WO2001087346A2 - Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen - Google Patents

Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen Download PDF

Info

Publication number
WO2001087346A2
WO2001087346A2 PCT/EP2001/005670 EP0105670W WO0187346A2 WO 2001087346 A2 WO2001087346 A2 WO 2001087346A2 EP 0105670 W EP0105670 W EP 0105670W WO 0187346 A2 WO0187346 A2 WO 0187346A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dendritic cells
toxins
species
cells according
cells
Prior art date
Application number
PCT/EP2001/005670
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001087346A3 (de
Inventor
Dirk Weickmann
Original Assignee
Toximed Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toximed Gmbh filed Critical Toximed Gmbh
Priority to JP2001583813A priority Critical patent/JP2003533203A/ja
Priority to AU62297/01A priority patent/AU6229701A/en
Priority to EP01936371A priority patent/EP1283726A2/de
Publication of WO2001087346A2 publication Critical patent/WO2001087346A2/de
Publication of WO2001087346A3 publication Critical patent/WO2001087346A3/de
Priority to US10/292,282 priority patent/US20040013740A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A61K35/648—Myriapods, e.g. centipedes or millipedes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4642—Invertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma

Definitions

  • the invention relates to dendritic cells loaded with toxic substances, processes for their production and the use of these dendritic cells for the treatment of tumors, in particular for the therapy of tumors of the mucous membrane and the skin.
  • Skin cancer is understood to mean on the skin, less often tumors occurring on the mucous membrane.
  • the malignant tumors are called skin carcinomas or melanomas.
  • the primary tumors are manifested in the skin and can be seen on the skin surface as pigmented areas (Neronesi U., Cascinelli ⁇ ., Santinami M. (1987): Cutaneous Melanoma. Status of Knowledge and Future Perspective. London Orlando San Diego New York Austin Boston Sidney Tokyo Toronto: Academic Press).
  • tissue extraction and, in many cases, cultivation in tissue culture is necessary.
  • the most aggressive among the known neoplasia is malignant melanoma, which is also often called "black cancer” is called.
  • a problem with this disease concerns its extremely metastatic spread, which does not stop at any organ boundary.
  • the radiation is carried out with ionizing radiation; usually used
  • the disadvantage of radiation is that, similar to chemotherapy, spatial limitation is not possible.
  • the radiation hardness also sustainably damages healthy cells, especially DNA. Since cancer cells usually divide faster than healthy cells, the cancer cells are usually the first to be killed in radiation therapy. However, there is a risk of radiation ulcer (Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch 256, 1990 edition, page 1602).
  • DTIC Cisplatin
  • CDDP Carboplatin
  • CBDCA Ifosfamid IFO) fotemustine
  • VBL Vinblastine
  • VCR Vincristine
  • Cisplatin + vinblastine + bleomycin (CVB protocol)
  • cytostatics are extremely aggressive cell toxins, which in addition to tumor tissue also damage healthy tissue to a large extent, including liver and kidney cells.
  • the main aim here is to use the interferon therapies that have so far only been approved for the indications of Kaposi's sarcoma and hairy cell leukemia.
  • Interferon is one of the cytokines that are active against degenerate cells. The mode of action is based on the detection of surface proteins of cancer cells and their destruction. Disadvantages of interferon therapy include fever, anorexia-nausea-emeses syndrome, fatigue, head pressure, headache, joint pain, dizziness, liver enzyme elevation, pruritus, IFN antibody formation, circulatory and blood pressure problems (DeVita Jr. VT., Hellman S., Rosenberg SA. (1991): Biology Therapy of Cancer. Philadelphia: JB Lippincott Co.).
  • myeloma cells grown by a method by Köhler and Millstein are fused with rodent lymphocytes which have been immunized with human antigenic melanoma cell material or membrane fractions from melanoma cells.
  • rodent lymphocytes which have been immunized with human antigenic melanoma cell material or membrane fractions from melanoma cells.
  • monoclonal antibodies are produced from melanoma cells.
  • the antibodies are then injected and then find and destroy the skin cancer cells naturally using immunomodulators. Side effects are not known, since they are the body's own substances, so none Immune shock reactions occur.
  • the disadvantage of this form of therapy is the low sensitivity to skin cancer cells (Voigt H. (1996): 150 questions and answers on malignant melanoma. Zuckerhedt Verlag, Kunststoff / Ibelgaufts H. (1992): Lexikon Zytokine. Medikon Kunststoff).
  • dendritic cells are grown in vitro from the patient's spinal cord and / or blood stem cells, which are then vaccinated again when the patient has reached a minimum titer.
  • the dendritic cells actively search for and find tumor cells and attack them with cell-destroying substances.
  • the main disadvantage here is the low efficiency, so attempts are made to load the dendritic cell with the body's own human cytokines and / or peptides (e.g. anaphylatoxins C3a, C4a etc.) (Kirchner H., Kruse A., Neustock P., Rink L. ( 1994): Cytokines and Interferons. Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg). Unfortunately, the specificity of the substances found is often not sufficient to completely kill the tumor cells.
  • the object of this invention is therefore to provide improved agents for the therapy of tumor diseases which can be attacked by means of dendritic cells.
  • This object is achieved according to the invention by loading dendritic cells with toxic substances, the toxic substances from the poison of scolopenders of the genera Scolopendra and Hemiscolopendra, snakes of the genera Bitis and Naja, spiders of the genera Loxosceles, Sicarius and Pholcus and Dysdera as well as scorpions of the Genus Parabuthus and a combination of one or more of these toxins are selected.
  • Dendritic cells loaded in this way can be used for the therapy of tumor diseases, in particular for the therapy of skin cancer and mucosal tumors.
  • the dendritic cells can be used as sole therapy, but also as accompanying therapy without the risk of the disadvantages of the current state of the art.
  • the dendritic cells are loaded with one and / or several toxic substances from the venom of scolopenders of the genera Scolopendra and / or hemiscolopendra, snakes of the genera Bitis and Naja, as well as scorpions of the genus Parabuthus and / or spiders of the genus Loxosceles, Sicarius and Pholcus , in a pharmaceutically and therapeutically effective amount.
  • toxic substances from the venom of scolopenders of the genera Scolopendra and / or hemiscolopendra, snakes of the genera Bitis and Naja, as well as scorpions of the genus Parabuthus and / or spiders of the genus Loxosceles, Sicarius and Pholcus , in a pharmaceutically and therapeutically effective amount.
  • the poison of the animals mentioned above contains a whole cocktail of compounds, which include not only peptide toxins but also toxins with an amido group, which, however, have no protein structure and, for example, have a molecular weight of 30-55 kDa.
  • the poison cocktail also includes substances with an antagonistic effect, which ensure the spatial and temporal controlled spreading of the toxins released by the animal.
  • the toxins are preferably peptide toxins.
  • the toxins generally have necrotic, cytotoxic and or apoptotic properties.
  • the toxins can be isolated from the poison cocktails of the animals by methods known per se become. However, since this is tedious, it has been shown according to the invention that, after fractionation of the poison cocktail, individual fractions containing the toxins can also be used to load the dendritic cells.
  • the toxins are present in these fractions together with other substances. However, since the fractions are selected so that they contain, in particular, the substances which are toxic to the cells, apoptotic and / or necrotic, it is not absolutely necessary to purify the toxins until they are completely pure.
  • the peptide toxins generally have a molecular weight in the range from 50-350 kDa, preferably a molecular weight of approximately 100 kDa.
  • the toxins can also be produced synthetically, and modifications of the toxins present in the animal species mentioned and used according to the invention for loading the dendritic cells are naturally also possible, that is to say derivatives which have been obtained by chemical modification of the toxins.
  • peptide toxins derivatives are to be understood to mean, inter alia, toxins in which one or more amino acids have been added, deleted and / or replaced by other amino acids, the toxic properties of which are of course retained in each case. It should be noted that a toxin can combine not only cytotoxic, but also necrotic and / or apoptotic properties.
  • the dendritic cells loaded with the toxic substances can be used for the targeted therapy of tumors.
  • the toxins have cell-destroying properties. Since the dendritic cells actively search for and find tumor cells and attack them with cell-destroying substances, the toxic substances are selected in such a way that they destroy cell-destroying, i.e. have cytotoxic, necrotic and / or apoptotic properties. Such substances are present in the poison cocktails of the animal species mentioned in claim 1. They are therefore outstandingly suitable for the therapy of tumors, in particular for the therapy of tumors of the skin and mucous membranes. However, it is also possible to load the dendritic cells loaded in this way with further substances which can be used for tumor therapy, for example with cytokines, cytokine receptors, anaphylatoxins, interferons, antibodies, glycosides, etc.
  • the loading takes place, for example, by direct injection of the toxic substances into the cell, by incubation of the dendritic cells with the toxic substances or through lipofection.
  • this was a technique for transforming cells with foreign DNA or RNA. Increased effectiveness is achieved by attaching antibodies, proteins, glycolipids, etc. to liposomes, the interactions of liposomes and cell surfaces being influenced in a targeted manner.
  • the peptide toxins or cytokines can be recognized as "cell-specific” and introduced into the dendritic cells during the "normal" metabolic functions [Herder (1995): Lexicon of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 2, Spectrum, Academic Publishing House Heidelberg].
  • Another method of loading is laser microinjection.
  • dendritic cells that are present in a medium containing the toxic substances are treated for a short time with a highly focused laser beam, so that a hole is created in the cell wall through which the surrounding medium can penetrate the cell.
  • the technique of micromanipulation of cells or cell assemblies on which this method is based is described, for example, in Schütze K. et al .; Nature Biotechnolgy, 16.8: 737-742 (1998), Schütze K. et al .; J. Cell. Mol. Biol., 44.5: 735-746 (1998), Böhm M. et al; Americ. J. Pathology; 151.1: 63-67, Ponten F.
  • RSA bacterial swine spp.
  • Cuba Pholcus spp.
  • the peptide toxin and / or the optionally further substances come from the poison of scolopenders, Bitis arietans and / or Loxosceles spiniceps.
  • This has the advantage that the substance's natural skin and / or tissue-degrading effect can be exploited. It is preferred that the raw animal poison mixture of male and / or female scolopenders of the genera Scolopendra and Hemiscolopendra from approx.
  • male and / or female snakes of the genera Bitis and Naja preferably from a body length of 50 cm, female sub-adult and / or adult scorpions of the genus Parabuthus, and / or from female subadult or adult spiders of the genus Loxosceles and or Pholcus and / or Sicarius.
  • This is advantageous because female arachnids of the genera Parabuthus, Loxosceles, Pholcus and Sicarius produce more poison than male representatives.
  • both sexes produce comparable poison quantities and poison qualities.
  • the raw animal venom mixture is obtained by manual milking. This has the advantage of a particularly gentle extraction of the raw animal poison mixture.
  • the raw animal venom mixture is homogenized before the fractionation, and it is further preferred that the fractions are deep-frozen before further processing and more preferably lyophilized.
  • the pharmaceutical loads of the dendritic cells according to the invention are suitable for use in medicine. According to the invention, the dendritic cells loaded with the pharmaceutically active substances can preferably be used for the treatment of skin cancer diseases.
  • RSA bacterial bacterium stys
  • Pholcus spp. Cuba
  • peptide toxins from the venom of scolopenders, Bitis arietans and / or Loxosceles spiniceps are particularly preferred.
  • the use of a peptide toxin from the venom of scolopender centipede species is preferred Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., The snake species Bitis arietans (puff adder), Bitis gabonica (Gabon otter), Bitis nasicomis (rhinoceros viper) and the smaller bitis species B. atropos, B.
  • the peptide toxin is preferably obtained by a fractionation process and it is further preferred that the pharmaceutically active substance is obtained from the poison cocktail of one of the types mentioned.
  • the effectiveness of the pharmaceutical effectiveness of the loading can advantageously be matched to the type and / or size of the tumor to be treated.
  • the peptide toxin can be obtained by fractionation processes known per se for the separation of proteins from the crude animal poison mixture (total poison cocktail). It is preferred that the peptide toxin is obtained by gel chromatography, HPLC, affinity chromatography and / or ion exchange chromatography.
  • the present invention also includes derivatives and salts of the substances provided according to the invention.
  • the peptide toxin can comprise one or more additions, substitutions and / or deletions of amino acids, it must be ensured that the pharmaceutical-medical effect according to the invention is retained.
  • the peptide toxin is present in such an amount for the pharmaceutically effective dose for loading that the peptide toxin is only released in a controlled manner by the dendritic cell.
  • a pharmaceutically effective loading in which the amount of peptide toxin that the dendritic cell can release is subject to a controlled spread in space and time in its cell-destroying effect.
  • the pharmaceutical composition of the load preferably has an amount of peptide toxin which is selected depending on the skin cancer and / or other tumor to be treated.
  • the human spinal cord stem cells are preferably frozen in Eppendorf sample vessels (E-cups) with a capacity of 1 ml. It is preferably a saturated stem cell solution (saline or plasma, maximum 50 microliters). For further processing, preferably 750 microliters of medium (37 degrees Celsius) consisting of 500 mL DMEM-Hatmfs F-12, 50 mL RP 1260, 10 mL penicilin / streptomycin, 5 mL glutamine and 50 mL FBS are added.
  • E-cups Eppendorf sample vessels
  • medium 37 degrees Celsius
  • the suspension diluted in this way is then shaken for 10-15 seconds at the lowest level on the vortex without foaming for homogeneous mixing.
  • the suspension is introduced into a 75 cm 2 cell culture bottle and filled with 20 mL of the same medium (37 degrees Celsius).
  • This cell culture bottle is placed in an incubator set at 37 degrees Celsius. It is preferred to leave the cell culture in the incubator for five days at a constant temperature (37 degrees Celsius).
  • the first visual inspection under the invert microscope to determine whether the spinal cord stem cells have grown to the bottom of the bottle is preferably five days after the cell culture bottle has been placed in the incubator.
  • the medium bottle is held in such a way that as much of the medium as possible is poured out without flushing out the cells that have already grown in place. Possibly. remaining medium is removed by tapping the bottle neck gently on a surface.
  • the medium collected in this way is discarded.
  • the medium change described in this way must be carried out after three or four days until several cell layers have grown over one another and the first cells dissolve into the protruding medium.
  • the growth of the cell culture is checked under the inverted microscope before each medium change.
  • the entire supernatant of approximately 20 mL is subcultured in equal parts in 4 small 25 cm bottles and then filled with medium at 37 degrees Celsius.
  • the growth factor mixture is added in an amount such that a concentration of 900 U / mL GM-CSF and IL-4 and 700 U / mL sIL-4R (eg from Biochrom) is achieved becomes. A temperature of 37 degrees Celsius is preferred.
  • the growth factor mixture is added using a sterile 2 mL pipette.
  • the cell culture bottle is easily swiveled manually without detaching the cells from the bottom.
  • the cell culture flask is stored in the incubator at 37 degrees Celsius for at least 24 hours.
  • the first visual inspection under the invert microscope is carried out to determine whether dendritic cells have already differentiated, and then using a glass pasteur pipette with the least possible medium in a new bottle (25 cm 2 ) each day under the most sterile conditions medium (2 ml) warmed to 37 degrees Celsius until no new dendritic cells form in the original bottle.
  • the medium change for the dendritic cells collected in the new cell culture bottle is preferably carried out in such a way that the old medium is aspirated down to 1 ml with a glass Pasteur pipette under the most sterile conditions, without also sucking off dendritic cells and then with 4 ml of new, 37 degrees Celsius medium is filled.
  • This medium change is then carried out every three or four days in the manner described.
  • the dendritic cells recognize genetically defective cells in the body, dock on to them and release the added active substance into the sick cell. The additional effect the targeted destruction of the degenerated cell via the cytotoxic effect.
  • dendritic cells are able to pass on information about tumor events (by recognizing cytokines), but also information about tumor-destroying substances to T cells.
  • the "informed" T cells are called killer cells.
  • the advantage here is that the dendritic cells are able to recognize genetically defective cells, bring the enclosed charge to the site of action and prevent the formation of daughter ulcers.
  • arthropod venom The main components of arthropod venom are:
  • RSA bacterial swine spp.
  • Cuba Pholcus spp.
  • peptide toxins from the poison of scolopenders, Bitis arietans and / or Loxosceles spiniceps being particularly preferred.
  • the total poison cocktail cannot yet be used pharmaceutically due to the large number of individual substances contained and its resulting complex effects in the body. Used as a defense poison by the animals, the bitten person suffers from the following symptoms: Scolopenders of the genera Scolopendra and Hemiscolopendra:
  • the poison Due to its large mouthparts, the bite of animals up to 30 cm long is always felt. There are no general observations of the poisonous effects of giant centipedes (scolopenders). In any case, the poison is very effective for small mammals. For example, the content of one poison gland is enough to kill 25 mice weighing approx. 20 gr. Within 7 hours. The poison has a strong effect on the nervous system, which leads to the following symptoms: acceleration of the breath, sweating, balance problems, vomiting, respiratory paralysis, cramps until death. There are no recent works on chemistry, biochemistry and toxicology of poisons (Habermehl G. (1987): Poison animals and their weapons. Springer-Verlag, Berlin, 4th and subsequent editions).
  • the bite itself is perceived by the bitten by the force with which the snake hits.
  • a special feature is the ability of the spitting cobras, which can use their teeth to spray the poison in a targeted manner up to 5 meters onto their victim using compressed air.
