CN111574587B

CN111574587B - 一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途

Info

Publication number: CN111574587B
Application number: CN202010454273.9A
Authority: CN
Inventors: 田雪飞; 裴刚; 田莎; 周青; 柳卓; 王志琪; 廖柳
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111574587A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途，包括如下氨基酸序列的多肽，氨基酸序列为：RAQNHYCK，本多肽提高抑制肿瘤的效果，降低对正常细胞的损害。

Description

一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途。

背景技术

蜈蚣属节肢动物门唇足纲蜈蚣目蜈蚣科，味辛，性温，有毒，归肝经，具辛温走窜、通经逐邪、调达肝经的功效，为祛风镇痛、攻毒散结之要药，在我国作为中草药始见于两千多年前《神农本草经》。蜈蚣作为防病、治病的传统中药材沿用至今，现代蜈蚣的临床应用、药理作用又有新的扩展。

蜈蚣毒素具有抗癌的用途，中国专利申请号为201010104802.9的专利申请公开了一种多肽，其序列为Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly组成的十二肽，分子量为1296.05Da，其测定了对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。从蜈蚣的毒素中能提取出抑制肿瘤的物质，比如上文中提到的多肽，但是由于多肽类物质本身是小分子物质，提取液中具有多种不同的多肽和其他物质，导致难以从上述提取物中得到最有效的作用于肿瘤的多肽物质，蜈蚣毒素价格昂贵，多肽的抗肿瘤效果一般。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途，提高抑制肿瘤的效果，降低对正常细胞的损害。

本发明的内容包括蜈蚣提取多肽，包括如下氨基酸序列的多肽，氨基酸序列为：

RAQNHYCK，即：SEQ ID NO：1，为Arg-Ala-Gln-Asn-His-Tyr-Cys-Lys。

其分子结构式为：

合成后成品为白色到灰白色的冻干粉。

本发明包括蜈蚣提取多肽在制备抗肿瘤药物方面的用途，优选的，所述肿瘤为肝肿瘤。

本发明的有益效果是，本申请采用蜈蚣药材本身提取得到，原料更加低廉，采用过柱提取并结合高效液相分离提纯，纯度更高。本申请通过试验分析发现，本申请的蜈蚣提取多肽，对肿瘤细胞特别是对肝肿瘤细胞具有强烈的抑制作用，且显示其对于正常肝细胞的细胞毒性显著小于人肝癌HepG2细胞，表明蜈蚣提取多肽具有较好的选择性，具备成为特异抗肿瘤药物的基础。

附图说明

图1为质谱离子流图，a峰为所需物质。

图2为色谱峰质谱鉴定图。

图3为蜈蚣提取多肽的结构图。

图4为蜈蚣提取多肽样本检测色谱图。

图5为蜈蚣提取多肽合成样本检测质谱图。

图6为蜈蚣提取多肽对人肝癌HepG2细胞增殖抑制率。

图7为蜈蚣提取多肽干预人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞LO2 12h后，细胞增殖抑制率图。

图8为光镜观察蜈蚣小分子合成肽对人肝癌HepG2和人正常肝细胞LO2细胞形态的影响图。

图9为Hoechst 33342染色观察蜈蚣提取多肽对HepG2细胞形态的影响图。

具体实施方式

实施例1蜈蚣小分子肽(蜈蚣提取多肽)生物合成及检测

蜈蚣小分子多肽提取及结构分析

蜈蚣小分子多肽提取：蜈蚣粉(少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipesmutilans))与胰蛋白酶混合，用蒸馏水溶解，置入46℃水浴箱中抚育4h，99℃水浴中灭活后离心取上清液，加丙酮低温离心，取沉淀，加5ml双蒸水溶解，重复加丙酮离心并用蒸馏水溶解，再加1倍体积丙酮，1倍体积石油醚，离心取沉淀，加入5ml蒸馏水溶解，制备冻干粉，加入双蒸水溶解，注入蛋白纯化仪进行分离，加丙酮离心，取沉淀，加双蒸水溶解，再重复一次后，制成冻干粉。

