CN117143193B

CN117143193B - 血小板聚集抑制肽、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN117143193B
Application number: CN202311433845.5A
Authority: CN
Inventors: 崔一民; 向倩; 王哲; 邱志维; 翟小田
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2023-11-01
Filing date: 2023-11-01
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2043-11-01
Also published as: CN117143193A

Abstract

本发明公开血小板聚集抑制肽、其制备方法及应用。本发明在大量筛选实验的基础上，发现特定的多肽能够结合至血小板表面PEAR1受体，从而抑制或拮抗血小板聚集功能，由此可作为抗血小板药物，用于预防和治疗血栓、栓塞类疾病。

Description

血小板聚集抑制肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及抗血小板聚集领域，具体地涉及靶向PEAR1受体的血小板聚集抑制肽、其制备方法及应用。

背景技术

抗血小板药物能够抑制血小板聚集功能，是预防和治疗血栓栓塞类疾病的重要药物之一。在短暂性脑缺血发作或缺血性脑卒中患者中，急性期与恢复期使用抗血小板药物治疗可显著改善患者预后。在经皮冠脉介入术后的急性冠脉综合征患者中，抗血小板药物治疗可降低患者不良心血管事件发生风险。因此，抗血小板药物不仅是血栓栓塞类疾病的重要治疗药物，也是众多心血管疾病的二级预防药物，在临床上发挥着重要作用。

目前我国用于临床的抗血小板药物主要靶向三种受体：环氧化酶、P2Y₁₂受体、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受体。阿司匹林是环氧化酶拮抗剂，通过拮抗环氧化酶阻断血栓素A2的合成，从而抑制血小板聚集。但由于环氧化酶广泛分布于血管、胃与肾脏组织中，阿司匹林使用后可引起胃肠道、哮喘等不良反应。氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛是P2Y₁₂受体拮抗剂。P2Y₁₂受体拮抗剂通过抑制二磷酸腺苷与P2Y₁₂受体的结合抑制血小板聚集。但是其临床应用中个体差异大，治疗中出现出血或缺血不良事件，影响患者临床预后。GPIIb/IIIa受体拮抗剂包括阿昔单抗、替罗非班和依替巴肽。抑制GPIIb/IIIa可阻断其与纤维蛋白原等配体的结合并抑制血小板聚集。但GPIIb/IIIa受体抗血小板作用效果过强，仅短期内静脉使用。

因此，现有药物存在可选种类少、个体差异大、存在不良反应且不耐受等缺点，亟需发现与血小板功能相关的新靶点并研发针对新靶点的药物。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供具有结合血小板并抑制其聚集活性的多肽。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的一方面，提供多肽，其具有血小板并抑制其聚集活性，且具有下式所述的结构：

KVIYY-V1 式(I)；

其中，V1表示0-4个氨基酸长度的可变区。

在某些实施方案中，根据本发明所述的多肽，其中，所述可变区选自K、KD、KDG、KDGE。

本发明的第二方面，提供核酸分子，其包含编码第一方面所述的多肽的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供载体分子，其包含本发明所述的核酸分子。

本发明的第四方面，提供宿主细胞，其包含本发明第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体分子。

本发明的第五方面，提供根据第一方面所述多肽的制备方法，其包括通过人工合成方式制备或通过基因工程方式制备。

本发明的第六方面，提供药物组合物，其包含第一方面所述的多肽和/或第二方面所述的核酸分子，和药物学可接受载体。

本发明的第七方面，提供多肽或其核酸分子在制备抗血小板聚集药物中的用途。

本发明的第八方面，提供一种体外抑制血小板聚集的方法，其包括在体外使本发明第一方面所述的多肽与血小板接触的步骤。

针对目前尚无靶向PEAR1受体抑制类药物分子的现状，本发明在大量筛选实验的基础上，发现特定的多肽能够结合至血小板表面PEAR1受体，从而抑制或拮抗血小板聚集功能，由此可作为抗血小板药物，用于预防和治疗血栓、栓塞类疾病。

