CN101970681A - 细胞观察中的活细胞判别方法、细胞观察的图像处理程序和图像处理装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞观察的图像处理程序，能够以宽松的观察条件进行细胞观察中的活细胞与其以外的异物的判别，该程序包括：取得相隔规定的时间拍摄了位于观察视野内的物体的第1图像和第2图像的步骤(S10)；从取得的各个图像中抽出所包含的物体的像的步骤(S20)；使图像平面上的物体的旋转角度姿势一致，计算出相关值的步骤(S60、S65)；输出对物体的判断结果的步骤(S80、S85)。
Description
技术领域
本发明涉及一种对在细胞观察中取得的图像自动判别活细胞和异物的图像处理技术。
背景技术
作为一边培养活细胞一边观察状况的装置，有一种培养显微镜。培养显微镜具有形成适合细胞培养环境的培养装置(保温箱)、和对被收容在培养装置中的培养容器内的细胞的状态进行显微观察的显微观察系统，每隔预先设定的规定时间，拍摄并取得细胞的观察图像，把拍摄的图像，采用例如隔时图像回放等方法进行连续映像回放，从而能够容易目视观察细胞的活动状况(例如参照专利文献1)。
这样的装置，在培养容器中除了观察对象的活细胞以外，有时会混入灰尘、气泡、以及细胞的残骸等那样的异物(非对象物)。因此，例如在进行细胞的跟踪时，作为判别观察对象和非对象物的方法，是通过检测细胞核或细胞质等的有无来判断是否是活细胞。
专利文献1：日本特开2004-229619号公报
但是，进行观察视野内的细胞全体的运动解析等比较低倍的观察、和不能清楚观察细胞的内部构造的观察系统等，多数情况难以检测出细胞核等的纹理，因此不适合采用上述的方法。
发明内容
本发明就是鉴于上述问题而提出的，其目的是提供一种能够以宽松的观察条件进行细胞观察中的活细胞和其以外的异物的判别的技术。
根据本发明的第1实施方式，提供一种细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到位于观察视野内的物体的第1图像和第2图像；抽出映入到第1图像中的物体的第1像、和映入到第2图像中的物体的第2像，并且使图像平面上的物体的旋转角度姿势一致；计算出旋转角度姿势一致时的第1像与第2像的相关值或差量；根据计算出的相关值或差量，判断物体是否是活细胞。
根据本发明的第2实施方式，提供一种细胞观察的图像处理程序，其特征在于，包括：取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到位于观察视野内的物体的第1图像和第2图像的步骤；从所取得的所述第1图像和所述第2图像，抽出映入到第1图像中的物体的第1像、和映入到第2图像中的物体的第2像，并且使图像平面上的物体的旋转角度姿势一致的步骤；计算出旋转角度姿势一致时的第1像与第2像的相关值或差量的步骤；根据计算出的相关值或差量，判断物体是否是活细胞的步骤；输出针对物体的判断结果的步骤。
根据本发明的第3实施方式，提供一种细胞观察的图像处理装置，其特征在于，具有：拍摄物体的摄像装置；图像解析部，其取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到物体的第1图像和第2图像，根据映入到第1图像中的物体的第1像、和映入到第2图像中的物体的第2像，判断物体是否是活细胞；输出部，其把由图像解析部判断出的判断结果输出到外部，并且构成为，图像解析部抽出第1像、和第2像，并使图像平面上的物体的旋转角度姿势一致，计算出旋转角度姿势一致后的第1像与第2像的相关值或差量，根据计算出的相关值或差量，判断物体是否是活细胞。
根据这样的细胞观察中的活细胞的判别方法、细胞观察的图像处理程序、和细胞观察的图像处理装置，根据时间系列的观察图像中包含的物体的像彼此的相关，判别是否是活细胞。因此，可提供一种即使是比较低倍率的观察、或不能清楚观察细胞内部构造的观察系统等，也能够识别活细胞和其以外的异物的技术。
附图说明
图1是活细胞判别的图像处理程序GP的流程图。
图2是作为本发明的适用例的培养观察系统的概要结构图。
图3是上述培养观察系统的方框图。
