CN110669669A - 一种模块化三维灌注细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种模块化三维灌注细胞培养系统。该系统包括换液模块、生物反应器模块、氧合模块和动力模块，生物反应器模块包括生物反应器，生物反应器内设置有接口，接口与再细胞化支架连接，换液模块通过三通接头分别与生物反应器和动力模块连通，氧合模块包括壳体，壳体内包括依次连通的气泡过滤器、膜式氧合器和空气过滤器，接口与气泡过滤器连通，膜式氧合器和空气过滤器分别与动力模块连通。本发明易于制作，结构合理、易消毒、污染少、制作成本低、稳定性高、易于扩展并且操作简单，值得推广使用。

Description

一种模块化三维灌注细胞培养系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种模块化三维灌注细胞培养系统。

背景技术

目前的生物基础理论大多通过基于培养瓶或培养板的二维静态培养细胞试验得到。典型的二维静态培养将从人体或动物组织来源单一或混合细胞种在塑料或者玻璃平板上，浸泡在营养丰富的培养基中，通过定期更换培养基移除细胞代谢产物、提供新的营养成分。二维静态细胞培养技术经过多年的发展已经十分成熟，成为生物学最重要的实验方法之一。但是组织器官中的细胞是三维结构的，而且由血液循环系统不断灌注。而在平板培养中，组织的立体结构、细胞与细胞之间的连接以及细胞与细胞外基质的连接彻底失去，许多细胞实验结果很难在动物体内重现，而即使费时费力在动物体内证实，由于种属差异，相关结果在人体内也时常出现偏差。

三维灌注培养在三维静态培养的基础上引入灌注携氧培养基的方法模拟血液循环系统，能够及时的移除代谢产物、提供新鲜营养物质，维持培养体系(例如PH、氧气、葡萄糖以及生长因子的)的稳态。三维灌注培养保留了与体内类似的细胞与细胞及外基质的相互连接，更能反映体内的生理状态，相关实验结果能够与体内实验结果一致，同时又能体现细胞培养的直观性及条件可控性，将传统二维细胞培养与动物实验模型相结合，为进一步研究体内细胞正常特征提供了良好的实验平台，可以用于研究组织的病理和生理过程，测试药物毒性和有效性、评估生物材料安全性等等。灌注培养还能够提供可控的支架强度、机械性能、剪切力、模拟流体动力学效应，能够增强细胞功能，有效增加组织扩散能力。此外，携氧培养基能够消除培养组织大小限制，扩大细胞培养规模，能够为再生医学的临床应用提供大量的种子细胞，同时减少人力、物力和试剂的消耗。

目前三维灌注培养系统无成熟商品，多由实验室自行设计，未进行系统整合。大多将蠕动泵、氧合器、培养瓶、输送管道简单组装而成。许多研究则根据实验需求对生物反应器进行了设计以适用于不同组织工程支架，如水凝胶、微流体、骨支架、聚合物支架的培养，或者设计一些可以提供生物力学信息的生物反应器，少部分研究对培养系统的氧合部分进行了设计。这些三维灌注培养系统结构复杂、影响因素多、难消毒、易污染，制作工艺复杂难以推广，极大地限制了三维灌注培养的应用。

发明内容

本发明针对目前的三维灌注培养系统的缺点，采用集成化、模块化设计，将系统分为生物反应器模块、氧合模块、动力模块、换液模块。各模块可以独立包装，并使用环氧乙烷灭菌，进行细胞培养时将各模块简单连接即可，减少操作步骤及可能的污染环节，各模块的壳体均通过3D打印制作而成，因此本发明易于制作，结构合理、易消毒、污染少、制作成本低、稳定性高、易于扩展并且操作简单，值得推广使用。

本发明的技术解决方案如下：本发明为一种模块化三维灌注细胞培养系统，其特殊之处在于：所述培养系统包括换液模块、生物反应器模块、氧合模块和动力模块，生物反应器模块包括生物反应器，生物反应器内设置有接口，接口与再细胞化支架连接，换液模块通过三通接头分别与生物反应器和动力模块连通，氧合模块包括壳体，壳体内包括依次连通的气泡过滤器、膜式氧合器和空气过滤器，接口与气泡过滤器连通，膜式氧合器和空气过滤器分别与动力模块连通。

优选的，换液模块由长方体壳体构成，长方体壳体内部呈倒锥形，底部正中装有深紫外LED灯，换液模块通过硅胶软管与生物反应器连通，硅胶软管一端通过硅胶软管接头插入换液模块中，另一端接三通接头，三通接头的另外两端分别通过硅胶软管与生物反应器和动力模块连通。

优选的，接口通过硅胶软管与气泡过滤器一端连通，气泡过滤器另一端与膜式氧合器的第一接口连通，膜式氧合器的第二接口通过空气过滤器与动力模块连通，膜式氧合器的第三接口通过硅胶软管与动力模块连通。