  • the spitting cobras With the bite, immediate pain sets in through the release of poison. Soon after, the poison begins to break down its tissue. First there is the local necrotic effect, in which the skin layers are lysed. Then, with the help of the permeability-increasing enzymes, the poison spreads over a large area in the tissue surrounding the bite site. With the exception of the skeleton, all tissue components can be destroyed via necrosis. If the bite occurs in an extremity, an amputation must be weighed depending on the situation. In addition to the tissue-destroying poisons, depending on the type, there are also neurotoxins or cardiotoxins, which are primarily responsible for the pain and circulatory instability. In the case of fatal bite accidents, blood poisoning and kidney failure come first.
  • the sting causes severe pain at the sting point due to the neurotoxins contained in the poison cocktail, which is similar to the pain of a burn. After a while, the pain is relieved by a tingling sensation which ultimately a numbness passes.
  • the general symptoms can appear after 5 minutes, but sometimes only 24 hours after the sting.
  • the prick is excited, children occasionally have cramps; Reflexes are reduced to a minimum or disappear entirely. Awareness remains, with severe anxiety often occurring. This is followed by lacrimation and dilation of the pupils while reducing eyesight.
  • the pulse is accelerated and irregular. Blood pressure can be both raised and lowered. Body temperature fluctuates widely, with hypothermia indicating deterioration in the patient's condition. The breath is irregular.
  • Vomiting is a serious sign that nerve centers are also affected. Death occurs mainly through respiratory paralysis, usually within 20 hours, less often within 30 hours (Habermehl G. (1987): Poison animals and their weapons. Springer-Verlag, Berlin, 4th and subsequent editions).
  • the bite of spiders of the genus Dysdera is usually perceived painfully due to their jaw size and position. After a few minutes, the bite will turn red-brown and blister. Over the next few hours, the skin around the bite will loosen up to about 2 cm in size. An open wound forms, which often does not heal for weeks without treatment. Accompanying symptoms are shortness of breath and cardiac rhythm. There are no known deaths.
  • the bite itself is not felt by the bitten person.
  • the bite site swells very strongly after 2 to 5 hours, the swelling being accompanied by severe pain.
  • the bite parts turn dark red and bubbles form.
  • the tissue turns black and skin cells die. This leaves a hole in the skin, which can be up to 5 cm in diameter.
  • the healing can take up to 2 years, whereby a skin graft may be necessary in some cases.
  • haemolytic anemia and haematuria associated with sensory disorders.
  • the body temperature can rise to 41 degrees Celsius, although in severe cases a coma can occur.
  • the bite is not felt here either. After about 2 hours, the bite site is clearly red and wet. In the course of the next few hours, the skin layer around the bite site will dissolve to a size of 3 cm. An open wound forms that does not heal for up to 3 months without treatment. Without treatment, wound healing takes place with severe scarring. One form of treatment is e.g. in a skin graft. Accompanying symptoms manifest themselves in circulatory instability. There are no known deaths.
  • RSA melanoma cells
  • Cuba Pholcus spp.
  • the destruction of melanoma cells and / or of tumor tissue not recorded during the operation can be carried out by detecting, unmasking and the targeted elimination of the genetically defective cells.
  • genetically defective body cells tumor cells
  • tumor cells can be destroyed in the therapy, since the surface protein structure and the dendritic cells loaded with peptide toxin, according to the invention, can recognize and destroy these cells whose surface structure has been changed.
  • tumor cells release specific messenger substances, so-called tumor markers, to which the dendritic cells loaded with peptide toxin react and then destroy the tumor cells.
  • DC Dendritic Cells
  • Spiders and some scolopenders typically around 100 kDa, have a tissue-destroying effect, including a skin-cell-destroying effect. Because of their high molecular weight and their spatial structure they have in tissues without the help of so-called
  • Penetration enzymes have a low tendency to spread.
  • Dendritic cells are preferably produced and isolated from spinal cord stem cells using a growth factor mixture (GM-CSF / IL-4, preferably in combination with the interleukin receptor sIL-4R) because of their similarity.
  • GM-CSF / IL-4 a growth factor mixture
  • IL-4R interleukin receptor
  • the dendritic cells obtained in this way are preferably obtained from the toxins of the Scolopender centipede species Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., The snake species Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicom the smaller bitis species B. atropos, B. caudalis, B.
  • the mode of action of the dendritic cells loaded with peptide toxins can be tested by testing them in corresponding healthy and tumorous human cell lines.
  • the toxic substances, or the peptide toxin with which the dendritic cells are loaded come from the venom of scolopenders of the Scolopendridae family, snakes of the Viperidae family, snakes of the Elapidae family, spiders of the Sicariidae family (according to the invention also belong to the Sicariidae family) Sicarius also the genera Loxosceles and Scytodes), spiders of the family Pholcidae, scorpions of the family Buthidae.
  • Scolopendra and Hemiscolopendra are preferred.
  • the Scolopendra and Hemiscolopendra are preferred.
  • the Scolopendra and Hemiscolopendra are preferred.
  • the Scolopendra and Hemiscolopendra are preferred.
  • Parabuthus scorpion species Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus and Parabuthus villosus are used with particular preference in the genus Parabuthus.
  • the other species can also be used among the spiders of the genus Loxosceles.
  • scolopenders of the genus Scolopendra and Hemiscolopendra all types with a body length of 10 cm or more can be used according to the invention.
  • snakes of the Bitis genus all dwarf puff adder types can also be used according to the invention.
  • the Asian spitting cobra Naja naja atra can also be used among the snakes of the genus Naja.
  • all Central African species can also be used among the scorpions of the genus Parabuthus.
  • scorpions of the genera Opistophthalmus, Androctonus and Nebo can be used according to the invention.
  • the pharmaceutically effective loading of dendritic cells according to the invention can be produced in such a way that a peptide toxin is injected under a microscope directly into a dendritic cell via a microcapillary, and these cells are then returned to the culture bottle. With this imprint, the dendritic cell already loaded with this peptide toxin can pass on its information about the absorption of a cell poison to the other dendritic cells. As a result, a solution of this peptide toxin used can be added to the medium after about 72 hours. After a further 48 hours, the dendritic cells have taken up a certain amount of the peptide toxin which is dependent on the peptide toxin and the dendritic cells.
  • the preparation can also be carried out by inoculating a culture of dendritic cells, in which skin cancer cells are also found, with a peptide toxin, which destroys the skin cancer cells, directly into the culture bottle. Because the poison destroys intact cancer cells, certain markers are released during tumor cell degradation, which indicate to the dendritic cells that the tumor cell destruction can be carried out more effectively with the aid of the peptide toxin, the adaptation of the dendritic cells with the active substances via the addition of phenyl-gal -Nac can be increased quantitatively.
  • the aim of the manufacturing process is to achieve the highest possible quantitative loading of the dendritic cells with this peptide toxin. A determination of the concentration in the cell is currently not possible or only possible with great difficulty.
  • the medium concentrations of the substance to be loaded are in the last However, depending on the toxin used, the incubation step usually ranges from approx. 0.5 ⁇ g / ml to 250 ⁇ g / ml.
  • the crude animal venom mixture can preferably be obtained in such a way that it is obtained from the arachnids and scolopenders by methods known per se and the crude animal venom mixture is fractionated by fractionation methods, likewise known per se, for the separation of proteins in order to destroy the peptide toxins and / or the other cell-destroying cells to obtain active substances in as separate a form as possible in separate fractions.
  • Individual fractions are preferably used to produce a pharmaceutically effective loading of dendritic cells.
  • Snake poisons which have a line-destroying action, e.g. the cobra snake venom Najatoxin-S can be used to load the dendritic cells used for therapy.
  • the above-mentioned poison cocktail which is obtained by manual milking
  • Animal species can be obtained, e.g. by column chromatographic purification, specific poison components (necrotic and cytotoxic peptide toxins) are selected.
  • the analysis for differentiating the components contained in the fractions can be carried out via HPLC-MS-MS (e.g. with a device from Perkin-Elmer). It could be demonstrated that some of the high molecular weight substances are peptide toxins through the representation of toxic groups of the NX-NHX-NOX and SX type. This is confirmed by their mode of action in cell experiments.
  • the substances used according to the invention for the pharmaceutically effective loading can be obtained naturally. These are poisons produced by giant centipedes of the genera Scolopendra and Hemiscolopendra, by snakes of the genera Bitis and Naja, by spiders of the genera Loxosceles, Sicarius and Pholcus and by scorpions of the genus Parabuthus, which were originally developed for prey capture and for the pre-digestion of animal proteins .
  • This natural mode of action can be obtained by a function-preserving, gentle extraction of the basic toxic substance (eg by manual milking).
  • an electrical process Weickmann D. (1991): Posture and toxicity of Sicariidae.
  • the poison cocktail is obtained via a manual process in which the animals are stimulated to release their poison using their natural defense behavior.
  • arachnid venom contains substances or molecules which have been restructured by the flow of electrons and which may have changed their mode of action or which may also contain substances in the poisons that the animal would otherwise not release would, while with the giant centipedes no poison is released by the conventional electric milking methods.
  • the substances additionally released from the arachnids by electric milking can, but do not necessarily have to adversely affect the medical effectiveness of the individual compounds contained in the total poison cocktail.
  • quality control of the raw venom can be carried out using electrophoretic processes.
  • Fig. 1 shows an SDS-PAGE of total poison cocktails from scorpions, which were obtained in manual and electric milking;
  • Lanes from left to right molecular weight standard; Androctonus anst. hector, mechanical milking, electric milking; Nebo hierichonticus, mechanical milking, electric milking; Opistophthalmus sp., Mechanical milking, electric milking. Examples
  • Snakes of the genera Bitis and Naja from a body length of about 50 cm are used for milking.
  • the snakes are fixed behind the head with a firm grip and the body is placed over the arm. Then you let the snake bite through a film that is stretched over a beaker. Or you can gently bite the snake to be milked directly on the edge of a beaker or an evaporation bowl.
  • poison is released, which accumulates on the bottom of the cup.
  • the poison collected in this way is dried in an exicator.
  • the dried poison can be stored at plus 4 degrees Celsius for several years.
  • a new syringe with a new cannula is used for each animal.
  • the cannula is then closed again with the cannula protective cover.
  • the sealed syringe and the drawn-up poison are then immediately placed in a desiccator. This is then kept in a freezer at least minus 14 degrees Celsius for at least 12 hours.
  • the frozen total poison is removed from the freezer in 1 mL solvent, e.g. protein solvent from Carl Roth GmbH & Co, KG (solvent for protein column chromatography: 0.25 M Tris / HCl, pH 6.5 to 7.3, 1 , 92 M Glycine, in distilled, deionized water (due to denaturation, no SDS is used in the buffer).
  • solvent e.g. protein solvent from Carl Roth GmbH & Co, KG
  • solvent for protein column chromatography 0.25 M Tris / HCl, pH 6.5 to 7.3, 1 , 92 M Glycine
  • the individual poison solutions of the respective species prepared in this way can be collected in a sterile, clean tefion vial at room temperature.
  • the sealed tefion vial is then shaken on a vortex without foaming for 30 seconds to obtain a homogeneous solution.
  • the entire solution is passed through a plexiglass funnel (to avoid contamination) into a standing transparent plexiglass column, which has an inner diameter of 1.5 cm, a wall thickness of 2 mm and a height of 50 cm, and is conical down to 1 , 5 mm tapered, open, filled with 20 mL gel (Sigma Supelco, AcA 34; matrix: 3% acrylamide / 4% agarose; fractionation range (MW): proteins: 20 to 350 kDa; cut-off limit 750 kDa; bead diameter: 60 to 140 microns).
  • the poison solution thus introduced runs through the gel and displaces the buffer in the gel.
  • an additional 150 mL of solvent (0.25 M Tris / HCl, pH 6.5 to 7.3; 1.92 M glycine) are applied to the column. This additional solvent displaces the poison solution contained in it as it passes through the gel.
  • the first 15 mL that run out of the bottom of the column are residual buffers and are discarded. After these 15 mL, up to 30 fractions of 4 mL each are collected, depending on the animal species. The separation into 4 mL is due to the physical and chemical properties of the individual fractions, proven by electrophoresis, preferably SDS-PAGE.
  • Roti Load 1 + 2 (Carl Roth GmbH & Co, KG, Düsseldorf: SDS, glycerol, bromophenol blue, phosphate buffer, Roti Load 1 with mercaptoethanol, Roti Load 2 without mercaptoethanol) are used as application buffers for peptide binding and protein protection.
  • the individual fractions are collected separately in sterile, screwable 5 mL Teflon vials. The quality of the individual fractions is checked by electrophoresis.
  • the skin cell lysing effect of the fractions was determined by testing the individual fractions from the total poison cocktail of the respective animal species in a test on human living cells in high to overdosed amounts (approx. 200 to 500 ⁇ g / ml of medium used). Those peptide toxins which destroyed both healthy skin cells, preferably skin fibroblasts of different biology, and degenerated skin cells, preferably 2 lines of malignant melanoma, were used to load dendritic cells. Those peptide toxins which did not only damage skin cells and other cells (eg breast tissue cells and liver cells) and in some cases even lysed were disregarded. In the case of Sicarius, peptide toxins were obtained in fractions 1-12. These fractions contained peptide toxins in a molecular weight range from approximately 72 to approximately 168 kDa. A skin cell lysing, in particular malignant melanoma cell lysing peptide toxin is contained in fraction 10.
  • the dendritic cells For the pharmaceutically therapeutically effective loading of the dendritic cells according to the invention, e.g. individual skin cell lysing fractions of animal toxins are used. These fractions contained animal toxin protein components in a molecular weight range of approximately 50 to 350 kDa or non-protein toxins with at least one amido group in a molecular weight range of approximately 30-55 kDa.
  • An SDS-PAGE of the total poison cocktail of scorpions is shown in FIG. 1.
  • the respective fractions are e.g. via HPLC-MS-MS and DAD-UV spectrometry (DAD or DADI: Direct Analysis of Daughter Ions, direct analysis of daughter ions).
  • DAD or DADI: Direct Analysis of Daughter Ions, direct analysis of daughter ions No known substances could be represented in the higher molecular weight range from 10,000.
  • the basic framework determinations indicate that some of the substances belong to at least one type of polypeptide with toxic components, that is to say polypeptide toxins. However, toxins with a molecular weight of 30-55 kDa, which have no protein structure, were also determined.
  • Fractions with the same composition can be collected together.
  • the individual fractions are freeze-dried for further processing and storage, for example with the following parameters:
  • the fraction to be lyophilized is cooled in an open tefion vial loosely covered with perforated aluminum foil to minus 22 degrees Celsius.
  • a cooling time of 11 hours is observed (at least 20 hours for scolope poison).
  • a vacuum of 0.200 mbar is then applied. After the vacuum has been reached, the fraction is heated to plus 4 degrees Celsius and kept at this temperature for at least 24 hours while maintaining the vacuum.
  • the tefionvial is screwed airtight with the lyophilized fraction.
  • the storage time is approx. 3 months at room temperature (4 weeks for scolopendic poisons), approx. 1 year at plus 7 degrees Celsius (scolopendic poisons are only stable for about 5 months at this temperature) and approx. 5 at minus 14 degrees Celsius Years (scolope poison should be stored at minus 80 degrees Celsius if stored for a long time).
  • 3-5 ml of a culture of dendritic cells (2.5 to 15 million dendritic cells / 5 ml), prepared by the method described above in this invention, were treated with 0.5 to 2.5 ml of a skin cancer cell solution (supernatant of a freshly patted pure human skin cancer cell culture bottle with about 250,000 cuticle cells / mL cell medium, medium: 500 mL DMEM-Ham's F-12, 10 mL penicillin / streptomycin, 5 mL glutamine and 50 mL FBS). Then 1 to 2 mL of a solution containing about 150 ⁇ g / mL peptide toxin from fraction 3 from Loxosceles spiniceps were added.
  • a skin cancer cell solution supernatant of a freshly patted pure human skin cancer cell culture bottle with about 250,000 cuticle cells / mL cell medium, medium: 500 mL DMEM-Ham's F-12, 10 mL penicillin / streptomycin
  • the dendritic cells loaded with the above-mentioned toxins are collected / enriched, so that a "saturated" solution of dendritic cells loaded with toxins is formed.
  • a culture of healthy tissue and skin tumor cells cell culture: malignant melanoma: cells identified as safe, obtained from the patient after consultation with the patient, also since 1995 as a long-term and subculture
  • the effects of different poisons were then with which the dendritic cells are loaded.
  • the tumor cell areas (malignant melanoma cells) were 4 mm in diameter and about 1-2 mm thick.
  • Loaded dendritic cells were added directly to the medium (500 DMEM-Ham's F-12, 10 mL penicilin / streptomycin; 5 mL glutamine and 50 mL FBS), whereby all tumor cell areas were attacked, but the procedure took the longest and was repeated after 3 weeks had to become.
  • the dendritic cells can be worked very selectively, but many dendritic cells die in the process. It was found to be most effective to inject the toxin-loaded cells directly onto the tumor margin, so that the dendritic cells, by their nature, can first destroy the biologically active tumor area.
  • the lysed tumor cells are digested (partly by macrophages). In all of the animal poisons examined, the lysed cell areas grew again with healthy cells. In this example the effects of the following poisons were examined:
  • the dendritic cells introduced the above-mentioned toxic substances to the degenerated liver tumor cells and always led to the destruction of the degenerated, tumorous liver cells.
  • the experimental set-up and the procedure was as described under number 4 above, with a mixed culture of liver cells and liver tumor cells (both liver primary tumor cells and liver metastasis cells) being used instead of the skin and melanoma cells.
  • the dendritic cells loaded with the liver cell-destroying poisons were also added to the mixed tissue cultures as described in section 4.

