TR202020549A2 - Bi̇r canli hücre yüklü poli̇mer/ enzi̇m hi̇drojel üretme yöntemi̇ ve söz konusu yöntem i̇le üreti̇len bi̇r yapay kornea tabakasi - Google Patents

Abstract

Buluş, kornea körlüğü veya yetersizliği tedavisinde kullanılmak üzere; - Önceden belirlenmiş oranlarda polimerin, önceden belirlenmiş bir oranda saf su içerisinde önceden belirlenmiş bir sıcaklık değerine ayarlanmış bir karıştırıcı kullanılarak çözdürülmesi (101) - Önceden belirlenmiş oranda bir enzimin polimerli solüsyona ilave edilmesi ve çözünmesinin beklenmesi (102) - Çözünme ardından enzimli polimerin önceden belirlenmiş sıcaklık değerinde tutulan sıcaklığı ayarlanabilen bir kabine konulup jelleşmenin beklenmesi ve hidrojelin elde edilmesi (103) - Önceden belirlenmiş miktarlarda hidrojele önceden belirlenmiş miktarda hücre ilavesi ve söz konusu karışımın homojen olana kadar karıştırılması (104) - Homojen hücre ilaveli ve enzimli hidrojelin üretimi (105) adımlarına göre karakterize edilen bir üretim yöntemi (100) ve söz konusu yöntem (100) ile üretilen hidrojelden bir 3D yazıcı yardımıyla üç boyutlu üretilen bir yapay kornea tabakası (1) ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME BIR CANLI HÜCRE YÜKLÜ POLIMER/ ENZIM HIDROJEL ÜRETME YÖNTEMI YE SÖZ KONUSU YÖNTEM ILE ÜRETILEN BIR YAPAY KORNEA TABAKAsi Teknik Alan Bulus, bir canli hücre yüklü polimer/ enzim hidrojel üretme yöntemi ve bu yöntem kullanilarak üretilen üç boyutlu yapay bir kornea tabakasi ile ilgilidir. Önceki Teknik Kornca körlügü vakalarinin gittikçe arttigi ülkelerde saglikli donör doku nakli orani oldukça düsüktür. Nakil için keratoprotezler kullanilmakla birlikte söz konusu protezler, çok büyük avantajlara sahip olsa da implantasyon sonrasi ortaya çikan komplikasyonlar, keratoprotezlerin en büyük dezavantajidir. Bunun yaninda teknigin bilinen durumunda yapay kornea üretimi ile ilgili birkaç çalisma bulunsa da jelatin / mTG hidrojel tabanli mezenkimal kök hücre yüklü biyokornea dokusunun üretimi hiç çalisilmamistir. dokusunun, acryloyl-PEG-collagen hidrojel ile bes katmanli olarak olusturuldugundan bahsedilmistir. jelatin/mTG hidrojel porlu yapinin elde edildiginden bahsedilmistir. Fakat olusturulan hidrojelin kornea dokusu ile herhangi bir iliskisi bulunmamaktadir. Teknigin bir diger bilinen durumunda yer alan CN 109172604A numarali patent dokümaninda kardiyovasküler uygulamalar için, ankraj molekülü (PAAM) - glutamin transaminaz (mTG) ve jelatin, mezenkimal kök hücre (MSC) ile birlestirilerek üretilen hidrojelden bahsedilmistir. Teknigin bilinen durumunda mezenkimal kök hücre pek çok çalismanin konusu olmustur. Ancak bahsedilen bu kök hücrenin kornea dokusu olusturmak için ilk defa kullanilacak hidrojele eklenmesi ve söz konusu karisimdan üç boyutlu canli kornea dokusunun üretimi hiç çalisilmamistir. Dolayisiyla teknigin bilinen durumunda yer alan hiçbir çalismada jelatin/mTG hdrojel ile canli kök hücre yüklü kornea dokusunun üç boyutlu üretimi yer almamaktadir. Bulusun Kisa Açiklamasi: Bulusun amaci, bir canli hücre yüklü polimer / enzim hidrojel üretme yöiitemi ve bu yöntem kullanilarak üretilen üç boyutlu yapay bir kornea tabakasi ile ilgilidir. Bulusta uygun kosullarda üretilen hidrojele canli hücre ilave edilip, canli hücre yüklü biyokornea stroma tabakasi (veya dokusu) 3D olarak olusturulmustur. Bulus kapsaminda üretilen hidrojelle insan komeasinin boyut ve sekline uygun canli hücre yüklü yapay kornea gelistirilmekte ve üretilen yapilar kornea transplantasyonunda kullanilmaktadir. Böylece bulus ile elde edilen yapay biyokornea yapisi ile donör korneaya olan ihtiyaç azalacaktir. Üretilen kornea stroma yapilari, canli kök hücre içerdiklerinden doku reddi riski oldukça düsüktür. Sekillerin açiklamasi Sekil 1. (a) Gözün yapisi