附图说明

图1 为具有式(I)所示结构的不同多肽序列对应血小板功能抑制情况。

图2 为示例性多肽与PEAR1结合曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本文中，术语“多肽”是指由多个氨基酸残基组成的聚合物，或其变体、合成或天然存在的类似物。因此，多肽适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物。此类衍生物的实例包括但不限于例如翻译后修饰和降解产物，包括焦谷氨酰、异天冬氨酰、蛋白水解的、磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。

本文中，术语“抑制血小板聚集活性”，有时可称作“抗血小板聚集活性”或“抗血小板活性”，是指降低、减少、抑制或阻断血小板聚集的活性，优选抑制率为5%以上，10%以上，优选12%以上，如14%以上，15%以上时的活性。抑制率是指在相同条件下测量时得到的对照组血小板的聚集量与待测血小板的聚集量/对照组血小板的聚集量。抑制率的测定不特别限定，包括使用血小板聚集仪(如Helena AggRAM)记录5min内的血小板聚集抑制测定得到。

多肽

本发明一方面，提供多肽，其为具有结合血小板并抑制其聚集活性的短肽。因其能够靶向结合PEAR1受体，有时可称作“PEAR1受体抑制剂”。一般而言，本发明的多肽的长度为20个氨基酸以下，如18个氨基酸以下，15个氨基酸以下、12个氨基酸以下等。

在某些实施方案中，本发明的多肽具有式(I)所示的结构：

KVIYY-V1 式(I)；

其中，V1表示0-4个氨基酸长度的可变区，优选地，V1选自K、KD、KDG、KDGE；

式(I)中，在V1不存在时，“-”不存在。在V1表示不同氨基酸残基时，“-”表示共价键，如肽键。

示例性地，本发明的多肽选自以下序列之一：

KVIYY(SEQ ID No.1)，

KVIYYK(SEQ ID No.2)，

KVIYYKD(SEQ ID No.3)，

KVIYYKDG(SEQ ID No.4)，

KVIYYKDGE(SEQ ID No.5)。

核酸分子

本发明的一方面，提供核酸分子，其包含编码本发明所述多肽的核苷酸序列。

本发明只要能够产生本发明所述的多肽，则对于核酸分子不特别限定，其包括编码多肽的核苷酸序列和可选的其他序列。示例性的其他序列以可操作的方式与编码多肽的核苷酸序列连接。编码多肽的核苷酸序列可以是包含一个多肽基因的核苷酸序列，也可以是包含多个串联的多肽基因的核苷酸序列。其他序列的实例包括但不限于用于基因表达的控制序列，如启动子、在宿主细胞中具有功能的任何前导子、终止子等。编码多肽的核苷酸序列包括天然编码序列(例如，由技术人员使用可获得的数据库容易确定的序列)或简并序列，例如针对具体宿主细胞设计的密码子优化的编码序列，特别是针对宿主而进行的密码子优化版本。

载体分子

本发明的一方面，提供一种载体分子，其包含本发明所述的核酸分子。

本发明的载体指一种人工构建体，其能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种目的基因或序列。本发明的载体不限定，可以是表达载体、病毒载体等。在某些实施方案中，载体包含编码本发明多肽基因或其前体的目标基因、启动子、终止子，或可选地进一步包含标记基因。载体可使用已知的载体或自行构建的载体。已知载体包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、AAV病毒载体等。

宿主细胞

本发明的一方面，提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体分子。

本发明的宿主细胞是指适于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。宿主细胞包括亲本细胞的任何后代，其由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同。

制备方法

本发明的一方面，提供本发明所述多肽的制备方法。对于制备方法不特别限定，包括通过人工合成或基因工程方式制备。

在某些实施方案中，本发明的多肽通过人工合成方式获得。人工合成多肽的方法在本领域是已知的。具体包括液相和固相两种方法。液相多肽合成方法包括采用BOC保护和Z保护两种。此类方法优选应用短肽合成，特别是本发明的多肽合成。其相对于固相多肽合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。对于本发明的多肽一般采用液相多肽合成。

在某些实施方案中，本发明的多肽通过固相多肽合成方法，其包括采用FMOC保护和采用BOC保护两种方案。具有合成方便，迅速，容易实现自动化等优点。

在某些实施方案中，本发明的多肽通过基因工程表达获得。基因工程表达系统包括原核细胞表达系统、真核细胞表达系统和无细胞系表达系统。其中原核细胞表达系统的实例包括大肠杆菌表达系统。真核细胞表达系统包括酶母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

