JP6543954B2

JP6543954B2 - 除去領域設定方法、除去領域設定装置およびプログラム

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Publication number: JP6543954B2
Application number: JP2015034577A
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Inventors: 裕司宮下; 正晃岡
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Publication date: 2019-07-17
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Description

本発明は、良好と判別された細胞および不良と判別された細胞のコロニー内での集合状態を考慮し、コロニーの少なくとも一部を除去領域に設定することが可能な除去領域設定方法、除去領域設定装置およびプログラムに関する。

一般的に、細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。

培養される細胞としては、例えばiＰＳ細胞が挙げられる。iＰＳ細胞は、体を構成する様々な種類の細胞に分化（変化）可能なものであり、分化していない状態（未分化）のiＰＳ細胞に分化誘導を行うことで、特定の細胞に分化させることができる。

ところで、一旦分化した細胞は、その他の種類の細胞に分化できないことから、分化誘導の処理が行われるiＰＳ細胞は、未分化の状態であることが必要である。しかしながら、iＰＳ細胞は分化誘導を行わなくても培養時に意図せず分化または癌化することがあり、分化または癌化したiＰＳ細胞は、その周辺にある未分化のiＰＳ細胞が悪化（分化や癌化）することを促進するので、培養に使用している培地上から除去する必要がある。なお、このように培養中に除去する必要のある細胞が発生する問題は、iＰＳ細胞だけでなく、他の細胞でも起こりうることである。

培養される細胞のこのような特性に鑑みて、特許文献１には、細胞が現れた画像に画像処理を行うことで細胞のサイズや核の形状、密集状態などの特徴量を抽出し、その特徴量をデータベースの情報と照らし合わせることで、各細胞の良否を判別可能な細胞の自動良否判別システムが開示されている。これにより、人が顕微鏡で細胞を確認しながら感覚で各細胞の良否を判断している現状の負担を軽くすることができる。

また、細胞の品質を自動で判別する他の構成として、特許文献２には、個々の細胞の面積や円形度、コロニーにおける細胞の密度、コロニー中の細胞本体でない面積等の特徴量の時系列データを解析し、細胞の品質を予測する予測モデルの構築方法が開示されている。

特許第４８５２８９０号公報特許第５１８１３８５号公報

ところで、コロニーを形成する細胞は種々の集合状態を取り得るものであり、例えば、図２（ａ）に示すように、未分化細胞からなる未分化領域１０と分化細胞からなる分化領域１１によって二分されるコロニー１ａや、図２（ｂ），（ｃ）に示すように、未分化領域１０又は分化領域１１の一方の内部に他方が存在するコロニー１ｂ，１ｃなどが挙げられる。このうち、図２（ａ），（ｂ）に示すコロニー１ａ，１ｂは、分化領域１１を除去すれば、残りの未分化領域１０が不良に変化する可能性は低く、良好な状態で継続して培養を行うことができる。一方、図２（ｃ）に示すコロニー１ｃは、未分化領域１０をある程度含んでいることから、分化領域１１を培地上から除去して培養を継続することも考えられるが、残した未分化細胞が培養中に意図せず分化（悪化）する可能性が高く、同一のコロニー１に対して再度の除去操作が必要となる可能性が高いので、コロニー１全体を除去することが好ましいものである。

特許文献１に開示の判別システムは、各細胞の良否を判別しているにすぎず、コロニーを形成する細胞の集合状態が考慮されていない。そのため、例えばiＰＳ細胞の管理に前記判別システムを利用したとしても、分化と判断された細胞を培地上から除去する程度にとどまり、図２（ｃ）に示すようなコロニー１ｃの全体を除去できず、継続培養により分化する可能性が高い未分化細胞を残すことになるので、同一のコロニーに対して再度の除去操作が必要となり、除去操作の回数が多くなるおそれがある。

また、特許文献２に開示の方法は、細胞の品質として細胞の増殖率や残存分裂回数などを予測しており、コロニーの部分的な除去が考慮されていない。そのため、予測結果をそのまま細胞の除去に適用すると、図２（ａ），（ｂ）に示すようなコロニー１ａ，１ｂ全体が除去対象となることが考えられ、良好な状態で継続培養が可能な未分化領域１０の細胞まで除去して、除去対象となる細胞が多くなるおそれがある。また逆に、図２（ｃ）に示すような、不良に変化する可能性が高いコロニー１ｃを除去せずそのまま全て残してしまうおそれがあり、再度の除去操作が必要になることがある。

本発明は、このような課題を有効に解決することを目的としており、除去対象とする細胞を少なくしつつ、同一のコロニーに対して再度の除去操作が必要となる状態になりにくくして、除去操作の回数を少なく抑えることが可能な除去領域設定方法、除去領域設定装置およびプログラムを提供することを目的としている。

本発明は以上のような問題点を鑑み、次のような手段を講じたものである。

すなわち、本発明の除去領域設定方法は、複数の細胞からなるコロニーが撮像された撮
像画像に基づき、コロニーの少なくとも一部を培地から除去すべき除去領域として設定可
能であり、前記撮像画像を取り込む画像取込み工程と、前記撮像画像に現れている各細胞
の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞を得る良否判別工程と、コロニーに対して前記良
好判別細胞が占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー全体を除
去領域に設定する第１の除去領域設定工程と、前記良好判別細胞に基づいて、良好な状態
で継続的な培養が可能でないコロニーを判別し、当該コロニー全体を除去領域に設定する
処理を少なくとも含む第２の除去領域設定工程と、第１の除去領域設定工程および第２の
除去領域設定工程で除去領域に設定されなかったコロニーの一部分に除去領域を設定可能
な第３の除去領域設定工程とを有し、前記第２の除去領域設定工程では、複数の良好判別細胞が集まって形成される良好判別範囲の面積が閾値以上か否か判断し、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲を１つも有さないコロニーを、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断して、当該コロニー全体を除去領域に設定する一方、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲に対して膨張および収縮させるための画像処理を行い、当該画像処理後の良好判別範囲のうち少なくとも一部を良好細胞領域に設定可能とし、前記第３の除去領域設定工程では、前記良好細胞領域を膨張させるための画像処理を行い、良好細胞領域を膨張させたコロニーに対して、当該良好細胞領域をコロニーから除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張させるための画像処理を行う、または、コロニーから前記良好細胞領域を除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張および収縮させるための画像処理を行うことを特徴とする。