图4是举例说明进行细胞的轮廓抽出的轮廓抽出处理的状况的模式图。
图5是用于说明在时刻t-1的图像中包含的物体与在时刻t的图像中包含的物体的对应关系的说明图。
图6是举例表示从时刻t-1到时刻t的活细胞的变化状态的模式图。
图7是举例表示从时刻t-1到时刻t的活细胞以外的物体的变化状态的模式图。
图8是举例表示随着时间的经过的活细胞的变化状态的模式图。
图9是举例表示随着时间的经过的活细胞以外的物体的变化状态的模式图。
图10是表示图像处理装置的概要结构的方框图。
图11是举例表示活细胞和异物的判别显示的模式图(1)。
图12是举例表示活细胞和异物的判别显示的模式图(2)。
附图标记说明：BS-培养观察系统；GP-图像处理程序；C-观察细胞；54宏观观察系统；54c-摄像装置；55-显微观察系统；55c-摄像装置；100-图像处理装置；120-图像解析部；130-输出部。
具体实施方式
下面，参照附图，对用于实施本发明的实施方式进行说明。作为应用本发明的细胞观察的图像处理装置的系统的一例，在图2和图3中分别图示了培养观察系统的概要结构图和方框图。
该培养观察系统BS大体上由设在箱体1的上部的培养室2、收容保持多个培养容器10的货架状的储料器3、观察培养容器10内的试验料的观察单元5、把培养容器10在储料器3与观察单元5之间搬运的搬运单元4、控制系统的动作的控制单元6、具备了图像显示装置的操作盘7等构成。
培养室2是形成并维持根据要培养的细胞的种类和目的等的培养环境的室，为了防止环境变化和污染，在投入样品后保持密闭状态。作为培养室2的附带设备，设有使培养室内的温度升温、降温的温度调整装置21、调整湿度的加湿器22、供应CO2和N2等气体的气体供应装置23、用于使培养室2整体的环境均匀的循环风扇24、检测培养室2的温度和湿度的环境传感器25等。由控制单元6控制各个设备的动作，把基于培养室2的温度、湿度、二氧化碳浓度等的规定的培养环境维持在与在操作盘7中设定的培养条件一致的状态。
储料器3形成为在图2中的与纸面正交的前后方向和上下方向分别被分隔为多个的货架状。对各个货架分别设有固有地址，例如在把前后方向设为A～C列、把上下方向设为1～7层的情况下，A列5层的货架被设定为A-5。
培养容器10具有烧瓶、盘、井板等种类，并具有圆形、方形等形态和尺寸，可根据要培养的细胞的种类和目的，选择使用适宜的容器。在本实施方式中，举例说明了使用盘的结构。把细胞等的试验料、与添加了酚红等pH试剂的液体培养基一同注入培养容器10中。对培养容器10付与代码编号，与储料器3的指定编号对应收容。另外，在培养容器10中，根据容器的种类和形态等形成的搬送用容器托架，在被装入的状态下被收容保持在各个货架中。
搬送单元4由在培养室2内部可上下方向移动设置的，基于Z轴驱动机构升降的Z台41、可前后方向移动地安装在Z台41上的基于Y轴驱动机构而前后移动的Y台42、和可左右方向移动地安装在Y台42上的基于X轴驱动机构而向左右移动的X台43等构成，在相对Y台左右移动的X台43的前端侧设有将培养容器10抬起支撑的支撑臂45。搬送单元4构成为使支撑臂45具有在储料器3的全部货架与观察单元5的试验料台15之间可移动的移动范围。X轴驱动机构、Y轴驱动机构、Z轴驱动机构例如由滚珠丝杠和带编码器的伺服电机构成，由控制单元6控制其工作。
观察单元50由第1照明部51、第2照明部52、第3照明部53、进行试验料的宏观观察的宏观观察系统54、进行试验料的微观观察的微观观察系统55、图像处理装置100等构成。试验料台15由具有透光性的材质构成，并且在显微观察系统55的观察区域设有透明窗部16。
第1照明部51由设在下部框架1b侧的面发光光源构成，从试验料台15的下侧对培养容器10整体进行背光照明。第2照明部52具有LED等光源、和由相位环和聚光透镜等构成的照明光学系统，并被设置在培养室2内，从试验料台15的上方沿着显微观察系统5的光轴，对培养容器中的试验料进行照明。第3照明部53具有由可分别射出适合进行落射照明观察和荧光观察的波长的光的多个LED和水银灯等光源、和把从各个光源射出的光重叠在显微观察系统55的光轴上的分光镜和荧光滤镜等构成的照明光学系统，其被配置在培养室2下侧的下部框架1b内，从试验料台15的下方沿着显微观察系统5的光轴，对培养容器中的试验料进行照明。
