CN103194390A - 双环路振荡灌注式生物反应系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及应用于种子细胞与生物材料共培养的双环路振荡灌注式生物反应系统。该生物反应系统包括：支架灌注培养装置，其内部容纳有多个用于种子细胞和生物材料共培养的支架；储液瓶，用于将瓶内的培养液通过输液管输送到支架；回收瓶，用于通过输液管接收从支架灌注培养装置流出的培养液；储液瓶和回收瓶通过各自的三通管来控制培养液的流向，以致在灌注换液通路和灌注培养通路中间切换；蠕动泵，设置在灌注换液通路与灌注培养通路中，用于控制通过输液管的培养液的流速。本发明实现了振荡和灌注方法的结合，保证生物材料内部的种子细胞得到充分物质交换以及应力刺激，提高工程化组织的生产效率，能够满足大规模分类培养的需要。

Description

双环路振荡灌注式生物反应系统

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及一种使用组织工程技术构建人工组织或器官的生物反应器，尤其是涉及应用于种子细胞与生物材料共培养的双环路振荡灌注式生物反应系统。

背景技术

    当前组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、工程化组织或器官的体内、外构建以及组织工程的临床应用。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，模拟细胞在体内的立体生存环境，更有助于细胞本质特性的发挥，这与传统的二维培养（细胞培养）方式有着本质的区别。随着三维细胞培养技术的兴起，越来越多的研究着眼于如何提高生物材料内部种子细胞的增殖速率和功能发挥，以便更快、更好的获得满足科研和临床需要的工程化组织或器官。生物反应器以其能够对细胞进行动态三维培养、细胞增殖代谢快、可以模拟体内应力环境等特点得到了越来越多的关注。

    目前市面上常见的生物反应器有搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、旋转壁式生物反应器、膜式生物反应器、灌注式生物反应器等。

    搅拌式生物反应器的主要原理是通过叶轮或搅拌器转动培养液，以此提高培养液内细胞的物质交换效率。它的优点在于确保了细胞培养的氧浓度和培养液内养分的均衡；其缺点是由于搅拌器转动产生的剪切应力很大，在蛋白质含量较高的培养基中易产生大量气泡，因此不适用于组织工程领域细胞和组织的培养。该反应器广泛应用于发酵工业和酶工业。 

    气升式生物反应器的主要原理是在反应器底部设置一个气体喷嘴，外源性空气或者氧气以气泡的形式从下部上升，通过气体上升的过程促进气体交换。它的优点是有较高的传质效率，培养液的浓度较均匀，工作状况柔和，操作简单；其缺点是操作弹性小，尤其是在低流速，反应器高、直径大，高密度微载体培养时，混合性能欠佳。尽管其剪切应力较机械搅拌小，但气泡离开液面破裂瞬间所产生的剪切力仍会对细胞造成损伤。该反应器多应用于动植物细胞的培养研究和生产。

旋转壁式生物反应器的原理是将培养液及培养物共置于2个同轴的内外圆筒之间，在步进电动机的带动下，充满培养液的圆柱形悬浮培养容器和其内的培养物会一起绕水平轴作旋转运动，模拟微重力环境，具有低剪切力、传质效率高，容积利用率高、可进行细胞或组织培养等优点；但缺点在于因为剪切力小，支架内部微孔道内的微环境不能有效得到改善,而且制约其实际操作的因素较多，例如：当需要加快转速提高其传质效果时，转速同时受到抵抗细胞沉降不与内外壁碰撞以及动物细胞脆性的限制；当需要提高氧分压增加液体内溶氧度时，过高的氧分压又会抑制代谢物的排除和产生气泡，影响细胞的正常生长。因此，该反应器很难得到推广应用。

膜式生物反应器的主要原理是通过一个起传质作用的超滤膜进行气体和物质交换。它的优点是避免了反应器内产生气泡和流体剪切应力，作为一种温和的培养方式，适用于容易受到剪应力破坏的细胞培养；其缺点在于膜的通透性会增加反应系统污染的可能性，而且在高浓度细胞培养时，如果不能及时更新系统内的培养液，仅通过膜交换的方式难以满足大量细胞培养对营养物质的需求。

