KR20170040809A

KR20170040809A - 세포외 기질 조성물

Info

Publication number: KR20170040809A
Application number: KR1020177008216A
Authority: KR
Inventors: 모힛 비. 바티아; 우리 헤르츠베르그; 알렉산드르 카플루노브스키; 라이하나 자카; 퀴안 예
Original assignee: 에이치엘아이 셀룰러 테라퓨틱스, 엘엘씨
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2017-04-13
Also published as: EP3185888A4; AU2015306811A1; CN106794227B; SG10201901713RA; JP2017525732A; JP2020142114A; EP3185888A1; NZ729021A; SG11201701114UA; JP2022130466A; MY193650A; WO2016033041A1; CA2958211C; CA2958211A1; EP3185888B1; IL250753A0; ZA201701059B; EA201790461A1; AU2021202201A1; CN106794227A

Abstract

본 발명은 태반 세포외 기질(ECM) 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 제공된 태반 ECM 조성물의 용도를 제공한다.

Description

세포외 기질 조성물{EXTRACELLULAR MATRIX COMPOSITIONS}

본 출원은 2014년 8월 25일자로 출원된 미국 가출원 제 62/041,468호에 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.

1. 기술분야

본 발명에는 세포외 기질(ECM) 조성물 및 이를 제조하는 방법이 제공된다. 또한 본 발명에는 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 용도가 제공된다.

2. 배경기술

세포외 기질(ECM)은 피부 및 내장 기관을 지지하는 힘줄, 인대 및 층(sheets)을 포함하는, 체내에 많은 구조를 형성하는 단백질을 포함한다. 신규하고 개선된 ECM 조성물 및 이러한 ECM 조성물을 제조하는 방법은 본 기술분야에서 요구된다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 태반 세포외 기질(ECM) 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 본 발명의 태반 ECM 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

3. 요약

일 양태에서, 본 발명에는 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직을 사용하여 제조된 세포외 기질(ECM) 조성물이 제공된다.

특정한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 ECM 조성물은 약 30% 내지 약 60%의 콜라겐 및 약 10% 내지 약 35%의 엘라스틴을 포함한다. 추가로, 이러한 ECM 조성물은 (i) 매우 낮은 양의 피브로넥틴(예를 들어 0.1% 피브로넥틴 미만), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; (ii) 라미닌(laminin)이 없거나 검출되지 않는 양, 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; 및/또는 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양, 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 약 30% 내지 약 72%의 콜라겐 및 약 10% 내지 약 35%의 엘라스틴을 포함한다. 추가로, 이러한 ECM 조성물은 (i) 피브로넥틴(예를 들어, 0.1% 피브로넥틴 미만), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; (ii) 라미닌(예를 들어 0.1% 라미닌 미만), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; 글리코사미노글리칸(예를 들어 0.1% 글리코사미노글리칸 미만) 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; (iii) 사이토카인이 없거나 검출되지 않는 양; (iv) 성장 인자가 없거나 검출되지 않는 양; 및/또는 (v) 디옥시콜린산이 없거나 검출되지 않는 양을 포함할 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치료적/의학적 용도에 매우 적합한 특성을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 설명된 ECM 조성물은 무균, 무세포(예를 들어 99% 이상의 무세포)이며 및/또는 세포 파편이 없다(예를 들어 99% 이상의 세포 파편이 없음). 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 ELISA에 의해 측정된, 사이토카인을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양의 사이토카인을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 추가로 시약 잔류물이 없는, 즉 최종 ECM 조성물은 조성물의 제조에 사용된 검출 불가능한 양의 시약을 포함한다. 추가로, 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 핵산(예를 들어 ~41-171 ng/mg의 건조 생산물) 및 엔도톡신(예를 들어 <0.25 EU)의 최소량을 포함한다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 다른 유리한 특징은 물을 흡수하는 그들의 능력이다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 물에서 150%-225% 사이의 그들의 중량을 흡수한다. 이러한 특징은 예를 들어 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 상처 치료 적용에 유익하다.