Abstract

Die Erfindung beschreibt mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen, wobei die toxischen Substanzen ausgewählt sind aus dem Gift von Scolopendern der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra, Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, Spinnen der Gattungen Loxosceles, Sicarius und Pholcus und Dysdera sowie Skorpionen der Gattung Parabuthus und einer Kombination aus einem oder mehreren dieser Toxine.

Description

MIT TOXISCHEN SUBSTANZEN BELADENE DENDRITISCHE
ZELLEN
Die Erfindung betrifft mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung dieser dendritischen Zellen zur Behandlung von Tumoren, insbesondere zur Therapie von Tumoren der Schleimhaut und der Haut.
Stand der Technik:
Unter Hautkrebs versteht man an der Haut, seltener an der Schleimhaut vorkommende Tumore. Die bösartigen Tumore bezeichnet man als Hautcarzinome bzw. Melanome. Die Primärtumore sind in der Haut manifestiert und an der Hautoberfläche als pigmentierte Flächen zu erkennen (Neronesi U., Cascinelli Ν., Santinami M. (1987): Cutaneous Melanoma. Status of Knowledge and Future Perspective. London Orlando San Diego New York Austin Boston Sidney Tokyo Toronto: Academic Press). Um sie von Muttermalen, mit denen sie häufig auf Grund ihres Aussehens verwechselt werden, zu unterscheiden, ist eine Gewebeentnahme und in vielen Fällen Anzucht in Gewebekultur erforderlich. Das aggressivste unter den bekannten Neoplasien ist das maligne Melanom, das auch oft "Schwarzer Krebs", genannt wird. Ein Problem bei dieser Erkrankung betrifft seine extrem metastatische Ausbreitung, die vor keiner Organgrenze stoppt.
Die folgenden Therapien werden momentan bevorzugt:
Operative Entfernung:
Das gängigste Verfahren stellt derzeit die operative Entfernung des Hautkrebses dar. Wegen der Tiefe bzw. der Streuung des Hautkrebses ist eine ausreichende Dissektion des
Hautkrebses nicht möglich. Daher wird oftmals eine Kombination mit anderen
Therapieformen versucht (Voigt H. (1996): 150 Fragen und Anworten zum malignen
Melanom. Zuckerschwerdt Verlag, München).
Nachteile:
Stationärer Aufenthalt und/oder Narkose, Wundheilung und Narbenbildung.
Strahlentherapie:
Heutzutage wird die Strahlentherapie mit abnehmender Bedeutung bei Hautkrebs hauptsächlich nur noch zur Lymphknoten- und Hautkrebsmetastasenbehandlung eingesetzt.
Die Bestrahlung erfolgt mit ionisierender Strahlung; üblicherweise verwendet man
Elektronen-, Gamma-, Neutronen- oder Röntgenstrahlen (Zetkin/Schaldach: Lexikon der
Medizin, 16. Auflage 1999, Seite 1922/1923 Ullstein Medical).
Nachteil der Bestrahlung ist, dass ähnlich wie bei der Chemotherapie eine räumliche Begrenzung nicht möglich ist. Durch die Strahlungshärte werden auch gesunde Zellen nachhaltig geschädigt, vor allem die DNA. Da Krebszellen sich meist schneller als gesunde Zellen teilen, werden die Krebszellen unter normalen Umständen bei der Strahlentherapie als erstes abgetötet. Allerdings besteht dabei die Gefahr eines Strahlenulkuses (Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch 256, Auflage 1990, Seite 1602).
Chemotherapie:
Bei der Chemotherapie gilt, dass vor allem metastasierende Melanome kaum chemoresponsiv sind. Eine Monotherapie mit Zytostatika ist in aller Regel nicht ausreichend, so dass vor allem Polychemotherapien angewendet werden. Es sind vor allem nachfolgende Substanzen, die eine Anwendung finden:
Dacarbazin (DTIC) Cisplatin (CDDP) Carboplatin (CBDCA) Ifosfamid IFO) Fotemustin
Bendamustin
CCNU
BCNU
Methyl-CCNU
Cyclophosphamid (CPA)
Vindesin (DVA bzw. VDS)
Vinblastin (VBL)
Vincristin (VCR)
Procarbazin (PBZ)
Mitomycin (MMC)
Die Anwendung dieser Substanzen erfolgt in den nachfolgenden Therapieprotokollen, welche die derzeit wirksamsten darstellen:
Bleomycin + Vincristin + CCNU + Dacarbazin (BOLD-Protokoll)
BCNU + Cisplatin + Dacarbazin + Tamoxifen (+ Interleukin -2/Interferon- alfa)
Cisplatin + Vinblastin + Bleomycin (CVB-Protokoll)
Cisplatin + Vindesin + Dacarbazin (CVD-Protokoll)
BCNU + Hydroxyurea + Dacarbazin (BHD-Protokoll)
Dacarbazin + Vincristin + BCNU (DVB-Protokoll)
Cisplatin + Ifosfamid
Fotemustin + Interferon-alfa
- Voigt H. (1996): 150 Fragen und Anworten zum malignen Melanom.
Zuckerschwerdt Verlag, München -
Neben den positiven Wirkungen gegen die genetisch defekten Zellen weisen die genannten Chemotherapien leider auch viele Nebenwirkungen und Nachteile auf.
Nachteile der Chemotherapie sind, dass diese auf Grund ihrer chemischen Struktur nur schwer gezielt einzusetzen sind; diese Zytostatika äußerst agressive Zellgifte sind, die neben Tumorgewebe auch im großen Maße gesundes Gewebe, einschließlich Leber- und Nierenzellen schädigen. Die auftretenden Nebenwirkungen, wie z.B. Haarausfall, Schwindel, Erbrechen, Magen-Darmblutungen, Kreislaufbeschwerden u.a., sind wegen der systemischen Ausbreitung der Zytostatika nur schwer abzuwägen ( Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ Heidelberg - Focus 19/1995).
Diese zahlreichen, gefährlichen und unerwünschten Nebenwirkungen erklären sich vor allem aus der Regenerationshemmung schnell proliferierender Gewebe und betreffen insbesonders das blutbildende System, die Epithelien der Schleimhäute und der Gonaden sowie die Haut und Hautanhangsgebilde. Unter den lebensbedrohlichen Komplikationen stehen Infektionen an erster Stelle gefolgt von Blutungen. (Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch 256. Auflage 1990, Seite 1866)
Zy tokinb ehandlung :
Hauptsächlich versucht man hier die bislang nur für Indikationen von Kaposi-Sarkom und Haarzellleukämien zugelassenen Interferon -Therapien anzuwenden. Interferon gehört zu den aktiv gegen entartete Zellen wirksamen Zytokinen. Die Wirkweise basiert auf der Erkennung von Oberflächenproteinen von Krebszellen und deren Zerstörung. Zu den Nachteilen der Interferontherapie gehören Fieber, Anorexie-Nausea-Emeses- Syndrom, Abgeschlagenheit, Kopfdruck, Kopfschmerzen, Gelenkschmerzen, Schwindel, Leberenzymerhöhung, Pruritus, IFN-Antikörperbildung, Kreislaufund Blutdruckprobleme (DeVita jr. VT., Hellman S., Rosenberg SA. (1991): Biologie Therapy of Cancer. Philadelphia: J. B. Lippincott Co.).
Antikörp er ther apie :
Neben der Interferontherapie setzt man bei den Immuntherapien bei der Behandlung vor allem auf den Einsatz von monoklonalen Antikörpern.
Dazu werden nach einem Verfahren von Köhler und Millstein gezüchtete Myelomzellen mit Nagerlymphozyten fusioniert, welche mit menschlichen antigenen Melanomzellmaterial bzw. Membranfraktionen aus Melanomzellen immunisiert wurden. Dabei entstehen in fast unbegrenzter Menge monoklonale Antikörper aus Melanomzellen. Die Antikörper werden dann injiziert und finden dann auf natürlichem Wege über Immunmodulatoren die Hautkrebszellen und zerstören diese. Nebenwirkungen sind nicht bekannt, da es sich um körpereigene Stoffe handelt , so dass auch keine Immunschockreaktionen auftreten. Der Nachteil bei dieser Therapieform ist jedoch die geringe Sensitivität auf Hautkrebszellen (Voigt H. (1996): 150 Fragen und Anworten zum malignen Melanom. Zuckerschwerdt Verlag, München / Ibelgaufts H. (1992): Lexikon Zytokine. Medikon München).
Therapie mit dendritischen Zellen:
Seit ca. 1995 erforscht man intensiv die Möglichkeit des Einsatzes von körpereigenen dendritischen Zellen bei der Behandlung von Hautkrebs. Dazu werden aus Rückenmark- und/oder Blutstammzellen des Patienten dendritische Zellen in vitro gezüchtet, die dann, wenn sie einen Mindesttitter erreicht haben, dem Patienten wieder geimpft werden. Die dendritischen Zellen suchen und finden aktiv Tumorzellen und greifen diese mit zellzerstörenden Stoffen an. Hierbei ist der geringe Wirkungsgrad der Hauptnachteil, sodass man versucht, die dendritische Zelle mit körpereigenen menschlichen Zytokinen und/oder Peptiden (z.B. Anaphylatoxine C3a, C4a u.a. ) zu beladen (Kirchner H., Kruse A., Neustock P., Rink L. (1994): Cytokine und Interferone. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg). Leider reicht bei den gefundenen Stoffen die Spezivität oft nicht zur vollständigen Abtötung der Tumorzellen aus.
Aus der Publikation des Journal of Investigative Dermatology (Jan. 2000), Band 114, No. 1, Seite 234, Referat nr. 47 ist die Verwendung von Choleratoxin als Adjuvans bei Versuchstieren bekannt. Die toxische Untereinheit des Choleratoxins (CTA) wurde von der CTB-Untereinheit, die für die Bindung des Choleratoxins an die Zellmembran verantwortlich ist, abgetrennt, um mit Hilfe dieser CTB-Untereinheit eine humorale Immunantwort zu induzieren. Die erfmdungsgemäße Beladung dendritischer Zellen mit toxischen Substanzen, insbesondere mit den in Anspruch 1 genannten, wird hierdurch nicht vorweggenommen oder nahegelegt. Die Toxine werden in der Erfindung nicht als Adjuvansien eingesetzt, sondern um mit Hilfe der dendritischen Zellen die toxischen Substanzen an die Tumorzellen gezielt heranzuführen.
Aufgabe dieser Erfindung ist daher die Bereitstellung verbesserter Mittel für die Therapie von Tumorerkrankungen, die mittels dendritischer Zellen angreifbar sind. Diese Aufgabe wird erfmdungsgemäß durch die Beladung von dendritischen Zellen mit toxischen Substanzen erreicht, wobei die toxischen Substanzen aus dem Gift von Scolopendern der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra, Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, Spinnen der Gattungen Loxosceles, Sicarius und Pholcus und Dysdera sowie Skorpionen der Gattung Parabuthus und einer Kombination aus einem oder mehreren dieser Toxine ausgewählt sind.
Derart beladene dendritische Zellen sind zur Therapie von Tumorerkrankungen, insbesondere zur Therapie von Hautkrebs und Schleimhauttumoren, einsetzbar. Die dendritischen Zellen können als alleinige Therapie, aber auch als Begleittherapie ohne die Gefahr der Nachteile des derzeitigen Standes der Technik eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung näher beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nachfolgende Beschreibung und die Ausführungsbeispiele beschränkt. Der Fachmann kann die Erfindung auf Grundlage der beiliegenden Patentansprüche unter Berücksichtigung der Beschreibung abwandeln, ohne den Schutzbereich der beiliegenden Ansprüche zu verlassen.
Die Beladung der dendritischen Zellen erfolgt mit einer und/oder mehreren toxischen Substanzen aus dem Gift von Skolopendern der Gattungen Scolopendra und/oder Hemiscolopendra, Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, sowie Skorpionen der Gattung Parabuthus und/oder Spinnen der Gattung Loxosceles, Sicarius und Pholcus, in einer pharmazeutisch und therapeutisch wirksamen Menge. Es ist aber auch möglich, eine Kombination von mindestens zwei dieser toxischen Substanzen aus den Giften einzusetzen.
Das Gift der oben genannten Tiere enthält einen ganzen Cocktail von Verbindungen, wozu nicht nur Peptidtoxine gehören, sondern auch Toxine mit einer Amidogruppe, die jedoch keine Proteinstruktur aufweisen und beispielsweise ein Molekulargewicht von 30-55 kDa aufweisen. Weiterhin gehören zum Giftcocktail antagonistisch wirkende Substanzen, die eine räumliche und zeitliche kontrollierte Ausbreitung der vom Tier abgegebenen Gifte sicherstellen.
Bei den Toxinen handelt es sich bevorzugt um Peptidtoxine. Die Toxine weisen im allgemeinen nekrotische, cytotoxische und oder apoptotische Eigenschaften auf. Die Toxine können durch an sich bekannte Verfahren aus dem Giftcocktail der Tiere isoliert werden. Da dies jedoch mühsam ist, hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß nach einer Fraktionierung des Giftcocktails auch einzelne, die Toxine enthaltenden Fraktionen zur Beladung der dendritischen Zellen einsetzbar sind. In diesen Fraktionen liegen die Toxine zusammen mit weiteren Substanzen vor. Da die Fraktionen jedoch so ausgewählt werden, daß sie insbesondere die zelltoxisch, apoptotisch und/oder nekrotisch wirkenden Substanzen enthalten, ist eine Aufreinigung der Toxine bis zur vollständigen Reinheit nicht zwingend notwendig. Falls dies jedoch erfolgt ist und beispielsweise auch die Struktur der Toxine bekannt ist, könnten diese nicht nur in isolierter, reiner Form, sondern auch in rekombmanter Form eingesetzt werden, wenn es sich um die Peptidtoxine handelt. Die Peptidtoxine besitzen im allgemeinen ein Molekulargewicht im Bereich von 50-350 kDa, bevorzugt ein Molekulargewicht von ca. 100 kDa. Die Toxine können auch synthetisch hergestellt werden, und es sind selbstverständlich auch Abwandlungen der in den genannten Tierarten vorhandenen und erfindungs gemäß zur Beladung der dendritischen Zellen eingesetzten Toxine möglich, also Derivate, die durch chemische Modifikation der Toxine erhalten wurden. Bei den Peptidtoxinen sind unter Derivate u.a. solche Toxine zu verstehen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren hinzugeführt, deletiert und/oder durch andere Aminosäuren ausgetauscht wurden, wobei natürlich jeweils die toxischen Eigenschaften erhalten bleiben. Es sei darauf hingewiesen, daß ein Toxin nicht nur cytotoxische, sondern auch nekrotische und/oder apoptotische Eigenschaften in sich vereinigen kann.