    灌注式生物反应器的原理是通过蠕动泵的作用，不断泵入新鲜培养基，泵出代谢废产物，通过对灌流速率的调节可以使细胞之间的物质传递、种子细胞-生物材料复合体内细胞外基质的截留以及流体产生的剪切力之间达到平衡，组织培养性强。但是，如何最大限度地减少非灌流路径和无效循环，提高灌注效率，一直是亟待突破的问题；灌注培养单一平面的应力刺激难以模仿细胞的在体力学环境也是近来的研究热点，即便对生物材料的预处理可以提高工程化组织的构建效率，却在无形中增加了生产成本，不具有普适性；而且，重复灌注同一培养液难免会造成代谢废物的堆积，而不断灌注新的培养液，丢弃含有代谢废物的培养液又会大大提高生产成本，如何通过低成本便可获得高效、质优的工程化组织是生物医学工程领域需要解决的一个难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于种子细胞和生物材料共培养的双环路振荡灌注式生物反应系统，该生物反应系统在组织或器官体外构建过程中实现了振荡和灌注方法的结合，有效减少了无效循环，保证生物材料内部的种子细胞可以得到充分的物质交换和应力刺激，促进种子细胞增殖和功能发挥，缩短培养周期，提高工程化组织的生产效率；该生物反应系统内灌注换液通路和灌注培养通路两个环路之间可自由切换，降低培养液消耗，节约生产成本；灌注培养装置的圆盘内有多个灌注器，每个灌注器可分别容纳不同种类的多个支架，能够满足大规模分类培养的需要，并且结构简单，易于推广。

本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统包括：支架灌注培养装置，其内部容纳有多个用于种子细胞和生物材料共培养的支架；所述支架灌注培养装置的顶面装有进液管，底面装有出液管；所述进液管和出液管分别连接输液管；储液瓶，用于将瓶内的培养液通过输液管输送到所述支架；回收瓶，用于通过输液管接收从所述支架灌注培养装置流出的培养液；所述储液瓶和回收瓶通过各自的三通管来控制培养液的流向，以致在灌注换液通路和灌注培养通路中间切换；所述灌注换液通路是培养液从储液瓶流入支架灌注培养装置再流入回收瓶的环路；所述灌注培养通路是培养液在输液管内循环进出所述支架灌注培养装置的环路；蠕动泵，设置在所述灌注换液通路与灌注培养通路中，用于控制通过输液管的培养液的流速及方向。

根据本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的进一步特征，所述系统还包括振荡器，所述支架灌注培养装置放置在振荡器上。

根据本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的进一步特征，所述储液瓶与支架灌注培养装置之间的输液管上装有通气滤膜。

根据本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的进一步特征，所述输液管与通气滤膜之间设有缓冲气囊。

根据本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的进一步特征，所述的支架灌注培养装置包括：灌注体，在液体灌注方向开设有多个灌注孔，所述灌注孔内可容纳至少一个支架；灌注器上盖，其顶面是光滑的平面，其底面开设有可部分容纳所述灌注体的凹槽；所述灌注器上盖上开设有可插入进液管的进液孔；灌注器下盖，其底面是光滑的平面，其顶面开设有可部分容纳所述灌注体的凹槽；所述灌注器下盖上开设有可插入出液管的出液孔；所述灌注器上盖的周边上开设有多个上盖固定孔，所述灌注器下盖的周边上也开设有与所述上盖固定孔位置相对应的下盖固定孔；所述灌注体被嵌套在所述灌注器上盖与所述灌注器下盖之间，并通过螺丝穿过所述上盖固定孔和下盖固定孔，将灌注器上盖、灌注体和灌注器下盖连接为一个紧密的整体。

优选地，在所述的支架灌注培养装置中，所述的灌注体是圆盘形的。相应地，所述的灌注器上盖和灌注器下盖是圆盘形的。

优选地，在所述的支架灌注培养装置中，所述的灌注体具有不同的厚度，且所述的灌注体上的灌注孔具有不同的直径以及不同的数量和分布。

优选地，在所述的支架灌注培养装置中，所述灌注体内灌注孔的进液孔的尺寸大于出液孔的尺寸。

优选地，在所述的支架灌注培养装置中，所述灌注器上盖与灌注器下盖的凹槽是阶梯式的，以致当所述灌注体嵌入凹槽内时形成上贮液室和下贮液室。

优选地，在所述的支架灌注培养装置中，所述支架灌注培养装置还包括：上密封圈，放置在所述灌注器上盖底面的阶梯式凹槽内；以及下密封圈，放置在所述灌注器下盖顶面的阶梯式凹槽内。

