DD151076A1 - Verfahren zur herstellung von spaltantigenen - Google Patents
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Abstract
Technische Virologie, insbesondere Produktion von Impfstoffen und diagnostischen Praeparaten. Das Ziel ist die Herstellung von Spaltantigenen mit hoher Reinheit, Stabilitaet und Ausbeute, insbesondere fuer die Praeparation von Diagnostika und gut vertraeglichen Impfstoffen, und zwar ohne aufwendige Verfahrensschritte und ohne zusaetzliche Investitionen in den entsprechenden Produktionsbetrieben. Die Aufgabe zur schonenden Herstellung von Spaltantigenen, die universell einsetzbar und sowohl fuer die Praeparation von Spalt- oder Subeinheitenimpfstoffen als auch fuer diagnostische Praeparate bzw. Standards in human- und veterinaermedizinischen sowie in sonstigen diagnostischen Bereichen verwendbar sind, wird dadurch geloest, dasz die Spaltung von Orthomyxo- oder Paramyxoviren und auch weiteren Viren durch Kombination chemischer/biochemischer Agenzien mit physikalischen Faktoren erfolgt. Orthomyxo- oder Paramyxoviren und auch andere Viren werden in der Kombination chemischer/ biochemischer Agenzien, insbesondere Tenside, mit physikalischen Faktoren, insbesondere Temperatur, pH-Wert und Ultraschall, einer Spaltung unterworfen. Dadurch kann bei niedrigen Konzentrationen an Fremdreagenzien und gleichzeitig schonend gespalten werden. Mit diesem Vorgehen wird die native Struktur der Ausgangsantigene weitgehend erhalten. Moegliche Anwendungsgebiete: Praeparation von Diagnostika bzw. Standards sowie von Spalt- bzw. Subeinheitenimpfstoffen.
Description
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Verfahren zur Herstellung von Spaltantigenen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Das Anwendungsgebiet betrifft die Herstellung von Spaltantigenen aus Orthomyxo- und Paramyxoviren oder auch aus anderen Viren, die in entsprechender Präparationsforni sowohl für Spalt~ oder Subeinheitenimpfstoffe als auch für diagnostische Antigene eingesetzt werden können. Sie verfügen über eine hohe Reinheit und Stabilität und lassen sich technisch in wenigen Verfahrensschritten mit günstigen Ausbeuten produzieren.
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Die Anwendung besieht sich auf Herstellungsbetriebe für Spezialimpfstoffe sowie diagnostische Präparate und Standards für die Human- und Veterinärmedizin sowie für sonstige diagnostische Bereiche.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Technische Lösungen zur Herstellung von Spalt- oder Subeinheitenimpfstoffen sowie von diagnostischen Spaltantigenen, die den Vorteil der Kombination chemischer bzw, biochemischer Agenzien mit physikalischen Faktoren gezielt ausnutzen, sind bisher nicht bekannt geworden. Zur Aufspaltung von z. B. Influenaaviren werden seit langen besonders zur.Lösung wissenschaftlicher Fragestellungen chemische bzw» biochemische oder physikochemische Methoden ausgeübt. Breitere Anwendung findet der Einsatz von Detergenzien bei der Virusspaltung. Als gut geeignet er-
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weisen sich Triton X-100 sowie Natrium- oder Ammoniumdesoxycholat. Weitere wirksame Detergenzien sind Na-dodecylsulfat, Na-Laurylsarcosinat und Cetyltrimethylammoniumbromid.
Die Anwendung relativ hoher Konzentrationen an Detergenzien bei langen Inkubationszeiten hat den Nachteil, daß die Virusspaltung wenig selektiv verläuft und insbesondere beim Einsatz ionischer Detergenzien (z. B. Na-dodecylsulfat) ebenfalls innere Virusstrukturproteine freigesetzt werden. Eine weitere Unsicherheit ist beim Arbeiten mit hohen Viruskonzentrationen durch die auftretende Gelbildung zu verzeichnen. Nachteile dieser Art werden durch die im WP C 12 K/215 969 beschriebene Einhaltung bestimmter Viruskonzentrationen (bezogen auf Hämagglutinin) beseitigt.
Andere prinzipielle Möglichkeiten der Gewinnung von SpaltantigeBen bzw. Hüllproteinen aus Orthomyxo- und Paramyxoviren sind die Einwirkung lipidlösendor Agenzien oder auch organische Lösungsmittel zusammen mit einem Detergenz. Bei Nichtbeachtung bestimmter Temperaturbereiche bei der Heranzüchtung des Virusmaterials (z. B. Masernvirus) oder "bei Nichtbeachtung spezieller Reinheitskriterien der verwendeten organischen Lösungsmittel resultieren hier niedrige Antigenqualitäten oder sogar Proteinaggregationen.