Die mit den toxischen Substanzen beladenen dendritischen Zellen können zur gezielten Therapie von Tumoren eingesetzt werden. Demzufolge weisen die Toxine zellzerstörende Eigenschaften auf. Da die dendritischen Zellen aktiv Tumorzellen suchen und finden und diese mit zeilzerstörenden Stoffen angreifen, werden die toxischen Substanzen so ausgewählt, daß sie zellzerstörende, d.h. cytotoxische, nekrotische und/oder apoptotische Eigenschaften aufweisen. Gerade derartige Substanzen liegen in den Giftcocktails der im Anspruch 1 genannten Tiergattungen vor. Sie eignen sich deshalb in hervorragender Weise zur Therapie von Tumoren, insbesondere zur Therapie von Tumoren der Haut und der Schleimhäute. Es ist aber auch möglich, die derart beladenen dendritischen Zellen mit weiteren, für die Tumortherapie einsetzbaren Substanzen zu beladen, beispielsweise mit Cytokinen, Cytokin-Rezeptoren, Anaphylatoxinen, Interferonen, Antikörpern, Glykosiden usw.
Die Beladung erfolgt beispielsweise durch direkte Injektion der toxischen Substanzen in die Zelle, durch Inkubation der dendritischen Zellen mit den toxischen Substanzen oder durch Lipofektion. Ursprünglich handelte es sich hierbei um eine Technik zur Transformation von Zellen mit fremder DNA oder RNA. Effektivitätssteigerung wird dadurch erreicht, daß an Liposomen Antikörper, Proteine, Glykolipide u.a. geknüpft werden, wobei zielgerichtet die Interaktionen von Liposomen und Zelloberflächen beeinflußt werden. Dadurch können die Peptidtoxine oder Zytokine als "zelleigen" erkannt werden und bei den "normalen" Stoffwechselfunktionen in die dendritischen Zellen eingeschleust werden [Herder (1995): Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie, Band 2. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg].
Ein weiteres Verfahren zur Beladung ist die Laser-Mikroinjektion. Dabei werden dendritische Zellen, die in einem die toxischen Substanzen enthaltenden Medium vorliegen, für kurze Zeit mit einem stark fokussierten Laserstrahl behandelt, so daß ein Loch in der Zellwand entsteht, durch welches das umgebende Medium in die Zelle eindringen kann. Die diesem Verfahren zugrunde liegende Technik der Mikromanipulation von Zellen oder Zellenverbänden ist bspw. in Schütze K. et al.; Nature Biotechnolgy, 16,8: 737-742 (1998), Schütze K. et al.; J. Cell. Mol. Biol., 44,5: 735-746 (1998), Böhm M. et al; Americ. J. Pathology; 151,1: 63-67, Ponten F. et al.; Mutation Research Genomics, 382: 45-55 (1997), Bernsen M. et al.; Lab. Invest. 78: 1267-1273 (1998) oder Fink L. et al; Nat. Medicine. 4,11: 1329-1333 (1998) beschrieben.
Bevorzugt ist es, wenn das Peptidtoxin, mit dem die dendritische Zelle beladen wird, und/oder die wahlweise weiteren enthaltenen Substanzen aus dem Gift der Skolopender- Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashornviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles- Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und/oder der Zitterspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba) stammen, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn das Peptidtoxin und/oder die wahlweise weiteren Substanzen aus dem Gift von Skolopendern, Bitis arietans und/oder Loxosceles spiniceps stammen. Dies hat den Vorteil, dass bei der Substanz die von der Natur vorgegebene haut- und/oder gewebezersetzende Wirkung ausgenutzt werden kann. Dabei ist bevorzugt, dass das Tiergiftrohgemisch aus männlichen und/oder weiblichen Skolopendern der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra ab ca. 15 cm Körperlänge, männlichen und/oder weiblichen Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, bevorzugt ab einer Körperlänge von 50 cm, weiblichen subadulten und/oder adulten Skorpionen der Gattung Parabuthus, und/oder aus weiblichen subadulten oder adulten Spinnen der Gattung Loxosceles und oder Pholcus und/oder Sicarius gewonnen wird. Dies ist vorteilhaft, da weibliche Spinnentiere der Gattungen Parabuthus, Loxosceles, Pholcus und Sicarius mehr Gift produzieren als männliche Vertreter. Bei Skolopendern und Schlangen produzieren beide Geschlechter vergleichbare Giftquantitäten und Giftqualitäten. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Tiergiftrohgemisch durch manuelles Melken erhalten wird. Dies hat den Vorteil einer besonders schonenden Gewinnung des Tiergiftrohgemiscb.es.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist überdies bevorzugt, dass das Tiergiftrohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird, und es ist weiterhin bevorzugt, dass die Fraktionen vor der Weiterverarbeitung tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Beladungen der dendritischen Zellen eignen sich zur Verwendung in der Medizin. Die mit den pharmazeutisch wirksamen Substanzen beladenen dendritischen Zellen können erfindungsgemäß bevorzugt zur Behandlung von Hautkrebs erkrankungen verwendet werden. Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift der Skolopender-Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashomviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi, und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus- Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles -Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und/oder der Zitterspinnenarten und der Pholcusspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba) in einer pharmazeutischen wirksamen Beladung von dendritischen Zellen zur Behandlung von Hautkrebs erkrankungen, wobei Peptidtoxine aus dem Gift von Skolopendern, Bitis arietans und/oder Loxosceles spiniceps besonders bevorzugt sind.. Ausserdem ist die Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift von Skolopender- Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashornviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus und/oder den Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta und den Pholcusspinennarten, Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA), Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius testaceus, Sicarius oweni und Sicarius spp. (Südamerika) in der Medizin erfindungsgemäß vorgesehen.
Bevorzugt wird das Peptidtoxin durch ein Fraktionierungs verfahren erhalten und es ist weiterhin bevorzugt, dass die pharmazeutisch wirkende Substanz aus dem Giftcocktail einer der genannten Arten erhalten wird. Dadurch kann die pharmazeutische Wirksamkeit der Beladung in ihrer Wirkung vorteilhafterweise auf die zu behandelnde Tumorart und/oder Größe abgestimmt werden.
Das Peptidtoxin kann durch an sich bekannte Fraktionierungs verfahren zur Auftrennung von Proteinen aus dem Tiergiftrohgemisch (Gesamtgiftcocktail) erhalten werden. Bevorzugt ist, dass das Peptidtoxin durch Gel Chromatographie, HPLC, Affinitätschromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie erhalten wird.
Es ist aber auch möglich, das Peptidtoxin und/oder die weiteren verwendeten Substanzen aus dem Gift von Skolopender-Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashornviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi, und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, der Sechs augenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und/oder der Pholcusspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba) chemisch-synthetisch oder durch geeignete gentechnologische Methoden in rekombinanter Form herzustellen. Wie bei chemischen Substanzen üblich umfasst die vorliegende Erfindung auch Derivate und Salze der erfindungsgemäß bereitgestellten Substanzen. Beispielsweise kann das Peptidtoxin ein oder mehrere Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren umfassen, wobei sichergestellt sein muss, dass die erfindungsgemäße pharmarzeutisch-medizinische Wirkung beibehalten bleibt.
Bevorzugt ist außerdem, dass das Peptidtoxin in einer solchen Menge zur pharmazeutisch wirksamen Dosis zur Beladung vorliegt , dass durch die dendritische Zelle nur eine kontrollierte Abgabe des Peptidtoxins erfolgt.
Weiterhin bevorzugt ist eine pharmazeutisch wirksame Beladung, bei der die Menge an Peptidtoxin, die die dendritische Zelle abgeben kann, in ihrer zellzerstörenden Wirkung räumlich und zeitlich einer kontrollierten Ausbreitung unterliegt. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Beladung weist bevorzugt eine Menge an Peptidtoxin auf, die in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Hautkrebs und/oder sonstigen Tumor gewählt ist.
Anzucht der dendritischen Zellen:
Bevorzugt sind die menschlichen Rückenmarkstammzellen tiefgefroren in Eppendorf- Probengefäßen (E-cups) mit einem Fassungsvermögen von lmL. Dabei handelt es sich bevorzugt um eine gesättigte Stammzellenlösung (Kochsalzlösung oder Plasma, maximal 50 Mikroliter). Zur weiteren Verarbeitung werden bevorzugt 750 Mikroliter Medium (37 Grad Celsius), bestehend aus 500 mL DMEM-Hatmfs F-12, 50 mL RP 1260, 10 mL Penicilin/Streptomycin, 5 mL Glutamin und 50 mL FBS zugegeben.
Die so verdünnte Suspension wird anschließend 10-15 Sekunden auf niederster Stufe auf dem Vortex ohne Schaumbildung zur homogenen Durchmischung geschüttelt.
Direkt danach wird die Suspension in eine 75 cm2 Zellkulturflasche eingebracht und mit 20 mL des selben Mediums (37 Grad Celsius) aufgefüllt.
Dann erfolgt ein leichtes zwei- bis dreimaliges manuelles Schwenken zur optimalen Verteilung der in der Suspension befindlichen Rückenmarkstammzellen in der Zellkulturflasche.
Diese Zellkulturflasche wird in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Brutschrank eingebracht. Bevorzugt ist es, die angesetzte Zellkultur fünf Tage bei gleichbleibender Temperatur (37 Grad Celsius) im Brutschrank zu belassen.
Damit wird ein Festwachsen der Rückenmarkstammzellen am Flaschenboden ermöglicht. Die erste Sichtkontrolle unter dem Invert-Mikroskop, ob die Rückenmarkstammzellen am Flaschenboden angewachsen sind, ist bevorzugt fünf Tage nach dem Verbringen der Zellkulturflasche in den Brutschrank.
Bevorzugt ist es, den ersten Mediumwechsel unter sterilen Bedingungen fünf Tage nach dem Ansetzen der Zellkultur wie folgt vorzunehmen:
Die Mediumflasche wird so gehalten, dass möglichst viel des darin enthaltenen Mediums ausgegossen wird, ohne die bereits festgewachsenen Zellen mit auszuschwemmen. Evtl. verbleibendes Restmedium wird durch leichtes Ausklopfen des Flaschenhalses auf einer Unterlage entfernt.
Das so gesammelte Medium wird verworfen.
Anschließend werden 20 mL neues Medium in die Zellkulturflasche vorsichtig eingebracht, ohne die angewachsenen Zellen vom Zellkulturflaschenboden zu lösen.
Der so beschriebene Mediumwechsel ist jeweils nach drei bzw. vier Tagen vorzunehmen, bis mehrere Zellschichten übereinander gewachsen sind und sich die ersten Zellen ins überstehende Medium lösen.
Das Wachstum der Zellkultur wird vor jedem Mediumwechsel unter dem Invert- Mikroskop kontrolliert.
Wenn die Flasche mit mehreren Zellschichten am Zellkulturflaschenboden bewachsen ist, wird der gesamte Überstand von etwa 20 mL zu gleichen Teilen in 4 kleine 25 cm Flaschen subkultiviert und im Anschluss daran mit 37 Grad Celsius warmen Medium aufgefüllt.
Diese Subkulturen werden fünf Tage im Brutschrank bei 37 Grad Celsius ohne weitere Aktivitäten stehengelassen. Ab dem fünften Tag erfolgt jeweils alle drei bzw. vier Tage der zuvor beschriebene Mediumwechsel mit je 5 mL Medium unter laufender Mikroskopkontrolle.
Wenn der Zellkulturflaschenboden vollständig mit Zellschichten bewachsen ist, erfolgt die Zugabe der Wachstumsfaktorenmischung in der Menge, dass eine Konzentration von je 900 U/mL GM-CSF und IL-4 sowie 700 U/mL sIL-4R (z.B. von Fa. Biochrom) erreicht wird. Bevorzugt ist dabei eine Temperatur von 37 Grad Celsius. Die Zugabe der Wachstumsfaktorenmischung erfolgt mittels einer sterilen 2 mL-Pipette.
Die Zellkulturflasche wird leicht manuell geschwenkt ohne die Zellen vom Boden zu lösen.
Für mindestens 24 Stunden wird die Zellkulturflasche bei 37 Grad Celsius im Brutschrank gelagert.
Frühestens nach 24 Stunden erfolgt die erste Sichtkontrolle unter dem Invert-Mikroskop, ob sich schon dendritische Zellen ausdifferenziert haben, die dann jeweils täglich unter sterilsten Bedingungen mittels einer Glas-Pasteur-Pipette mit dem wenigstmöglichen Medium in eine neue Flasche (25 cm2) mit schon auf 37 Grad Celsius erwärmten Medium (2mL) überführt werden, bis sich in der Ursprungsflasche keine neuen dendritischen Zellen mehr bilden.
Der Mediumwechsel für die in der neuen Zellkulturflasche gesammelten dendritischen Zellen wird in der Art bevorzugt vorgenommen, dass das alte Medium bis auf 1 mL mit einer Glas-Pasteur-Pipette unter sterilsten Bedingungen abgesaugt wird, ohne dendritische Zellen mitabzusaugen und dann mit 4 mL neuem, 37 Grad Celsius warmen Medium aufgefüllt wird.
Dieser Mediumwechsel wird daran anschließend alle drei bzw. vier Tage in der beschriebenen Art vorgenommen.
Durch die so gewonnenen dendritischen Zellen mit einer mindestens drei Wochen langen
Lebensfähigkeit steht eine ausreichende Zahl für therapeutische Zwecke zur Verfügung. Wirkweise
Die dendritischen Zellen erkennen genetisch defekte körpereigene Zellen, docken an diese an und geben die beigeladene Wirksubstanz in die kranke Zelle ab. Die Beiladung bewirkt die gezielte Zerstörung der entarteten Zelle über die zytotoxische Wirkung. Zudem sind dendritische Zellen in der Lage, Informationen über Tumorgeschehen (durch Erkennung von Zytokinen), aber auch Informationen über tumorzerstörende Substanzen an T-Zellen weiterzugeben. Die so „informierten" T-Zellen bezeichnet man als Killerzellen.
Vorteil dabei ist, dass die dendritischen Zellen in der Lage sind, genetisch defekte Zellen zu erkennen, die beigepackte Ladung zielgenau an den Wirkort zu bringen und die Bildung von Tochtergeschwüren zu verhindern.
Beschreibun _ga_:.