宏观观察系统54具有观察光学系统54a、和对由观察光学系统成像的试验料的像进行拍摄的CCD照相机等摄像装置54c，其位于第1照明部51的上方，并被设在培养室2内。宏观观察系统54拍摄由第1照明部51背光照明的培养容器10的从上方观察的整体观察图像(宏观像)。
微观观察系统55具有由物镜、中间变倍透镜、和荧光滤镜等构成的观察光学系统55a、和拍摄由观察光学系统55a成像的试验料的像的，冷却CCD照相机等摄像装置55c，其被设置在下部框架1b的内部。分别设置有多个物镜和中间变倍透镜，并且构成为使用省略了详细图示的转换器和滑块等变位机构可设定多个倍率的结构，其根据初始选择的透镜设定，能够在例如2倍～80倍等的范围内变倍。显微观察系统55拍摄通过显微镜观察了由第2照明部52照明的，透过了细胞的透过光、或由第3照明部53照明的，从细胞反射的反射光、或由第3照明部53照明的，从细胞发出的荧光的显微观察像(微观像)。
图像处理装置100对从宏观观察系统的摄像装置54c和显微观察系统的摄像装置55c输入的信号进行A/D转换，并且实施各种图像处理，生成整体观察图像或显微观察图像的图像数据。另外，图像处理装置100对这些观察图像的图像数据实施图像解析，进行隔时图像的生成和细胞的移动量计算、细胞的运动状态的解析等。图像处理装置100具体是通过执行在后述的控制装置6的ROM中保存的图像处理程序构筑而成。另外，关于图像处理装置100，将在后面详细说明。
控制单元6具有CPU61、设定并保存了控制培养观察系统BS的动作的控制程序、用于保存控制各部的数据的ROM62、暂时保存图像数据等的RAM63等，并且构成为由数据总线把这些连接的结构。控制单元6的输入输出口与培养室2中的温度调整装置21、加湿器22、气体供应装置23、循环风扇24、环境传感器25、搬送装置4中的X、Y、Z台43、42、41的各轴的驱动机构、观察单元5中的第1、第2、第3照明部51、52、53、宏观观察系统54、显微观察系统55、操作盘7中的操作面板71、和显示屏72等连接。从上述各部向CPU61输入检测信号，由CPU61根据预先设定的控制程序，控制上述各部。
在操作盘7上设有：设置了键盘、片式开关、和对磁记录介质或光盘等进行信息的读出和写入的读/写装置等输入输出装置的操作面板71、以及显示各种操作画面和图像数据等的显示屏72，通过一边参照显示屏72，一边利用操作面板71输入观察程序(动作条件)的设定和条件选择、和动作指令等，通过CPU61使培养观察系统BS的各部动作。即，CPU61根据来自操作面板71的输入，进行培养室2的环境调整、培养室2内的培养容器10的搬送、基于观察单元5的试验料的观察、取得的图像数据的解析、和在显示屏72上的显示等。在显示屏72上，除了显示动作指令和条件选择的输入画面以外，还显示培养室2的环境条件的各个数值、被解析的图像数据、和发生异常时的警告等。另外，CPU61通过根据有线或无线的通信规格构成的通信部65，能够在与外部连接的计算机等之间进行数据的发送接收。
RAM63中记录有在操作面板71上设定的观察程序的动作条件、例如培养室2的温度和湿度等环境条件、每个培养容器10的观察时间安排、观察单元5中的观察种类、观察位置、观察倍率等观察条件等。另外，还记录有被收容在培养室2中的各个培养容器10的代码编号、收容了各个代码编号的培养容器10的储料器3的收纳地址等培养容器10的管理数据、和在图像解析中使用的各种数据。在RAM63中，设有记录由观察单元5拍摄的图像数据的图像数据存储区域(后述的图像存储部110)，在各个图像数据中，与其对应地记录有包括培养容器10的代码编号和摄影时间的索引数据。
这样概要构成的培养观察系统BS，根据在操作盘7上设定的观察程序的设定条件，由CPU61根据在ROM62中保存的控制程序控制各部的动作，同时自动地进行培养容器10内的试验料的摄影。即，如果通过对操作面板71的面板操作(或通过通信部65的远程操作)开始了观察程序，CPU61读取出在RAM64中保存的环境条件的各个条件值，同时检测出从环境传感器25输入的培养室2的环境状态，根据条件值与实测值的差异，使温度调整装置21、加湿器22、气体供应装置23、循环风扇24等动作，对培养室2的温度、湿度、二氧化碳浓度等培养环境进行反馈控制。