このような構成であると、画像取込み工程で取得した前記撮像画像に基づいて、良否判別工程で各細胞の良否を判別し、第１の除去領域設定工程において、良好判別細胞が占める面積の割合が閾値未満と判断され、略全体が不良と判別された細胞からなるコロニー全体を除去領域に設定することができる。また、第２の除去領域設定工程では、良好な状態での継続的な培養が可能でないと判断されたコロニー全体を除去領域に設定できるので、良好判別細胞の占める面積の割合が閾値よりも多いものの、培養を継続した場合に不良に変化する可能性が高い細胞を含むコロニー全体を除去領域に設定することができる。さらに、第３の除去領域設定工程では、第１の除去領域設定工程および第２の除去領域設定工程で除去領域に設定されなかったコロニーの一部分に除去領域を設定できるので、不良な一部分を除去することで、良好な状態で継続的に培養できる可能性が高い細胞を培地上に残すことができる。したがって、除去領域に設定する範囲を抑えつつ、培養を継続した場合に不良に変化する可能性が高い細胞を含むコロニー全体を除去領域に設定することができるので、除去対象とする細胞を少なくできるとともに、同一のコロニーに対して再度の除去操作が必要となる状態になりにくくして、除去操作の回数を少なく抑えることが可能となる。なお、「コロニー全体」には「コロニーの略全体」も含まれる。

上記の効果に加えて、人が感覚で行った場合と同じような範囲に除去領域を設定できるとともに除去領域内に形成される穴を減少させ、培地から除去しやすい除去領域を設定することが可能となる。
特に、除去領域の輪郭に細かい凹凸がなく、除去しやすい除去領域を設定することが可能となる。

とりわけ、継続的に培養した場合に不良に変化する可能性が高い細胞をより適切に除去領域に設定するためには、前記第２の除去領域設定工程で、前記除去領域の設定に加えて、良好判別範囲内の穴の合計面積、良好判別範囲の凸面度、良好判別範囲の真円度、良好判別範囲の円形度または良好判別範囲の丸み度の少なくとも何れか１つを利用して良好判別範囲の形状を算出し、算出した良好判別範囲の形状が所定の条件を満たすか否か判断して、所定の条件を満たす良好判別範囲を良好細胞領域に設定することが好ましい。

一方、上記の効果が発揮される除去領域設定装置は、複数の細胞からなるコロニーを撮像する撮像手段と、上記の除去領域設定方法を実行する除去領域設定手段とを備えることを特徴とする。

さらに、上記の効果を発揮させるためのプログラムは、コンピュータに呼び込まれることによって、複数の細胞からなるコロニーが撮像された撮像画像に基づき、コロニーの少なくとも一部を培地から除去すべき除去領域として設定するための除去領域設定装置として前記コンピュータを動作させるものであり、前記撮像画像を取り込む画像取込ステップと、前記撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞を得る良否判別ステップと、コロニーに対して前記良好判別細胞が占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー全体を除去領域に設定する第１の除去領域設定ステップと、前記良好判別細胞に基づいて、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニーを判別し、当該コロニー全体を除去領域に設定する処理を少なくとも含む第２の除去領域設定ステップと、第１の除去領域設定ステップおよび第２の除去領域設定ステップで除去領域に設定されなかったコロニーの一部分に除去領域を設定可能な第３の除去領域設定ステップとをコンピュータに実行させるプログラムであり、前記第２の除去領域設定ステップでは、複数の良好判別細胞が集まって形成される良好判別範囲の面積が閾値以上か否か判断し、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲を１つも有さないコロニーを、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断して、当該コロニー全体を除去領域に設定する一方、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲に対して膨張および収縮させるための画像処理を行い、当該画像処理後の良好判別範囲のうち少なくとも一部を良好細胞領域に設定し、前記第３の除去領域設定ステップでは、前記良好細胞領域を膨張させるための画像処理を行い、良好細胞領域を膨張させたコロニーに対して、当該良好細胞領域をコロニーから除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張させるための画像処理を行う、または、コロニーから前記良好細胞領域を除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張および収縮させるための画像処理を行うことを特徴とする。

以上、説明した本発明によれば、除去領域に設定する範囲を抑えつつ、培養を継続した場合に不良に変化する可能性が高い細胞を含むコロニー全体を除去領域に設定することができるので、除去対象とする細胞を少なくできるとともに、同一のコロニーに対して再度の除去操作が必要となる状態になりにくくして、除去操作の回数を少なく抑えることが可能な除去領域設定方法、除去領域設定装置およびプログラムを提供することが可能となる。

本発明の一実施形態に係る除去領域設定装置を示すブロック図。複数の細胞が集まって形成されるコロニーの例を示す模式図。同除去領域設定装置による処理を説明するための模式図。本発明の一実施形態に係る除去領域設定方法を示すフローチャート。同除去領域設定方法で除去領域を設定するコロニーの一例を示す顕微鏡写真。良否判別工程での結果を示す顕微鏡写真。第１の除去領域設定工程を示すフローチャート。第２の除去領域設定工程を示すフローチャート。第２除去領域設定工程での結果を示す顕微鏡写真。第３の除去領域設定工程を示すフローチャート。第３除去領域設定工程での結果を示す顕微鏡写真。本発明の変形例を示すフローチャート。実施例で設定される除去領域を示す顕微鏡写真。変形例で設定される除去領域を示す顕微鏡写真。

以下、本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。

図１に示す本発明の一実施形態である除去領域設定装置１００は、複数のiＰＳ細胞からなるコロニーが撮像された撮像画像に基づき、コロニーの少なくとも一部を培地から除去すべき除去領域として設定可能なものである。図１に示すように、除去領域設定装置１００は、撮像画像を取得する撮像手段３と、撮像手段３が取得した撮像画像に基づいて除去領域を設定する除去領域設定手段としてのコンピュータ（制御手段）２とで構成される。

