CN110305790A - 一种细胞制备培养系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种细胞制备培养系统及方法，细胞制备培养系统，包括分离培养罐、动力系统和控制器，分离培养罐通过管道网连接所述动力系统；管道网包括主管路和第一分管、第二分管；主管路一端连接所述分离培养罐，另一端分别连接第一分管和第二分管；第一分管分别通过多条前端支管分别连接细胞样品供应部、生理盐水供应部、分离液供应部、细胞培养液供应部和微载体供应部；第二分管分别通过多条后端支管分别连接终产品存储部、中转袋和废液存储部；细胞制备培养方法，包括以下步骤：细胞分离、细胞分选、贴附微载体、细胞扩增，细胞洗涤与收集；提高了细胞培养和生产的效率，保证细胞质量的稳定性，均一性，实验结果的可重复性。

Description

一种细胞制备培养系统及方法

技术领域

本发明涉及细胞制备培养技术领域，具体涉及一种细胞制备培养系统及方法。

背景技术

传统的细胞培养方式为在洁净实验室内通过科研人员采用培养瓶或培养皿进行手工培养，为了培养大量的细胞，需要有高水平操作的技术人员，花费大量的时间，还需要大量的培养瓶和培养空间。因而需要大量的人力和物力，而且培养效率低，另外由于目前无论是人工制备细胞还是采用针对细胞制备所研发的新型技术设备，都不能完全避免人工干预，需要由有经验的专业技术人员操作完成。

由此带来了以下几个问题：

第一，细胞制备效率低，不能实现真正意义上的大规模生产；

第二，制备过程受到人为主观经验影响，终产品质量参差不齐，无法保证质量稳定性，给后续科研和细胞治疗参数选择带来困难；

第三，人工干预带来各种污染风险，且细胞培养时间过长会导致终产品在数量、活性、纯度等要素的安全性无法得到保证，细胞在基因稳定性上有很大的安全隐患。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种培养效率高且有效提高细胞质量稳定性与均一性的细胞制备培养系统及方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种细胞制备培养系统，包括分离培养罐、动力系统和控制器，所述分离培养罐通过管道网连接所述动力系统；

所述管道网包括主管路和第一分管、第二分管；所述主管路一端连接所述分离培养罐，另一端分别连接第一分管和第二分管；所述第一分管分别通过多条前端支管分别连接细胞样品供应部、生理盐水供应部、分离液供应部、细胞培养液供应部和微载体供应部；

所述第二分管分别通过多条后端支管分别连接终产品存储部、中转袋和废液存储部；

所述第一分管、第二分管、前端支管及后端支管上均连接有控制阀，所述动力系统、分离培养罐及控制阀的控制端均电连接到所述控制器；

所述动力系统在所述控制器作用下动作为所述管道网内部介质提供驱动力。

作为优选，所述培养系统还包括通过管道网分别与分离培养罐连通的消化酶供应部、磁珠供应部和非目标细胞存储部，在所述分离培养罐与所述消化酶供应部、与磁珠供应部、与非目标细胞存储部之间的局部管道网上分别连接有控制阀；所述控制阀的控制端均连接所述控制器；

所述分离培养罐与磁珠供应部连接的局部管道网上连接有用于对目标细胞进行分选的磁分选装置。

作为优选，所述培养系统还包括与分离培养罐连通形成独立流路的计数池，用以对细胞计数以及形态观测。

作为优选，所述动力系统为蠕动泵，所述控制阀为电磁阀，每个所述电磁阀自动控制一个管路的通断。

作为优选，所述培养系统还包括设置在管道网各个管路中的流量传感器，用以监测各个管路的流量并将信号传输至控制器。

作为优选，所述培养系统还包括与分离培养罐连通的混合气体供应罐，用以适时提供氧气、二氧化碳、氮气或压缩空气，供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需的各种成分。