与现有技术相比，本发明所述的双环路振荡双环路振荡灌注式生物反应系统，具有以下的特点和优点：

（1）本系统包含灌注换液通路和灌注培养通路这两个环路，通过灌注换液通路对支架灌注培养装置内的培养液更新完成后，可切换至灌注培养通路进行灌注培养一段时间，减少了灌注过程对培养基的消耗，节约生产成本。

（2）本系统采用了蠕动泵，在蠕动泵驱动下的培养液流动能够对细胞产生一定的剪切应力刺激，有效促进生物材料内贴附的种子细胞增殖与代谢，分泌更多的细胞外基质，调节细胞功能的发挥。

（3）本系统采用了振荡器，将支架灌注培养装置放置在振荡器上，从而增加了垂直于灌注方向的流体剪切力，对支架内部细胞的应力刺激更充分，有利于细胞增殖和功能发挥。

（4）本系统在回路上具有通气滤膜，无需单独配备气流控制系统和温度控制系统。

（5）输液管与通气滤膜之间设有缓冲气囊，避免了回路中液体经通气滤膜渗出，减少本系统发生污染事件的风险。

（6）本系统的各个部件结构简单，便于灭菌和组装，接通电源后在二氧化碳培养箱中可直接使用，易于推广普及。

（7）灌注体的灌注孔内可分别容纳不同种类、不同直径的支架，而且其深度可同时容纳多个支架，能够满足大规模分类培养的需要。

（8）支架灌注培养装置的灌注孔的进液孔较大，出液孔较小，这样的设计可最大限度地减少非灌注路径，减少无效循环，促使流体尽量流经整个支架内部，使力学刺激分布均匀，有效提高了灌注效率和传质效率，避免出现“空巢化”现象。

（9）支架置于灌注体内无需加用固定装置固定，避免对结构疏松、孔隙率高的组织工程支架造成破坏。

（10）支架灌注培养装置内采用阶梯式凹槽和密封圈的设计，使支架灌注体的安装更紧密，灌注更充分。

附图说明

图1为本发明所述的双环路振荡双环路振荡灌注式生物反应系统的结构示意图。

图2和图3分别为本发明所述的支架灌注培养装置的组装后的结构示意图。

图4为图2和图3所示的支架灌注培养装置的剖示图。

图5为图2和图3所示的支架灌注培养装置的分解示意图。

图6为不同规格的灌注体的示意图。

图7为原代肋软骨细胞图（倒置相差显微镜100×）。

图8为第2代肋软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学法染色图。

图9为不同组别的生物支架材料孔隙内肋软骨细胞不同时间点的扫描电镜图。

图10为不同组别的生物支架材料内肋软骨细胞不同时间点的分布图。

图11为不同组别的生物支架材料内肋软骨细胞的增殖趋势图。

具体实施方式

实施例1：本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的构建。

本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统适用于不同种类的种子细胞（例如，人、鼠、兔、羊、猴等各种来源的细胞）与具备一定生物力学强度的生物支架材料的共培养。

双环路振荡灌注式生物反应系统，如图1所示，包括：支架灌注培养装置14，其内部容纳有多个用于种子细胞和生物材料共培养的支架13；所述支架灌注培养装置14的顶面装有进液管1，底面装有出液管7；所述进液管1和出液管7分别连接输液管；储液瓶11，用于将瓶内的培养液通过输液管输送到所述支架13；回收瓶16，用于通过输液管接收从所述支架灌注培养装置14流出的培养液；所述储液瓶11和回收瓶16通过各自的三通管来控制培养液的流向，以致在灌注换液通路和灌注培养通路中间切换；所述灌注换液通路是培养液从储液瓶11流入支架灌注培养装置14再流入回收瓶16的环路；所述灌注培养通路是培养液在输液管内循环进出所述支架灌注培养装置14的环路；蠕动泵15，设置在所述灌注换液通路与灌注培养通路中，用于控制通过输液管的培养液的流速及方向。

在本实施例中，如图1所示，本生物反应系统还包括振荡器17，所述支架灌注培养装置14放置在振荡器17上。储液瓶11与支架灌注培养装置14之间的输液管上装有通气滤膜18，用于交换气体。输液管与通气滤膜18之间设有缓冲气囊19，避免了回路中液体经通气滤膜渗出，减少本系统发生污染事件的风险。