Die Ausnutzung biochemischer Möglichkeiten konzentriert sich besonders auf die Einwirkung freier Proteasen, wobei sich der Prozeß der Virusspaltung auch schlecht steuern läßt und damit auch niedrige und z. T. sehr unterschiedliche Ausbeuten an den Oberflächenantigenen Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) zu verzeichnen sind und zusätzlich auch in dem erhaltenen Endprodukt noch proteolytische Aktivität aus dem verwendeten Enzym nachzuweisen ist, so daß neben dem Enzymprotein als Fremdproteinverunreinigung auch der weitere Abbau der Oberflächenantigene Dicht blockiert ist. Weiterhin wird im Falle von z. B. Influenzaviren· unter dem schwer kontrollierbaren Einfluß
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ζ.·B. der freien Protease Bromelain die Subeinheit HA in HA 1 und HA. 2 zerlegt, so daß bei der Adsorb ens/Adj uv an s-Wirkung z. B. des Al(OH)~ die hydrophobe Region des HA 2. nicht mehr für die ganze HA-ßubeinhoit zur Geltung kommt.
Ziel der Erfindung
Der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, in den Anwenderbetrieben ohne aufwendige Verfahrensschritte und ohne zusätzliche Investitionen durch Kombination chemiseher/biochemischer Agenzien, insbesondere Tenside, mit physikalischen Faktoren, insbesondere Temperatur, pH-Wert und Ultraschall, eine schonende Spaltung von Orthomyxo- und Paramyxoviren und auch weiteren Viren zu erreichen, so daß Spaltantigene von hoher Reinheit, Stabilität und Ausbeute erhalten werden. Dabei tritt auch;die Viruskonzentration nicht als limitierender Faktor bei Spaltungsvorgängen in Form von z. B. Gelbildungen auf, und es kann somit auch bei höheren Viruskonzentrationen ( > 1 600/ug HA/ml), beliebigen Ausgangsqualitäten (in Allantoisflüssigkeiten enthaltene Viren oder pelletierte, zonenzentrifugierte, durch Adsorption/Elution gewonnene Viruskonzentrate) oder während der Konzentrierung und Reinigung und besonders auch bei relativ niedrigen Konzentrationen an Fremdreagenzien gespalten werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Spaltantigene von hoher Reinheit, Stabilität und Ausbeute aus Orthomyxo- oder Paramyxoviren und auch aus anderen Viren herzustellen, die universell verwendbar und sowohl für die Präparation von Spalt-oder Subeinheitenimpfstoffen als auch als diagnostische Präparate bzw. Standards in human- und veterinärmedizinischen sowie in sonstigen diagnostischen Bereichen einsetzbar sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die schorieride Spaltung von Orthomyxo- und Paramyxoviren sowie auch von anderen Viren zum Zwecke der Herstellung von
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Spaltantigenen für Spalt- oder Sub ein he it en impf stoffe oder für diagnostische Präparat© in der Kombination chemischer/biochemischer Agenzien, insbesondere Tenside, mit physikalischen Faktoren, insbesondere Temperatur, pH-Wert und Ultraschall, erfolgt und dadurch bei niedrigen Konzentrationen an Premdreagenzien gespalten werden kann. Mit diesem erfindungsgemäßen Vorgehen wird die native Struktur der Äusgangsantigene weitgehend geschont, was im Falle von z. B. Influenzaviren bedeutet, daß der Zerfall in HA 1 und HA 2 verhindert wird und damit in besonderem Maße die hydrophobe Region des HA 2 bei der Adsorbens/Adjjuvans-Y/irkung von z. B.. Al(OH) ο sowohl bei der Isolierung des HA durch Al(OH)^ als auch später in Form als Adjuvans voll .zur Geltung kommt.