优选的，氧合模块的壳体上设置有空气过滤器观察窗。

优选的，动力模块由蠕动泵及空气泵组成。

优选的，生物反应器为80ml蓝口瓶。

优选的，三通接头为三通阀。

优选的，硅胶软管的管路接口均采用标准6％鲁尔接头。

本发明具有以下优点：

1、结构简单、无污染且易消毒。本发明采用生物反应器模块作为细胞培养的容器，装载培养基及细胞支架复合物，氧合模块装载膜式氧合器、空气过滤器、气泡过滤器等，为本发明的核心组件。动力模块负责对整个系统的培养基及气体提供动力。换液模块由3D打印长方体壳体及深紫外LED灯组成，可以对换液接口进行消毒，避免换液过程引起污染。因此本发明采用模块化设计，各模块可独自进行环氧乙烷灭菌，安装方便快捷，使用时仅需连接生物反应器模块及氧合模块，降低了操作难度，减少可能的污染环节，最大程度上避免污染，解决了既往三维灌注培养系统结构复杂、难消毒、易污染的难题。

2、温度维持要求低。动力模块往往是产热的主要设备，对培养箱的温度维持系统带来了严峻挑战，本发明通过动力模块的分离降低了对培养箱温度调节系统的要求。

3、制作成本低，方便推广。本发明的生物反应器由实验室常见的蓝口瓶组装而成，制作工艺简单，而氧合模块和换液模块的壳体通过3D打印技术制作而成，制作成本低，方便推广。

4、应用范围广。本发明各管路接口均采用标准6％鲁尔接头，对于采用标准鲁尔接口的支架体系均可采用。

5、系统稳定性高。更换培养基过程是系统污染的主要环节，本发明在更换培养基前对换液接头进行局部紫外线照射灭菌，减少了污染机会，提高了系统的稳定性。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

附图标记如下：

1、三通接头，2、气泡过滤器，3、第一接口，4、第二接口，5、空气过滤器，6、膜式氧合器，7、动力模块，8、深紫外LED灯，9、硅胶软管接头，10、生物反应器模块，11、再细胞化支架，12、生物反应器，13、氧合模块，14、第三接口，15、接口，16、换液模块。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

参见图1、本发明的具体实施例结构包括换液模块16、生物反应器模块10、氧合模块13和动力模块7，其中：

换液模块16由10cm长硅胶软管及3D打印长方体壳体构成，长方体壳体内部呈倒锥形，底部正中装有深紫外LED灯8(波长260±5nm)，换液模块16通过硅胶软管与生物反应器模块10中的生物反应器12连通，硅胶软管一端通过硅胶软管接头9插入换液模块16中，进行紫外线照射灭菌，另一端接三通接头1，三通接头1的另外两端分别通过硅胶软管与生物反应器12和动力模块7连通。

生物反应器模块10主体为生物反应器12，生物反应器12采用80ml蓝口瓶，瓶体作为细胞培养容器，三通接头1穿过瓶盖连接生物反应器12内的灌注管路，生物反应器12内的接口15连接再细胞化支架11。三通接头1其中的一个接口连接换液模块16，通过此口移除旧培养基及加入新培养基，三通接头1为三通阀。

氧合模块13包括壳体，壳体通过3D打印制作而成，壳体内部安装有依次连通的气泡过滤器2、膜式氧合器6和空气过滤器5，各组件之间通过硅胶软管连接，接口15通过硅胶软管与气泡过滤器2一端连通，气泡过滤器2另一端与膜式氧合器6的第一接口3连通，膜式氧合器6的第二接口4通过空气过滤器5与动力模块7连通，膜式氧合器6的第三接口14通过硅胶软管与动力模块7连通。壳体上留有空气过滤器观察窗，可监测氧合模块13液位变化，预防气泡进入培养系统，以上管路接口均采用鲁尔接头。

动力模块7由蠕动泵及空气泵组成，放置在培养箱旁，安装在30cm高铁架台上，通过12v直流电源供电。蠕动泵灌注速度可在0-20ml/min之间调节，空气泵流量可在0-300ml/min之间调节，为培养基及氧气提供循环动力。

本发明使用之前对生物反应器模块10、氧合模块13及换液模块16使用环氧乙烷灭菌。在生物反应器12中加入50-60ml普通或含有携氧成分(如氟碳化合物)的培养基，将系统按照图1所示连接。打开蠕动泵及空气泵电源，通过调整氧合模块13姿态调整气泡过滤器2液平面高度，将液平高度控制在液壶的2/3位置。随后在接口15处连接载有待培养的细胞支架复合物的再细胞化支架11。调整蠕动泵及空气泵速度。随后将生物反应器12及氧合模块13放入培养箱中，动力模块7置于培养箱旁，调整蠕动泵及空气泵至适合流量，每日观察培养系统运行状况，定期更换培养基。更换培养基前打开换液模块16中的深紫外LED灯8的开关，对换液接头照射消毒2小时，关闭动力模块7电源，随后连接一次性50ml无菌注射器，移除生物反应器12中的培养基。使用另一只注射器吸取50ml新鲜培养基，连接换液接头注入新培养基，完成对此培养系统的换液。随后再次打开动力模块7开关继续进行培养。