図２に示すように、複数のiＰＳ細胞が集まって形成されるコロニー１は、未分化の細胞（未分化細胞）と分化した細胞（分化細胞）の集合状態によって、いくつもの形態を取り得る。例えば、同図（ａ）に示すように、未分化細胞からなる未分化領域１０と、分化細胞からなる分化領域１１とによって二分されるコロニー１ａや、同図（ｂ）に示すように分化領域１１内に１つの未分化領域１０が存在するコロニー１ｂがあり、これらを混合コロニー１と呼ぶ。また、同図（ｃ）に示すように分化領域１１内に複数の未分化領域１０が点在するコロニー１ｃや、同図（ｄ）に示すように、未分化領域１０内に１つの分化領域１１が存在するコロニー１ｄ、同図（ｅ）に示すように分化領域１１内に歪（いびつ）な形状の未分化領域１０が存在するコロニー１ｅがあり、これらを分化中のコロニー１と呼ぶ。さらに、同図（ｆ）に示すように歪な形状の未分化領域１０からなるコロニー１ｆがある。

このうち、同図（ａ），（ｂ）に示す混合コロニー１は、分化領域１１を除去すれば、良好な状態（未分化の状態）を維持して培養を継続できる可能性が高い。一方、同図（ｃ）〜（ｆ）に示す分化中のコロニー１は、分化領域１１を除去したとしても、継続して培養した場合に、残りの未分化細胞が意図せず分化（不良に変化）する可能性が高い。そのため、混合コロニー１は、分化領域１１を除去して未分化領域１０を残すことが好ましく、分化中のコロニー１は、全体をまとめて除去領域に設定して培地から除去することが好ましい。

図１に示すコンピュータ２は、図示しないＣＰＵ、メモリ及びインターフェース等を具備し、ＣＰＵは、メモリに予め記憶されている後述の除去領域設定方法を行うためのプログラム等を呼び出して実行することにより、周辺ハードリソースと協働して、良否判別部２１ａと第１の除去領域設定部２１ｂと第２の除去領域設定部２１ｃと第３の除去領域設定部２１ｄとを実現する。

良否判別部２１ａは、撮像画像中でコロニー１を構成する各iＰＳ細胞が良好（未分化）または不良（分化や癌化）のどちらであるか判別し、良好と判断した良好判別細胞と、良好と判断しなかった（不良と判別した）不良判別細胞とを得る。このような各細胞の良否判別の処理は既存の技術であり、詳細な手法は省略する。

ここで、例えば図２（ａ）に示すコロニー１ａに対して、良否判別部２１ａが上記処理を行うと、図３（ａ）に示すようなデータが得られる。なお、図３（ａ）では、データを模式的に示しており、良好判別細胞１０ａを白べた、不良判別細胞１１ａに斜線を引いて示す。良否判別部２１ａによる処理を行うと、概ね良好判別細胞１０ａと不良判別細胞１１ａとがそれぞれ分かれた位置に現れるものの、ところどころ、良好判別細胞１０ａの集まりの中に不良判別細胞１１ａが現れ、不良判別細胞１１ａの集まりの中に良好判別細胞１０ａが現れたデータが得られる。

図１に示す第１の除去領域設定部２１ｂは、良否判別部２１ａの判別結果を用いて、コロニー１に対して良好判別細胞１０ａ（図３（ａ）参照）が占める面積の割合を求めるとともに、その割合が閾値未満か否か判断し、前記割合が閾値未満であると判断すると、そのコロニー１全体を除去領域に設定する。すなわち、第１の除去領域設定部２１ｂは、全体又は大部分が不良判別細胞１１ａ（図３（ａ）参照）によって構成されているコロニー１全体を除去領域に設定することができる。

第２の除去領域設定部２１ｃは、第１の除去領域設定部２１ｂが除去領域に設定しなかったコロニー１がある場合、後に詳述するように、良好判別細胞１０ａに基づき、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニー１を判別する処理を少なくとも行うものであり、このような培養が可能でないと判断したコロニー１全体を除去領域に設定する。良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断されるコロニー１としては、図２（ｃ）に示す分化中のコロニー１が挙げられる。なお、除去領域の設定の対象とする細胞の種類によっては、良好な状態で継続培養が可能でないと判断されるコロニーの形態が変わる場合がある。

具体的に、第２の除去領域設定部２１ｃは、まず、複数の良好判別細胞１０ａが集まって形成される良好判別範囲の面積が閾値以上かどうか判断する。もし、コロニー１内に良好判別範囲が複数存在する場合、第２の除去領域設定部２１ｃは、同一の閾値を用いて、各良好判別範囲が閾値以上かどうかそれぞれ判断する。そして、前記面積が閾値以上と判断された良好判別範囲を１つも有しないコロニー１を、良好な状態で継続的な培養が可能でないものと判断し、当該コロニー１全体を除去領域に設定する。例えば、図３（ａ）に示すコロニー１ａでは、最も大きい良好判別範囲１０ｂの面積は閾値以上と判断される。そのため、最も大きい良好判別範囲１０ｂの周囲に存在する複数の良好判別範囲１０ｂの面積が閾値未満と判断されたとしても、コロニー１ａ全体としては、良好な状態で継続的な培養が可能でないものと判断されることはない。一方、図２（ｃ）に示す分化領域１１中に複数の未分化領域１０が点在するコロニー１ｃは、各未分化領域１０があまり大きな面積で存在しないことから、全ての良好判別範囲１０ｂの面積が閾値未満となり、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断され、全体が除去領域に設定される。

また、第２の除去領域設定部２１ｃは、面積が前記閾値以上の良好判別範囲１０ｂに対して、膨張後に収縮させる１回目の画像処理（close操作）を行うとともに、このような画像処理を行った良好判別範囲１０ｂに対して、収縮後に膨張させる２回目の画像処理（open操作）を行う。これら膨張および収縮の画像処理は、コロニー１の全ての輪郭に対して特定の比率で行われる。このような膨張および収縮の画像処理は既存の技術であり、詳細な手法は省略する。