Neben den ca. 1.500 weltweit in gemäßigten Zonen vorkommenden Skorpionarten und den ca. 35.000 Webspinnenarten weiß man von nur etwa 70 Skolopenderaiten. Mit Ausnahme von etwa 300 Webspinnenarten gehören die vorgenannten Tiere alle zu den aktiv giftigen Tieren, die ihre Gifte zum Nahrungserwerb einsetzen. Da diese Tiere nur eine sehr kleine Mundöffnung haben, entwickelten sie die Aussenvorverdauung, die über ein hochentwickeltes Enzym- und Giftsystem ermöglicht wird. Entweder wird ein Giftcocktail direkt in das Beutetier injiziert oder das Beutetier wird mechanisch getötet, zerrissen und/oder durchgekaut und dabei mit dem Giftcocktail durchmischt. Die verflüssigte Nahrung mit kleinsten festen Bestandteilen kann dann eingesogen werden.
Etwa 50 Webspinnenarten, ebensoviele Skorpionarten und etwa 20 Skolopenderarten können durch ihre Gifte auch dem Menschen gefährlich werden. Nach wie vor sind vor allem die Gifte der medizinisch wichtigen Arten kaum oder gar nicht erforscht. Die Hauptbestandteile der Arthropodengifte sind:
- Verdauungsenzyme
- Biogene Amine
- Organische Säuren
- Peptide
- Peptidtoxine.
Unter den Peptidtoxinen finden sich folgende Toxingruppen:
- Herzgifte - Nervengifte
- Blutgifte
- Zellgifte
- Gewebezerstörende Gifte.
Ursprünglich findet durch den Gesamtgiftcocktail von allen aktiv giftigen Tieren durch das synergistisch und/oder antagonistische Zusammenwirken verschiedener Substanzen generell auch eine Vorverdauung und damit eine gezielte Ursprungszellenveränderung tierischer Zellen statt.
Bei den in dieser Erfindung verwendeten Skolopender-, Schlangen-, Skoipion- und Spinnenarten finden sich im Gesamtgiftcocktail Substanzen, welche zytotoxisch, nekrotisch und/oder apoptotisch wirken (verdauende Wirkung der Gifte). Substanzen, die als Herzgifte, Nervengifte oder Blutgifte wirken, sollten dagegen erfindungsgemäß eher veπnieden werden. Mittels HPLC-MS-MS wurden die Peptidtoxine aus dem Gesamtgiftcocktail bestimmt. Diesen wiederum wurden über Zellversuche spezifische Wirkweisen zugeordnet. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Bestandteile der Tiergifte von Skolopender-Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashornviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und oder der Pholcusspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba) zur Behandlung von Hautkrebs erkrankungen verwendet werden können, wobei Peptidtoxine aus dem Gift von Skolopendern, Bitis arietans und/oder Loxosceles spiniceps besonders bevorzugt sind.
Der Gesamtgiftcocktail ist auf Grund der Vielzahl der enthaltenen Einzelsubstanzen und seiner daraus resultierenden komplexen Wirkung im Körper derzeit pharmazeutisch noch nicht einsetzbar. Als Abwehrgift von den Tieren eingesetzt, erleidet der Gebissene folgende Symptomatik: Skolopender der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra:
Auf Grund seiner großen Mundwerkzeuge wird der Biss der bis zu 30 cm langen Tiere, immer gespürt. Allgemeine Beobachtungen über die Giftwirkungen von Riesenhundertfüssern (Skolopender) fehlen. Das Gift ist jedenfalls für Kleinsäuger stark wirksam. So genügt beispielsweise der Inhalt einer Giftdrüse um 25 Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20 gr. innerhalb von 7 Stunden zu töten. Das Gift wirkt stark auf das Nervensystem, was zu folgenden Symptomen führt: Beschleunigung des Atems, Schweissausbrüche, Gleichgewichtsstörungen, Erbrechen, Atemlähmung, Krämpfe bis zum Tod. Neuere Arbeiten über Chemie, Biochemie und Toxikologie der Gifte gibt es nicht (Habermehl G. (1987): Gift-Tiere und ihre Waffen. Springer-Verlag, Berlin, 4. und nachfolgende Auflagen).
Schlangen der Gattungen Bitis und Naja
Der Biss selbst wird von den Gebissenen durch die Wucht, mit dem die Schlange zustößt, wahrgenommen. Als Besonderheit ist die Fähigkeit der Speikobras zu erwähnen, die über ihre Zähne mittels Druckluft das Gift zielgerichtet bis zu 5 Meter auf ihr Opfer versprühen können. Mit dem Biss setzt über die Giftabgabe sofortiger Schmerz ein. Bald darauf beginnt das Gift mit seiner gewebezersetzenden Wirkung. Zunächst beginnt die lokalnekrotische Wirkung, bei der die Hautschichten lysiert werden. Anschließend breitet sich mit Hilfe der permeabilitätssteigernden Enzyme das Gift großflächig im die Bissstelle umgebenden Gewebe aus. Dabei können mit Ausnahme des Skelettes alle Gewebebestandteile über Nekrose zerstört werden. Erfolgt der Biss in eine Extremität ist eine Amputation situationsabhängig abzuwägen. Neben den gewebezerstörenden Giften findet man je nach Art noch Neuro- bzw. Cardiotoxine, die in erster Linie für die Schmerzen und die Kreislaufinstabilität verantwortlich sind. Bei den tödlich verlaufenden Bissunfällen stehen Blutvergiftung und Nieren versagen an erster Stelle.
Skorpione der Gattung Parabuthus:
Schon der Stich verursacht wegen der im Giftcocktail enthaltenen Neurotoxine starke Schmerzen an der Stichstelle, die den Schmerzen einer Verbrennung ähneln. Die Schmerzen werden nach einiger Zeit von einem Prickeln abgelöst welches letztendlich in eine Gefühllosigkeit übergeht. Die allgemeinen Symptome können schon nach 5 Minuten, teilweise aber auch erst 24 Stunden nach dem Stich auftreten. Der Gestochene wird erregt, Kinder haben gelegentlich Krämpfe; Reflexe gehen auf ein Minimum zurück oder verschwinden ganz. Das Bewusstsein bleibt erhalten, wobei oft starke Angstzustände auftreten. Es folgt Tränenfluss und eine Erweiterung der Pupillen bei gleichzeitiger Einschränkung der Sehkraft. Der Puls ist beschleunigt und unregelmäßig. Blutdruck kann sowohl erhöht als auch erniedrigt sein. Die Körpertemperatur schwankt stark, wobei eine Hypothermie eine Verschlechterung des Zustandes des Patienten anzeigt. Der Atem geht unregelmäßig. Erbrechen ist ein ernstes Zeichen dafür, dass auch Nervenzentren angegriffen sind. Der Tod tritt überwiegend durch Atemlähmung ein, meist innerhalb 20 Stunden, weniger häufig innerhalb von 30 Stunden (Habermehl G. (1987): Gift-Tiere und ihre Waffen. Springer-Verlag, Berlin, 4. und nachfolgende Auflagen).
Spinnen der Gattung Dysdera:
Im Gegensatz zu den Bissen von beispielsweise Spinnen der Gattung Loxosceles und/oder Pholcus wird der Biß von Spinnen der Gattung Dysdera aufgrund deren Kiefergröße und - Stellung meist schmerzhaft wahrgenommen. Nach einigen Minuten färbt sich die Bißstelle rotbraun und wirft Blasen. Wärend der nächsten Stunden löst sich die Haut um die Bißstelle bis zu einer Größe von etwa 2 cm. Es bildet sich eine offene Wunde, die ohne Behandlung oft wochenlang nicht zuheilt. Begleitende Symptome sind Atemnot und Herzaιτhythmien. Todesfälle sind nicht bekannt.
Spinnen der Gattung Loxosceles:
Der Biss selbst wird in den allermeisten Fällen vom Gebissenen nicht gespürt. Die Bissstelle schwillt nach 2 bis 5 Stunden sehr stark an, wobei das Anschwellen mit starken Schmerzen einhergeht. Die Bisssteile verfärbt sich dunkelrot und es bilden sich Blasen. Anschließend färbt sich das Gewebe schwarz und Hautzellen sterben ab. Dabei hinterbleibt ein Loch in der Haut, welches bis zu 5 cm im Durchmessser betragen kann. Die Heilung kann bis zu 2 Jahren betragen, wobei teilweise eine Hautverpflanzung nötig werden kann. Bei schwereren Fällen kommt es zu Blut im Urin und letztlich zu einem Nierenversagen mit Todesfolge. Es gibt ausserdem Fälle mit hämolytischer Anämie und Hämaturie welche mit Sinnesstörungen einhergehen. Die Körpertemperatur kann bis auf 41 Grad Celsius steigen, wobei sich in schweren Fällen auch ein Koma einstellen kann.
Spinnen der Gattung Pholcus
Auch hier wird der Biss in den meisten Fällen nicht gespürt. Nach etwa 2 Stunden rötet sich die Bissstelle deutlich und nässt. Im Laufe der nächsten Stunden löst sich die Hautschicht um die Bissstelle bis zu einer Größe von 3 cm. Es bildet sich eine offene Wunde, die ohne Behandlung bis zu 3 Monate nicht zuheilt. Ohne Behandlung erfogt die Wundheilung unter starker Narbenbildung. Eine Behandlungsform besteht z.B. in einer Hautverpflanzung. Begleitende Symptome äußern sich in einer Kreislaufinstabilität. Todesfälle sind nicht bekannt.
Überraschenderweise können jedoch Einzelsubstanzen, von den im Tiergift enthaltenen Peptidtoxinen, welche von Skolopender-Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashomviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi, und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und/oder den Pholcusspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba) stammen, zur Behandlung von Hautkrebserkrankungen sowie parallel bzw. unterstützend zu Hautkrebsoperationen eingesetzt werden, um genetisch entartete Zellen zu zerstören. Beispielsweise kann erfindungsgemäß die Zerstörung von Melanomzellen und/oder von bei der Operation nicht erfasstem Tumorgewebe über das Aufspüren, Enttarnen und die zielgerichtete Elimination der genetisch defekten Zellen erfolgen. Bei der Therapie können zum einen genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da die Oberflächenproteinstruktur und die erfindungs gemäß eingesetzten, mit Peptidtoxin beladenen dendritischen Zellen, diese in ihrer Oberflächenstruktur veränderten Zellen erkennen und zerstören können. Darüberhinaus geben Tumorzellen spezifische Botenstoffe, sogenannte Tumormarker ab, aufweiche die mit Peptidtoxin beladenen dendritischen Zellen reagieren und daraufhin die Tumorzellen zerstören. (Zitvogel L. et al (1999): Novel Immunologie And Therapeutic Attributes of Dendritic Cells (DC): Modulation of T and NK cell -Mediated- Antitumor Immune Responses. The European Journal Of Cancer, Vol. 35 Supplement 5-S25//Gong J., Avigan D. et al (1999): Activation of Antitumor Cytotoxic T Lymphocytes by Fusions of Human Dendritic Cells and Breast Carcinoma Cells. The European Journal Of Cancer, Vol. 35 Supplement 5-S30)
Die Funktionsweise basiert auf der Fähigkeit dendritischer Zellen, genetisch defekte Zellen aufspüren, erkennen und zerstören zu können und der gewebezerstörenden Wirkung der Peptidtoxine wie folgt.:
Die Peptidtoxine mit einem Molekulargewicht von ca. 50-350 kDa, im Fall von
Skorpionen,
Spinnen und einigen Skolopendern typischerweise ca. 100 kDa, besitzen eine gewebezerstörende Wirkung, darunter auch eine Hautzelltypen- zerstörende Wirkung. Auf Grund ihres hohen Molekulargewichts und ihrer räumlichen Struktur haben sie in Geweben ohne die Hilfe von sogenannten
Durchdringungsenzymen nur eine geringe Ausbreitungstendenz.
Dendritische Zellen werden mit Hilfe eines Wachstumsfaktorengemisches (GM- CSF/IL-4, bevorzugt in Kombination mit dem Interleukin-Rezeptor sIL-4R) bevorzugt aus Rückenmarkstammzellen wegen ihrer Gleichheit hergestellt und isoliert.
Die so gewonnenen dendritischen Zellen werden bevorzugt mit den hautnekrotisch wirksamen säulenchromatographisch erhaltenen Einzelkomponenten aus den Giften der Skolopender-Hundertfüsserarten Scolopendra gigantea ssp., Hemiscolopendra spp., der Schlangenarten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashomviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi, und der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der Parabuthus- Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus, Parabuthus villosus, der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta. der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis und den Pholcus spinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp (Kuba), über Lipofektion beladen. Die quantitative Beladung der dendritischen Zellen kann durch eine ca. 1,66 % ige Zugabe von Phenyl-Gal-Nac gesteigert werden.
Gegebenenfalls können weitere im Tiergiftrohgemisch enthaltene Substanzen die Wirkungen der Peptidtoxine, mit denen die dendritische Zelle beladen wird, unterstützen.
Die Wirkweise der mit Peptidtoxinen beladenen dendritischen Zellen kann durch Austestung dieser in entsprechenden gesunden und tumorösen humanen Zelllinien erfolgen.
Erfindungsgemäß stammen die toxischen Substanzen, bzw. das Peptidtoxin, mit welchem die dendritschen Zellen beladen werden, aus dem Gift von Skolopendern der Familie Scolopendridae, Schlangen der Familie Viperidae, Schlangen der Familie Elapidae, Spinnen der Familie Sicariidae (erfindungsgemäß gehören zur Familie der Sicariidae neben Sicarius auch die Gattungen Loxosceles und Scytodes), Spinnen der Familie Pholcidae, Skorpione der Familie Buthidae.
Bevorzugt sind die Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra, Bitis und Naja, sowie Loxosceles, Pholcus und Parabuthus. Im Bereich der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra können die Scolopendra- und Hemiscolopendra-
Riesenhundertfüsserarten Scolopendra morsitans, Scolopendra gigantea und Hemiscolopendra spp., im Bereich der Gattung Bitis die Bitis-Schlangenarten Bitis arietans, Bitis gabonica und Bitis nasicomis, im Bereich der Gattung Naja die Naja- Schlangenarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, im Bereich der Gattung Loxosceles die Loxosceles-Spinennarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, im Bereich der Gattung Sicarius die Sicarius-Spinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius argentinensis im Bereich der Gattung Pholcus die Pholcus-Spinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus spp. (RSA.), Pholcus spp (Kuba) und Pholcus opilionides, im Bereich der Gattung Parabuthus die Parabuthus-Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus und Parabuthus villosus besonders bevorzugt verwendet werden. Unter den Spinnen der Gattung Loxosceles sind erfindungsgemäß auch die weiteren Arten einsetzbar.
