 100°C behandelt werden kann, ohne die subkutane ACTH-Wirksamkeit, die
erhalten wurde, zu zerstören. Beispiel X 2 g eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten
Rinder-ACTH werden in 200 ccm pyrogenfreiem destilliertem Wasser gelöst. Zu der
erhaltenen Lösung werden 5 g Pyridoxinhydrochlorid hinzugegeben und diese Lösung
mit 20%iger Natronlauge auf ein p$ von 4,7 eingestellt. Die Lösung wird in 50-ccm-Ampullen
gefüllt und die gefüllten Ampullen 4,5 Stunden in einem siedenden Wasserbad bebrütet,
die Lösung anschließend mit 20°/oiger Natronlauge auf ein p$ von 6,5 eingestellt
und mit 2 g Cystein versetzt. Diese Lösung wurde erneut in 50-ccm-Ampullen gefüllt,
die gefüllten Ampullen ver= schlossen und in einem siedenden Wasserbad 2 Stunden
lang bebrütet. 1 ccm dieses bebrüteten Produktes wird mit 9 ccm einer 16°/oigen
wäßrigen Gelatinelösung, die 0,5 °/o Phenol enthält, verdünnt. Die erhaltene Lösung
hat eine SCG-Wirksamkeit (zwei Versuche) von 31,2 :E 4,4 und 35,4 Ih 3,6 mit einem
Mittel von 33,8 ± 2,9 USP-Einheiten pro ccm. Der Rest des bebrüteten Präparates
wird durch Filtrierung durch ein feines Sinterglasfilter geklärt und der Filterrückstand
getrocknet (Ausbeute von 374 mg). Das Filtrat beträgt 190 ccm und wird mit 855 ccm
einer 32°/oigen wäßrigen Gelatinelösung, die 1,0°/o Phenol enthält, und mit 665
ccm pyrogenfreiem destilliertem Wasser verdünnt. Dieses Präparat hat eine SCG-Wirksamkeitvon
40,8 - 6,0 USP-Einheitenproccm.
-
Die ACTH-Gelatinelösung wird durch ein Ertel-Filter Nr. 8 steril filtriert
und aseptisch in 5-ccm-Glasampullen gefüllt, und zwar pro Ampulle 5,5 ccm. Das Präparat
der Ampulle hatte eine SCG-Wirksamkeit (zwei Versuche) von 36,4 - 5,2 und 56,6 ±
9,6 mit einem Mittel von 43,0 y4,6 USP-Einheiten pro ccm.
-
Ein Anteil des Präparates wird durch 8 Stunden und 16 Stunden langes
Erhitzen auf eine Temperatur von 100°C einer Stabilitätsbestimmung unterworfen.
Die erhaltenen Präparate werden nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht
Ratten pro Präparat analysiert. Die Wirksamkeit dieser Präparate in USP-Einheiten
pro ccm ist die folgende: .
-
Anfängliche Wirksamkeit .... 43,0 ± 4,6 Nach 8 Stunden Bebrütung
. . 16,8 und 25,5 mit einem Mittel von 21,2 Nach 16 Stunden Bebrütung . . 12,4 und
16,8 mit einem Mittel von 14,6 Ein anderer Anteil des Präparates wird mit
0,10/,
(Gew./Vol.) Cystein gemischt. Die erhaltene Mischung wird 8 Stunden
und 16 Stunden auf eine Temperatur von 100°C erhitzt. Die erhaltenen Präparate werden
nach dem SCG-Verfahren unter Verwendung von acht Ratten pro Präparat geprüft. Die
Wirksamkeit dieser Präparate in USP-Einheiten pro ccm ist die folgende: Anfängliche
Wirksamkeit .... 43,0-1-4,6 Nach 8 Stunden Bebrütung .. 17,2 und 23,6 mit
einem Mittel von 20,4 Nach 16 Stunden Bebrütung . . 13,6 und 14,4 mit einemMittel
von 14,0 Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verstärkung der subkutanen Wirksamkeit
von ACTH auch dann beibehalten wird, wenn anschließend mit einem Reduktionsmittel
wie Cystein bei einem pH von 6,5 behandelt wurde.
-
Beispiel XI 200 mg eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten
Rinder-ACTH werden in 20 ccm pyrogenfreiem
destilliertem Wasser
suspendiert. Dieser Suspension «-erden 200 mg Pyridoxinhydrochlorid zugegeben und
das PH mit In-.Natronlauge auf 4,7 eingestellt.
-
Diese Suspension wird in Glasampullen abgefüllt und diese nach dem
Verschließen in ein siedendes Wasserbad getaucht. Nach bestimmten Zeitabständen
werden während der Bebrütung Anteile des Ampulleninhalts entnommen. Diese Anteile
werden mit 10 Teilen einer wäßrigen 16°oigen Gelatinelösung, die 0,5°;o Phenol enthält,
verdünnt. Diese Gelatinelösung wird nach dem SGG-Verfahren unter Verwendung von
acht Ratten pro Präparat geprüft. Die Ergebnisse sind die folgenden:
| Zeitintervall (Stunden) Wirksamkeit |
| (USP-Einheiten pro ccm) |
| 0 79 |
| 1 140 |
| 2 207 |
| 3 444 |
| 4 590 |
| 4,5 96 |
| 5 48 |
| 5,5 64 |
| 6 84 |
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Anwesenheit von
10/,
Pyridoxinhydrochlorid
in der Inkubationsmischung den Grad der Verstärkung gegenüber demjenigen, der mit
2,5°/oigem Pyridoxinhydrochlorid erhalten wird, erhöht (Beispiel 10).