본 발명에 제공된 특정한 실시예는 35-55% 콜라겐 및 약 10-30% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이다. 특정한 실시예에서, 상기 조성물은 34-53%의 콜라겐 및 13-29%의 엘라스틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 피브로넥틴 미만, 0.01% 피브로넥틴 미만, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴의 매우 낮은 양, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함하며; 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함하며; 및 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

본 발명에 제공된 특정한 실시예는 약 35-72%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이다. 본 발명에 제공된 다른 특정한 실시예는 약 40-70% 콜라겐 및 약 15-25% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 조성물은 40-70% 콜라겐 및 15-22% 엘라스틴을 포함한다. 또 다른 특정한 실시예에서, 상기 조성물은 43-68% 콜라겐 및 18-21% 엘라스틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 사이토카인, 성장 인자, 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막판, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막, 예를 들어 융모막판으로부터 수득된다.

다른 특정한 실시예에서 약 50-60% 콜라겐 및 약 10-20% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 45-55% 콜라겐 및 약 15-25% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 40-50% 콜라겐 및 약 20-30% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 30-40% 콜라겐 및 약 25-35% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 34-43% 콜라겐 및 약 16-24% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 37-42% 콜라겐 및 약 16-24% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서 약 30-70%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 30-35%, 34-43%, 35-72%, 35-40%, 37-42%, 40-70%, 40-60%, 40-50%, 40-45%, 40-65%, 43-68%, 45-50%, 50-55%, 또는 55-60%의 콜라겐 및 약 10-30%, 10-20%, 10-15%, 15-25%, 15-22%, 15-20%, 16-24%, 17-24%, 18-21%, 18-20%, 20-24%, 20-30%, 20-25%, 25-30%, 또는 약 30-35%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 융모막판, 예를 들어 융모막, 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70% or 약 72%의 콜라겐 및 약 10%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, or 약 35%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 융모막판, 예를 들어 융모막, 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 또는 약 72% 콜라겐 및 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 35% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 융모막판, 예를 들어 융모막, 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 또는 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 또는 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 다양한 방법으로 제형화될 수 있으며, 제형의 유형은 예를 들어, ECM 조성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 예시적 제형은 4.1.1 절에 상세히 기재되어 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 주사기를 사용하여 투여될 수 있는 형태로 유동성 기질로 제형화된다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 분말 형태의 미립자로 제형화된다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 시트(sheets)로 제형화된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 비 ECM 성분인 하나 이상의 성분을 포함하도록 제형화된다. 4.1.1.1절 참조.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 적어도 하나의 ECM 시트를 포함하는 라미네이트(laminates)가 제공된다. 특정한 실시예에서, 두개의 ECM 시트를 포함하는 라미네이트가 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 적어도 하나의 ECM 시트 및 적어도 하나의 다른 평면 탈세포화된 조직(예를 들어, 완전히 탈세포화되거나 섬유아세포 세포층을 보유하도록 탈세포화된 탈세포화된/탈수화된 양막)을 포함하거나, 평면 인조 조직 대체물을 갖는 라미네이트가 제공된다. 특정한 실시예에서, 라미네이트는 접착제(adhesive), 예를 들어 접착제(glue)(예를 들어 천연 접착제(glue), 예를 들어 피브로넥틴, 피브린; 또는 합성 접착제)의 존재 하에 ECM 시트, 또는 하나 이상의 ECM 시트 및 다른 평면 탈세포화된 조직을 서로 접촉시켜 배치함으로써 생성될 수 있다. 특정한 실시예에서, 라미네이트는 둘 이상의 ECM 시트, 또는 하나 이상의 ECM 시트 및 하나 이상의 평면 탈세포화된 조직을 함께 가열 건조시킴으로써 생성될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 하나 이상의 유형의 세포로 시딩될 수 있고 및/또는 포함할 수 있으며, 즉 세포는 본 발명에 설명된 ECM 조성물로 배양되고 자랄 수 있거나, 본 발명에 설명된 ECM 조성물 내에 분산될 수 있다(예를 들어 ECM 유동성 기질 조성물에 첨가됨). 본 기술분야의 통상의 기술자는 기술분야에 공지된 임의의 세포 유형이 줄기 세포 및 비-줄기 세포 모두를 포함하여, 본 발명에 제공된 ECM 조성물로 시딩 및/또는 배양될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에서 제공되는 ECM 조성물 상에 시딩될 수 있는 세포 유형의 비제한적인 목록은 4.1.2 절에 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명에 설명된 ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 4.2절 참조. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 태반(예를 들어 인간 태반)으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 순서대로 하기 단계를 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 양막, 융모막, 및 탯줄을 제거하는 단계; (ii) 태반 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 태반 조직을 처리하는 단계; (iii) 태반을 세제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 태반을 염기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계. 특정한 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어 인간 태반)의 융모막을 사용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 태반 조직을 처리하는 단계; (iii) 태반을 세제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 태반을 염기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계. 특정 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어, 인간 태반)의 융모막을 이용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후의 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 융모막을 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 처리하는 단계; (iv) 융모막을 세제를 포함하는 용액에 접촉시키는 단계; 및 (v) 그라인드 및 동결 건조하는 단계. 특정한 다른 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어, 인간 태반)의 융모막을 사용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (iii) 융모막을 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 처리하는 단계; (iv) 융모막을 첫 번째, 이후 두 번째 세제 용액을 포함하는 용액에 접촉시키며, 상기 용액은 세제 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA를 포함하는 단계; 및 (v) 동결 건조하는 단계.