ve komeanin temsili Çizimidir. (b) bulus konusu yöntem ile üretilen soldan saga % 0.5, %1, %3 oranlarinda mTG içeren Jel/mTG hidrojellerin tüp içerisinde temsili çizimidir. Sekil 2. Üç boyutlu biyoyazici ile üretilen yapay kornea dokusunun üstten (a) ve yandan (b) temsili çizimidir. Sekil 3. Yapay kornea tabakasi üretmek için kullanilan canli hücreli hidrojel yönteminin akis diyagramidir. Sekillerdeki Referanslarin Açiklanmasi Bulusun daha iyi anlasilabilmesi için sekillerdeki numaralarin karsiligi asagida verilmistir: 1. Yapay kornea tabakasi 100. Yöntem Bulusun Detayli Açiklamasi: Kornea körlügü veya görme yetersizligi tedavisinde kullanilmak üzere yapay kornea tabakasini ( l) meydana getirmek için kullanilan solüsyon, en az bir enzim ve/veya en az bir polimer ve/veya en az bir canli hücre içermektedir. Söz konusu enzim; bir mTG enzimidir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Enzimin solüsyondaki orani % 0.5 ila 4 "tür, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Enzimin oranlari tercihen % 0.5 veya % 1 veya % 3`tür, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Söz konusu polimer; bir jelatin polimerdir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Polimerin orani % 8 ile %10 araliginda, tercihen % 8°dir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Söz konusu canli hücre; bir inezenkimal kök hücre veya kornea hücresidir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Kullanilan canli hücre miktari (2-6) X106 hücre/mL olup, uygulamada bununla sinirli degildir. Söz konusu yapay kornea tabakasini (1) üretmek için solüsyondaki polimer terciheiijelatin polimeri, mTG enzimi ile çapraz baglanmistir. Bulusta kullanilan jelatinin enzim ile çapraz baglanmasi hücre canliligi açisindan avantajdir. Çünkü söz konusu maddelerin çapraz baglanmasi, çapraz baglamak için kullanilan diger ajanlarin aksine hücreye zarar verecek toksik bir etkisi bulunmamaktadir. Solüsyon asagidaki yöntem (100) ile elde edildikten sonra 3D yazicinin haznesine doldurulmakta, üç boyutlu biyoyaziin teknigi ile yapay kornea tabakasi (1) üretilinektedir. Yapay kornea tabakasi (l), yapay bir kornea stroma dokusudur. Bulus; yapay kornea tabakasinin (l) tasarimi, üretimi ve karakterizasyonu asamalarindan olusmaktadir. Üç boyutlu yapay kornea tabakasinin (1) (Sekil 2) olusturulmasinda ilk adim tasarim asamasidir. Bulusun ilk asamasinda yetiskin insanin kornea boyutlari olan 12 mm dikey ve yatay çap degerlerine sahip kornea modeli (Temsili Gösterim-l), bir 3D çizim programinda (örnegin Solidworks) olusturulmustur. Söz konusu programda önceden belirlenmis boyutlarda tasarlanan yapay kornea modeli bir dilimleme programi (örnegin Simplify) yardimiyla cihazin içerdigi bir kontrol birimi vasitasiyla üretilmistir. 3D yapay koriiea tabakasiiiin (1) üretilebilmesi için kontrol birimi söz konusu yapay kornea modelini bir koda dönüstürmekte ve daha sonra olusturulan kod, üç boyutlu yaziciya (Temsili çizim 1-4) bir hafiza birimi yardimiyla aktarilmaktadir. Üç boyutlu üretim yapan cihaza yüklenen kod ile cihazin içerdigi bir diger kontrol birimi tarafindan yapay kornea tabakasi (1), (veya yapay biyokornea dokusu) 3D olarak üretilmektedir. Temsili Gösterim 1: Yapay kornea modeli Hidrojellerin (Sekil l-b) olusumu, enzim ilavesi ile baslamaktadir. Buna göre, bulus konusu yapay kornea tabakasinin (l ) üretiini için kullanilacak yöntemin (100) yöntem adimlari asagidaki gibidir: - Önceden belirlenmis oranlarda polimerin, önceden belirlenmis bir oranda saf su içerisinde önceden belirlenmis bir sicaklik degerine ayarlanmis bir karistirici kullanilarak çözdürülmesi (101) - Önceden belirlenmis oranda bir enzimin polimerli solüsyona ilave edilmesi ve çözünmesinin beklenmesi (102) - Çözünme ardindan enzimli polimerin önceden belirlenmis sicaklik degerinde tutulan Sicakligi ayarlanabilen bir kabine konulup jellesmenin beklenmesi ve hidrojelin elde edilmesi (103) - Önceden belirlenmis miktarlarda hidrojele önceden belirlenmis miktarda hücre ilavesi ve SÖZ konusu karisimm homojen olana kadar karistirilmasi (104) - Hoinojcn hücre ilavcli ve cnzimli hidrojclin üretimi (105) 101 . adimda sözü geçen polimer bir jelatindir; ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 101 . adimda sözü geçen polimerin orani % 8 ile %10 araligindadir. ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 101 . adimda sözü geçen polimerin orani tercihen % 8`dir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 101 . adimda sözü edilen sicaklik deger araligi 25-40 OCldir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 101 . adimda sözü geçen karistirici bir manyetik karistiricidir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 101 . adimda Sözü edilen karistiricinin Sicaklik degeri tercihen 37OC7dir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 102 . Adimda sözü geçen enzim bir mTG enzimidir. ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 102 . Adimda sözü geçen enzimin orani her bir hidrojel yapisi için. % 0.5 - 4 araligindadir. 102 . adimda sözü geçen enzimin oranlari tercihen % 0.5 veya % 1 veya % 3 "tür, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 103. adimda sözü geçen kabin, bir inkübatördür, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 103 . adimda sözü geçen kabinin sicaklik degeri 37 oC`dir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 103. Adimda sözü geçen % 0.5, % 1 ve % 3 oranli enzimler için karisimin jellesme süresi sirasiyla 3 ila 4 saat, 2 ila 3 saat ve 1 ila 2 saattir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 104. Adimda sözü geçen hidrojel miktari 5 ila 10 ml olup, uygulamada bununla sinirli degildir. 104 . Adimda sözü geçen mezenkimal canli hücre miktari (2-6) xlO(j hücre/mL olup, uygulamada bununla sinirli degildir. 104 . adimda sözü edilen hücre tercihen bir mezenkiinal kök hücre veya bir canli kornea hücresidir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. 105 . Adimdan sonra kök hücre içeren hidrojel, 3D cihazin haznesine yerlestirilmistir ve yapay kornea tabakasi (1), 3D biyoyazici ile 3D olarak üretilmistir. Dolayisiyla, yapay kornea tabakasi (1), yukaridaki yöntem (100) ile üretilen canli hücre ilaveli ve enzimli polimerik hidrojel"den üç boyutlu olarak 3D yazicida üretilmistir. Daha spesifik olarak yapay kornea tabakasi (l), yukaridaki yöntcin (100) ile üretilen canli mczenkimal kök hücre veya canli kornea hücresi ilavcli ve mTG enzimli/jelatin hidrojel°den üç boyutlu olarak 3D yazicida üretilmistir. Yöntemde (100) yer alan suda çözünebilen polimerin, tercihen jelatinin tek basina yani çapraz baglayici olmadan kullanimi uygun degildir. Çünkü hücrelerin besi yeri su bazli bir sividir. Eger suda kolaylikla çözünen bir yapi çapraz baglanmamissa hücre besiyerine eklenince direkt çözünmekte ve hiç verim alinamamaktadir. Bu nedenle jelatinin bir ajan ile inutlaka çapraz baglanmasi gerekmektedir. Bulusta tercihen kullanilan mTG enzimi, jelatini çapraz baglamak için mutlaka olmasi gereken bir inalzemedir. Çapraz baglama için kullanilan enzim, hücre canliligi için güvenilir olanidir. Öte yandan Jelatin/mTG hidrojeline kök hücre yüklenmesi canli hücre yüklü kornea dokusu üretmek için oldukça önemlidir. Buradaki kök hücre farklilasarak kornea hücresine dönüsebilmektedir. Fakat kök hücre yerine direkt kornea hücresi de yüklenebilmektedir. Sonuç olarakjelatin/mTG mutlaka olmali fakat hücre dogal korneada bulunan herhangi bir hücre hatti da olabilir. Hücre ilaveli ve enziinli hidrojelin yukaridaki yöntem (100) ile