Unter den Skolopendern der Gattung Scolopendra und Hemiscolopendra sind erfindungsgemäß alle Arten mit einer Körperlänge ab 10 cm einsetzbar. Unter den Schlangen der Gattung Bitis sind auch alle Zwergpuffotternarten erfindungsgemäß einsetzbar. Unter den Schlangen der Gattung Naja ist erfindungsgemäß auch die asiatische Speikobra Naja naja atra einsetzbar.
Unter den Spinnen der Familie Pholcidae sind erfindungsgemäß alle größeren Arten einsetzbar.
Unter den Skorpionen der Gattung Parabuthus sind erfindungsgemäß auch alle zentralafrikanischen Arten einsetzbar. Daneben sind erfindungsgemäß die Skorpione der Gattungen Opistophthalmus, Androctonus und Nebo einsetzbar.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutisch wirksamen Beladung dendritischer Zellen kann so erfolgen, dass dendritischen Zellen ein Peptidtoxin unter dem Mikroskop direkt über eine Mikrocapillare injiziert wird, und diese Zellen dann in die Kulturflasche rückgeführt werden. Bei dieser Prägung kann die schon mit diesem Peptidtoxin beladene dendritische Zelle ihre Information über die Aufnahme eines Zellgiftes an die anderen dendritischen Zellen weitergeben. Dadurch kann nach ca. 72 Stunden eine Lösung dieses verwendeten Peptidtoxins ins Medium zugegeben werden. Nach weiteren 48 Stunden haben die dendritischen Zellen eine bestimmte, vom Peptidtoxin und den dendritischen Zellen abhängige Menge des Peptidtoxins aufgenommen.
Die Herstellung kann auch so erfolgen, dass einer Kultur dendritischer Zellen, in welcher sich auch Hautkrebszellen befinden, direkt in die Kulturflasche ein Peptidtoxin, welches die Hautkrebszellen zerstört, zugeimpft wird. Dadurch, dass das Gift intakte Krebszellen zerstört, werden beim Tumorzellenabbau bestimmte Marker frei, welche den dendritischen Zellen anzeigen, dass die Tumorzellzerstörung mit Hilfe des Peptidtoxines effektiver erfolgen kann, wobei die Adaption der dendritischen Zellen mit den wirksamen Substanzen über die Zugabe von Phenyl-Gal-Nac quantitativ gesteigert werden kann.
Dadurch kann nach etwa 24 Stunden eine weitere, konzentriertere Zugabe des Peptidtoxins erfolgen, welches dann auch von den dendritischen Zellen aufgenommen wird. Ziel bei den Herstellungsverfahren ist es, eine möglichst hohe quantitative Beladung der dendritischen Zellen mit diesem Peptidtoxin zu erreichen. Eine Bestimmung der Konzentration in der Zelle ist meßtechnisch derzeit nicht oder nur sehr schwer möglich. Die Medium-Konzentrationen an zu beladender Substanz bewegen sich im letzten Inkubationsschritt jedoch üblicherweise, abhängig vom verwendeten Toxin, im Bereich von ca. 0,5 μg/ml bis 250 μg/ml.
Bevorzugt kann die Gewinnung des Tiergiftrohgemisch so erfolgen, dass dieses durch an sich bekannte Verfahren aus den Spinnentieren und Skolopendern gewonnen wird und eine Fraktionierung des Tiergiftrohgemisches durch ebenfalls an sich bekannte Fraktionierangsverfahren zur Auftrennung von Proteinen vorgenommen wird, um die Peptidtoxine und/oder die sonstigen zellzerstörend wirkenden Substanzen in möglichst voneinander getrennter Form in getrennten Fraktionen zu erhalten. Zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Beladung dendritischer Zellen werden bevorzugt einzelne Fraktionen verwendet. Bevorzugt können als Peptidtoxine auch zeilzerstörend wirkende Schlangengifte wie z.B. das Kobraschlangengift Najatoxin-S eingesetzt werden, jeweils zur Beladung der zur Therapie eingesetzten dendritischen Zellen. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutisch wirksamen Fraktionen der Peptidtoxine können aus dem Giftcocktail, der über manuelles Melken der o.g. Tierarten gewonnen werden kann, z.B. über säulenchromatographische Aufreinigung, spezifische Giftkomponenten, (nekrotisch und zytotoxisch wirkende Peptidtoxine) selektiert werden. Die Analytik zur Differenzierung der in den Fraktionen enthaltenen Komponenten kann über HPLC-MS-MS (z.B. mit einem Gerät der Fa. Perkin-Elmer) erfolgen. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei einem Teil der hochmolekularen Substanzen über die Darstellung toxischer Gruppen vom NX-NHX-NOX-und SX-Typ, um Peptidtoxine handelt. Dieses wird durch ihre Wirkweise im Zellversuch noch bestätigt. (Burda R., Schrottenloher E., Weickmann D. (2000): In vitro Versuche zur Anwendung/Verwendung von zellzerstörenden Giftkomponenten der Sechsaugen-krabbenspinnen Sicarius spp. in der biologischen Krebstherapie. Arachnologisches Magazin 2(8): 1-7 und Lundblad R.L. (1995): Techniques in Protein Modification, CRC Press, London, Tokyo).
Die erfindungsgemäß für die pharmazeutisch wirksame Beladung verwendeten Substanzen können auf natürlichem Wege gewonnen werden. Dabei handelt es sich um von Riesenhundertfüssern der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra, von Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, von Webspinnen der Gattungen Loxosceles, Sicarius und Pholcus und von Skorpionen der Gattung Parabuthus produzierte Gifte, die ursprünglich zum Beutefang und zur Vorverdauung tierischen Proteins entwickelt wurden. Diese natürliche Wirkweise kann durch eine funktionserhaltende, schonende Gewinnung des Giftgrundstoffes (z.B. durch manuelles Melken) erhalten werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Melkweisen von Arthropoden, mittels eines elektrischen Verfahrens (Weickmann D. (1991): Haltung und Giftigkeit von Sicariidae. Arachnologischer Anzeiger 16: 12-13; Weickmann D., Burda R. (1994): Electrophoresis of scorpion venoms. Electrophoresis Forum 1994, Abstracts, Techn. Universität München, Okt. 24-26), bei dem den Tieren das Gift über einen elektrischen Impuls, der bei den Tieren die Kontraktion der Giftdrüsen auslöst, entzogen wird (die Spinnen sind hierbei bevorzugt unterkühlt, Skorpione und Skolopender geben bei Unterkühlung kaum bis kein Gift ab), wird gemäß der vorliegenden Erfindung der Giftcocktail über ein manuelles Verfahren, bei dem die Tiere unter Ausnutzung ihres natürlichen Abwehrverhaltens zur Abgabe ihres Giftes stimuliert werden, erhalten.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist eine manuelle Melkweise der Spinnen vorgesehen. Dadurch werden echte, unverfälschte native Gifte gewonnen, während bei der elektrischen Melkweise von den Spinnentiergiften durch Elektronenfluss umstrukturierte Substanzen bzw. Moleküle erhalten werden, die in ihrer Wirkweise geändert sein können oder auch Substanzen in den Giften vorhanden sein können, die das Tier sonst nicht abgeben würde, während bei den Riesenhundertfüssern durch die herkömmlichen elektrischen Melkweisen kein Gift abgegeben wird. Die durch elektrisches Melken zusätzlich von den Spinnentieren abgegebenen Substanzen können, müssen aber nicht zwingend die medizinische Wirksamkeit der einzelnen im Gesamtgiftcocktail enthaltenen Verbindungen negativ beeinflussen. Standardmäßig kann eine Qualitätskontrolle des Rohgiftes über elektrophoretische Verfahren erfolgen.
Die folgenden Beispiele zeigen vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung, sollen den Schutzumfang der Erfindung jedoch nicht beschränken.
In den Beispielen und der Beschreibung wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
Fig. 1 zeigt eine SDS-PAGE von Gesamtgiftcocktails aus Skorpionen, die in manueller und elektrischer Melkweise gewonnen wurden;
Bahnen von links nach rechts: Molekulargewichtsstandard; Androctonus anst. hector, mechanische Melkweise, elektrische Melkweise; Nebo hierichonticus, mechanische Melkweise, elektrische Melkweise; Opistophthalmus sp., mechanische Melkweise, elektrische Melkweise. Beispiele
1. Melken:
a) Skolopender:
Zur manuellen Melkung werden Tiere ab einer Körperlänge von ca. 10 cm der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra die Scolopendra- und Hemiscolopendra- Riesenhundertfüsserarten Scolopendra morsitans, Scolopendra gigantea und Hemiscolopendra spp.verwendet. Dabei werden die Skolopender mit den Fingern einer Hand hinter dem Kopf gegriffen, mit dem Handballen so fixiert, dass das Tier nicht mit dem zu Greifzangen umgebildeten letzten Beinpaar stechen kann. Dann lässt man das Tier durch eine Folie beissen, die über ein Reagenzglas gespannt ist.
Beim Biss wird gleichzeitig Gift abgebeben, welches sich am Reagenzglas sammelt. Das so gesammelte Gift wird in einen Exsikator gebracht. Dieser wird dann für mindestens 12 Stunden in einer Tiefkühltruhe bei mindestens minus 14 Grad Celsius aufbewahrt.
b) Schlangen:
Zur Melkung werden Schlangen der Gattungen Bitis und Naja ab einer Körperlänge von etwa 50 cm verwendet. Dabei werden die Schlangen mit festem Griff hinter dem Kopf fixiert und der Körper über den Arm gelegt. Dann lässt man die Schlange durch eine Folie, die über ein Becherglas gespannt ist, beissen. Oder man last die zu melkende Schlange vorsichtig direkt an den Rand eines Becherglases bzw. einer Abdampfschale beissen. Beim Biss wird jeweils Gift abgegeben, welches sich am Becherboden sammelt. Das so gesammelte Gift wird in einem Exikator getrocknet. Das getrocknete Gift kann bei plus 4 Grad Celsius mehrere Jahre aufbewahrt werden.
c) Spinnen:
Zur manuellen Melkung werden adulte Weibchen der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles laeta, Loxosceles spiniceps, Loxosceles bergeri, Loxosceles parami, Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa, Loxosceles deserta, im Bereich der Gattung Sicarius die Sicarius- Spinnenarten Sicarius hahni, Sicarius albospinosus, Sicarius oweni, Sicarius testaceus, im Bereich der Gattung Pholcus die Pholcus-Spinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus spp. (RSA.), Pholcus spp. (Kuba) und Pholcus opilionides, mit den Fingern einer Hand in Rückenlage fixiert, dabei mit einer in der anderen Hand befindlichen sterilen Spritze (2 mL Braun Injekt von Fa. B. Braun) mit aufgesetzter steriler Kanüle (20 oder 21 von Becton Dickinson), die Tageszeit spielte keine Rolle, bei einer Raumtemperatur von 21 bis 27 Grad Celsius, bei einer Luftfeuchtigkeit von ca. 60 %, an den Cheliceren durch Berühren mit der stumpfen Seite der Kanüle zur Abgabe des Giftes stimuliert. Dabei ist es bevorzugt, dass die Stimulationszeit nicht länger als 90 Sekunden dauert, da ansonsten das Tier einem unnötigen Stress ausgesetzt wird. Nach Erscheinen des Gifttropfens an den Giftklauen wird dieser mit der Spritze über die Kanüle aufgezogen. Für jedes Tier wird eine neue Spritze mit neuer Kanüle verwendet. Anschließend wird die Kanüle mit der Kanülenschutzhülle wieder verschlossen. Die verschlossene Spritze samt aufgezogenem Gift wird direkt anschließend in einen Exsikator verbracht. Dieser wird dann für mindestens 12 Stunden in einer Tiefkühltruhe bei mindestens minus 14 Grad Celsius aufbewahrt.
d) Skorpione:
Zur manuellen Melkung werden Tiere ab einer Körpergröße von etwa 3 cm der Skorpionarten Parabuthus transvallicus, Parabuthus granulosus und Parabuthus villosus verwendet. Dabei werden die Skorpione am Postabdomen direkt hinter der Giftblase mit einer an den Spitzen mit Schaumstoff ummantelten Pinzette gefasst und der Giftstachel bevorzugt auf eine feinstpolierte Aluminiumplatte (ca. 4 x 5 cm) mit einer Dicke von 2 mm kontaktiert. Beim Kontakt gibt der Skorpion einen Gifttropfen auf die Aluminiumplatte ab, die dann in den Exsikator verbracht wird. Dieser wird dann für mindestens 12 Stunden in einer Tiefkühltruhe bei mindestens minus 14 Grad Celsius aufbewahrt.
2. Fraktionierung des Gesamtgifts
Das durchgefrorende Gesamtgift wird nach Entnahme aus der Tiefkühltruhe in 1 mL Lösungsmittel z.B. Proteinlösungsmittel von Fa. Carl Roth GmbH & Co, KG (Lösungmittel für Protein-Säulenchromatographie: 0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, 1,92 M Glycin, in destiliertem, deionisiertem Wasser (wegen Denaturierung wird kein SDS im Puffer verwendet) eingebracht. Dadurch wird Gift in Lösung erhalten. Die so aufbereiteten einzelnen Giftlösungen der jeweiligen Arten können in einem sterilen, sauberen Tefionvial bei Raumtemperatur gesammelt werden. Das verschlossene Tefionvial wird anschließend auf einem Vortex ohne Schaumbildung 30 Sekunden lang geschüttelt, wobei eine homogene Lösung erhalten wird. Nach der Durchmischung wird die gesamte Lösung über einen Plexiglastrichter (um Kontamination zu vermeiden) in eine stehende transparente Plexiglassäule, die einen Innendurchmesser von 1,5 cm, eine Wandstärke von 2 mm und eine Höhe von 50 cm aufweist, und unten konisch bis auf 1,5 mm zulaufend, offen ist, gefüllt mit 20 mL Gel (Fa. Sigma Supelco, AcA 34; Matrix: 3 % Acrylamid/4 % Agarose; Fraktionierungsbereich (MW): Proteine: 20 bis 350 kDa; Ausschlussgrenze 750 kDa; Kügelchendurchmesser: 60 bis 140 Mikrometer) eingebracht. Die so eingebrachte Giftlösung durchläuft das Gel und verdrängt dabei den im Gel befindlichen Puffer. Nach vollständigem Eindringen der Giftlösung in das Gel werden zusätzliche 150 mL Lösungmittel (0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3; 1,92 M Glycin) auf die Säule gebracht. Dieses zusätzliche Lösungsmittel verdrängt bei seinem Durchlauf durch das Gel die darin befindliche Giftlösung. Die ersten 15 mL , die unten aus der Säule laufen sind Restpuffer und werden verworfen. Nach diesen 15 mL werden je nach Tierart bis zu 30 Fraktionen zu je 4 mL aufgefangen. Die Trennung in jeweils 4 mL ist bedingt durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der einzelnen Fraktionen, nachgewiesen durch Elektrophorese, bevorzugt SDS-PAGE. Als Auftragspuffer zum Peptidbindungs -und Proteinschutz werden Roti Load 1 + 2 (Carl Roth GmbH & Co, KG, Karlsruhe: SDS-, Glycerol-, Bromphenolblau-, Phosphatpuffer, Roti Load 1 mit Mercaptoethanol, Roti Load 2 ohne Mercaptoethanol) verwendet. Die einzelnen Fraktionen werden in steril sauberen verschraubbaren 5 mL Teflonvials getrennt aufgefangen. Die Qualtitätskontrolle der einzelnen Fraktionen erfolgt mittels Elektrophorese.