药物组合物

本发明的一方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的多肽和/或核酸分子，和药物学可接受载体。对于多肽和核酸分子已在上面进行了详细说明，在此不再赘述。下面说明药物学可接受载体。

本发明中，药物学可接受载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。

合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9%盐水(0.9%w/v氯化钠)，和(3)5%(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

用途

本发明的一方面，提供本发明的多肽或其核酸分子在制备抗血小板聚集药物中的用途。

目前现有抗血小板药物一般靶向环氧化酶、P2Y₁₂受体、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受体。与现有药物不同，本发明的多肽能够结合PEAR1，由此抑制或阻断血小板表面PEAR1受体的激活，而该激活能够引起PEAR1胞内区段酪氨酸磷酸化，导致磷酯酰肌醇-3-激酶的磷酸化，引起GPIIb/IIIa的活化和血小板的聚集。

抑制血小板聚集的方法

本发明的一方面，提供一种抑制血小板聚集的方法，其包括使本发明所述的多肽与血小板接触的步骤。本发明的方法可以是体外方法，也可以是体内方法。体外抑制血小板聚集可用于分析或研究血小板功能，进而可用于例如有用化合物的筛选，特别是高能量化合物筛选等。

实施例1

1、实验仪器与试剂

实验仪器：万分之一的电子天平；竖行反应器(20＊25mm，1号砂芯)；离心管；100-1000µl移液枪；1ml移液枪；氮气；循环水式真空泵；洗瓶；试管；长颈吸管；

实验试剂：2-cl树脂；Fmoc- AA-OH；无水DCM；DIEA；甲醇；DCM；工业级DMF；分析纯DMF；20%哌啶/DMF；检测试剂A(5g茚三酮-100ml无水乙醇)、B(分析级吡啶)；HOBT；DIC；

2、实验步骤

(1)电子天平称取2-Cl-Trt树脂500mg，放入25ml反应器中，加入DCM浸泡30分钟。然后用DMF洗3遍，DCM洗1遍。

(2)称取0.15mmol的Fmoc-AA-OH(C端)加入离心管中，并加入8ml无水DMF和800µlDIEA，摇匀。用移液枪吸取溶液加入到上一步的反应器中，氮气鼓泡反应1.5h，反应结束用DMF洗涤树脂3次，每次30s，用加0.5ml DIEA，0.5ml甲醇，2ml DCM的混合液，反应20min。

(3)洗涤：用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干后，用洗瓶向反应器中加入工业级DMF，使树脂完全被溶液浸泡，洗涤30s，然后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，重复该操作4次。

(4)脱Fmoc：用洗瓶加入20%哌啶/DMF溶液至反应器中，试剂体积约占树脂体积的3倍，使树脂完全被溶液浸泡，氮气鼓泡反应20min。

(5)洗涤：按照步骤(3)，并在第五次洗涤过程中将工业级的DMF换成分析纯DMF；

(6)树脂检测：用长颈吸管取反应器中树脂10-20颗置于检测管底部，接着用胶头滴管各取两滴检测试剂A、B滴入试管中，使树脂与检测试剂能够充分接触，然后将试管放入100℃恒温加热2min。

(7)缩合：称取0.5mmol Fmoc- AA-OH(C端第二位)和0.5mmol HOBT(0.075g)于离心管中，用1ml DMF充分溶解后；再加入100µl DIC，混合1min，加入到抽干后的树脂中，氮气鼓泡反应1h。

(8)重复(5)-(7)操作，直到接肽结束。

(9)最后脱除Fmoc，之后进行洗涤，然后用甲醇按照洗涤方法洗涤树脂3次，最后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，真空干燥至树脂呈颗粒状。

