CN114315961A - 一种活性多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活性多肽及其应用，所述多肽序列为VAPEEHPVLL。该多肽具有抗凝、抗血小板聚集作用，在抗凝(APTT、PT、TT)及抑制ADP诱导血小板聚集活性等方面表现出显著的活性。

Description

一种活性多肽及其应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体地涉及一种活性多肽及其应用。

背景技术

肽是介于大分子蛋白质和小分子氨基酸之间的最具活性的物质，现代营养学发现，食物蛋白进入人体后，只有三分之一被分解为游离氨基酸，而另外三分之二则以肽的形式被吸收，且更易被身体吸收；此外肽具有蛋白质和氨基酸不具备的独特用途，对人体生理活动十分重要，生物体内的各种组织如骨骼、肌肉、感觉器官、消化系统、内分泌系统、生殖系统、免疫系统、周围和中枢神经系统等都存在活性肽，特定的寡肽和多肽具有多种人体代谢和生理调节功能。随着研究的深入，肽在功能应用上的多种作用逐渐都被证实，肽可以合成细胞，调节细胞的功能活。肽作为人体神经递质，传递信息，肽可在人体内作为运输工具，将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织等。对于人的细胞活性、功能活动、生命存在来讲，肽具有不可替代的重要作用。

小分子肽又称寡肽，或称为低聚肽，一般由2～10个氨基酸组成，拥有很多独特的生物活性，是蛋白质结构的功能片段，在生物体内具有重要的生理功能。小分子肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类药物、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用。所以小分子肽虽然在生物体中含量较少，但活性强、作用大，是细胞分化、识别、免疫、应激、衰老及分子进化等一切生命过程的参与者或调节因子。因此对于肽类成分尤其是小分子肽类成分的挖掘和探索研究有十分重要的意义。

疏血通注射液是传统中药水蛭、地龙经提炼而成的中药注射剂。经过药理研究发现，水蛭中水蛭素和抗血栓素等具有很强的抗凝作用。经过临床和科学研究，疏血通注射液主要的治疗作用包括：抗凝血和抗血小板聚集；抑制血栓形成和溶栓；减少脑缺血范围。

发明内容

本发明旨在提供一种活性多肽，以及其在抗凝和抗血小板聚集方面的应用。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种活性多肽，所述的活性多肽肽段序列为VAPEEHPVLL(代号P09740)。

所述的活性多肽具有抗凝、抗血小板聚集作用，可以通过合成得到。

其中所述多肽的抗凝血、抗血小板聚集作用的浓度不小于0.8mg/ml。

本发明的另一目的是提供所述的活性多肽在制备抗凝血药物中的应用,本发明的另一目的是提供所述活性多肽在制备防治脑卒中药物中的应用。

本发明的又一目的是提供一种抗凝血药物制剂，由所述的活性多肽和药用辅料组成。

本发明的还一目的是提供一种防治脑卒中药物制剂，由所述活性多肽和药用辅料组成。

附图说明

图1疏血通注射液与多肽对照品P09740离子流图谱；上图为疏血通离子流图谱，中间图谱为疏血通EIC＝552图谱，下图为P09740离子流图谱。

图2疏血通注射液与多肽对照品P09740提取MS图谱,上图为疏血通图谱，下图为P09740图谱(m/z＝552.30，m/z＝1103.61)。

图3疏血通与P09740多肽对照品9.8min一级质谱图同位素峰分布比对图谱,上图为疏血通图谱，下图为P09740图谱(m/z＝552,z＝2)。

图4疏血通注射液与P09740多肽对照品二级质谱比对图谱A；上图为疏血通图谱，下图为P09740图谱。

图5疏血通注射液与P09740多肽对照品二级质谱比对图谱B上图为疏血通图谱，下图为P09740图谱(母离子：m/z＝552，z＝2)。

具体实施方式

以下实施例仅为对本发明具体实施方式的描述，不应视为对本发明的限制。在此基础上的改变或变性，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。

实施例1

1、实验仪器：

ABSCIEX

6500质谱仪,

Eksigent 425nano液相色谱；

全自动血凝仪(法国Stago公司)、

血小板聚集仪(美国Chrono-log公司)、

全自动五分类血球计数仪(日本SYSMEX公司)、

B104-S分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

一次性使用真空采血管(广州阳普医疗科技股份有限公司)、一次性使用静脉采血针(广州阳普医疗科技股份有限公司)。凝血检测试剂(法国Stago公司)、血球计数试剂(日本SYSMEX公司)，其余试剂为国产分析纯试剂。