蜈蚣小分子多肽结构液质分析：

(1)实验步骤：

①样品准备：在样品中加去离子超纯水1.5mL，超声，过膜；

②仪器平衡：打开二元泵，柱温箱，紫外灯，质谱等，对流动相进行管路排气后，根据做采用的方法设置液相、质谱参数、样品序列等；按照液相梯度对色谱柱进行平衡；

③上机，首先对样品进行一级质谱分析，根据所得结果，在对可能的物质进行目标二级分离；二级质谱模式所选用碰撞能为30V。

(2)实验参数：

①液相参数：进样量5μL，柱温25℃、流速0.3/min、50％乙腈50％水等度洗脱。洗脱时间：5min。

②质谱参数：离子源：电喷雾离子源、离子模式：正离子模式、气温：300℃、气流量：11L/min、喷雾压：15psi。

实施例2蜈蚣小分子肽生物合成及检测

序列合成蜈蚣小分子生物合成肽：

①将第一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体氯甲基聚苯乙烯树脂上。

②在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基。

③在氨基被封闭情况下，通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化第二个氨基酸的羧基。

④将第二个氨基酸的羧基与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键。

⑤用三氟乙酸脱掉第二个氨基的保护基。

⑥依次将第三至八个氨基酸的羧基与已接在固相载体的前一个氨基酸的氨基反应形成肽键。

⑦最后脱去氨基的封闭基团，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。

⑧凝胶柱脱盐。

蜈蚣小分子生物合成肽检测

①HPLC检测纯度

实验步骤：样品准备，仪器平衡，上机。

实验参数：

A泵：100％的水，含0.1％的三氟醋酸

B泵：100％的乙腈，含0.1％的三氟醋酸

总流速：1.0ml/min

波长：214nm

分析柱类型：SHIMADZU Inertsil ODS-SP(4.6*250MM*5UM)

溶解方法：0.5mg样本溶解于0.5mL100％水

进样量：60ul。

②MS检测分子量

实验步骤：样品准备，仪器调试选用Digest.m，仪器质量准确度校正，进样检测。

实验参数：

气流流速：1.50L/min

溶解方法：0.1mg样本溶解于0.5mL100％水

进样量：1ul。实施例3蜈蚣小分子生物合成肽细胞毒性试验

细胞培养及传代：LO2细胞培养于10％Gibco FBS+1％双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基中，Hepg2细胞培养于10％Gibco FBS+1％双抗的DMEM培养基中，2-3d换一次液，细胞汇合率达80％左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。

CCK8法细胞增殖活性的检测

(1)细胞准备及铺板：消化收集对数生长期且细胞状态良好的细胞，用细胞计数板计数，并用完全培养基调整细胞密度至5*10⁴/ml。吹打混匀细胞悬液，吸取细胞悬液100μl至96孔板，在96孔板多余孔处加入完全培养基作为调零组，细胞周围孔加入无菌PBS，防止边缘效应。

(2)分组及给药：铺板4h后，确认细胞贴壁后进行加药。按照每组3个复孔铺板，5组，4个时间点，共60孔。进行如下分组的处理：

①对照组：100μl细胞悬液+100μl完全培养基。

②调零组：200μL完全培养基。

③蜈蚣小分子肽药物组：

50ug/mL：100μl细胞悬液+50ug/mL的蜈蚣小分子肽药物处理细胞6h，12h，24h。

100ug/mL：100μl细胞悬液+100ug/mL的蜈蚣小分子肽药物处理细胞6h，12h，24h。

150ug/mL：100μl细胞悬液+150ug/mL的蜈蚣小分子肽药物处理细胞6h，12h，24h。

200ug/mL：100μl细胞悬液+200ug/mL的蜈蚣小分子肽药物处理细胞6h，12h，24h。

(3)药物溶解

3mg的本申请的蜈蚣提取多肽溶于60uL的PBS中，此时母液浓度为50mg/mL，

(4)CCK8法细胞增殖活性的检测

加药培养到预定时间12h后，每孔加入100ul含有10％CCK8的培养基。37℃，5％C0₂继续孵育2小时后于Bio-Tek酶标仪分析450nm处吸光度(OD)值，取均值。细胞生存率的计算按照公式：抑制率＝1-(实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。

(5)光镜观察细胞形态变化

用培养基配置蜈蚣小分子合成肽浓度为100ug/mL，将铺好的6孔板中的细胞培养液弃掉，加入药物，置于细胞培养箱内培养12h后，置于显微镜下观察并拍照。

(6)hoechst染色实验

细胞培养及处理：同上。

hoechst染色：①取出爬片，PBS清洗2～3次。②将爬片用4％多聚甲醛固定30分钟。③PBS冲洗3次。④加入hoechst(工作浓度25uM)，染色3min。⑤PBS冲洗3次。⑥缓冲甘油封片。⑦避光保存，到荧光显微镜下观察。

统计学分析

用SPSS 22.0软件(5d2d5a0ea089654bca48)分析，数据均以

表示，用方差齐性检验后，用单因素方差分析，对多组均值进行比较，用LSD法对均值进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义的标准。