另外，CPU61读取出在RAM63中保存的观察条件，根据观察时间安排，使搬送单元4的X、Y、Z台43、42、41的各轴的驱动机构动作，把观察对象的培养容器10从储料器3搬送到观察单元5的试验料台15，开始观察单元5的观察。例如，在观察程序中设定的观察是宏观观察的情况下，把由搬送单元4从储料器3搬送来的培养容器10定位在宏观观察系统54的光轴上，并载置在试验料台15上，使第1照明部51的光源点灯，从被背光照明的培养容器10的上方，由摄像装置54c拍摄整体观察像。从摄像装置54c被输入到控制装置6的信号由图像处理装置100进行处理，生成整体观察图像，其图像数据与拍摄时间等索引数据等一同被记录在RAM63中。
另外，在观察程序中设定的观察是对培养容器10内的特定位置的试验料的微观观察的情况下，把由搬送单元4搬送来的培养容器10的特定位置定位在显微观察系统55的光轴上，并把其载置在试验料台15上，使第2照明部52或第3照明部53的光源点灯，由摄像装置55c拍摄基于透过照明、落射照明、荧光的显微观察像。由摄像装置55c拍摄的，被输入到控制装置6的信号，由图像处理装置100进行处理，生成显微观察图像，该图像数据与拍摄时间等索引数据等一同被保存在RAM63中。
CPU61对被收容在储料器3中的多个培养容器的试验料，按照基于观察程序的30分钟～2小时左右的时间间隔的观察时间安排，顺序进行上述那样的观察，并顺序进行整体观察像和显微观察像的摄影。另外，在本实施方式中，摄影的时间间隔可以固定，也可以不同。摄影的整体观察像和显微观察像的图像数据，与培养容器10的代码编号一同被保存在RAM63的图像数据存储区域(图像存储部110)中。被记录在RAM63中的图像数据，根据从操作面板71输入的图像显示指令，被从RAM63中读出，在操作盘7的显示屏72上显示指定时刻的整体观察图像和显微观察图像(单体图像)、或指定时间层的整体观察像和显微观察像的隔时图像。
在如上述那样构成的培养观察系统BS中，图像处理装置100不仅具有细胞的运动解析和细胞的跟踪等功能，而且为了高效率执行这些功能，还具有判别作为观察对象的活细胞、和除此以外的灰尘、气泡、细胞残骸等异物(非对象物)的功能。
基于图像处理装置100的活细胞的判别方法是，取得利用摄像装置每隔规定的时间间隔拍摄了位于观察单元5的观察视野内的物体的2枚图像，抽出在这些图像中表示物体的像，使图像平面上的物体的旋转角度姿势(细胞的方位角)一致，计算出两者的相关值或差量，根据计算出的相关值或差量，判断物体是否是活细胞。
(前处理)
在活细胞的判别处理之前，抽出在图像内包含的物体(包含活细胞和灰尘等异物的物体的区域，以下称为物体)O的最外轮廓。图4是表示该最外轮廓抽出处理的状况的模式图，取得由摄像装置55c(54c)拍摄的时刻t的图像(为了便于说明，称为第1图像)(a)、和在比第1图像提前规定的时间拍摄的时刻t-1的图像(称为第2图像)，对这些图像，如(b)所示那样抽出物体O的最外侧的轮廓。在该最外轮廓抽出处理中，例如可以采用基于辉度值进行二值化的方法、在实施了分散过滤后使其二值化的方法、和Snakes、和Level Set等动态轮廓抽出方法等。对于上述的规定时间，根据作为观察对象的活细胞的运动状况进行设定，例如，在活细胞的运动比较活跃的情况下，把时间设定为10分钟～1小时左右，在活细胞的运动比较缓慢的情况下，把时间设定为30分钟～2小时的程度。
这样，对分区的各个物体O实施标定，取得第1图像中包含的物体O1、O2、O3、...、On、与在第2图像中包含的物体O1’、O2’、O3’、...、On’的对应关系。例如，图5中用实线表示第1图像中的各个物体，用虚线表示第2图像中的各个物体那样，对被实施了标定的各个物体，把最接近的标识彼此，作为相同的物体来取得对应关系，使O1与O1’对应、O2与O2’对应、O3与O3’对应、...、On与On’对应。
(活细胞的判别)