本发明还提供一种细胞制备培养方法，其特征在于采用上述细胞制备培养系统执行以下步骤，

S1：从生理盐水供应部将生理盐水引入到管道网，将管道网各个管路中的空气排出至废液存储部；

S2：分别从细胞样品供应部和分离液供应部将细胞样品和分离液分别输送至分离培养罐；

S3：转动分离培养罐，对分离培养罐内的细胞样品和分离液进行物理学密度梯度离心分离，得到分层的PBMC与废弃液；

S4：将分离培养罐内废弃液转移至废液存储部，向分离培养罐中引入生理盐水对PBMC进行洗涤；

S5：洗涤结束后再分别从细胞培养液供应部和微载体供应部向分离培养罐引入细胞培养液和微载体，分离培养罐持续转动完成PBMC在微载体上的贴附和扩增；

S6：重复步骤S4后，通过分离培养罐中的搅拌装置搅拌使得PBMC脱落，再降低分离培养罐转速使微载体沉淀；

S8：收集S6中所述的PBMC输入中转袋，排出分离培养罐中的微载体至废液存储部；

S9：将中转袋中的PBMC再回转至分离培养罐并引入生理盐水进行洗涤，而后获得PBMC终产品并转移至终产品存储部。

作为优选，所述步骤S5中，扩增的步骤包括：

从分离培养罐内采集部分样品进入计数池；

对计数池内的细胞进行计数和形态观察，在细胞数量和形态均达到阈值时输出信号。

作为优选，所述细胞数量阈值设定的步骤包括：

在进行计数和形态观察时，根据单次导入到计数池内的细胞数量绘制生长曲线；

将生长曲线的峰值设定为阈值。

作为优选，所述形态阈值设定的步骤包括：

在计数池中只有细胞而无其他异物时通过显微镜采集成像图片；

提取图片中除细胞之外的异物成像信息；

将异物成像信息转换为数值；

将所述数值设定为所述形态阈值。

与现有技术相比，本发明的有益之处是：

一、将细胞制备培养所需的分离培养罐、细胞样品、清洗单元、试剂供应单元、传输单元、监测单元、动力系统等各个部分集成化处理，并通过操作控制器实现智能化和自动化，相对于传统的人工操作大大提高了细胞培养和生产的效率，节省了科研人员的时间；而且由于生产过程全自动，生产环境、原材料和生产工艺的一致性可确保每一批细胞都是在同等标准条件下制备，保证细胞质量的稳定性，均一性，实验结果的可重复性，并具备了实现大规模生产的条件；

二、避免了人工干预，从而减少了各种污染风险和安全隐患，产品在数量、活性、纯度等要素的安全性也能得到保证。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

下面结合附图对本发明进一步说明：

图1是本发明的细胞培养系统的一实施例的示意图。

1、细胞样品供应部，2、生理盐水供应部，3、分离液供应部，4、细胞培养液供应部，5、微载体供应部，6、消化酶供应部，7、终产品存储部，8、中转袋，9、废液存储部，10、控制阀，11、流量传感器，12、分离培养罐，13、混合气体供应罐，14、计数池，15、前端支管，16、第一分管，17、后端支管，18、第二分管，20、磁分选装置，21、磁珠供应部，22、蠕动泵，23、非目标细胞存储部。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如附图1所示的一种细胞制备培养系统，包括分离培养罐12、动力系统和控制器，所述分离培养罐12通过管道网连接动力系统；所述管道网包括主管路和第一分管16、第二分管18；所述主管路一端连接所述分离培养罐12，另一端分别连接第一分管16和第二分管18；所述第一分管16分别通过多条前端支管15分别连接细胞样品供应部1、生理盐水供应部2、分离液供应部3、细胞培养液供应部4和微载体供应部5；所述第二分管18分别通过多条后端支管17分别连接终产品存储部7、中转袋8、废液存储部9和非目标细胞存储部23；所述第一分管16、第二分管18、前端支管15及后端支管17上均连接有控制阀10，所述动力系统、分离培养罐12及控制阀10的控制端均电连接到控制器；所述动力系统在所述控制器作用下动作为所述管道网内部介质提供驱动力。