１回目の画像処理では、膨張によって良好判別範囲１０ｂを変形させ、良好判別範囲１０ｂ内に形成された不良判別細胞１１ａなどからなる比較的小さい穴を埋めたり、細かい突起を無くすことができる。また、収縮によって、前述の比較的小さい穴が塞がれた状態で良好判別範囲１０ｂをほぼ元の大きさまで戻すことができる。２回目の画像処理では、収縮によって、不良判別細胞１１ａなどからなる比較的大きな穴や輪郭の凹凸を強調することができる。また、膨張によって、比較的大きな穴や輪郭の凹凸が強調された状態で良好判別範囲１０ｂをほぼ元の大きさまで戻すことができる。

例えば図３（ｂ）には、１回目の画像処理で膨張させた良好判別範囲１０ｂを実線、当該膨張前の良好判別範囲１０ｂを二点鎖線で示しており、膨張によって、良好判別範囲１０ｂ内に形成された、不良判別細胞１１ａからなる面積の小さい穴が塞がれる。良否判別部２１ａによって得られるデータでは、前述のように、ところどころ良好判別細胞１０ａ又は不良判別細胞１１ａの何れか一方の集まりの中に他方が少数現れるものの、このように局所的な現れは誤差である可能性が高く、仮に良否判別部２１ａが得たデータを用いて人が感覚で除去領域を設定する場合には、良好判別細胞１０ａの集まりの中で少数しか現れていない不良判別細胞１１ａは、本来、良好な細胞であるとみなされることが多い。そのため、１回目の画像処理によって、不良判別細胞１１ａからなる面積の小さい穴を塞いで良好判別範囲１０ｂに組み込むことで、良否判別部２１ａによる判別誤差を訂正できるとともに、２回目の画像処理によって良好判別範囲１０ｂの形状を明確にし、ひいては除去しやすい除去領域を設定することができる。

さらに、第２の除去領域設定部２１ｃは、後述するような良好判別範囲１０ｂの形状に関する指標に基づいて良好判別範囲１０ｂの形状を算出し、算出した形状が後述する所定の条件を満たすかどうか判断する（形状の解析）。そして、形状が所定の条件を満たす良好判別範囲１０ｂを、良好な状態で継続的に培養できる可能性が高い細胞が集まった領域である良好細胞領域として設定する。良好判別範囲１０ｂの形状に関する指標としては、例えば、良好判別範囲１０ｂ内の穴の合計面積、良好判別範囲１０ｂの凸面度、良好判別範囲１０ｂの真円度、良好判別範囲１０ｂの円形度（コンパクト性）または良好判別範囲１０ｂの丸み度（丸み）が挙げられ、これらの少なくとも何れか１つが用いられる。

ここで、穴の合計面積は、良好判別範囲１０ｂ内において不良判別細胞１１ａなどで形成される穴の合計面積である。

また、凸面度は、下記式１に基づいて求められ、良好判別範囲１０ｂの形状が凸図形であれば値が１となり、良好判別範囲１０ｂに凹みが存在したり、穴が存在すると、値が１未満となる。なお、下記の凸包とは、その図面を含む最小の凸図形である。

凸面度＝良好判別範囲１０ｂの面積／良好判別範囲１０ｂの凸包の面積・・・（式１）

また、真円度は、下記式２に基づいて求められ、良好判別範囲１０ｂが真円であれば値が１となり、良好判別範囲１０ｂが長細い形状、あるいは、良好判別範囲１０ｂに穴が存在すると値が１未満となる。

真円度＝（良好判別範囲１０ｂの面積）／
｛π×（良好判別範囲１０ｂの中心から輪郭までの最大距離）^２｝・・・（式２）

また、円形度（コンパクト性）は、下記式３に基づいて求められ、良好判別範囲１０ｂが真円であれば値が１となり、良好判別範囲１０ｂに凹みや穴が存在すると値が１よりも大きくなる。

円形度＝
（良好判別範囲１０ｂの輪郭の長さ）^２／（４π×良好判別範囲１０ｂの面積）
・・・（式３）

さらに、丸み値（丸み）は、下記式４に基づいて求められ、良好判別範囲１０ｂが真円であれば値が１となり、良好判別範囲１０ｂが長細い形状、あるいは、良好判別範囲１０ｂ内に穴が存在すると値が１未満となる。すなわち、良好判別範囲１０ｂの重心から輪郭までの距離にばらつきがあるほど値が小さくなる。

丸み＝
１−（良好判別範囲１０ｂの重心から輪郭までの距離の標準偏差／前記距離の平均）
・・・（式４）

良好な状態で継続的に培養できる可能性が高い良好判別範囲１０ｂの形状は、例えば、内部に大きな穴のない略円形状であり、本実施形態では所定の条件を、内部に大きな穴のない略円形状であることとする。そして、内部に大きな穴がない形状、或いは略円形の形状かどうか判断するための閾値を上記指標ごとに予め設定しておき、第２の除去領域設定部２１ｃは、当該閾値に基づいて、良好判別範囲１０ｂの形状を上記指標で算出した値が、内部に大きな穴がない形状、或いは略円形状を示す値かどうか判断することで、良好判別範囲１０ｂの形状が所定の条件を満たすかどうか判断する。したがって、内部に穴がない略円形状の良好判別範囲１０ｂは、算出される上記指標の値が、内部に穴がない形状、或いは略円形状を示す値となり、所定の条件を満たすと判断されるとともに、このような良好判別範囲１０ｂを除去領域に設定しないようにする（除去の対象から外す）ために良好細胞領域に設定することができる。一方、内部に大きな穴が空いていたり、形状が歪な良好判別範囲１０ｂは、算出される上記指標の値が、内部に大きな穴のない形状、或いは略円形状を示す値にならず、所定の条件を満たさないと判断されないことから、良好細胞領域に設定されず、後述するように除去領域に設定される。

例えば、図２（ｄ）に示すような未分化領域１０内に分化領域１１が存在するコロニー１ｄの場合、上記の指標のうち、穴の合計面積、真円度や円形度などに基づくことで、良好判別範囲１０ｂの形状が所定の条件を満たさないと判断され、コロニー１ｄには良好細胞領域が設定されない。また、図２（ｅ）に示すような歪な形状の未分化領域１０を含むコロニー１ｅや、図２（ｆ）に示すような歪な形状の未分化領域１０からなるコロニー１ｆの場合、凸面度、真円度、丸み度等に基づくことで、良好判別範囲１０ｂの形状が所定の条件を満たさないと判断され、コロニー１ｅ，１ｆには良好細胞領域が設定されない。なお、上記のような指標を用いて形状を算出する手法は、数学的な手法としては既知である。