然后，对相互对应的各个物体，使第1图像的物体像(第1像)和第2图像的物体像(第2像)在图像平面上的旋转角度姿势(细胞的方位角)一致。作为其具体的方法是，对相互对应的各个物体(例如，O1与O1’)，计算出通过图心(重心)的轴圆周的截面二次矩(惯性力矩)，在第1像的截面二次矩I1与第2像的截面二次矩I2的相关值成为最大的角度位置下，使第1像与第2像的旋转角度一致。另外，也可以构成为使用椭圆形近似了各个物体O的椭圆模型的长轴方向一致。另外，在物体的轮廓形状接近圆形的情况下，对第1像或第2像的一方，一边使其在通过图心的轴的圆周逐步旋转一定的角度，一边计算2个像的相关，在相关值成为最大的角度下，使其一致。
另外，也可以构成为在第1像的截面二次矩I1和第2像的二次力矩I2的差量成为最小时的角度下，使旋转角度姿势一致。另外也可以构成为，对第1像或第2像的一方，一边使其在通过图心的轴的圆周逐步旋转一定的角度，一边计算2个像的差量，在第1像与第2像的差量成为最小的角度下，使其一致。
这里，在成为相关计算对象的物体Ox是活细胞的情况下，如图6所示，随着时间的经过，不仅外形，而且内部构造也从Ox向Ox’变化。因此，第1像和第2像的相关值不会成为特别大的值，一般采用0.7以下的值。而成为相关计算对象的物体Oy是灰尘、细胞残骸、气泡等异物的情况下，如图7所示，在从Oy到Oy’的过程中，几乎不发生随着时间的构造变化。因此，旋转角度姿势一致时的第1像和第2像的相关值大，成为接近1的值。
因此，使相互对应的物体的旋转角度姿势一致，计算相关值，通过判断计算出的相关值是否小于规定的阈值，可判断出该物体是否活细胞、还是灰尘或细胞的残骸、气泡等异物。另外，对于上述“规定的阈值”，可根据细胞的种类和活动状况、进行观察的时间间隔等选择适宜的值，例如，可以在0.5～0.8左右的范围内进行选择设定。
另外，作为提高判别精度的方法，提出有一种把作为时间系列采用的区间(时间间隔)延长，在进行了充分的时间的跟踪后，取得相互的相关的方法。根据这样的方法，在如图8所示那样物体O是活细胞的情况下，随着时间的经过，相关值变小，而在如图9所示那样物体O是异物的情况下，即使经过了时间后，相关值还是接近1的值，活细胞阈异物的相关值之差被明显表示出。因此，能够利用位于中间的阈值，明确分离出活细胞和异物，从而可提高判别精度。
下面，参照图10和图1，对在培养观察系统BS的图像处理装置100中执行的图像解析的具体应用程序进行说明。这里，图10是表示执行活细胞判别图像处理的图像处理装置100的概要结构的方框图，图1是活细胞判别的图像处理程序GP的流程图。
图像处理装置100具有取得并保存由摄像装置55c(54c)以规定的时间间隔拍摄的第1图像和第2图像的图像存储部110、根据在第1图像中包含的物体O的第1像、和在第2图像中包含的物体O的第2像，判断物体O是否是活细胞的图像解析部120、和把由图像解析部120判断的判断结果输出到外部的输出部130，并且构成为，把由图像解析部120判断为是否是活细胞的判断结果，例如输出到显示屏72进行显示。图像处理装置100由CPU61读取出被预先设定保存在ROM62中的图像处理程序GP，构成为由CPU61顺序执行基于图像处理程序GP的处理。
基于图像解析部120的图像解析处理，除了读出以规定的时间间隔拍摄的，已经被保存在图像存储部110(RAM63的图像存储区域)中的多个图像数据，对其执行该处理以外，还能够从摄像装置取得当前正在观察的观察图像，对其实施该处理。在本实施方式中，对根据预先设定的观察程序，在每隔规定的时间进行所指定的培养容器10内的细胞的显微观察的过程中，进行在由摄像装置拍摄的图像中包含的物体是否是活细胞的判别的情况进行说明。
如上述那样，培养观察系统BS根据在观察程序中设定的观察条件，每隔规定的时间进行所指定的培养容器内的细胞观察。具体是，CPU61使搬送单元4的各轴的驱动机构动作，从储料器3把观察对象的培养容器10搬送到观察单元5，由摄像装置55c对基于显微观察系统55的观察像进行拍摄。