在本实施例中，所述管道网内各个管路相互连通，所述管道网可以根据需要进行设计，动力系统以及流量传感器11连接在管道网中，为方便控制，在本实施例中，所述动力系统为蠕动泵22，所述控制阀10为电磁阀，每个所述电磁阀自动控制一个管路的通断，为实现自动化控制，所述蠕动泵22和电磁阀电连接到控制器。

所述控制阀10设置在管道网中，而蠕动泵22同样连接在管道网中，其具体连接方式以及位置根据实际需要进行调整和设计，满足为管道网中的各个管路中的介质流动提供动力即可，控制器控制不同的控制阀使得细胞样品供应部1、生理盐水供应部2、分离液供应部3、细胞培养液供应部4、微载体供应部5和消化酶供应部6，以及终产品存储部7、中转袋8、废液存储部9和非目标细胞存储部23与分离培养罐12之间分别形成互不干涉的独立流路，在实际应用中，通过关闭管道网中不同位置的控制阀，然后控制蠕动泵22，继而能将细胞样品供应部1、生理盐水供应部2、分离液供应部3、细胞培养液供应部4、微载体供应部5和消化酶供应部6中的介质分别单独的抽出并引入至分离培养罐12内，而且也可以控制蠕动泵22将分离培养罐12内的介质单独抽出至终产品存储部7、中转袋8、废液存储部9或非目标细胞存储部23，在此过程中，只需要控制好管道网中相应位置的控制阀即可。

所述蠕动泵22、控制阀10以及分离培养罐12均由控制器自动控制运行，为方便控制，在本实施例中，控制器采用PLC控制器，PLC控制器内设有根据细胞自动培养过程所预先设计的各个设备的逻辑指令输出程序，设置在各个管路中的流量流感器11采集各个流路中的介质流量信息并输送至PLC控制器，PLC控制器输出控制指令至分离培养罐12以及各个控制阀10以及蠕动泵22，实现整个培养系统自动运行。

为方便废液的存储以及细胞在培养过程中的中转，所述培养系统设置有废液存储部9以及中转袋8，两者均连接到管道网，且通过控制阀10分别形成连接分离培养罐12的管路的独立流路，通过控制蠕动泵22提供动力，将分离培养罐12内的废液转移至废液存储部9内，同样可以通过控制蠕动泵22提供动力，将分离培养罐内的细胞转移至中转袋8中。

为能对分离培养罐内的细胞进行样品采样以方便计数以及形态观测等质量监测，所述细胞制备培养系统还包括计数池14，所述计数池14连接在管道网中并在对应位置设置控制阀使计数池14与分离培养罐12连通之间能形成独立流路。

另外，在实际应用中，如果分离培养罐12内还存在非目标细胞，需要采用现有的磁珠分选系统进行细胞分选，分选出非目标细胞，所述磁珠分选系统包括磁珠供应部21以及与管道网连通的磁分选装置20，所述磁珠供应部21为磁分选装置20提供对应标志物的抗体磁珠，磁分选装置通过管道网分别连通分离培养罐12、计数池14和非目标细胞存储部23，在磁分选装置20中洗脱未与磁珠结合的非目标细胞并转移至非目标细胞存储部23，然后去除磁场得到高纯度的目标细胞，完成分选过程。

在本实施例中，如图1所示，以胰岛β细胞的制备为例，其包括以下步骤：

步骤一，开机自检。首先做开机自检，接通本发明所述的细胞制备培养系统电源，通过控制器开启运行，设备开机自检无异常后，选择胰岛细胞制备工艺程序，输入待制备细胞样品的相关信息。

步骤二，预冲管路。设备通过控制器控制蠕动泵22和控制阀10作用自行接通生理盐水供应部2中的生理盐水运转进行预冲，逐步将管道网中的空气排出至废液存储部9。

步骤三，细胞分离。预冲过程结束后，设备通过蠕动泵22和控制阀10作用接入预处理完成的细胞样本和分离液，然后通过分离培养罐12的转动，800G离心15-30分钟，进行物理学密度梯度离心分离。