본 발명에 설명된 ECM 조성물을 제조하는 방법은 본 발명에 설명된 특정한 특성을 갖는 ECM 조성물을 생산할 수 있는 양의 성분, 예를 들어, 염기, 세제, 킬레이트제를 사용한다.

본 발명에 설명된 ECM 조성물을 제조하는 방법은 본 발명에 설명된 특정한 특성을 갖는 ECM 조성물을 생산할 수 있는 양의 성분, 예를 들어, 염기, 세제를 사용한다.

특정한 실시예에서, ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 양막, 융모막, 및 탯줄을 제거하는 단계; (ii) 태반 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1 M NaCl)에 남아있는 태반 조직을 두며 태반 조직을 균질화하는 단계; (iii) 태반 조직을 세제를 포함하는 용액, 예를 들어 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 소듐 디옥시콜레이트)와 접촉시키는 단계; (iv) 태반 조직을 예를 들어 물로 세척하는 단계; (v) 태반 조직을 염기, 예를 들어 소듐 하이드록사이드(NaOH, 예를 들어 1 M NaOH)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (vi) 중성 pH(예를 들어, pH 6.0-8.0) 또는 이와 유사하도록 태반 조직을 포함하는 용액에 산 용액, 예를 들어, 염산(HCl)을 첨가하는 단계; 및 (vii) 용액의 액체 부분으로부터 태반 조직을 분리(예를 들어, 원심분리에 의해)하고 태반 조직을 수집함으로써 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 제조되는 ECM 조성물은 일반적으로 본 발명에 설명된 ECM 제형, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질의 형태인 것을 제조하기 위해, 나중에 사용하기 위해 수득 후 동결 및 저장될 수 있거나, 또는 수득 직후 사용될 수 있는, 페이스트(ECM 페이스트)의 형태이다.

다른 특정한 실시예에서, ECM 조성물의 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1 M NaCl)에 남아있는 융모막 조직을 두며 융모막 조직을 균질화하는 단계; (iii) 융모막 조직을 세제를 포함하는 용액, 예를 들어 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 소듐 디옥시콜레이트)와 접촉시키는 단계; (iv) 융모막 조직을 예를 들어 물로 세척하는 단계; (v) 융모막 조직을 염기, 예를 들어 소듐 하이드록사이드(NaOH, 예를 들어 1 M NaOH)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (vi) 중성 pH(예를 들어, pH 6.0-8.0) 또는 이와 유사하도록 융모막 조직을 포함하는 용액에 산 용액, 예를 들어, 염산(HCl)을 첨가하는 단계; 및 (vii) 용액의 액체 부분으로부터 태반 조직을 분리(예를 들어, 원심분리에 의해)하고 태반 조직을 수집함으로써 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 제조되는 ECM 조성물은 일반적으로 본 발명에 설명된 ECM 제형, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질의 형태인 것을 제조하기 위해, 나중에 사용하기 위해 수득 후 동결 및 저장될 수 있거나, 또는 수득 직후 사용될 수 있는, 페이스트(ECM 페이스트)의 형태이다.