图像处理装置100在步骤S10中取得由摄像装置55c拍摄的观察图像，在步骤S15中，把取得的观察图像与培养容器的代码标号、观察位置、观察时刻等索引数据一同保存在图像存储部110中，然后进入步骤S20。另外，图像处理装置100每隔规定的时间，反复执行根据观察程序的上述观察图像的取得(步骤S10)、和向图像存储部110的保存(步骤S15)。
在步骤S20，对从摄像装置55c取得的时刻t的观察图像(第1图像)、和在规定的时间前的时刻t-1由摄像装置拍摄的，被保存在图像存储部110中的观察图像(第2图像)，在图像解析部120中执行物体的最外轮廓抽出处理，如图4(b)所示那样，抽出在各个观察图像中包含的物体的最外轮廓，然后进入步骤S30。
在步骤S30中，对被抽出了最外轮廓的第1图像和第2图像的各个物体O实施标定，并且例如图5所示那样，把第1图像中的各个物体(实线标记：O1、O2、O3、...、On)、与在第2图像中的各个物体(虚线标记：O1’、O2’、O3’、...、On’)的对应关系，以使最接近的标识彼此(O1与O1’O2与O2’、O3与O3’、...、On与On’)是相同的物体的方式进行相互对应。
然后，对相互对应的各个物体，例如On与On’，使第1图像的物体On的第1像、和第2图像的物体On’的第2像在图像平面上的旋转角度姿势一致，计算出第1像和第2像的相关值。
在图1所示的结构例中，在步骤S40中，对物体On的第1像和物体On’的第2像进行椭圆近似，计算出所近似的椭圆的长轴方向(或短轴方向)，并且计算出被近似的椭圆的长短轴比，在步骤S50中，判断计算出的椭圆的长短轴比是否充分大。在步骤S40中计算出的椭圆的长短轴比(长轴的长度/短轴的长度)相对1是充分大的情况(例如是2以上的情况)下，即使考虑到活细胞的外形变形，也能够通过使近似的椭圆的长轴方向一致，以高精度使物体的旋转角度姿势(方位角)一致。
但是，在长短轴比接近1的情况下，物体的轮廓形状接近圆形，采用使椭圆的长轴方向一致的方法，使活细胞的旋转角度姿势一致的精度不充分。因此，在步骤S50中判断近似椭圆的长短轴比是否充分大，在长短轴比充分大的情况下，进入步骤S60，在否定的情况下进入步骤S65。长短轴比的判断基准值被保存在RAM63的参数设定区域115中，在操作面板71上，可根据观察对象来变更设定。另外，关于椭圆近似的判断基准，也可以不用长轴与短轴的单纯比率，而采用长轴与短轴的差量、短轴或长轴的长度/(短轴的长度+长轴的长度)等，能够判别椭圆和圆的其他基准。
在步骤S60中，使近似了物体On的第1像的椭圆(称为第1椭圆)、和近似了物体On’的第2像的椭圆(称为第2椭圆)的长轴方向一致，由此，在第1像的旋转角度姿势和第2像的旋转角度姿势一致的状态下，计算出相关值。此时，椭圆的长轴方向是以图心为中心的左右2个方向，由于有时细胞的头和脚朝向相反的方向，所以对0度方向和180度方向的2个方向计算出相关值，把相关值大的一方作为第1像与第2像的相关值采用，然后进入步骤S70。
在步骤S65中，把第1像或第2像的一方，一边向图心的圆周以一定的角度间隔逐步旋转，一边计算出各个角度位置的相关值。例如，把时刻t的物体On的第1像，向图心的圆周以5度～10度左右的一定角度逐步旋转360度，计算出在各个角度位置的与t-1的物体On’的第2像的相关值。然后，把相关值成为最大的角度位置的相关值作为第1像与第2像的相关值采用，然后进入步骤S70。
在步骤S70中，判断在步骤S60或步骤S65中采用的第1像和第2像的相关值是否小于规定的阈值。如对比参照图6和图7进行说明那样，在物体On、On’是活细胞的情况下，由于随着时间的经过，其外形形状和内部构造都变化，所以第1像和第2像虽然作为同一细胞而具有一定的相关，但相关值不会成为很大的值，一般是0.7以下的值。而在物体On、On’是灰尘、细胞的残骸、气泡等的情况下，即使经过了时间，其外形和内部构造也几乎不变化，第1像和第2像的相关值成为接近1的值。
上述“规定的阈值“是关注这样的活细胞与其他异物的相关值的差异而设定的判别基准值，在一般的活细胞的隔时观察中，选择0.6～0.7左右的阈值，并把其设定保存在RAM63的参数设定区域115中。另外，最佳的阈值根据观察对象的活细胞的种类和活动状况、进行显微观察的时间间隔等观察条件而微妙变化。因此，在图像处理装置100中，构成为可以根据观察条件来变更设定阈值，通过利用操作面板71调出判别基准的阈值，进行变更操作，能够在例如0.5～0.8左右的范围内变更设定。