Die Reihenfolge der Verfahrenssohritte stellt sich bei der Herstellung von Spaltantigenen wie folgt dar:
Orthomyxoviren (Influenza) Variante 1
- Virusvermehrung
- Viruskonzentrierung bzw. -reinigung
- Zusatz von Reagenzien (z. B. Tensid) und Einstellung der Temperatur und des pH-47ertes
- Spaltung unter Schütteln oder mit Ultraschall
-'Auftrennung des gespaltenen Virusmaterials in Hüllantigene und Rückstände
Variante 2
- Virusvermehrung
- Viruskonzentrierung und -spaltung mit Tensid während der Zentrifugation (normale Ultrazentrifugation oder Dichtegradientenzentrifugation)
- Abtrennung der Spaltantigene durch Ädsorption/Elution oder durch Fällung
Variante 3
« Virusvermehrung
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- Spaltung des Virusmaterials
- Auftrennung duroh Zentrifugation
Paramyxoviren (Masern)
- Vermehrung der Viren (unter besonderer Beachtung des ZeIlkultursystems und der [Temperatur)
- Aufschluß des Virusrohmaterials (mit den Zellen) durch Einfrieren/Auftauen oder Ultraschall oder Homogenisation
- Spaltung der Viren
- Abtrennen der Spaltantigene durch Zentrifugation
Ausführungsbeispiele Beispiel 1
0,8 ml'Viruskonzentrat (Influenzaviren Typ A Stamm Dresden/1/79) rait einem Virusproteingehalt von 25 mg/ml und einem HA-Gehalt von 6 mg/ml werden mit 39,2 ml 0,02 tigern CiCAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)in 0,0067 M Phosphatpuffer pH 8,2/0,8 % Natriumchlorid (1,19 S Na2HPO4 .2 H2O und 8,0 g NaCl mit aqua dest. auf 1 000 ml auffüllen) vermischt und 30 min bei Kaumtemperatur stehengelassen. Das Masseverhältnis von Reinprotein zu Detergenz beträgt ca. 2 : 1. Anschließend v/ird 90 min bei 50 000 χ g zentrifugiert. Der Überstand enthält die Oberflächenantigene HA und ITA in Ausbeuten von 80 %t die durch Adsorption an Aluminiumhydroxid (auf 40yug HA = 0,6 mg Al) abgetrennt werden.
Influenzaviren Typ A Stamm X-71 (erhalten über einen Saccharose-Dichtegradienten) werden in 0,9 JSiger Kochsalzlösung bei pH 7,8 (eingestellt mit NaOH) unter Zusatz von 0,08 % Natriumdesoxycholat aufgenommen. Der HA-Gehalt in /ug/ml beträgt 3 000. Bs folgt 30 min Rühren bei 27 0C. Anschließend werden die Hüllproteine HA und NA durch Ul-
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trazentrifugation (90 min) "bei max. 100 000 χ g abgetrennt» Die im Überstand befindlichen Hüllproteine werden durch Adsorption an Al(OH)3 (auf 40/ug HA = 0,75 mg Al) abgetrennt und einmal mit phosphatgepufferter physiologischer NaCl-Lösung gewaschen. Zum Schluß wird ein HA-Gehalt von 30/ug HA/ml für den Impfstoff eingestellt.
Mit Hilfe von Natriumdesoxycholat (Arbeitskonzentration 0,06 %) und eines Ultra-Desintegrators (250 Watt, 25 ItHz) bei einer Einwirkungszeit von ca. 5 mia gespaltenes Visusmaterial (Influenzaviren Typ A - Rekombinante NIB-4) wird durch ültrazentrifugation bei ca. 75 000 χ g (90 min) in Überstand und Sediment getrennt. Der Überstand nach der Ultrazentrifugation, der die Strukturproteine HA und NA enthält, wird mit festem Ammoniumsulfat bis zur halbkonzentrierten Lösung (ca. 35 ß P^o 100 ml Überstand) oder festem Natriumchlorid (30 g/100 ml) bzw. Natriumsulfat-10-hydrat (10 g/100 ml) versetzt. Nach 30 - 60 min Stehen bei 4 0C wird niedertourig (2 000 - 4 000 χ g/15 min) zentrifugiert, das Sediment mit wenig gepufferter physiologischer Natriumchloridlösung aufgenommen, evtl. durch niedertourige Zentrifugation geklärt und gegen gepufferte physiologische Natriumchloridlösung dialysiert (12 - 24 Std./4 0C).
Die Strukturproteine HA und NA liegen in reiner Form weitgehend frei von Fremdsalzen und Detergenz vor.
Es werden nach der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (mit Saccharose und Ammoniumdesoxycholat) die Gradientenfraktionen entnommen, die die abgespaltenen Antigene HA "und NA enthalten. Diese werden in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Die weitere Abtrennung erfolgt gemäß Beispiel 2 durch Adsorption an Al(OH)o oder gemäß Beispiel 3 durch Fällung mit Salzen.