-
Beispiel XII 200 mg eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten
Rinder-ACTH werden in 100 ccm einer 16°/oigen wäßrigen Gelatinelösung, die 10 g
Pyridoxin, 110 mg Vitamin B12 und 0,5 °/o Phenol enthält, suspendiert. Die erhaltene
Suspension wird bei einer Temperatur von 32°C bebrütet. Während der Bebrütung werden
Anteile der Suspension in bestimmten Zeitabständen entfernt. Diese Anteile werden
durch das SCG-Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:
| Zeitintervall |
| Wirksamkeit |
| (Stunden) (USP-Einheiten pro eem) |
| 0 12 bis 16 |
| 2 30,4 (8-Ratten-Versuch) |
| 9 43,0 ± 6,0 (2- bis 3-Stufen-Versuche) |
| 36,0 ± 4,8 (Mittel = 39,4 ± 3,8) |
| 16 91,2 ± 8,8 (3-Stufen-Versuch) |
Die 16 Tage lang bebrüteten Präparate werden durch ein Ertel-Filter Nr. 8 filtriert
und das sterile Filtrat nach dem SGG-Verfahren analysiert. Dieses sterile Präparat
hat eine Wirksamkeit von 58,4 ± 4,8 USP-Einheiten pro ccm (3-Stufen-Versuch).
-
Beispiel XIII Unter Verwendung von Rinder-ACTH, das nach dem Bunding-Verfahren
erhalten wird, werden folgende Rezepturen hergestellt: Präparat A: eine 16°%ige
wäßrige Gelatinelösung, die 0,4 USP-Einheiten ACTH pro ccm, das nicht mit Pyridoxin
vorbehandelt wurde, und 0,5 °/o Phenol enthält.
-
Präparat B : Eine 16°/jge wäßrige Gelatinelösung, die 0,4 USP-Einheiten
pro ccm ACTH enthält, das mit Pyridoxin nicht vorbehandelt wurde, in Kombination
mit 24,6 y-Vitamin B12 pro ccm, 2,46 mg Pyridoxin pro ccm und 0,5 °/o Phenol. Präparat
C: Eine wäßrige 16°/oige Gelatinelösung, enthaltend 0,4 USP-Einheiten pro ccm eines
ACTH, das nach 16tägiger Bebrütung wie im Beispiel XII erhalten wurde, in Kombination
mit 8 y-Vitamin B12 pro ccm, 0,8 mg Pyridoxin pro ccm und 0,501, Phenol.
-
Präparat D: Eine wäßrige 16°/oige Gelatinelösung, enthaltend 0,4 USP-Einheiten
pro ccm eines nach 16-tägiger Bebrütung nach Beispiel XII erhaltenen ACTH in Kombination
mit 26,6 -y-Vitamin B12 pro ccm, 2,66 mg Pyridoxin pro ccm und 0,501, Phenol.
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Diese Produkte werden nach dem SGG-Verfahren wie folgt analysiert:
Achtig hypophysektomierte Ratten werden in vier Gruppen von je zwanzig Ratten geteilt.
Jeder Gruppe werden 0,5 ccm eines der obenerwähnten Präparate injiziert. Vier Ratten
jeder Gruppe werden in bestimmten Zeitabständen nach der Injektion getötet. Die
Erschöpfung des Ascorbinsäuregehaltes der Nebenniere der Ratten wird bestimmt, und
die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle als y pro mg Nebennierengewicht in
bestimmten Zeitabständen angegeben.
| Präparat Zeitintervall (Stunden) |
| r 2 s 5 |
| A 3,48 3,28 2,98 3,60 4,26 |
| B* 3,08 3,36 3,09 3,48 3,69 |
| C 2,87 2,61 2,47 2,57 3,20 |
| D 2,60 2,47 I 2,00 I 1,95 I 2,53 |
| * Dies ist eine anomale Verteilung von Versuchsdaten. |
Beispiel XIV 200 mg eines nach dem Bunding-Verfahren hergestellten Schaf-ACTH werden
in 20 ccm pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension werden
500 mg Pyridoxinhydrochlorid hinzugegeben, und das pH wird mit einer wäßrigen Natronlauge
auf 4,7 eingestellt.
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Diese Suspension wird bei einer Temperatur von 100° C in einem siedenden
Wasserbad bebrütet. Aliquote Teile davon werden in bestimmten Zeitabständen entfernt.
Diese werden mit einer wäßrigen 16°/jgen Gelatinelösung, die 0,5 °/o Phenol enthält,
auf 1 : 10 verdünnt und dann nach dem SGG-Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind
die folgenden:
| Zeitintervall Wirksamkeit |
| (Stunden) (USP-Einheiten pro ccm) |
| 0 5,2 |
| 2 95,8 |
| 3 98,0 |
| 4 20,0 |
| 5 8,8 |
| 8 unwirksam |
Diese Ergebnisse zeigen, daß die maximale Verstärkung des nach dem Bunding-Verfahren
hergestellten Schaf-ACTH mit Pyridoxin in einer Bebrütungszeit von weniger als 3
Stunden erhalten werden kann.