实施例2：支架灌注培养装置的设计与装配。

支架灌注培养装置是本发明所述的双环路振荡灌注式生物反应系统的关键装置，其设计与装配详述如下。

所述的支架灌注培养装置，如图2至图5所示，包括：灌注体4，在液体灌注方向开设有多个灌注孔41，所述灌注孔41内可容纳至少一个支架；灌注器上盖6，其顶面是光滑的平面，其底面开设有可部分容纳所述灌注体的凹槽；所述灌注器上盖6上开设有可插入进液管1的进液孔；灌注器下盖2，其底面是光滑的平面，其顶面开设有可部分容纳所述灌注体的凹槽；所述灌注器下盖2上开设有可插入出液管7的出液孔；所述灌注器上盖6的周边上开设有多个上盖固定孔61，所述灌注器下盖2的周边上也开设有与所述上盖固定孔位置相对应的下盖固定孔21；所述灌注体4被嵌套在所述灌注器上盖6与所述灌注器下盖2之间，并通过螺丝穿过所述上盖固定孔61和下盖固定孔21，将灌注器上盖6、灌注体4和灌注器下盖2连接为一个紧密的整体。

在本实施例中，所述的灌注体4是圆盘形的；所述的灌注器上盖6和灌注器下盖2是圆盘形的。

灌注体4是可替换的，根据实际的应用，可采用具有不同的厚度的灌注体4。灌注体4上的灌注孔41具有不同的直径以及不同的数量和分布。图6展示了不同规格的灌注体4。

如图4所示，灌注体4内灌注孔41的进液孔的尺寸大于出液孔的尺寸，也就是，灌注体4的进液孔较大，出液孔较小。这样的设计可最大限度地减少非灌注路径，减少无效循环，促使流体尽量流经整个支架内部，使力学刺激分布均匀，有效提高了灌注效率和传质效率，避免出现“空巢化”现象。

如图4所示，在支架灌注培养装置中，灌注器上盖6与灌注器下盖2的凹槽是阶梯式的，以致当所述灌注体4嵌入凹槽内时形成上贮液室和下贮液室。

如图4所示，在支架灌注培养装置中，支架灌注培养装置还包括：上密封圈5，放置在所述灌注器上盖6底面的阶梯式凹槽内；以及下密封圈3，放置在所述灌注器下盖2顶面的阶梯式凹槽内。

实施例3：种子细胞（新西兰大白兔肋软骨细胞）的分离、培养及鉴定。

取2-3月龄新西兰大白兔，耳缘静脉空气栓塞处死，无菌条件下暴露双侧胸廓，取出两侧肋软骨。在超净台内使用含1％双抗(青霉素、链霉素)的PBS将血污冲洗干净，剪去外侧残余肌肉及软骨外包绕的致密软骨膜，将软骨剪碎，37℃ 0.25％胰蛋白酶消化30min，1000rpm离心5min,弃上清，加入0.2％Ⅱ型胶原酶消化6-8h，1000rpm离心10min，DMEM漂洗沉淀。将获得的肋软骨细胞接种于75cm²培养瓶内，添加含有10％胎牛血清、1％双抗的DMEM，置于37℃含5％CO₂的孵箱内培养，每3天进行1次细胞观察与换液。如图7所示，直至原代肋软骨细胞达到80％-90％融合。使用0.25﹪-0.01﹪胰蛋白酶-EDTA混合液消化，进行传代扩大培养。选取生长良好的第2代细胞进行Ⅱ型胶原免疫组织化学法染色，倒置相差显微镜下观察细胞形态及Ⅱ型胶原的表达。如图8所示，在倒置相差显微镜下，可见新西兰大白兔第2代肋软骨细胞Ⅱ型胶原阳性表达明显，可以确定是功能活力良好的肋软骨细胞。

实施例4：种子细胞的接种。

取生长良好的新西兰大白兔第2代肋软骨细胞，用0.25﹪-0.01﹪胰蛋白酶-EDTA混合液消化并离心，弃上清，用20mg/ml含有50U/ml抑肽酶的纤维蛋白原溶液（0.9％NaCl溶液配制）混悬软骨细胞，调整细胞浓度为3×10⁷/ml。取100ul细胞悬液，加至1.5ml尖底离心管底，同时放入生物材料，使用真空泵进行负压法细胞接种，接种压力设为-850mba，接种时间3min。接种完成后取出生物材料，浸没于含10U/ml凝血酶的40mM CaCl₂溶液中进行凝胶化操作。