第３の除去領域設定部２１ｄは、後述するように、良好細胞領域が設定されたコロニー１の一部分に除去領域を設定することができるとともに、第１の除去領域設定部２１ｂおよび第２の除去領域設定部２１ｃで除去領域に設定されなかったコロニー１のうち、良好細胞領域が設定されていないコロニー１全体を除去領域に設定することができる。具体的に、第３の除去領域設定部２１ｄは、良好細胞領域を膨張させるための画像処理を行うとともに、コロニー１から当該画像処理後の良好細胞領域を除いた残りの領域である仮除去領域のうち、面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、除去領域を膨張させるための画像処理を行う。良好細胞領域を膨張させることで、良好細胞領域内の比較的小さい穴を塞いで良好細胞領域の輪郭を滑らかにすることができるとともに、除去領域を膨張させることで、良好細胞領域を膨張させた分を補うことができる。また前述のように、このような膨張および収縮の画像処理は既存の技術である。なお、良好細胞領域が設定されていないコロニー１に対しては、良好細胞領域を膨張させるための画像処理が行われたとしても、良好細胞領域を有しないために画像データが変化することはなく、当該コロニー１全体が仮除去領域、ひいては除去領域に設定される。この場合、除去領域を膨張させる画像処理については、前述のように良好細胞領域の膨張がないことから、行われなくてもよい。

例えば、図３（ｃ）に示すコロニー１ａに対して上記処理を行った場合、二点鎖線で示す膨張前の良好細胞領域１４は、実線で示すような範囲まで膨張される。また、同図（ｃ）において斜線を引いた範囲が、コロニー１ｅから膨張後の良好細胞領域１４を除いた残りの領域である仮除去領域１５ａとなる。また、同図（ｄ）において二点鎖線で示す仮除去領域１５ａ（膨張前の除去領域１５）を膨張させると、斜線を引いて示すような範囲の除去領域１５となる。

このように良好細胞領域１４を膨張させる画像処理を行って良好細胞領域１４の輪郭を滑らかにすることで、良好細胞領域１４の形状に対応する除去領域１５の形状も滑らかにし、除去しやすい除去領域１５を設定することができる。また、面積が所定値以上の仮除去領域１５ａを除去領域１５に設定することも、除去しやすい除去領域１５を設定することに繋がる。

また、図２（ｄ）〜（ｆ）に示すように、良好細胞領域が設定されないコロニー１ｄ〜１ｆは、全体が仮除去領域１５ａ、ひいては除去領域１５に設定される。これにより、継続して培養した場合に不良に変化する可能性が高いコロニー１ｄ〜１ｆ全体を除去領域１５に設定することができる。

以上のように、本実施形態の除去領域設定装置１００は、第１の除去領域設定部２１ｂ、第２の除去領域設定部２１ｃおよび第３の除去領域設定部２１ｄの少なくとも何れかで除去領域１５を設定することができ、混合コロニー１に対しては、主として分化領域１１からなる一部分のみを除去領域１５に設定し、分化中のコロニー１に対しては、全体を除去領域１５に設定することができる。

以下、図４〜１１を用いて本実施形態の除去領域設定方法について具体的に説明する。本実施形態の除去領域設定方法は、図４に示すように、画像取込み工程ＳＰ１と、良否判別工程ＳＰ２と、第１の除去領域設定工程ＳＰ３と、第２の除去領域設定工程ＳＰ４と、第３の除去領域設定工程ＳＰ５とを有する。

まず、画像取込み工程ＳＰ１では、コンピュータ２が、複数のiＰＳ細胞からなるコロニー１が撮像された撮像画像を取り込み（ステップＳＰ１）、例えば図５に示すような撮像画像を得る。その後、図４に示す良否判別工程ＳＰ２で、良否判別部２１ａが、撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞１０ａおよび不良判別細胞１１ａを得る。図５に示す撮像画像に対して良否の判別を行うと、図６に示すように、良好判別細胞１０ａと不良判別細胞１１ａとがコロニー１中で異なる色で表示されたデータが得られる。なお、図５では培地１６上に存在するコロニー１の大まかな輪郭を二点鎖線で示し、図６では、良好判別細胞１０ａを白べた、不良判別細胞１１ａを黒べたで示している。

図７に示すように、第１の除去領域設定工程ＳＰ３では、第１の除去領域設定部２１ｂが、コロニー１に対して良好判別細胞１０ａの占める面積の割合が閾値未満かどうか判断する（ステップＳＰ３ａ）。前記割合が閾値未満と判断すると（ステップＳＰ３ａ：ＹＥＳ）、当該コロニー１全体を除去領域１５に設定し（ステップＳＰ３ｂ）、本フローを終了する。前記割合が閾値未満でないと判断すると（ステップＳＰ３ａ：ＮＯ）、除去領域１５を設定することなく本フローを終了する。