结果

蜈蚣小分子肽(即蜈蚣提取多肽)生物合成及检测

蜈蚣小分子多肽结构分析

本申请采用胰蛋白酶解法粗提，用Sephadex G-25凝胶过滤层析对所得粗提物进行分离纯化。用高效液相色谱法分析分离，并采用MTT法检测纯化物对HepG2细胞、Eca-109细胞和A549细胞的增殖抑制作用；将经过高效液相色谱法分离的有效成分通过四极杆飞行时间质谱(QTOF)检测，得到本申请的多肽。

由色谱峰(图1、2)可知有活性的多肽分子量为1018kD，序列为RAQNHYCK。

蜈蚣小分子肽生物合成及检测

蜈蚣小分子肽生物合成

蜈蚣小分子肽的合成序列为RAQNHYCK，长度为8AA，结构图如图3，合成后成品为白色到灰白色的冻干粉。

蜈蚣小分子生物合成肽样本检测

HPLC检测结果见色谱图(图4)结果提示，合成的蜈蚣小分子肽纯度为98.993％。

理论上，蜈蚣小分子肽的分子量为1019.134kD，MS检测结果见质谱图(图5)结果提示，合成的蜈蚣小分子肽分子量为1019.10kD，符合要求。

本申请对冻干粉中的其他多肽进行了分析，选取了8个多肽进行了纯化和测序，本申请选择其中一个序列做对比试验，对比序列为SEQ ID NO：2，为H-H-l-G-S，分子量为604kD。

实施例4蜈蚣小分子生物合成肽细胞毒性试验

CCK8检测显示蜈蚣小分子合成肽降低人肝癌HepG2细胞生存率

为了探究蜈蚣小分子合成肽对肝癌HepG2细胞的作用，我们采用了CCK-8方法检测了其对肝癌HepG2的抑制率。不同浓度的蜈蚣小分子合成肽(50ug/m L，100ug/mL，150ug/mL，200ug/mL)作用于肝癌HepG2细胞6h，12h，24h后，抑制率显著上升，一定药物浓度内，呈现浓度依赖特征(见表1，图6)。

表1不同浓度蜈蚣小分子合成肽对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响(X±s)

注：与对照组比较：a P<0.01。

本申请对比了不同序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)对HepG2细胞增殖活性的影响，具体见表2。

表2不同蜈蚣小分子合成肽对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响(X±s)

注：与对照组比较：a P<0.01。

从表2中可以看出，本申请多肽的效果要明显优于其他多肽，具备成为抗肿瘤药物的良好前景。

CCK8检测显示蜈蚣小分子合成肽对人正常肝细胞L02的细胞毒性显著小于人肝癌HepG2细胞

为了探究蜈蚣小分子合成肽对肝癌细胞的选择性，进一步采用了CCK-8方法对比蜈蚣小分子合成肽对正常肝细胞LO2与人肝癌HepG2细胞的细胞毒性作用的差异。不同浓度的蜈蚣小分子合成肽(50ug/mL，100ug/mL，150ug/mL，200ug/mL)作用12h后，结果显示蜈蚣小分子合成肽(100ug/mL，150ug/mL，200ug/mL)对人正常肝细胞L02的细胞毒性显著小于人肝癌HepG2细胞(图7)。

光镜观察显示蜈蚣小分子合成肽对细胞形态有显著影响

蜈蚣小分子合成肽(100ug/mL)作用12h后，人肝癌HepG2和人正常肝细胞LO2细胞的变化见图8。光镜下，与对照组相比，较大部分人肝癌HepG2细胞漂浮在培养液中；与对照组相比，小部分人正常肝细胞LO2也漂浮在培养液中，提示蜈蚣小分子合成肽对细胞形态和细胞活性具有一定毒性，与正常肝细胞比较，其对人肝癌HepG2细胞毒性较高。

Hoechst 33342染色发现蜈蚣小分子合成肽引起人肝癌HepG2细胞细胞核发生凋亡形态变化

Hoechst 33342染色剂更易通过凋亡细胞的细胞膜，导致细胞核染色后呈现亮蓝色荧光。发生凋亡的癌细胞荧光强度要比未发生凋亡的癌细胞高。染色结果表明，蜈蚣小分子合成肽作用细胞12h后，细胞表现为细胞质高亮染色和细胞核固缩的现象(图9)，提示蜈蚣小分子合成肽可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。

<110> 湖南中医药大学

<120> 一种蜈蚣提取多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途

<160>2

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）

<400>1

Arg Ala Gln Asn His Tyr Cys Lys

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）

<400>2

His His Ile Gly Ser

1 5

Claims

1.一种蜈蚣提取多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列为：RAQNHYCK。

2.一种如权利要求1所述的蜈蚣提取多肽在制备抗肝肿瘤药物方面的用途。