Die hautzelllysierende Wirkung der Fraktionen wurde bestimmt, indem die einzelnen Fraktionen aus dem Gesamtgiftcocktail der jeweiligen Tierarten im Versuch an menschlichen lebenden Zellen in hoch- bis überdosierten Mengen (ca. 200 bis 500 μg/ml verwendetem Medium) ausgetestet wurden. Anwendung zur Beladung dendritischer Zellen fanden diejenigen Peptidtoxine, welche sowohl gesunde Hautzellen, bevorzugt Hautfibroplasten unterschiedlicher Biologie, als auch entartete Hautzellen, bevorzugt 2 Linien vom malignem Melanom, zerstörten. Unberücksichtigt blieben diejenigen peptidtoxine , welche neben Hautzellen auch noch weitere Zellen (z.B. Brustgewebszellen und Leberzellen) schädigten und teilweise sogar lysierten. Im Fall von Sicarius wurden Peptidtoxine in den Fraktionen 1-12 erhalten. Diese Fraktionen enthielten Peptidtoxine in einem Molekulargewichtsbereich von ca. 72 bis ca. 168 kDa. Ein hautzelllysierendes, insbesondere maligne Melanomzellen lysierendes Peptidtoxin ist in Fraktion 10 enthalten.
Für die erfindungsgemäße pharmazeutisch therapeutisch wirksame Beladung der dendritischen Zellen werden z.B. einzelne hautzelllysierende Fraktionen der Tiergifte verwendet. Diese Fraktionen enthielten Tiergiftproteinbestandteile in einem Molekulargewichtsbereich von ca. 50 bis 350 kDa bzw. Nichtproteintoxine mit zumindest einer Amidogruppe in einem Molekulargewichtsbereich von ca. 30-55kDa. Eine SDS- PAGE des Gesamtgiftcocktails von Skorpionen ist in Figur 1 gezeigt.
Um die Struktur der einzelnen Substanzen aufzuklären, werden die jeweiligen Fraktionen z.B. über eine HPLC-MS-MS sowie eine DAD-UV-Spektrometrie (DAD bzw. DADI: Direct Analysis of Daughter Ions, Direkte Analyse von Tochterionen) untersucht. Im höheren Molekulargewichtsbereich ab 10.000 konnten keine bekannten Substanzen dargestellt werden. Die Grundgerüstbestimmungen deuten eine Zugehörigkeit eines Teils der Substanzen zumindest zu einem Polypeptidtyp mit toxischen Komponenten, also Polypeptidtoxinen, an. Es wurden jedoch auch Toxine mit einem Molekulargewicht von 30-55 kDa ermittelt, die keine Proteinstruktur aufweisen.
Fraktionen mit gleichen Zusammensetzungen können zusammen gesammelt werden. Für die weitere Verarbeitung und Lagerung werden die einzelnen Fraktionen gefriergetrocknet, beispielweise mit folgenden Parametern:
Die zu lyophylisierende Fraktion wird in einem offenen, mit perforierter Aluminiumfolie locker bedeckten Tefionvial, auf Minus 22 Grad Celsius gekühlt. Zur sicheren Durchfrierung der Probe wird eine Kühlzeit von 11 Stunden (bei Skolopendergiften mindestens 20 Stunden) eingehalten. Dann wird ein Vakuum von 0,200 mbar angelegt. Nach Erreichen des Vakuums wird die Fraktion auf Plus 4 Grad Celsius erwärmt und mindestens 24 Stunden unter Aufrechterhaltung des Vakuums auf dieser Temperatur gehalten. Nach dem Gefriertrocknungsvorgang wird das Tefionvial mit der lyophilisierten Fraktion luftdicht verschraubt. Die Lagerzeit beträgt bei Raumtemperatur ca. 3. Monate (bei Skolopendergiften 4 Wochen), bei Plus 7 Grad Celsius ca. 1 Jahr (Skolopendergifte sind bei dieser Temperatur nur etwa 5 Monate stabil) und bei Minus 14 Grad Celsius ca. 5 Jahre (Skolopendergifte sollten bei längerer Lagerung bei Minus 80 Grad Celsius gelagert werden).
3. Beladung dendritischer Zellen mit Peptidtoxinen
3-5 mL einer Kultur dendritischer Zellen (2,5 bis 15 Millionen dendritische Zellen/5 mL), hergestellt nach dem in dieser Erfindung weiter oben beschriebenem Verfahren, wurden mit 0,5 bis 2,5 mL einer Hautkrebszelllösung (Überstand einer frisch aufgeklopften reinen menschlichen Hautkrebszellkulturflasche mit etwa 250.000 Hautkrelszellen/mL Zellmedium. Medium: 500 mL DMEM-Ham's F-12, 10 mL Penicillin/Streptomycin, 5 mL Glutamin und 50 mL FBS) versetzt. Anschließend wurden 1 bis 2 mL einer Lösung, die ca. 150 μg/mL Peptidtoxin der Fraktion 3 aus Loxosceles spiniceps enthielten, zugesetzt. Es wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde unter der sterilen Werkbank mit einer vorher autoklavierten Pasteurpipette etwa 4 mL Mediumüberstand (möglichst ohne dendritische Zellen) abgenommen und verworfen. Anschließend erfolgte eine weitere Zugabe von 1 bis 2 mL des Peptidtoxines Lox.Tox. 3 (gleiche Konzentration wie bei erster Zugabe), so dass eine Endkonzentration an Peptidtoxin von ca. 100 μg/mL vorlag. Bis zur Verwendung der so beladenen dendritischen Zellen werden diese weiter bei 37°C im Brutschrank inkubiert
4. Wirkung der beladenen dendritischen Zellen auf maligne Melanomzellen
Die mit den genannten Toxinen beladenen dendritischen Zellen werden gesammelt/angereichert, so daß eine möglichst "gesättigte" Lösung an dendritischen Zellen, beladen mit Toxinen, entsteht. Im Mischgewebszell versuch, d.h. einer Kultur aus gesundem Gewebe und Hauttumorzellen (Zellkultur: Malign. Melanom: sicher als diese identifizierte Zellen, vom Patienten nach Absprache mit diesem erhalten, seit 1995 ebenfalls als Langzeit- und Subkultur beobachtet) wurden dann die Wirkungen unterschiedlicher Gifte, mit welchen die dendritischen Zellen beladen werden, ausgetestet. Im Mittel waren die Tumorzellbereiche (malig. Melanomzellen) im Durchmesser 4 mm groß und etwa 1-2 mm dick. Beladene dendritische Zellen wurden direkt ins Medium (500 DMEM-Ham's F-12, 10 mL Penicilin/Streptomycin; 5 mL Glutamin und 50 mL FBS) gegeben, wobei zwar alle Tumorzellbereiche angegriffen wurden, die Prozedur aber am längsten dauerte und nach 3 Wochen wiederholt werden mußte. Beim Injizieren von dendritischen Zellen in den Tumor kann sehr selektiv gearbeitet werden, doch sterben viele dendritische Zellen dabei ab. Am effektivsten erwies es sich, die mit den Giften beladenen Zellen direkt an den Tumorrand zu injizieren, so daß die dendritischen Zellen ihrer Natur entsprechend, den biologisch aktiven Tumorrandbereich zuerst zerstören können. Die lysierten Tumorzellen werden verdaut (teilweise von Makrophagen). Bei sämtlichen untersuchten tierischen Gifte wuchsen die lysierten Zellbereiche mit gesunden Zellen wieder zu. In diesem Beispiel wurde die Wirkung der nachfolgenden Gifte untersucht:
Fraktionen des
Molekulargewicht
Toxine aus: Gesamtgiftcocktails in kDa
Scolopendra morsitans C.S.A. 2 130
Hemiscolopendra sp ex Peru 2 140
Bitis arietans 4 125
Bitis gabonica 4 210
Loxosceles laeta 3 160
Loxosceles spiniceps 3 175
Pholcus phalangioides X 115
Parabuthus transvallicus 17 305
X: viele eng beieinander liegende Banden auf dem Gel, und somit nicht eindeutig bestimmbar, ob Fraktion 5 oder 6.
Die beste und schnellste Tumorzerstörung schon nach einmaliger Gabe von beladenen dendritischen Zellen an den Tumorrand wurde mit Giften von Skolopendern, Bitis arietans, Loxosceles spiniceps erreicht. Hierbei erfolgte eine vollständige Tumorzellzerstörung schon nach 6h bei einmaliger Zugabe, wobei die lysierten Zellbereiche mit gesunden Zellen zuwuchsen.
Wenn nicht alle Tumorzellen zerstört sind, gibt man alle zwei Tage eine neue Gabe an beladenen dendritischen Zellen hinzu. 5. Wirkung der beladenen dendritischen Zellen auf Lebertumorzellen
Es wurden Versuche über die Wirkung von dendritischen Zellen, die mit leberzellzerstörenden Giften von:
Bitis atropos Molekulargewicht 13 kDa und/oder Naja naja sputatrix Molekulargewicht 18 kDa und/oder Hemiscolopendra spp. Molekulargewicht 102 kDa und/oder Loxosceles reclusa Molekulargewicht 113 kDa und/oder Sicarius hahni Molekulargewicht 192 kDa und/oder Pholcus phalangioides Molekulargewicht 90 kDa und/oder Dysdera crocata Molekulargewicht 102 kDa
beladen waren, auf Lebertumorzellen durchgeführt.
Die dendritischen Zellen führten die oben genannten toxischen Substanzen an die entarteten Lebertumorzellen heran und führten stets zu einer Zerstörung der entarteten, tumorösen Leberzellen. Der Versuchsauf bau und der Ablauf war wie oben unter der Ziffer 4. beschrieben, wobei anstatt der Haut- und Melanomzellen eine Mischkultur aus Leberzellen und Lebertumorzellen (sowohl Leber-Primärtumorzellen als auch Lebermetastasenzellen) gearbeitet wurde. Die Zugabe der mit den leberzellzerstörenden Giften beladenen dendritischen Zellen zu den Mischgewebekulturen erfolgte ebenfalls wie unter der Ziffer 4. beschrieben.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die toxischen Substanzen (Toxine) aus dem Gift von Scolopendern der Gattungen Scolopendra und Hemiscolopendra, Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, Spinnen der Gattungen Loxosceles und Sicarius und Pholcus und Dysdera sowie Skorpionen der Gattung Parabuthus und einer Kombination aus einem oder mehreren dieser Toxine ausgewählt sind.
2. Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen ausgewählt werden aus Toxinen von Giften der Scolopenderarten Scolopendra morsitans, S. gigantea und Hemiscolopendra sp., der Schlangenalten Bitis arietans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicomis (Nashomviper), B. atropos, B. caudalis, B. peringueyi, der Speikobraarten Naja melanoleuca, Naja pallida und Naja naja sputatrix, der araneomorphen Einsiedlerspinnenarten Loxosceles laeta, L. spiniceps, L. bergeri, L. parami, L. rufescens, L. reclusa, L. deserta, der Sechsaugenkrabbenspinnenarten Sicarius hahni, S. albospinosus, S. testaceus, S. argentinensis, den Zitterspinnenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus spp. (RSA) und Pholcus spp. (Kuba), der Dickschwanzskorpionarten Parabuthus transvalllicus, P. granulosus, P. villosus und einer Kombination aus einem oder mehreren dieser Toxine.
3. Dendritische Zellen nach Ansprach 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die dendritischen Zellen menschlichen Ursprungs sind.
4. Dendritische Zellen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine durch Fraktionierung des Giftcocktails der genannten Tierarten gewonnen wurden.
5. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Fraktionierung des Giftcocktails gewonnenen Toxine zusammen mit weiteren, in den einzelnen Fraktionen vorliegenden Substanzen eingesetzt werden, ohne daß eine weitere Aufreinigung erfolgt.
6. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine in Reinform eingesetzt werden.
7. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine in rekombmanter Form vorliegen.
8. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine Peptidtoxine sind.
9. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidtoxine ein Molekulargewicht von ca. 50-350 kDa besitzen.
10. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine nekrotische, cytotoxische und/oder apoptotische Eigenschaften aufweisen.
11. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die dendritischen Zellen mit den Toxinen durch Lipofektion und/oder Laser- Mikroinjektion beladen wurden.
12. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxine eine Amidogruppe, jedoch keine Proteinstruktur aufweisen und ein Molekulargewicht von 30-55 kDa aufweisen.
13. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die dendritischen Zellen in einer therapeutisch wirksamen Menge mit den Toxinen beladen sind, wobei die dendritischen Zellen zur Beladung mit einem Medium in Kontakt gebracht wurden, in dem die Toxinkonzentration im Bereich von 0,5-250 μg/mL, bevorzugt 80-225 μg/mL, noch bevorzugter ungefähr 170 μg/mL, liegt.
14. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß synthetisch oder rekombinant hergestellt Peptidtoxine eingesetzt werden.
15. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
Derivate der Peptidtoxine eingesetzt werden, bei denen ein oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, deletiert und/oder ausgetauscht wurden, wobei die toxischen Eigenschaften des Toxins im wesentlichen beibehalten bleiben.
16. Dendritische Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin mit Interferonen, Cytokinen, Cytokin-Rezeptoren, Anaphylatoxinen,
Glycosiden und/oder Antikörpern beladen sind.
17. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die dendritischen Zellen mit einem oder mehreren Toxinen, wie sie in den Ansprüchen 1-16 definiert würden, in Kontakt gebracht werden, um die Zellen mit den Toxinen zu assoziieren.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beladung die dendritischen Zellen mit den toxischen Substanzen inkubiert werden.
19. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die toxischen Substanzen in die dendritischen Zellen aufgenommen werden oder sich mit den dendritischen Zellen assoziieren.
20. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladung durch Lipofektion und/oder Laser-Mikroinjektion der toxischen
Substanzen erfolgt.
21. Verwendung der mit toxischen Substanzen beladenen dendritischen Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere von Tumoren der Haut und der Schleimhaut.
PCT/EP2001/005670 2000-05-17 2001-05-17 Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen WO2001087346A2 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001583813A JP2003533203A (ja) 2000-05-17 2001-05-17 毒性物質が充填された樹状細胞
AU62297/01A AU6229701A (en) 2000-05-17 2001-05-17 Dendritic cells loaded with toxic substances
EP01936371A EP1283726A2 (de) 2000-05-17 2001-05-17 Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen
US10/292,282 US20040013740A1 (en) 2000-05-17 2002-11-12 Dendritic cell loaded with toxic substances