实施例五：细胞与生物材料共培养。

1、在超净工作台内将接种有细胞的生物材料置于灌注培养装置的灌注器内。如实施例二所述，连接好灌注培养装置的各个部件，然后按照实施例一所述，将整个双环路振荡双环路振荡灌注式生物反应系统连接完毕，切换为灌注换液通路，用医用止血钳先夹闭灌注培养装置底盖出液口所连接的橡胶管，启动蠕动泵，以3ml/min流量使培养液缓慢充满整个反应器。

2、待液体充满灌注培养装置后，松开医用止血钳，让管道内液体缓慢流入回收瓶中，以排空管道内的气体。

3、迅速切换环路至灌注培养通路，以检测整个生物反应系统的密闭性。确认生物反应系统无漏液后，切换至灌注换液通路30分钟，待整个系统的管道内均充满培养液且流速稳定后，再次切换环路至灌注培养通路，并打开振荡器，设定速度为40rpm/min，进行振荡灌注培养。每24小时切换至灌注换液通路30分钟，以更新系统内的培养液。

按细胞-生物材料复合体培养方法的不同，分为以下2组：

（1）    反应器培养组（n=5）：采用双环路振荡双环路振荡灌注式生物反应系统进行培养，扫描电镜和切片DAPI染色的检测时间点为7天、14天，细胞增殖实验的检测时间点为1天、7天、14天、21天、28天；

（2）    传统培养组（n=5）：将接种有细胞的生物材料分别置于6孔板各孔内，每孔添加5ml含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液中，扫描电镜和切片DAPI染色的检测时间点7天、14天，细胞增殖实验的检测时间点为1天、7天、14天、21天、28天。

实施例6：生物支架材料内部孔隙的扫描电镜（SEM）观察。

1、收获种子细胞/生物材料复合体的操作步骤：

1）关闭振荡器，调节蠕动泵的蠕动方向使与原灌注方向相反，以回抽整个生物反应系统内的液体至储液瓶内，排空生物反应系统内的培养液；

2）将灌注培养装置从生物反应系统中取下，移入超净工作台。

3）拧松螺帽和螺钉后，打开灌注培养装置的顶盖和底盖，取出其内的圆盘，将圆盘正面朝下反扣在一次性无菌培养皿中，用无菌的细针头将生物材料从灌注器的出口推出至无菌培养皿中。

 4）在超净工作台内拆卸系统各部件，进行清洗消毒，以备再次使用。

2、SEM待检样品的制作

在各时间点培养终止后，收集生物支架材料，用PBS冲洗3遍，放入2.5％戊二醛溶液内4℃条件下固定6小时，三蒸水清洗支架，待自然干燥后，媒介物包埋，喷金，上机进行SEM观察。

实验结果如图9所示，采用双环路振荡灌注式生物反应系统进行细胞接种的培养组与传统培养组，在培养7天后，材料内部的孔隙内均未见有细胞贴附，仅在孔隙内布满一层致密的纤维蛋白凝胶。培养14天后，两组支架材料的孔隙内均长入有种子细胞，但反应器组的细胞分布、密度优于传统培养组。7天与14天相比，反应器组支架材料内部的细胞增殖较传统培养组明显。

实施例7：生物材料切片DAPI染色以观察细胞分布。

在各时间点培养终止后，收集生物支架材料，PBS漂洗待检支架，然后置于4％多聚甲醛内4℃固定6小时，逐级乙醇脱水，最后将同一时间点的两组支架和组织包埋用树脂置于同一包埋盒内（这样可以使最后磨片得到的切片近似为支架的同一平面，便于对比），在真空环境中排除气泡使其固化，采用硬组织切片技术对包埋块切片，磨片机上进行打磨，磨至厚度约20um进行DAPI染色,正置荧光显微镜，紫外光（340nm-390nm）激发条件下观察。

实验结果如图10所示，采用双环路振荡灌注式生物反应系统进行细胞接种的培养组与传统培养组，在培养7天后，材料内部的孔隙内均未见有细胞分布，仅在支架外周分布着大量细胞。培养14天后，两组支架材料的孔隙内均长入有种子细胞，但反应器组的细胞分布和数量远远优于传统培养组。7天与14天相比，反应器组支架材料内部的细胞增殖较传统培养组明显。