另外，对于活细胞的判别基准，也可以不采用第1像与第2像的相关值，而采用第1像与第2像的差量等基准。在使用差量的情况下，只要对应观察条件，根据经验设定阈值即可。
这样，在步骤S70中，判断物体On的第1像、和物体On’的第2像的相关值是否小于规定的阈值，在判断为相关值小于规定的阈值的情况下，在步骤S80中从输出部130输出表示物体On、On’是活细胞的判定结果，在判断为相关值等于或大于规定的阈值的情况下，在步骤S85中，从输出部130输出表示物体On、On’不是活细胞的判定结果。
图像显示装置100对在第1图像和第2图像中包含的各个物体O1、O2、O3、...、On反复执行上述的处理，从输出部130输出对每个物体的判定结果。从输出部130输出的对各个物体的判定结果被显示在操作盘7的显示屏72上，显示在时刻t拍摄的第1图像、或时刻t的第1图像和时刻t-1的第2图像的双方中，各个物体O1、O2、O3、...、On是否是活细胞。
作为具体的显示形态，例如可采用，如图11所示那样，附加表示是活细胞的记号L、和表示是异物的记号D，进行显示，或者，用不同的颜色显示活细胞和其以外的异物，或如图12所示那样，对异物进行涂抹显示，或者，显示除去了异物的图像等，区别活细胞和其以外的异物，进行显示等的界面。另外，可以构成为，把从输出部130输出的上述那样的判别数据，通过通信部65发送给外部连接的计算机等，使其显示同样的图像，或把该数据作为用于进行细胞的运动解析和细胞的跟踪等的基础数据使用。
由此，观察者通过参照被显示在显示屏72上的图像、或被显示在外部连接的计算机等显示装置上的图像，可立即判断出观察中的(或已经完成了观察图像的取得的)各个图像中包含的物体是否是活细胞。另外，通过使用这样地判别出活细胞和异物的数据，能够在把异物分离出后，高效率地进行活细胞的运动解析和跟踪的图像处理。
如以上说明的那样，根据本发明的图像处理程序GP、通过执行该图像处理程序而构成的活细胞的判别方法以及图像处理装置100，由于根据时间系列的观察图像中包含的像彼此的相关，判别是否是活细胞，所以，即使在以比较低倍率的观察中、或使用不能清楚观察到细胞的内部构造的观察系统等，也能够识别出活细胞和灰尘、细胞残骸等异物。因此，可提供一种能够以宽松的观察条件进行细胞观察中的活细胞和其以外的异物的判别。
Claims (15)
1.一种细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，
取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到位于观察视野内的物体的第1图像和第2图像；
抽出映入到所述第1图像中的所述物体的第1像、和映入到所述第2图像中的所述物体的第2像，并且使图像平面上的所述物体的旋转角度姿势一致；
计算出所述旋转角度姿势一致的所述第1像与所述第2像的相关值或差量；
根据计算出的所述相关值或差量，判断所述物体是否是活细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的相关值成为最大时的角度。
3.根据权利要求1所述的细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的差量成为最小时的角度。
4.根据权利要求1所述的细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，一边使所述第1像或所述第2像围绕通过图心的轴旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的相关之后，所述第1像与所述第2像的相关值成为最大时的角度。
5.根据权利要求1所述的细胞观察中的活细胞的判别方法，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即、一边使所述第1像或所述第2像在通过图心的轴圆周旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的差量之后，所述第1像与所述第2像的差量成为最小时的角度。