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10024383A DE10024383B4 (de) 2000-05-17 2000-05-17 Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen
DE10024383.5 2000-05-17

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/292,282 Continuation US20040013740A1 (en) 2000-05-17 2002-11-12 Dendritic cell loaded with toxic substances

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2001087346A2 true WO2001087346A2 (de) 2001-11-22
WO2001087346A3 WO2001087346A3 (de) 2002-05-23

Family

ID=7642535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2001/005670 WO2001087346A2 (de) 2000-05-17 2001-05-17 Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20040013740A1 (de)
EP (1) EP1283726A2 (de)
JP (1) JP2003533203A (de)
AU (1) AU6229701A (de)
DE (1) DE10024383B4 (de)
WO (1) WO2001087346A2 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005002616A1 (de) * 2003-06-24 2005-01-13 Toximed Gmbh Pharmazeutischer wirkstoff gegen tumoren enthaltend loxoscelidae spinnengift
WO2005023868A1 (fr) * 2003-09-05 2005-03-17 Shanghai Chuangeng Bio-Tech. Co., Ltd. Serine protease, et nucleotides codant cette serine protease
WO2005103231A2 (de) * 2004-04-21 2005-11-03 Toximed Gmbh Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen zur behandlung von nierenzellkarzinomen
WO2007065925A2 (de) * 2005-12-07 2007-06-14 Toximed Gmbh Zusammensetzung zur behandlung von melanomen und hautunreinheiten sowie kosmetisches hautpflegemittel

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10328251A1 (de) * 2003-06-24 2005-01-13 Toximed Gmbh Pharmazeutischer Wirkstoff
JP2012512629A (ja) 2008-12-17 2012-05-31 ディスカバリー テクノロジー インターナショナル，インク． 高トルク圧電モータ
EP2377177B1 (de) 2008-12-19 2015-11-04 Discovery Technology International, Inc. Piezoelektrischer motor
WO2011028780A2 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Discovery Technology International, Lllp Piezoelectric rotary motor with high rotation speed and bi- directional operation
CN103823008B (zh) * 2014-03-14 2016-03-02 北京市疾病预防控制中心 构建液相色谱-质谱数据库检测未知毒物的方法
CN111574587B (zh) * 2020-05-26 2022-08-30 湖南中医药大学 一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196193A (en) * 1989-10-31 1993-03-23 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Antivenoms and methods for making antivenoms
US5565431A (en) * 1994-06-20 1996-10-15 Lipps; Binie V. Cancer cell inhibitors and method
US6458585B1 (en) * 1996-08-14 2002-10-01 Nexell Therapeutics Inc. Cytokine-free culture of dendritic cells
AU6144499A (en) * 1998-09-15 2000-04-03 University Of Pittsburgh In situ injection of antigen-presenting cells with genetically enhanced cytokineexpression

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORITA AKIMICHI ET AL: "Cholera toxin B subunit activates dendritic cells as an adjuvant." JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, Bd. 114, Nr. 1, Januar 2000 (2000-01), Seite 234 XP001053008 The Sixth International Workshop on Langerhans Cells.;New York, New York, USA; October 08-10, 1999 ISSN: 0022-202X *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005002616A1 (de) * 2003-06-24 2005-01-13 Toximed Gmbh Pharmazeutischer wirkstoff gegen tumoren enthaltend loxoscelidae spinnengift
WO2005023868A1 (fr) * 2003-09-05 2005-03-17 Shanghai Chuangeng Bio-Tech. Co., Ltd. Serine protease, et nucleotides codant cette serine protease
WO2005103231A2 (de) * 2004-04-21 2005-11-03 Toximed Gmbh Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen zur behandlung von nierenzellkarzinomen
WO2005103231A3 (de) * 2004-04-21 2006-12-28 Toximed Gmbh Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen zur behandlung von nierenzellkarzinomen
WO2007065925A2 (de) * 2005-12-07 2007-06-14 Toximed Gmbh Zusammensetzung zur behandlung von melanomen und hautunreinheiten sowie kosmetisches hautpflegemittel
WO2007065925A3 (de) * 2005-12-07 2007-09-07 Toximed Gmbh Zusammensetzung zur behandlung von melanomen und hautunreinheiten sowie kosmetisches hautpflegemittel

Also Published As

Publication number Publication date
AU6229701A (en) 2001-11-26
WO2001087346A3 (de) 2002-05-23
DE10024383A1 (de) 2001-11-29
JP2003533203A (ja) 2003-11-11
EP1283726A2 (de) 2003-02-19
DE10024383B4 (de) 2005-07-21
US20040013740A1 (en) 2004-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10024383B4 (de) Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen
EP1244462B1 (de) Pharmazeutische zusammensetzung aus spinnengiften sowie deren herstellung und verwendung zur behandlung von tumorerkrankungen
DE69532964T2 (de) Neue proteine aus ektoparasitenspeichel und vorrichtung zur sammlung davon
DE102005038768A1 (de) Pharmazeutischer Wirkstoff gegen Borreliose
WO2005002604A1 (de) Pharmazeutischer wirkstoff gegen tumorerkrankungen
DE102005011111A1 (de) Pharmazeutischer Wirkstoff zur Beladung dendritischer Zellen und dessen Lösungsmittel
EP0423262B1 (de) Proteinfraktion aus dem photosyntheseapparat von pflanzen zur anwendung als wirkstoff zur selektiven auflösung von krebszellen und zur nachbehandlung von narben, keloiden und entzündlichen prozessen sowie diese enthaltende pharmazeutische erzeugnisse
EP0702955B1 (de) Verwendung von BK-RiV-Präparaten als Arzneimittel zur Therapie von AIDS
WO2007060252A2 (de) Pharmazeutischer wirkstoff zur behandlung von hepatitis, borreliose und multipler sklerose
EP2155335B1 (de) Pharmazeutische zusammensetzung, verwendung der pharmazeutischen zusammensetzung zur behandlung eines hirntumors, herstellungsverfahren derselben sowie ein kit of parts, enthaltend die pharmazeutische zusammensetzung
EP1754486A2 (de) Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Hepatitis, Borreliose und Multipler Sklerose
EP1699473A2 (de) Lösungsmittel für biogene pharmazeutische wirkstoffe
DE19609261C2 (de) Arzneimittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung der durch Chemotherapie von Tumorerkrankungen bedingten Myelosuppression
WO2005027942A1 (de) Pharmazeutischer wirkstoff aus schlangengift gegen melanome
WO2005002616A1 (de) Pharmazeutischer wirkstoff gegen tumoren enthaltend loxoscelidae spinnengift
WO2005009449A1 (de) Pharmazeutischer wirkstoff gegen warzen, herpes simplex und herpes zoster
DE102004019662A1 (de) Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen zur Behandlung von Hautkrebs
WO2005103231A2 (de) Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen zur behandlung von nierenzellkarzinomen
DE10330712A1 (de) Pharmarzeutischer Wirkstoff gegen Kolonkarzinome und andere Tumorarten
WO2007071716A1 (de) Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von tumoren und bestimmten virenerkrankungen
WO2006134166A2 (de) Pharmazeutischer wirkstoff zur überwindung der blut-hirn-schranke in verbindung mit einem aus biogenen giften gewonnenen wirkstoff gegen hirntumore
TURHAN BEE VENOM CONTENT AND IMPORTANT COMPONENTS
WO2005000326A1 (de) Peptidtoxine zur behandlung von übergewicht
WO2005002494A2 (de) Pharmazeutischer wirkstoff gegen prostatakarzinome
DE10331957A1 (de) Pharmarzeutischer Wirkstoff gegen Magengeschwüre

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10292282

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001936371

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001936371

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001936371

Country of ref document: EP