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Masernvirusrohmaterial, präpariert auf geeigneten Zellkultur systemen (vorzugsweise Linie FL), wird nach dreimaligem Einfrieren und Auftauen mit Tween 80 in einer Bndkon ζ en tr ation von ca. 0,125 % versetzt und 5 min bei Zimmertemperatur gut geschüttelt. Die Mischung wird anschließend mit Äther (2· AB-DDR) in einer Menge, die der Hälfte des Volumens des Materials entspricht, versetzt. Nach 20 min kräftigem Schütteln bei Zimmertemperatur wird das Material niedertourig (3 300 χ g) zentrifugiert und die wäßrige Phase durch Abziehen gewonnen. Der in der Antigenpräparation verbliebene Restäther wird mittels Durchblasen von Stickstoff entfernt. Nach Zusatz von Thiomereal im Verhältnis 1 : 10 000 und Aufbewahrung bei + 4 0C ist das' Antigen mindestens 24 Monate, im lyophilisierten Zustand mindestens 36 Monate haltbar.
Έβ wird gemäß Beispiel 5 verfahren. Anstelle des dreimaligen Einfrierens/Auftauens und des Einsatzes von Tween .80/Äther erfolgt jedoch eine Behandlung mit einem Ultra-Desintegrator (125 Watt/20 kHz) und Zusatz von 0,02 % CTAB.
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von Spaltantigenen aus Orthomyxo- und Paramyxoviren, die nach den üblichen Methoden der Ultrazentrifugation, Zonenzentrifugation, Membranfiltration, Fällung, Ädsorption/Elution oder Anreicherung über Zellkulturen gewonnen werden, gekennzeichnet dadurch, daß durch Kombination chemischer bzw. biochemischer Agenzien und physikalischer Faktoren die bei der Virusspaltung freigesetzten Antigene ihre native Struktur weitgehend beibehalten und dadurch Spaltantigene erhalten werden, die eine hohe Reinheit und Stabilität besitzen.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei Spaltung in der Kombination Tenside/Lösungsmittel organische Lösungsmittel mit speziellen Reinheitskriterien, z. B. Äther gemäß 2 AB-DDB, verwendet werden.
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Pat en t an sprue he
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei Einsatz von Tensiden bei erhöhten Temperaturen zwischen 25 -65 0C, vorzugsweise bei 38 0G, gespalten wird.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Spaltung mit Tensiden der pH-Wert mit Alkalien auf 7»5 - 11 »51 vorzugsweise auf 8*,5 - 9,5, eingestellt wird. .
5· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Spaltung in der Kombination Tenside mit Ultraschall, beispielsweise 0,03 % Natriumdesoxycholat und 5 min Behandlung mit Ultraschall bei einer Arbeitsfrequenz von 25 kHz erfolgt.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle der Spaltung von Masernvirus solche Materialien eingesetzt werden, die auf speziell selektierten Zellinien (FL) und bei 34 0C t 1 0C erhalten werden.
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7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Spaltung direkt Adsorbate, beispielsweise an Al(OH).j adsorbierte Viren, eingesetzt werden.
8, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle der Virusspaltung die hydrophobe Region der Hämagglutinine bei der Adouvanswirkung von Adsorbenzien, beispielsweise Al(OH)^« ausgenutzt wird.
9· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Spaltung auch mit Alkalien allein und in Kombination mit einer Temperaturerhöhung oder unter Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß
,, in die Kombination auch trägerfixierte Enzyme, insbesondere Proteasen, einbezogen werden können.
11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß während oder nach der Spaltung mit Tensiden/Alkalien oder Alkalien allein oder auch un1;er Einsatz von trägerfixierten Enzymen in Kombination mit einer Temperaturerhöhung oder Ultraschallanwendung die üblichen Methoden der Ultrazentrifugation, Zonenzentrifugation, Membranfiltration, Adsorption/Elution, Fällung mit Salzen oder Präzipitation mit organischen Lösungsmitteln oder Polyäthylenglycol zur Abtrennung der Antigene angewendet werden.
12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß
* bei Anwendung von Desoxycholaten eine Behandlung mit mineralischen Säuren, beispielsweise Salzsäure, erfolgen kann.
13· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Spaltantigene für diagnostische Präparate oder Impfstoffe eingesetzt werden.
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- 1980-05-19 DD DD22120780A patent/DD151076A1/de unknown
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