다른 특정한 실시예에서, ECM 조성물의 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막, 예를 들어 융모막판을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (iii) 융모막 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 0.5 M NaCl)에 남아있는 융모막 조직을 두는 단계; (iv) 융모막 조직을 세제를 포함하는 용액, 예를 들어 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 소듐 디옥시콜레이트)와 접촉시키는 단계; (iv) 융모막 조직을 세제, 예를 들어 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트)를 포함하는 용액과 접촉시키고, 린스(rinsing), 예를 들어 물로 린스하는 단계; 및(v) 그리인드 및 동결 건조하는 단계를 포함한다. 상기 ECM 조성물, 일반적으로 페이스트(ECM 페이스트)는 예를 들어 밀링(milled) 및 제형화되어 다양한 형상 및 형태, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질로 제조될 수 있다.

또 다른 특정한 실시예에서, ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막, 예를 들어 융모막판을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (iii) 융모막 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1.0 M NaCl)에 융모막 조직을 두는 단계; (iv) 융모막 조직을 세제, 예를 들어 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 0.05%-0.2% 또는 0.3%-0.6% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트) 및 EDTA(예를 들어, 1-5mM EDTA 또는 5-10 mM EDTA)를 포함하는 첫 번째 세제 용액과 접촉시키는 단계; (v) 융모막 조직을 세제, 예를 들어 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어 0.05%-0.2% 또는 0.3%-0.6% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트) 및 EDTA(예를 들어, 1-5mM EDTA 또는 5-10 mM EDTA)를 포함하는 두 번째 세제 용액과 접촉시키고, 예를 들어 물로 린스하는 단계; (vi) 제형화, 예를 들어, 탈세포화된 ECM 페이스트를 형성하기 위해 용액(예를 들어, 물 또는 인산염 완충 식염수)에 밀링 및 재현탁, 및 다양한 형상 및 형태, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질로 제형화될 수 있는 탈세포화된, 동결 건조된 전체 융모막을 생산하기 위해 동결 건조하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, ECM 시트를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) 예를 들어, 물에 ECM 페이스트를 현탁하고, 시트의 형성을 위해 적절한 기질에 재현탁된 ECM 용액을 첨가, 예를 들어, 몰드(mold)에 ECM을 첨가하는 단계; (iii) ECM을 동결시키는 단계; (iv) 동결된 ECM을 동결건조하는 단계; (v) 기질로부터 동결건조된 ECM을 제거하고 물 속에 담그는 단계; 및 (vi) ECM을 예를 들어 진공 건조기를 사용하여 건조시키는 단계를 포함한다.

특정한 실시예에서, ECM 입자를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) 상기 ECM 페이스트를 예를 들어 물에 현탁하는 단계; (iii) ECM을 동결시키는 단계; (iv) 동결된 ECM을 동결 건조시키는 단계; (v) 동결건조된 ECM을 밀링하는 단계를 포함한다.

특정한 실시예에서, ECM 유동 기질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) ECM 페이스트를 예를 들어 물에 현탁시키는 단계; (iii) ECM을 동결시키는 단계; (iv) 동결된 ECM을 동결건조시키는 단계; (v) 동결건조된 ECM을 미세화(micronizing)하는 단계를 포함한다. 미세화된 ECM을 예를 들어 식염수에 재현탁할 때, ECM 유동 기질이 생성된다.