步骤四，细胞分选。分离结束后先将废弃液转移至废液存储部9，然后将获得的单个核细胞进行1-2次细胞洗涤，即引入生理盐水至分离培养罐12中，500G离心5-10分钟，洗涤过程中采集部分样品进入计数池14进行计数和形态观察等质量监测，然后从磁珠供应部21引入带有胰岛细胞对应标志物抗体的磁珠到分离培养罐12中进行孵育10-20分钟，洗涤除去未结合的抗体磁珠，然后将带抗体磁珠的细胞引入到磁分选装置20进行免疫学磁珠分选，洗脱去除大部分非目标细胞并转移至非目标细胞存储部23，然后移去磁场洗脱获得高纯度的胰岛细胞。

步骤五，贴附微载体。将获得的胰岛细胞通过蠕动泵22和控制阀10作用转移至分离培养罐12，然后从微载体供应部5和细胞培养液供应部4分别引入经过水化处理后培养基浸泡好的微载体和胰岛细胞制备培养所需的细胞培养液，控制并维持培养室环境温度为37℃、5％CO₂浓度，胰岛细胞会经过黏附贴壁、生长、扩展成单层三个阶段逐渐完成和微载体的贴附，前期系统会按照设定好的参数将分离培养罐12的转速控制在40-60转/分钟，将胰岛细胞黏附贴壁过程中剪切力的影响降至最低，也确保细胞在为微载体上得到充分贴附。

步骤六，细胞扩增。分别于接种后1、3、5、7、9、11、13天，从分离培养罐12中采集部分样品进入计数池14进行计数和形态观察等质量监测，观察记录细胞贴附情况，按照监测结果，将分离培养罐暂停3-5分钟，贴附细胞的微载体沉降后，启动蠕动泵22和对应控制阀，将营养物质耗尽的废液抽至废液存储部9，再添加入新鲜的细胞培养液，通过设置在分离培养罐12一侧并与其连通的混合气体供应罐13为细胞提供充足的营养物质，继续在温度为37℃、5％CO₂浓度环境下培养，接种3天后，上调分离培养罐的转速至60-80转/分钟。

步骤七，细胞收获、洗涤、包装。对胰岛细胞进行功能评估和质量检测，从分离培养罐12中采集部分样品进入计数池14进行计数和形态观察等质量监测，确认合格后，先通过分离培养罐12、蠕动泵22和控制阀10作用排尽废液至废液存储部9，然后加入生理盐水进行洗涤，500G/分钟5分钟，从消化酶供应部6引入相应的消化酶进行消化，让分离培养罐12中的搅拌装置快速搅拌80-130转/分钟20-30分钟，让贴壁的胰岛细胞充分脱落下来，避免消化时间过长对细胞的影响，先离心400G/分钟5分钟排尽带消化酶的生理盐水，再加入新的生理盐水进行洗涤，500G/分钟5分钟，缓慢转动分离培养罐40-60转/分钟，让微载体沉淀，细胞体积小沉淀速度相对较慢，收集上清细胞进入中转袋8，再次洗涤确保细胞极大部分收集，然后排出微载体至废液存储部9，冲洗分离培养罐12，将中转袋8中的细胞再回转至分离培养罐洗涤500G/分钟5分钟，最后转移至终产品存储部7中收集和包装，并是用热合封管机封管，获得胰岛细胞终产品。

上述过程中，所述蠕动泵22、控制阀10、分离培养罐22的开启与关闭过程都是在控制器的控制下运行，而控制器根据流量传感器11监测到的流量及时控制蠕动泵22的开闭，从而达到自动控制流量的目的。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞制备培养系统，其特征在于：包括分离培养罐、动力系统和控制器，所述分离培养罐通过管道网连接所述动力系统；

所述管道网包括主管路和第一分管、第二分管；所述主管路一端连接所述分离培养罐，另一端分别连接第一分管和第二分管；所述第一分管分别通过多条前端支管分别连接细胞样品供应部、生理盐水供应部、分离液供应部、细胞培养液供应部和微载体供应部；