2、供试品：

疏血通样品：浅黄色固体粉末，由牡丹江友搏药业提供。

多肽：多肽肽段序列为VAPEEHPVLL，代码P09740，由牡丹江友搏药业提供。

实验中正常人外周血来自健康献血者(5例)，中位年龄35岁，均为男性。

3、肽段获取：

(1)本发明中所述的活性多肽序列信息来源于疏血通注射液，先通过质谱技术进行数据库解析匹配获得肽段序列信息(VAPEEHPVLL)，采用全序列合成方法合成。详述如下：

疏血通注射液固形物中主要含有氯化钠(辅料)、游离氨基酸、小肽、游离糖、寡糖(低聚糖)、内源性小分子类等成分。其中，分子量较大的主要是寡糖(低聚糖)、小肽(多肽)类成分，分子量较小的分别是游离糖、内源性小分子、游离氨基酸、氯化钠等。因此，可以借助分子排阻层析技术，首先对分子量较小的组分与分子量相对较大的组分进行分离，同时可以实现脱盐；其余组分主要为寡糖类、小肽类等组分，可以根据其在溶液状态下带电状态不同，借助离子交换层析技术进行分离。对于小分子的去除，主要考虑凝胶填料的分段分离范围，同时兼顾脱盐，综合考虑，优先选择Sephadex G15填料(适合分离范围小于1500Da)；关于肽类组分与寡糖类组分的分离，可以采用弱阴离子交换填料，根据经验，可以选择DEAE-52纤维素基质填料。以下为对疏血通注射液多肽组分提取分离的过程进行举例，但并不对本专利说明书构成限制：

取疏血通注射液10支(20ml)，合并，减压浓缩(不超过40℃)至约10ml后，先经过Sephadex G15柱，用水洗脱，脱盐并去除小分子类成分，收集约1/2CV(柱体积)，减压浓缩至10～15ml后，再通过DEAE-52纤维素柱，用水洗脱，收集约2CV后，减压浓缩并冻干后，即得组分一10mg：主要是中性寡糖类组分；再用0.2M NaCl洗脱，收集约2CV，减压浓缩后，再通过Sephadex G15柱，用水洗脱，收集约1/2CV，脱去NaCl(收集AgNO₃检测不产生白色乳浊沉淀部分洗脱液)，减压浓缩并冻干后，即得组分二10mg：主要是小肽类组分等组分。通过对上述小肽类组分进行LC-MS(ABSCIEX

6500,Eksigent 425 nano LC)分析，提取肽段；对肽段质谱数据进行数据库匹配解析，找到了多个相应的肽段序列，经过筛选和研究，发现活性肽段序列VAPEEHPVLL，命名为P09740。

(2)活性肽段的合成。

固相合成仪，型号CS136，厂家为希施生物科技有限公司，采用2-CTC树脂Fmoc法，根据肽段序列在合成仪上自动进行多肽的缩合、脱保护、洗涤等常规合成过程，最后获得多肽化合物，具体合成过程为：

固相反应器中加入2-CTC树脂，二氯甲烷浸泡充分溶胀后除去溶剂，氮气鼓吹下加入Fmoc-Leu-OH、DIPEA、CH₂Cl₂，室温缓慢搅拌，再加入甲醇继续搅拌，然后除去溶剂，树脂经CH₂Cl₂洗涤，减压干燥得Fmoc-Leu-树脂；取Fmoc-Leu-树脂加入至固相反应器中，20％哌啶-DMF溶液加入树脂中，缓慢搅拌后除去溶剂，树脂DMF洗涤，然后依次接入其余2-10个氨基酸，分别为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Val-OH、HATU、DIPEA、DMF，接肽完毕后，加入CH₂Cl₂-三氟乙酸，室温搅拌，过滤除去树脂，滤液充分减压浓缩，再加入冷异丙醚，过滤得到白色固体粉末，干燥，得目标多肽化合物。

采用LC-MS对疏血通注射液中的肽段与合成P09740多肽对照品进行匹配分析，过程如下：

色谱条件：采用C₁₈柱(2.1*50mm，1.8μm)。流速采用0.1ml/min，流动相：A：水(含0.1％FA)B：乙腈(含0.1％FA)。

梯度条件如下：

Time(min)	B％	Flow(ml/min)
			0	5	0.1
2	8	0.1
			13.34	30	0.1
15	60	0.1
			16	80	0.1
18.67	80	0.1
			19.33	5	0.1
21.67	5	0.1

质谱条件：采用正离子模式。Gas temp:350℃；Drying Gas:10L/min；Nebulizer:35psig；fragmentor：175V；Vcap:4000V；Collision Energy：25。

疏血通注射液与P09740质谱比对图谱如图1-5所示。

实施例2活性多肽的正常人体外活性实验

通过在正常人外周血中加入一定浓度的多肽P09740，观察与凝血及血小板功能相关的各项指标变化，研究可能的抗凝、抗血小板聚集作用。实验以生理盐水为空白对照，不设置同类对照药物。