다른 양태에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 용도가 제공된다. 4.3절 참조. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치료적/의학적 목적을 위해 사용된다. 4.3.1절 참조. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 미용 목적을 위해 사용된다. 4.3.2.절 참조.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상처 치료 및/또는 관리에 사용된다. 4.3.1절 참조. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상처를 충진하기 위해, 상처 충진제로써 사용된다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상처, 예를 들어 화상에 의해 유발된 상처를 드레싱(즉, 커버)하는데 사용된다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치아 상태를 치료 및/또는 관리, 예를 들어 치아 결함을 치료하기 위해 사용된다. 4.3.2절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 구강 병변의 치료 및/또는 관리에 사용된다. 4.3.3절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체의 몸체 내 공극(void)을 밀봉, 충진, 및/또는 다르게 치료하기 위해 사용된다. 4.3.4절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 조직을 벌킹(bulking)하는데 사용된다. 4.3.5절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 요실금의 치료를 위해 사용된다. 4.3.6절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 방광요관 역류(vesicoureteral reflux)의 치료를 위해 사용된다. 4.3.7절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 위식도 역류(gastroesophageal reflux) 병의 치료에 사용된다. 4.3.8절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 성대(vocal cords) 및/또는 후두(larynx) 중 하나 또는 양쪽에 영향을 미치는 질병, 질환, 또는 다른 비정상을 치료하기 위해 사용된다. 4.3.9절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체 내 성문 무능력(glottic incompetence)의 관리 또는 치료를 위해 사용된다. 4.3.10절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 조직 또는 기관의 생체 공학을 위해 사용된다. 4.3.11절 참조.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 화장학적 목적을 위해 개체의 피부를 증진하기 위한(예를 들어 개체가 보다 어려보이도록), 화장학적 목적이다. 4.3.12절 참조.

다른 양태에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 상기 키트는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 배포하기에 편리한 패키지로 본 발명에 설명된 ECM 조성물을 포함한다. 5절 참조.

본 발명은 태반 세포외 기질(ECM) 조성물은 여러가지 의학적 또는 화학적 용도를 위해 사용될 수 있다.

3.1 도면의 간단한 설명
도 1A 내지 1F: 알비노 뉴질랜드 화이트 래빗에 이식 이후 돼지의 방광 기질에 대한 조직 반응성과 비교하여 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조된 ECM 시트에 대한 조직 반응성. 이식 1주일 후, 방광 기질(UBM) 시트에 인접한 조직은 과립화 및 염증 반응(도 1A)의 뚜렷한 징후를 보인 반면, ECM 시트는 과립구의 약간의 침투로 산재된 근육 조직을 보였다(도 1B). 2주 및 4주째에, 과립화는 UBM 시트에 인접하여 여전히 명백한 반면(도 1C 및 1E), ECM 시트에 인접한 조직은 사실상 과립화를 나타내지 않았고 정상인 것으로 보였다(도 1D 및 1F).
도 2A 내지 2F: 알비노 뉴질랜드 화이트 래빗에 이식 이후 MATRISTEM MICROMATRIX®에 대한 조직 반응성과 비교하여 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조된 ECM 미립자에 대한 조직 반응성. 이식 후 1주일에, ECM 미립자는 염증을 가리키는 일부 과립을 보였으나(도 2B), UBM 미립자보다 현저하게 낮은 반면(도 2A), 2주 및 4주에, 상기 ECM 입자는 UBM 미립자에 비해 과립의 현저한 감소를 보였으며(각각 도 2D 및 2F), 2주 및 4주에 여전히 실질적인 염증을 보였다(각각 도 2C 및 2E).
알비노 뉴질랜드 화이트 래빗에 이식 이후 소로부터 유래된 상처 기질 제품(INTEGRA™ Flowable)에 대한 조직 반응성과 비교하여 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조된 ECM 유동 기질에 대한 조직 반응성. 소로부터 유래된 상처 기질 제품((INTEGRA™ Flowable)은 1주에 과립(도 3A), 이후 2주 및 4주에 흉터(도 3C 및 3E의 밝은 부분)를 보인 반면, ECM 유동 기질은 첫째주에만 실질적으로 염증 반응을 보였으며(도 3B), 이후 2주 및 4주에는 거의 완전히 치유되었다(각각 도 3D 및 3F).

4. 상세한 설명

본 발명은 세포외 기질(ECM) 조성물(4.1절 참조) 및 이의 제조 방법(4.2절 참조)을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 제공된 ECM 조성물의 용도(4.3절 참조) 및 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하는 키트(5절 참조)를 제공한다.