本发明的实验数据如下：

1、实验材料：

实验动物：健康3月龄SD大鼠，质量250～300g，由西安交通大学动物实验中心提供。饲养温度保持为18～25℃，标准饲料喂养，实验过程严格遵照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

试剂及仪器：

主要试剂：DMEM培养基、青链霉素(Hy-clone)、小牛血清(Gibco)、胰蛋白酶(碧云天)。

主要设备包括：膜式氧合器(西安西京医疗用品有限公司，大鼠型膜肺)、CO2恒温培养箱(Thermo Scientific，3110)、3D打印机(极臻三维)、蠕动泵(兰格恒流泵有限公司,BQ50-1J-A)、空气泵(桑连电子材料,SL-300)、深紫外LED灯(深圳市永霖科技有限公司,TO39)、空气过滤器(桑连电子材料,8mm过滤器)、一次性输液器(湖南省绿洲惠康发展有限公司，IS-GA3)、鲁尔接头(桑连电子材料,SL5/32-4.0mm)、一次性医用无菌三通阀(扬州洋生医药科技有限公司,LJG-S)。

2、实验方法：

大鼠脾脏脱细胞支架制备方法如下：经脾动脉插管获取大鼠脾脏，脾脏离体后继续去离子水灌注30min，随后浸入PBS中冻存于-80℃冰箱备用。反复冻融脾脏2次后置入烧杯中，连接蠕动泵，灌注速度为4mL/min，序列应用0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、PBS溶液经由脾动脉持续灌注，直至脱去脾脏实质细胞，应用PBS冲洗后使用0.1％过氧乙酸进行支架消毒，保存在含3％双抗PBS溶液中。

L02细胞培养：采用10％小牛血清的DMEM培养基扩增L02细胞至4×107个，消化离心后使用4ml培养基重悬。

采用脾动脉间断注射的方法再细胞化脾脏脱细胞支架。按照上一节描述的使用方法将再细胞化脾脏脱细胞支架连接于本发明中。使用10％小牛血清的DMEM培养基循环灌注，培养基灌注速度为1ml/min，空气泵速度为10ml/min，间隔3天更换培养基。对培养的再细胞化支架11进行SEM、HE染色以及Ki67免疫荧光染色观察。

2、实验结果

使用本发明进行三维灌注培养，安装过程简便快捷，仅需将生物反应器模块10及氧合模块13之间的鲁尔接头连接即可。结合换液过程中的紫外灯照射极大地减少了污染机会，利用此系统进行的三维培养均未发生污染。

大体观可见L02细胞在脾脏脱细胞支架内呈团块状生长，细胞团块体积逐渐增大。培养1周后的再细胞化脾脏支架SEM结果显示细胞与支架粘附紧密，细胞在支架内按照脾脏支架内部管腔及血窦结构分布。HE染色结果可见L02细胞呈现典型的肝细胞形态：细胞核蓝紫色、圆形或椭圆形、大而明显，细胞质丰富，提示细胞活性良好。免疫荧光染色可见Ki 67阳性率为38％±7％，提示支架中细胞增殖活跃。

以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述培养系统包括换液模块、生物反应器模块、氧合模块和动力模块，所述生物反应器模块包括生物反应器，所述生物反应器内设置有接口，所述接口与再细胞化支架连接，所述换液模块通过三通接头分别与生物反应器和动力模块连通，所述氧合模块包括壳体，所述壳体内包括依次连通的气泡过滤器、膜式氧合器和空气过滤器，所述接口与气泡过滤器连通，所述膜式氧合器和空气过滤器分别与动力模块连通。

2.根据权利要求1所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述换液模块由长方体壳体构成，长方体壳体内部呈倒锥形，底部正中装有深紫外LED灯，所述换液模块通过硅胶软管与生物反应器连通，所述硅胶软管一端通过硅胶软管接头插入换液模块中，另一端接三通接头，所述三通接头的另外两端分别通过硅胶软管与生物反应器和动力模块连通。

3.根据权利要求2所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述接口通过硅胶软管与气泡过滤器一端连通，所述气泡过滤器另一端与膜式氧合器的第一接口连通，所述膜式氧合器的第二接口通过空气过滤器与动力模块连通，所述膜式氧合器的第三接口通过硅胶软管与动力模块连通。

4.根据权利要求3所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述氧合模块的壳体上设置有空气过滤器观察窗。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述动力模块由蠕动泵及空气泵组成。

6.根据权利要求5所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述生物反应器为80ml蓝口瓶。

7.根据权利要求6所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述三通接头为三通阀。

8.根据权利要求3所述的模块化三维灌注细胞培养系统，其特征在于：所述硅胶软管的管路接口均采用标准6％鲁尔接头。