(1)凝血指标检测：枸橼酸抗凝全血3.5ml分别加入10％体积的P09740(P09740终浓度为10、5、2mg/mL)或生理盐水(对照组)，充分混匀后37℃孵育5分钟，随后在全自动血凝仪上检测PT、APTT、TT等指标。

(2)血小板聚集试验：枸橼酸抗凝全血3.5ml，以1100转/分离心5min分离出富血小板血浆(PRP)，剩余样品以3000转/分离心10min分离出PPP血浆。用PPP调整PRP的血小板计数为200～300×109/L，分别加入10％体积的P09740(P09740终浓度分别为10、5、2.5mg/mL)或生理盐水(对照组)，药物与血浆37℃孵育20min后在血小板聚集仪上以光学比浊法检测终浓度5μmol/LADP诱导的血小板聚集率。

(3)统计分析：所有结果均一一列出。以SPSS(版本20.0)统计分析包进行配对t检验，以P<0.05判定差异有统计学意义。

1、正常人体外实验结果

(1)凝血指标：加入多肽P09740后(终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml)，活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血时间(TT)均比对照组显著延长，均具有统计学意义，终浓度0.8mg/ml以上P09740延长APTT具有显著的量效关系，PT、TT未进行剂量探索。具体数据见表1-表2。

表1 受试样本凝血相关指标及纠正试验结果

表2 受试样本凝血相关指标量效关系探索

(2)血小板功能试验：在加入多肽P09740后(终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml)，调整计数后的富血小板血浆(PRP)对ADP诱导的血小板聚集与对照相比均显著降低，且有统计学意义，终浓度0.8～2.5mg/ml时，P09740抑制ADP诱导的血小板聚集具有显著的量效关系，具体数据见表3-表4。

表3 受试样本的血小板聚集相关数据

表4 受试样本的血小板聚集量效关系探索

实施例3多肽抗凝血与抑制血小板聚集功能

APTT是目前常用的筛查内源性凝血系统较敏感的试验，可能的作用靶点为凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ；PT是目前常用筛选外源性凝血系统较敏感的试验，可能的作用靶点为凝血因子Ⅶ、Ⅲ、Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原、纤维蛋白原等；TT反映共同凝血途径中，所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白的时间，也有报道TT作为纤溶系统的筛选试验指标；血小板膜表面的ATP酶作用是防止血小板相互粘聚而形成血栓，而ADP通过血小板膜上的ADP受体抑制表面ATP酶的活性，ADP还可使血小板暴露出磷脂表面，体外ADP诱导血小板聚集实验是进行抗血小板聚集药物筛选的常用实验。

疏血通注射液有效成分为生物提取物，药品提供方前期做过大量的动物试验及临床试验，显示该药有抗凝、抗栓、促纤溶、保护神经等作用。申请人对疏血通体外研究结果显示，PT、TT、APTT等凝血指标有延长，提示该药对外源性凝血途径和内源性凝血途径均有影响；该药物在较高浓度下对多种诱导物引起的血小板聚集以及血小板黏附均有抑制作用，提示药物中的某些成分可能影响了血小板聚集的共同通路。血小板的磷脂表面以及血小板膜糖蛋白IIbIIIa、糖蛋白Ib等都是可能的作用靶点。多肽P09740为疏血通中提取的一种成分，与疏血通的抗凝血与抑制血小板聚集功能比较如下，见表5：

表5 多肽P09740与疏血通抗凝血与抑制血小板聚集功能比较

如表所示，多肽P09740不仅在APTT、PT、TT及抑制ADP诱导血小板聚集活性等于疏血通效果类似，并且在极低的剂量下，即多肽P09740终浓度0.8mg/ml以上具有显著的血小板聚集抑制活性和抗凝活性，且单体成分抗凝活性浓度明显低于疏血通，表明该多肽活性远远强于疏血通。

SEQUENCE LISTING

<110> 牡丹江友搏药业有限责任公司,九芝堂股份有限公司

<120> 一种活性多肽及其应用

<130> 20P150147

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu

1 5 10

Claims (8)

1.一种活性多肽，其特征在于：所述活性多肽肽段序列为VAPEEHPVLL。

2.根据权利要求1所述的活性多肽，其特征在于：所述活性多肽通过全合成获得。

3.根据权利要求1或2所述的活性多肽，其特征在于：所述活性多肽具有抗凝、抗血小板聚集作用。

4.根据权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述活性多肽的抗凝血、抗血小板聚集的浓度不小于0.8mg/ml。

5.权利要求1所述的活性多肽在制备抗凝血药物中的应用。

6.权利要求1所述的活性多肽在制备防治脑卒中药物中的应用。

7.一种抗凝血制剂，由权利要求1所述的活性多肽和药用辅料组成。

8.一种抗脑卒中药物，由权利要求1所述的活性多肽和药用辅料组成。

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