4.1. 세포외 기질 조성물

일 양태에서, 본 발명은 태반 조직, 예를 들어, 인간 태반 조직을 이용하여 제조된 세포외 기질(ECM) 조성물을 제공한다. 본 발명에 설명된 ECM 조성물은 ECM 성분, 예를 들어 콜라겐 및 엘라스틴을 본 발명의 기술분야에 알려진 ECM 조성물에서와 상이한 양으로 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 약 30% 내지 60%의 콜라겐 및 약 10% 내지 35%의 엘라스틴을 포함한다. 본 발명에 사용된, 용어 "약"은 특정한 숫자의 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트의 양을 의미한다. 추가로, 이러한 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 (i) 매우 낮은 양의 피브로넥틴(예를 들어, 0.1% 미만의 피브로넥틴), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; (ii) 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양의 라미닌, 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; 및/또는 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양, 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 약 30% 내지 72%의 콜라겐 및 약 10% 내지 약 35%의 엘라스틴을 포함한다. 추가로, 이러한 ECM 조성물은 (i) 피브로넥틴(예를 들어, 0.1% 미만의 피브로넥틴), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; (ii) 라미닌(예를 들어 0.1% 미만의 라미닌), 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 것; 글리코사미노글리칸, (예를 들어 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸) 예를 들어, ELISA에 의해 측정된 것; (iii) 사이토카인이 없거나 검출되지 않는 양; (iv) 성장 인자가 없거나 검출되지 않는 양; 및/또는 (v) 디옥시콜린산이 없거나 검출되지 않는 양을 포함할 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치료적/의학적 용도를 위해 적합하게 이들을 제조하는 특징을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 설명된 ECM 조성물은 무균, 무세포(예를 들어, 99% 이상의 무세포) 및/또는 세포 파편이 없다(예를 들어, 99% 이상의 무 세포 파편). 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 ELISA를 통해 측정되는, 사이토카인을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양의 사이토카인을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공되는 ECM 조성물은 추가로 시약 잔류물이 없으며, 즉 최종 ECM 조성물은 상기 조성물의 제조에 사용되는 시약을 검출되지 않는 양을 포함한다. 추가로, 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 핵산(건조물의 ~41-171 ng/mg) 및 엔도톡신(<0.25 EU)의 최소량을 포함한다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 다른 유익한 특징은 물을 흡수하는 능력이다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 그들의 중량의 150%-225% 사이의 물을 흡수한다.

특정한 실시예에서, 34-53% 콜라겐 및 13-29% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양의 라미닌; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 35-55% 콜라겐 및 10-30% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양의 라미닌; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

특정한 실시예에서, 약 35-72% 콜라겐 및 약 15-25% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 약 40-70%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 조성물은 40-70% 콜라겐 및 15-22%의 엘라스틴을 포함한다. 또 다른 특정한 실시예에서, 상기 조성물은 43-68% 콜라겐 및 18-21% 엘라스틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막판, 예를 들어 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다.

다른 특정한 실시예에서, 약 50-60%의 콜라겐 및 약 10-20%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함하지 않거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 45-55%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 40-50%의 콜라겐 및 약 20-30%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 30-40%의 콜라겐 및 약 25-35%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 34-43%의 콜라겐 및 약 16-24%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 37-42%의 콜라겐 및 약 16-24%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 인간 태반의 융모막으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서 약 30-70%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 30-35%, 34-43%, 35-72%, 35-40%, 37-42%, 40-70%, 40-60%, 40-50%, 40-45%, 40-65%, 43-68%, 45-50%, 50-55%, 또는 55-60% 콜라겐 및 약 10-30%, 10-20%, 10-15%, 15-25%, 15-22%, 15-20%, 16-24%, 17-24%, 18-21%, 18-20%, 20-24%, 20-30%, 20-25%, 25-30%, 또는 약 30-35% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막판, 예를 들어 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어, 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1% 라미닌, 0.001 내지 0.05% 라미닌, 0.001 내지 0.01% 라미닌, 0.01 내지 0.1% 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05% 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01% 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05% 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양을 포함한다.

특정한 실시예에서, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70% or 약 72% 콜라겐 및 약 10%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, or 약 35% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막판, 예를 들어 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어, 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1% 라미닌, 0.001 내지 0.05% 라미닌, 0.001 내지 0.01% 라미닌, 0.01 내지 0.1% 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05% 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01% 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05% 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양을 포함한다.