図８に示すように、第２の除去領域設定工程ＳＰ４では、第２の除去領域設定部２１ｃは、コロニー１において、面積が閾値以上の良好判別範囲１０ｂ（複数の良好判別細胞１０ａが集まって形成されるもの）があるか判断する（ステップＳＰ４ａ）。このような良好判別範囲１０ｂがない、すなわち面積が閾値以上の良好判別範囲１０ｂを１つも有さないと判断すると（ステップＳＰ４ａ：ＮＯ）、当該コロニー１が良好な状態で継続的な培養が可能でないものと判断して、当該コロニー１全体を除去領域１５に設定し（ステップＳＰ４ｈ）、本フローを終了する。面積が閾値以上の良好判別範囲１０ｂがあると判断すると（ステップＳＰ４ａ：ＹＥＳ）、当該閾値以上の面積を有する良好判別範囲１０ｂを膨張および収縮させる画像処理を行う（ステップＳＰ４ｂ，ステップＳＰ４ｃ）。その後、第２の除去領域設定部２１ｃは、良好判別範囲１０ｂを１つ選択し、選択した良好判別範囲１０ｂの形状を前記指標を用いて算出するとともに（ステップＳＰ４ｄ）、当該形状が前記所定の条件を満たすかどうか判断する（ステップＳＰ４ｅ）。形状が条件を満たすと判断すると（ステップＳＰ４ｅ：ＹＥＳ）、選択した良好判別範囲１０ｂを良好細胞領域１４に設定し（ステップＳＰ４ｆ）、ステップＳＰ４ｇに進む。一方、形状が条件を満たさないと判断すると（ステップＳＰ４ｅ：ＮＯ）、選択した良好判別範囲１０ｂを良好細胞領域１４に設定することなく、ステップＳＰ４ｇに進む。第２の除去領域設定部２１ｃは、ステップＳＰ４ｃの処理を行った全ての良好判別範囲１０ｂに対して、ステップＳＰ４ｅの形状に関する判定を行ったかどうか判断する（ステップＳＰ４ｇ）。全ての良好判別範囲１０ｂについて判定を行っていないと判断すると（ステップＳＰ４ｇ：ＮＯ）、ステップＳＰ４ｄに戻り、その処理を繰り返す。全ての良好判別範囲１０ｂについて判定を行ったと判断すれば（ステップＳＰ４ｇ：ＹＥＳ）、本フローを終了する。

図５に示す撮像画像に対して第２の除去領域設定工程ＳＰ４の処理を行うと、図６に示す良好判別範囲１０ｂのうち面積が前記閾値以上の良好判別範囲１０ｂが膨張し、不良判別細胞１１ａからなる穴が埋まることで、図９において実線で囲んで示すような良好細胞領域１４が１つだけ設定される。図６の下部に存在する複数の良好判別範囲１０ｂは、面積が前記閾値未満であることから、良好細胞領域１４として設定されない。

図１０に示すように、第３の除去領域設定工程ＳＰ５では、第３の除去領域設定部２１ｄが良好細胞領域１４を膨張するための画像処理を行うとともに（ステップＳＰ５ａ）、所定の面積以上の仮除去領域１５ａを除去領域１５に設定する（ステップＳＰ５ｂ）。その後、除去領域１５を膨張させる画像処理を行い（ステップＳＰ５ｃ）、本フローを終了する。図５に示す撮像画像に対して第３の除去領域設定工程ＳＰ５の処理を行うと、図１１において黒べたで示すような除去領域１５が設定され、コロニー１の左下の部分のみが除去領域１５に設定される。

以上のように本実施形態の除去領域設定方法は、複数の細胞からなるコロニー１が撮像された撮像画像に基づき、コロニー１の少なくとも一部を培地１６から除去すべき除去領域１５として設定可能であり、撮像画像を取り込む画像取込み工程ＳＰ１と、撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞１０ａを得る良否判別工程ＳＰ２と、コロニー１に対して良好判別細胞１０ａが占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー１全体を除去領域１５に設定する第１の除去領域設定工程ＳＰ３と、良好判別細胞１０ａに基づいて、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニー１を判別し、当該コロニー１全体を除去領域１５に設定する処理を少なくとも含む第２の除去領域設定工程ＳＰ４と、第１の除去領域設定工程ＳＰ３および第２の除去領域設定工程ＳＰ４で除去領域１５に設定されなかったコロニー１の一部分を除去領域１５として設定可能な第３の除去領域設定工程ＳＰ５とを有する。

このような構成であると、画像取込み工程ＳＰ１で取得した前記撮像画像に基づいて、良否判別工程ＳＰ２で各細胞の良否を判別し、第１の除去領域設定工程ＳＰ３において、良好判別細胞１０ａが占める面積の割合が閾値未満と判断され、略全体が不良と判別された細胞からなるコロニー１全体を除去領域１５に設定することができる。また、第２の除去領域設定工程ＳＰ４では、良好な状態での継続的な培養が可能でないと判断されたコロニー１全体を除去領域１５に設定できるので、良好判別細胞１０ａの占める面積の割合が閾値よりも多いものの、培養を継続した場合に不良に変化（分化や癌化）する可能性が高い未分化細胞を含むコロニー１全体を除去領域１５に設定することができる。さらに、第３の除去領域設定工程ＳＰ５では、第１の除去領域設定工程ＳＰ３および第２の除去領域設定工程ＳＰ４で除去領域１５に設定されなかったコロニー１の一部分に除去領域１５を設定できるので、分化した部分を除去することで、良好な状態で継続的に培養できる可能性が高い未分化細胞を培地１６に残すことができる。したがって、除去領域１５に設定する範囲を抑えつつ、培養を継続した場合に不良に変化する可能性が高い細胞を含むコロニー１全体を除去領域１５に設定することができるので、未分化細胞が過度に除去されることを避けることができるとともに、同一のコロニー１に対して再度の除去操作が必要となる状態になりにくくして、細胞の培養中に悪化した細胞が発生する度に当該細胞を除去する場合よりも除去操作の回数を少なく抑えることが可能となる。

加えて、第２の除去領域設定工程ＳＰ４では、複数の良好判別細胞１０ａが集まって形成される良好判別範囲１０ｂの面積が閾値以上か否か判断し、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲１０ｂを１つも有さないコロニー１を、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断して、当該コロニー１全体を除去領域１５に設定する一方、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲１０ｂを膨張及び収縮させるための画像処理を行って、当該画像処理後の良好判別範囲１０ｂのうち少なくとも一部、具体的には形状が前記所定の条件を満たす良好判別範囲１０ｂを良好細胞領域１４に設定可能とし、第３の除去領域設定工程ＳＰ５では、良好細胞領域１４に基づいて除去領域１５を設定するように構成している。