实施例8：阿尔玛蓝细胞增殖实验（AlamarBlue kit）。

在各时间点培养终止后，取出培养的生物材料（生物反应器组4例，传统培养法组4例），分别转移至24孔板各孔内，每孔均加入1ml的DMEM，然后加入100μl AlamarBlue母液，静置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中3小时，然后将24孔板各孔1.1ml的上清液以200μl每孔的规格分装于96孔板各孔内，做好标记后，多功能酶标仪检测96孔板各孔的荧光强度(激发波长570nm，吸收波长585nm)。为避免培养基自发荧光对测量数据产生干扰，以无细胞DMEM+alamablue孔为空白对照，使用SoftMax Pro 5.2软件导出数据，每孔测量数据均用空白对照组做标准化，计算出每个样品的平均荧光密度值后进行数据分析。

实验结果如图11所示，各时间点反应器培养组细胞的数量均高于传统培养组，两组在21天后，细胞数量进入了平台期，但反应器培养组的细胞水平远高于传统培养组。

Claims (10)

1.一种双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于，包括：

支架灌注培养装置（14），其内部容纳有多个用于种子细胞和生物材料共培养的支架（13）；所述支架灌注培养装置（14）的顶面装有进液管（1），底面装有出液管（7）；所述进液管（1）和出液管（7）分别连接输液管；

储液瓶（11），用于将瓶内的培养液通过输液管输送到所述支架（13）；

回收瓶（16），用于通过输液管接收从所述支架灌注培养装置（14）流出的培养液；

所述储液瓶（11）和回收瓶（16）通过各自的三通管来控制培养液的流向，以致在灌注换液通路和灌注培养通路中间切换；所述灌注换液通路是培养液从储液瓶（11）流入支架灌注培养装置（14）再流入回收瓶（16）的环路；所述灌注培养通路是培养液在输液管内循环进出所述支架灌注培养装置（14）的环路；

蠕动泵（15），设置在所述灌注换液通路与灌注培养通路中，用于控制通过输液管的培养液的流速及方向。

2.根据权利要求1所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述系统还包括振荡器（17），所述支架灌注培养装置（14）放置在振荡器（17）上。

3.根据权利要求1所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述储液瓶（11）与支架灌注培养装置（14）之间的输液管上装有通气滤膜（18）。

4.根据权利要求3所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述输液管与通气滤膜（18）之间设有缓冲气囊（19）。

5.根据权利要求1所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于，所述的支架灌注培养装置包括：

灌注体（4），在液体灌注方向开设有多个灌注孔（41），所述灌注孔（41）内可容纳至少一个支架；

灌注器上盖（2），其顶面是光滑的平面，其底面开设有可部分容纳所述灌注体（4）的凹槽；所述灌注器上盖（2）上开设有可插入进液管（1）的进液孔；

灌注器下盖（6），其底面是光滑的平面，其顶面开设有可部分容纳所述灌注体（4）的凹槽；所述灌注器下盖（6）上开设有可插入出液管（7）的出液孔；

所述灌注器上盖（2）的周边上开设有多个上盖固定孔（21），所述灌注器下盖（6）的周边上也开设有与所述上盖固定孔位置相对应的下盖固定孔（61）；所述灌注体（4）被嵌套在所述灌注器上盖（2）与所述灌注器下盖（6）之间，并通过螺丝穿过所述上盖固定孔（21）和下盖固定孔（61），将灌注器上盖（2）、灌注体（4）和灌注器下盖（6）连接为一个紧密的整体。

6.根据权利要求5所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述的灌注体（4）是圆盘形的；所述的灌注器上盖（6）和灌注器下盖（2）是圆盘形的。

7.根据权利要求5所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述的灌注体（4）具有不同的厚度；所述的灌注体（4）上的灌注孔（41）具有不同的直径以及不同的数量和分布。

8.根据权利要求5所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于：所述灌注体（4）内灌注孔（41）的进液孔的尺寸大于出液孔的尺寸。

9.根据权利要求5所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于： 所述灌注器上盖（6）与灌注器下盖（2）的凹槽是阶梯式的，以致当所述灌注体（4）嵌入凹槽内时形成上贮液室和下贮液室。

10.根据权利要求6所述的双环路振荡灌注式生物反应系统，其特征在于，所述支架灌注培养装置还包括：

上密封圈（3），放置在所述灌注器上盖（2）底面的阶梯式凹槽内；以及

下密封圈（5），放置在所述灌注器下盖（6）顶面的阶梯式凹槽内。

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