所述第二分管分别通过多条后端支管分别连接终产品存储部、中转袋和废液存储部；

所述第一分管、第二分管、前端支管及后端支管上均连接有控制阀，所述动力系统、分离培养罐及控制阀的控制端均电连接到所述控制器；

所述动力系统在所述控制器作用下动作为所述管道网内部介质提供驱动力。

2.根据权利要求1所述的一种细胞制备培养系统，其特征在于：所述培养系统还包括通过管道网分别与分离培养罐连通的消化酶供应部、磁珠供应部和非目标细胞存储部，在所述分离培养罐与所述消化酶供应部、与磁珠供应部、与非目标细胞存储部之间的局部管道网上分别连接有控制阀；所述控制阀的控制端均连接所述控制器；

所述分离培养罐与磁珠供应部连接的局部管道网上连接有用于对目标细胞进行分选的磁分选装置。

3.根据权利要求2所述的一种细胞制备培养系统，其特征在于：所述培养系统还包括与分离培养罐连通形成独立流路的计数池，用以对细胞计数以及形态观测。

4.根据权利要求3所述的一种细胞制备培养系统，其特征在于：所述动力系统为蠕动泵，所述控制阀为电磁阀，每个所述电磁阀自动控制一个管路的通断。

5.根据权利要求4所述的一种细胞制备培养系统，其特征在于：所述培养系统还包括设置在管道网各个管路中的流量传感器，用以监测各个管路的流量并将信号传输至控制器。

6.根据权利要求5所述的一种细胞制备培养系统，其特征在于：所述培养系统还包括与分离培养罐连通的混合气体供应罐，用以适时提供氧气、二氧化碳、氮气或压缩空气，供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需的各种成分。

7.一种细胞制备培养方法，其特征在于：采用上述细胞制备培养系统执行以下步骤，

S1：从生理盐水供应部将生理盐水引入到管道网，将管道网各个管路中的空气排出至废液存储部；

S2：分别从细胞样品供应部和分离液供应部将细胞样品和分离液分别输送至分离培养罐；

S3：转动分离培养罐，对分离培养罐内的细胞样品和分离液进行物理学密度梯度离心分离，得到分层的PBMC与废弃液；

S4：将分离培养罐内废弃液转移至废液存储部，向分离培养罐中引入生理盐水对PBMC进行洗涤；

S5：洗涤结束后再分别从细胞培养液供应部和微载体供应部向分离培养罐引入细胞培养液和微载体，分离培养罐持续转动完成PBMC在微载体上的贴附和扩增；

S6：重复步骤S4后，通过分离培养罐中的搅拌装置搅拌使得PBMC脱落，再降低分离培养罐转速使微载体沉淀；

S8：收集S6中所述的PBMC输入中转袋，排出分离培养罐中的微载体至废液存储部；

S9：将中转袋中的PBMC再回转至分离培养罐并引入生理盐水进行洗涤，而后获得PBMC终产品并转移至终产品存储部。

8.根据权利要求7所述的一种细胞制备培养方法，其特征在于：所述步骤S5中，扩增的步骤包括：

从分离培养罐内采集部分样品进入计数池；

对计数池内的细胞进行计数和形态观察，在细胞数量和形态均达到阈值时输出信号。

9.根据权利要求8所述的一种细胞制备培养方法，其特征在于：所述细胞数量阈值设定的步骤包括：

在进行计数和形态观察时，根据单次导入到计数池内的细胞数量绘制生长曲线；

将生长曲线的峰值设定为阈值。

10.根据权利要求7-9任一项所述的一种细胞制备培养方法，其特征在于：所述形态阈值设定的步骤包括：

在计数池中只有细胞而无其他异物时通过显微镜采集成像图片；

提取图片中除细胞之外的异物成像信息；

将异物成像信息转换为数值；

将所述数值设定为所述形态阈值。