6.一种细胞观察的图像处理程序，其特征在于，包括：
取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到位于观察视野内的物体的第1图像和第2图像的步骤；
从所取得的所述第1图像和所述第2图像，抽出映入到所述第1图像中的所述物体的第1像、和映入到所述第2图像中的所述物体的第2像，并且使图像平面上的所述物体的旋转角度姿势一致的步骤；
计算出所述旋转角度姿势一致的所述第1像与所述第2像的相关值或差量的步骤；
根据计算出的所述相关值或差量，判断所述物体是否是活细胞的步骤；
输出针对所述物体进行判断后的判断结果的步骤。
7.根据权利要求6所述的细胞观察的图像处理程序，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的相关值成为最大时的角度。
8.根据权利要求6所述的细胞观察的图像处理程序，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的差量成为最小时的角度。
9.根据权利要求6所述的细胞观察的图像处理程序，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，一边使所述第1像或所述第2像围绕通过图心的轴旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的相关之后，所述第1像与所述第2像的相关值成为最大时的角度。
10.根据权利要求6所述的细胞观察的图像处理程序，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，一边使所述第1像或所述第2像围绕通过图心的轴旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的差量之后，所述第1像与所述第2像的差量成为最小时的角度。
11.一种细胞观察的图像处理装置，其特征在于，具有：
拍摄物体的摄像装置；
图像解析部，其取得由摄像装置相隔规定的时间拍摄到所述物体的第1图像和第2图像，根据映入到所述第1图像中的所述物体的第1像、和映入到所述第2图像中的所述物体的第2像，判断所述物体是否是活细胞；
输出部，其将由所述图像解析部判断出的判断结果输出到外部，
并且构成为，所述图像解析部抽出所述第1像和所述第2像，并且使图像平面上的所述物体的旋转角度姿势一致，计算出所述旋转角度姿势一致后的所述第1像与所述第2像的相关值或差量，根据计算出的所述相关值或差量，判断所述物体是否是活细胞。
12.根据权利要求11所述的细胞观察的图像处理装置，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的相关值成为最大时的角度。
13.根据权利要求11所述的细胞观察的图像处理装置，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，所述第1像的截面二次矩与所述第2像的截面二次矩的差量成为最小时的角度。
14.根据权利要求11所述的细胞观察的图像处理装置，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，一边使所述第1像或所述第2像围绕通过图心的轴旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的相关之后，所述第1像与所述第2像的相关值成为最大时的角度。
15.根据权利要求11所述的细胞观察的图像处理装置，其特征在于，
所述物体的旋转角度姿势在如下的角度下相互一致，即，一边使所述第1像或所述第2像围绕通过图心的轴旋转，一边计算出了所述第1像与所述第2像的差量之后，所述第1像与所述第2像的差量成为最小时的角度。
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