üretilmesinden sonra söz konusu biyoinürekkep, yapay kornea tabakasi (l) üretiini için biyoyazim yapan bir cihaza yükleninektedir. Biyoyazim süresince, önceden belirlenmis bir dis çapa sahip bir igne kullanilmistir. Söz konusu ignenin dis çapi 0.3 mm olup. uygulamada bununla sinirli degildir. Kullanilan igne plastik olup, uygulamada bununla sinirli degildir. Yapay kornea tabakasinin (1) üretimi için kullanilan parametreler, kök hücre yüklü hidrojelin akis orani, yazim hizi orani ve yazim sicakligidir. Söz konusu parametreler tercihen sirasiyla %100, 6 mm/sn ve 37 °C olarak ayarlanmistir, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Üretimden sonra tloresan mikroskopta hücrelerin çekirdeklerini görüntülemek için DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) boyama kullanilmistir. Üretilen yapay kornea tabakasi (l), önceden belirlenmis bir süre zarfindaki inkübasyondan sonra görüntüleme tekniklerden biri ile görüntülenmistir. Bulusun tercih edilen uygulamasinda sözü edilen inkübasyon süreleri 1. 4, 7 gündür, ancak uygulamada bununla sinirli degildir. Bahsedilen görüntüleme teknigi, floresans mikroskoptan alinan görüntüler (Görüntü-l a, b_v c; sirasiyla l, 4, 7 gün) olup, DAPI ile boyanan canli hücre sayisini göstermektedir. Buna göre, hidrojelin içerisine yüklenen kök hücrelerin yapi içinde canliliklarini koruduklari gözlemlenmistir. Hücrelerin kornea dokusu üzerindeki morfolojisi taramali elektron mikroskop (scanning electron microscope, SENI) ile ineelenmistir (Görüntü-l d, e, f). Karakterizasyon teknikleri kullanilarak, DAP] boyama ve SBM analizi ile hücrelerin hidrojel içinde canli kaldigi ispatlandi. Görüntü 1. Biyoyazim sonrasi bulusun bir uygulamasinda % 8 Jelatin / %1 mTG biyomürekkeplere ait Iloresan mikroskop görüntüleri: 1. gün (a), 4. gün (13), ve 7. gün (0); 1. gün tiksasyon sonrasi kök hücrelerin % 8 J elatin/ %1 mTG kornea doku içindeki morfolojileri (d, e, f). Bulus kapsaminda üretilen yapay biyokomea tabakasi (l), kornea transplatasyonunda saglanmaktadir. Bulusun Sanayiye Uygulanabilirligi: Bulus konusu yöntem (100), özellikle saglik sektöründe stroma kornea transplatasyonunda kullanilinak üzcrc sanayiye uygulanabilir nitcliktcdir. Bulus yukaridaki örnek uygulamalar ile sinirli olmayip, teknikte uzman bir kisi kolaylikla bulusun farkli diger uygulamalarini ortaya koyabilir. Bunlar bulusun istemler ile talep edilen koruma kapsaminda dcgcrlcndirilmelidir. su içerisinde ve önceden belirlenmis bir sicaklik degerine ayarlanmis bir karistirici kullanilarak Çözdürülmesi Önceden belirlenmis oranda bir enzimin polimerli solüsyona ilave edilmesi Jf 102 Önceden belirlenmis oranlarda polimerin, önceden belirlenmis bir oranda saf y 101 ve çözünmesinin beklenmesi tutulan sicakligi ayarlanabilen bir kabine konulup jellesmenin beklenmesi ve hidrnielin elde edilmesi Önceden belirlenmis miktarlarda hidroj ele önceden belirlenmis miktarda hücre ilavesi ve söz konusu karisimin homojen olana kadar karistirilmasi Homoj en hücre ilaveli ve enzimli hidrojelin üretimi Çözünme ardindan enzimli polimerin önceden belirlenmis sicaklik degerindei. TR TR TR

Claims (1)

1.ISTEMLER Kornea körlügü veya yetersizligi tedavisinde kullanilmak üzere; - Önceden belirlenmis oranlarda polimerin, önceden belirlenmis bir oranda saf su içerisinde önceden belirlenmis bir sicaklik degerine ayarlaninis bir karistirici kullanilarak çözdürülmesi (101) - Önceden belirlenmis oranda bir enzimin polimerli solüsyona ilave edilmesi ve çözünmesinin beklenmesi (102) - Çözünme ardindan enzimli polimerin önceden belirlenmis sicaklik degerinde tutulan sicakligi ayarlanabilen bir kabine konulup jellesmenin beklenmesi ve hidrojelin elde edilmesi (103) - Önceden belirlenmis iniktarlarda hidrojele önceden belirlenmis miktarda hücre ilavesi ve söz konusu karisimin homojen olana kadar karistirilinasi (104) - Homojen hücre ilaveli ve enzimli hidrojelin üretimi (105) adimlarina göre hücre ilaveli hidrojelin üretilmesi ile karakterize edilen bir üretim yöntemi (100). 