良好判別範囲１０ｂとして面積が閾値未満のもののみを含むコロニー１は、図２（ｃ）に示すように分化領域１１中に未分化領域１０が点在するコロニー１ｃである可能性が高く、悪化した細胞の集まりに未分化細胞が混在するコロニー１全体を除去対象とすることができる。また、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲１０ｂを膨張させる画像処理を行うことで、良否判別工程ＳＰ２で不良判別細胞１１ａと判断されたものの、本来未分化細胞である可能性が高い細胞を、良好判別範囲１０ｂに組み込み、人の感覚で判断した場合と同じような範囲に除去領域１５を設定できる。さらに、良好判別範囲１０ｂを収縮することで、良好判別範囲１０ｂ内での穴や、良好判別範囲１０ｂの輪郭の凹凸を強調でき、第３の除去領域設定工程ＳＰ５で、除去しやすく除去操作に時間が掛かりにくい除去領域１５を設定することができる。

とりわけ、第２の除去領域設定工程ＳＰ４では、上述したような除去領域１５の設定に加えて、良好判別範囲１０ｂの穴の合計面積、良好判別範囲１０ｂの凸面度、良好判別範囲１０ｂの真円度、良好判別範囲１０ｂの円形度または良好判別範囲１０ｂの丸み度の少なくとも何れか１つを利用して良好判別範囲１０ｂの形状を算出し、算出した良好判別範囲１０ｂの形状が前記所定の条件を満たすか否か判断して、前記所定の条件を満たす良好判別範囲１０ｂを良好細胞領域１４に設定する。

良好な状態で継続培養が可能な良好判別範囲１０ｂは内部に大きな穴のない略円形状をしているので、良好判別範囲１０ｂの形状に関する上記指標に基づくことで、不良判別細胞１１ａからなる大きな穴が内部に形成された良好判別範囲１０ｂ（図２（ｄ）のコロニー１ｄに対応）や、歪な形状の良好判別範囲１０ｂ（図２（ｅ），（ｆ）のコロニー１ｅ，１ｆに対応）など、継続して培養した場合に意図せず分化する可能性が高い良好判別範囲１０ｂを容易に判別することができ、凹凸や穴が少なく比較的丸い形状の良好判別範囲１０ｂのみを除去対象から外すことができる。

特に、第３の除去領域設定工程ＳＰ５では、良好細胞領域１４を膨張させるための画像処理を行い、良好細胞領域１４を膨張させたコロニー１に対して、当該良好細胞領域１４をコロニー１から除いた残りの領域としての仮除去領域１５ａの少なくとも一部を除去領域１５に設定し、当該除去領域１５を膨張させるための画像処理を行うことから、良好細胞領域１４とその周辺が除去領域１５に含まれないようにできるとともに、除去領域１５の輪郭に細かい凹凸がなく、除去しやすい除去領域１５を設定することができる。このように一部にまとまった範囲で除去領域１５を設定することで、除去操作を単純にでき、除去領域１５の除去に掛かる時間を短縮することができる。

一方、本実施形態の除去領域設定装置１００は、複数の細胞からなるコロニー１を撮像する撮像手段３と、前述の除去領域設定方法を実行する除去領域設定手段としてのコンピュータ２とを備えることから、除去領域１５に設定する範囲を少なく抑えつつ、培養を継続した場合に不良に変化する可能性が高いコロニー１全体を除去領域１５に設定できる装置を実現することができ、同一のコロニー１に対して再度の除去操作を行うことを抑制し、除去操作の回数の増加を抑制することができる。

さらに、本実施形態のプログラムは、コンピュータ２に呼び込まれることによって、複数の細胞からなるコロニー１が撮像された撮像画像に基づき、コロニー１の少なくとも一部を培地１６から除去すべき除去領域１５として設定するための除去領域設定装置１００としてコンピュータ２を動作させるものであり、撮像画像を取り込む画像取込ステップと、撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞１０ａを得る良否判別ステップと、コロニー１に対して良好判別細胞１０ａが占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー１全体を除去領域１５に設定する第１の除去領域設定ステップと、良好判別細胞１０ａに基づいて、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニー１を判別し、当該コロニー１全体を除去領域１５に設定する処理を少なくとも含む第２の除去領域設定ステップと、第１の除去領域設定ステップおよび第２の除去領域設定ステップで除去領域１５に設定されなかったコロニー１の一部分に除去領域１５を設定可能な第３の除去領域設定ステップとをコンピュータ２に実行させるものである。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、各部の具体的な構成は、上述した実施形態のみに限定されるものではない。

例えば、本実施形態は、iＰＳ細胞からなるコロニー１に対して除去領域１５を設定するものであるが、他の種類の細胞からなるコロニー１に対して除去領域１５を設定するものであってもよい。

また、図１０に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５の代わりに、図１２に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５Ａが行われてもよい。第３の除去領域設定工程ＳＰ５Ａでは、第３の除去領域設定部２１ｄが、コロニー１から良好細胞領域１４を除いた残りの領域を仮除去領域１５ａに設定し、仮除去領域１５ａのうち所定の面積以上のものを除去領域１５に設定する（ステップＳＰ５Ａａ）。その後、除去領域１５を膨張させるための画像処理を行い（ステップＳＰ５Ａｂ）、除去領域１５内の穴を埋めるとともに、除去領域１５を収縮させるための画像処理を行うことで（ステップＳＰ５Ａｃ）、穴を塞いだまま、膨張させた分をほぼ元に戻すことができる。なお、良好細胞領域が設定されていないコロニー１に対しては、当該コロニー１全体が仮除去領域１５ａ、ひいては除去領域１５に設定された後、当該除去領域１５を膨張および収縮させる画像処理が行われる。

このように、コロニー１から前記良好細胞領域１４を除いた残りの領域としての仮除去領域１５ａの少なくとも一部を除去領域１５に設定し、当該除去領域１５を膨張および収縮させるための画像処理を行う第３の除去領域設定工程ＳＰ５Ａは、除去領域１５となる不良領域の間に比較的面積の大きい良好細胞領域１４が存在する場合、当該良好細胞領域１４を除去領域１５に含めることができ、図１０に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５に比べて、除去を優先した制御を行うことができる。換言すると、図１０に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５は、図１２に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５Ａと比べて、細胞を培地１６上からできるだけ残すことを優先した処理を行うことができ、同一の撮像画像を用いた場合に除去領域１５を狭く抑えることができる。