实施例2

1、实验方法：

准备16周龄C57BL/6J小鼠，使用20%乌拉坦适量麻醉后，采用3.8%枸橼酸钠抗凝(抗凝:血液=1:9)抽取腹主动脉。90g离心9min取上层血浆，150g离心15min弃上清加入台式液获得洗涤血小板，调整洗涤血小板中血小板数量至3-4×10⁸/mL。移取240μL洗涤血小板，对照组加入5μL生理盐水，实验组加入5μL多肽(终浓度1mg/mL)，37℃孵育5分钟。分别加入磁转子后，分别加入5μL ADP溶液(01905, Sigma: Darmstadt, Germany；终浓度50μM)，在血小板聚集仪(Helena AggRAM)记录5min内的血小板聚集情况，比较实验组与对照组的最大血小板聚集率。

2、实验结果：

结果见图1。图1为具有式(I)所示结构的不同多肽序列对应血小板功能抑制情况。如图所示，根据1、2、3、4、5多肽结果发现KVIYY是保持多肽抗血小板活性的序列。为进一步确认其前端与后端氨基酸延长情况，构建6、7、8、9，结果发现多肽抗血小板活性随氨基酸延长逐渐下降，后端最多可延长四个氨基酸KDGE；构建10、11、12、13、14，结果发现多肽前端延长后抗血小板功能消失。为确认氨基酸可变性，分别替换不同位置氨基酸形成15、16、17多肽，结果发现替换氨基酸后多肽抗血小板活性消失。因此根据以上实验结果，得出具有下式的多肽为活性多肽：

K+V+I+Y+Y+(K)+(D)+(G)+(E) 式(IV)。

其中，“+”表示共价键，“()”表示括号内对应的氨基酸残基为可选氨基酸残基，即可以存在，也可以不存在。

实施例3

本实施例用于实验多肽可以与PEAR1蛋白结合。以下以多肽1为例进行验证。

1、实验方法：

使用氨基偶联试剂通过表面等离子共振仪将人PEAR1重组蛋白固定在Cytiva CM5芯片上。使用PBS-P将多肽1梯度稀释，随后以30 μL/min的流速将蛋白溶液流经芯片，持续120 s，随后解离480 s。使用盐酸甘氨酸溶液(pH 2.0)再生芯片表面，用Biaevaluation程序中1:1结合模型处理得化合物的动力学数据。

2、实验结果：

如图2所示，多肽1可以与PEAR1蛋白结合，结合常数Kd为0.31μM。

实施例4

本实施例用于验证多肽可抑制小鼠体内血小板功能。

1、实验方法：

准备16周龄C57BL/6J小鼠与Pear1基因敲除小鼠，阴性对照组采用C57BL/6J小鼠生理盐水按照0.05ml/10g静脉注射、实验组采用C57BL/6J小鼠1mg/kg多肽1按照0.05ml/10g眼眶静脉注射、阳性对照组采用Pear1基因敲除小鼠生理盐水按照0.05ml/10g静脉注射，等待30分钟。30分钟后按照250mg/kg剂量眼眶静脉注射ADP 0.05ml/10g。观察小鼠在10分钟内的生存情况。

2、实验结果：

阴性对照组小鼠迅速表现为呼吸急促、呼吸困难，90%(9/10)小鼠在10分钟内死亡，存活率为10%。多肽1静脉给药30分钟后可分别增加ADP诱导肺栓塞小鼠的存活率至60%(6/10)，阳性对照组Pear1基因敲除小鼠存活率为75%(9/12)。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims

1.多肽，其特征在于，其具有结合至血小板，并抑制聚集活性，且为如下所示的氨基酸序列中的至少一种：

(1) KVIYY；

(2) KVIYYK；

(3) KVIYYKD；

(4) KVIYYKDGE；

(5) WDVYKVIYYKDGE。

2.核酸分子，其特征在于，包含编码根据权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。

3.核酸载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的核酸分子。

4.宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的核酸载体。

5.根据权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，通过人工合成或基因工程方式制备。

6.药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的多肽和药物学可接受载体。

7.多肽或其核酸分子在制备抗血小板聚集药物中的用途，其特征在于，所述多肽为根据权利要求1所述的多肽，所述核酸分子为根据权利要求2所述的核酸分子。

8.一种体外抑制血小板聚集的方法，其特征在于，包括使根据权利要求1所述的多肽与血小板接触的步骤。