101 . adimda sözü geçen polimerin birjelatin olmasi ile karakterize edilen istem l”deki gibi bir üretim yöntemi (100) 101 . adimda sözü geçen polimerin oraninin % 8 ile %10 araliginda olmasi ile karakterize edilen istem 2”deki gibi bir üretim yöntemi ( 100) 101 . adimda sözü geçen polimerin oraninin tercihen % 8 olmasi ile karakterize edilen istem 37deki gibi bir üretim yöntemi (100). 101 . adimda sözü edilen sicaklik deger araliginin 25-40 OC olmasi ile karakterize edilen istem 4ideki gibi bir üretim yöntemi (100). 101 . adimda sözü geçen karistiricinin bir manyetik karistirici olmasi ile karakterize edilen istem 5`deki gibi bir üretim yöntemi (100). 10] .adimda sözü edilen karistiricinin sicaklik degeri tercihen 37°C olmasi ile karakterize edilen istem 6'daki gibi bir üretim yöntemi (100). 102 . Adimda sözü geçen enzimin bir mTG enzimi olmasi ile karakterize edilen istem 7`deki gibi bir üretim yöntemi (l00). 102 . Adimda sözü geçen enzimin oraninin her bir hidrojel yapisi için, % 0.5 - 4 araliginda olmasi ile karakterize edilen istem 8`deki gibi bir üretim yöntemi (100). . 102 . adimda sözü geçen enzimin oranlarinin tercihen % 0.5 veya % 1 veya % 3 olmasi ile karakterize edilen istem 9”daki gibi bir üretim yöntemi (100). 103. adimda sözü geçen kabinin bir inkübatördür olmasi ile karakterize edilen istem 10”daki gibi bir üretim yöntemi (100). 103 . adimda sözü geçen kabinin sicaklik degerinin 37 0C olmasi ile karakterize edilen istem 117deki gibi bir üretim yöntemi (100). 103. Adimda sözü geçen % 0.5, % 1 ve % 3 oranli enzimler için karisimm jellesme süresinin sirasiyla 3 ila 4 saat, 2 ila 3 saat ve 1 ila 2 saat olmasi ile karakterize edilen istem 12”deki gibi bir üretim yöntemi (100). 103 . Adimda sözü geçen hidrojel miktarinin 5 ila 10 ml olmasi ile karakterize edilen istein 13”deki gibi bir üretiin yöntemi (100). 104 . Adimda sözü geçen canli hücre miktarinin (2-6) x106 hücre/mL olmasi ile karakterize edilen istem l4'deki gibi bir üretim yöntemi (100). 104 . adimda Sözü edilen hücrenin tercihen mezenkimal kök hücre veya canli kornea hücresi olmasi ile karakterize edilen istem 155deki gibi bir üretim yöntemi (100). Yöntem (100) ile üretilen canli hücre ilaveli enzimli polimerik hidrojel°den 3D yazicida 3D olarak üretilmesi ile karakterize edilen yukaridaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir yapay kornea tabakasi (1). Kök hücre veya canli kornea hücresi ilaveli mTG enzim/ jelatin yapisindaki hidrojelden 3D yazicida 3D olarak üretilmesi ile karakterize edilen istem 17'deki gibi bir yapay kornea tabakasi (1). Komea stroma olmasi ile karakterize edilen istem 181deki gibi bir yapay kornea tabakasi (1). Kornea transplatasyonunda kullanilmasi ile karakterize edilen istem 19“daki gibi bir yapay kornea tabakasi (1). Kornea körlügü veya yetersizligi tedavisinde kullanilmak üzere; en az bir enzim ve/veya en az bir polimer ve/Veya en az bir canli hücre içermesiyle karakterize edilen bir solüsyon. Tercihen % 0.5 veya % 1 veya % 3 oraninda enzim ile karakterize edilen istein 22”deki gibi bir solüsyon. Bir mTG enzim olan enzim ile karakterize edilen istein 23 'deki gibi bir solüsyon. istem 24°deki gibi bir solüsyon. Birjelatin olan polimer ile karakterize edilen istem 25°deki gibi bir solüsyon. (2-6) x 106 hücre/mL miktarinda canli hücre ile karakterize edilen istem 26,daki gibi bir solüsyon. Bir mezenkimal kök hücre veya kornea hücresi olan canli hücre ile karakterize edilen istem 277deki gibi bir solüsyon. TR TR TR