具体的に、図１０に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５で、例えば、図１３に黒べたで示すような互いに離間した２つの除去領域１５が設定されるとすると、図１２に示す第３の除去領域設定工程ＳＰ５Ａでは、図１３に示す２つの除去領域１５の間に存在する面積の大きい良好細胞領域１４をも除去領域１５に含み、図１４に示すような除去領域１５を設定することができる。

このように、第３の除去領域設定工程では、コロニー１から良好細胞領域１４を除いた残りの領域としての仮除去領域１５ａを膨張および収縮する画像処理を行って除去領域１５を設定した場合でも、除去領域１５の輪郭に細かい凹凸がなく、除去しやすい除去領域１５を設定することができる。

また、除去領域設定方法での工程順は図４に示すものに限定されず、例えば第１の除去領域設定工程ＳＰ３の前に第２の除去領域設定工程ＳＰ４が行われてもよい。さらに、他の工程を含んでいてもよい。またさらに、第２の除去領域設定工程ＳＰ４において、ステップＳＰ４ａ〜４ｃ及び４ｈの制御のみが行われ、ステップＳＰ４ｄ〜４ｇの制御が行われない構成であってもよい。この場合、ステップＳＰ４ｂ，ＳＰ４ｃで膨張および収縮の画像処理が行われた良好判別範囲１０ｂの全てが、良好細胞領域１４に設定される。

その他の構成も、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。

１・・・コロニー
２・・・コンピュータ（除去領域設定手段）
３・・・撮像手段
１０ａ・・・良好判別細胞
１０ｂ・・・良好判別範囲
１４・・・良好細胞領域
１５・・・除去領域
１５ａ・・・仮除去領域（残りの領域）
１６・・・培地
ＳＰ１・・・画像取込み工程
ＳＰ２・・・良否判別工程
ＳＰ３・・・第１の除去領域設定工程
ＳＰ４・・・第２の除去領域設定工程
ＳＰ５，ＳＰ５Ａ・・・第３の除去領域設定工程
１００・・・除去領域設定装置

Claims

複数の細胞からなるコロニーが撮像された撮像画像に基づき、コロニーの少なくとも一部を培地から除去すべき除去領域として設定可能な除去領域設定方法であって、
前記撮像画像を取り込む画像取込み工程と、
前記撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞を得る良否判別工程と、
コロニーに対して前記良好判別細胞が占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー全体を除去領域に設定する第１の除去領域設定工程と、
前記良好判別細胞に基づいて、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニーを判別し、当該コロニー全体を除去領域に設定する処理を少なくとも含む第２の除去領域設定工程と、
第１の除去領域設定工程および第２の除去領域設定工程で除去領域に設定されなかったコロニーの一部分に除去領域を設定可能な第３の除去領域設定工程とを有し、
前記第２の除去領域設定工程では、複数の良好判別細胞が集まって形成される良好判別範囲の面積が閾値以上か否か判断し、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲を１つも有さないコロニーを、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断して、当該コロニー全体を除去領域に設定する一方、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲に対して膨張および収縮させるための画像処理を行い、当該画像処理後の良好判別範囲のうち少なくとも一部を良好細胞領域に設定可能とし、
前記第３の除去領域設定工程では、前記良好細胞領域を膨張させるための画像処理を行い、良好細胞領域を膨張させたコロニーに対して、当該良好細胞領域をコロニーから除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張させるための画像処理を行う、または、コロニーから前記良好細胞領域を除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張および収縮させるための画像処理を行うことを特徴とする除去領域設定方法。
前記第２の除去領域設定工程では、前記除去領域の設定に加えて、良好判別範囲内の穴の合計面積、良好判別範囲の凸面度、良好判別範囲の真円度、良好判別範囲の円形度または良好判別範囲の丸み度の少なくとも何れか１つを利用して前記良好判別範囲の形状を算出し、算出した良好判別範囲の形状が所定の条件を満たすか否か判断して、所定の条件を満たす良好判別範囲を良好細胞領域に設定する請求項１記載の除去領域設定方法。
複数の細胞からなるコロニーを撮像する撮像手段と、
請求項１または２に記載の除去領域設定方法を実行する除去領域設定手段とを備えることを特徴とする除去領域設定装置。
コンピュータに呼び込まれることによって、複数の細胞からなるコロニーが撮像された撮像画像に基づき、コロニーの少なくとも一部を培地から除去すべき除去領域として設定するための除去領域設定装置として前記コンピュータを動作させるためのプログラムであって、
前記撮像画像を取り込む画像取込ステップと、
前記撮像画像に現れている各細胞の良否をそれぞれ判別し、良好判別細胞を得る良否判別ステップと、
コロニーに対して前記良好判別細胞が占める面積の割合を求め、当該割合が閾値未満と判断したコロニー全体を除去領域に設定する第１の除去領域設定ステップと、
前記良好判別細胞に基づいて、良好な状態で継続的な培養が可能でないコロニーを判別し、当該コロニー全体を除去領域に設定する処理を少なくとも含む第２の除去領域設定ステップと、
第１の除去領域設定ステップおよび第２の除去領域設定ステップで除去領域に設定されなかったコロニーの一部分に除去領域を設定可能な第３の除去領域設定ステップとをコンピュータに実行させるプログラムであり、
前記第２の除去領域設定ステップでは、複数の良好判別細胞が集まって形成される良好判別範囲の面積が閾値以上か否か判断し、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲を１つも有さないコロニーを、良好な状態で継続的な培養が可能でないと判断して、当該コロニー全体を除去領域に設定する一方、面積が閾値以上と判断された良好判別範囲に対して膨張および収縮させるための画像処理を行い、当該画像処理後の良好判別範囲のうち少なくとも一部を良好細胞領域に設定し、
前記第３の除去領域設定ステップでは、前記良好細胞領域を膨張させるための画像処理を行い、良好細胞領域を膨張させたコロニーに対して、当該良好細胞領域をコロニーから除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張させるための画像処理を行う、または、コロニーから前記良好細胞領域を除いた残りの領域である仮除去領域のうち面積が所定値以上のものを除去領域に設定し、当該除去領域を膨張および収縮させるための画像処理を行うことを特徴とするプログラム。