다른 특정한 실시예에서, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 또는 약 72% 콜라겐 및 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 35% 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반 조직, 예를 들어 인간 태반 조직으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 태반의 융모막, 예를 들어 태반의 융모막판, 예를 들어 융모막, 예를 들어 인간 태반으로부터 융모막판으로부터 수득된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 또는 0.001% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 0.001 내지 0.1%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05%의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01%의 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1%의 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05%의 피브로넥틴을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 라미닌, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 라미닌, 0.001 내지 0.05%의 라미닌, 0.001 내지 0.01%의 라미닌, 0.01 내지 0.1%의 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05%의 라미닌을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양으로 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 글리코사미노글리칸, 예를 들어 0.001 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01%의 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1%의 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05%의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 매우 낮은 양의 피브로넥틴, 예를 들어 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴; 라미닌이 없거나 검출되지 않는 양; 및 글리코사미노글리칸이 없거나 검출되지 않는 양을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 피브로넥틴, 예를 들어, 0.1% 미만의 피브로넥틴, 0.05% 미만의 피브로넥틴, 0.01% 미만의 피브로넥틴, 0.001% 미만의 피브로넥틴, 0.001 내지 0.1% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.05% 피브로넥틴, 0.001 내지 0.01% 피브로넥틴, 0.01 내지 0.1% 피브로넥틴, 또는 0.01 내지 0.05% 피브로넥틴, 라미닌, 예를 들어, 0.1% 미만의 라미닌, 0.05% 미만의 라미닌, 0.01% 미만의 라미닌, 0.001% 미만의 라미닌, 0.001 내지 0.1% 라미닌, 0.001 내지 0.05% 라미닌, 0.001 내지 0.01% 라미닌, 0.01 내지 0.1% 라미닌, 또는 0.01 내지 0.05% 라미닌, 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.05% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.01% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001% 미만의 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.05% 글리코사미노글리칸, 0.001 내지 0.01% 글리코사미노글리칸, 0.01 내지 0.1% 글리코사미노글리칸, 또는 0.01 내지 0.05% 글리코사미노글리칸을 포함하며, 추가적으로, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 디옥시콜린산을 포함하지 않거나 또는 검출되지 않는 양을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 설명된 ECM 조성물 내 콜라겐은 텔로펩타이드(telopeptide) 콜라겐을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 설명된 ECM 조성물 내 콜라겐은 아텔로펩타이드(atelopeptide) 콜라겐을 포함하거나 이로 이루어진다. 어떤 경우 텔로펩타이드 콜라겐 및 아텔로펩타이드 콜라겐으로 이루어진다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐의 주요 유형은 제1형 콜라겐이다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 80% 이상의 제1형 콜라겐의 건조 중량을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 50% 내지 70%의 제1형 콜라겐, 60% 내지 80%의 제1형 콜라겐, 또는 70% 내지 90%의 제1형 콜라겐의 건조 중량을 포함한다. 특정한 실시예에서, ECM 조성물 내 콜라겐은 60% 내지 80%의 제1형 콜라겐을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 콜라겐의 유형의 혼합물을 포함하며, 예를 들어 제1형 콜라겐뿐만 아니라 제3형 콜라겐 및/또는 제4형 콜라겐을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 제1형 콜라겐의 상당한 양(예를 들어 60%-80%의 제1형 콜라겐)을 포함하는 한편 또한 제3형 콜라겐을 포함한다. 예를 들어, 제1형 콜라겐에 추가로, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 1% 내지 5%의 제3형 콜라겐, 5% 내지 10%의 제3형 콜라겐, 또는 1% 내지 10%의 제3형 콜라겐의 건조 중량을 포함하거나; 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%의 제3형 콜라겐의 건조 중량을 포함할 수 있다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 상당한 양의 제1형 콜라겐(예를 들어, 60%-80% 제1형 콜라겐)을 포함하는 한편 제4형 콜라겐도 포함한다. 예를 들어, 제1형 콜라겐에 추가로, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 1% 내지 5%의 제4형 콜라겐, 5% 내지 10%의 제4형 콜라겐, 또는 1% 내지 10%의 제4형 콜라겐의 건조 중량을 포함하거나; 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%의 제4형 콜라겐의 건조 중량을 포함할 수 있다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 상당한 양의 제1형 콜라겐(예를 들어, 60%-80% 제1형 콜라겐)을 포함하는 한편 제3형 콜라겐 및 제4형 콜라겐도 포함한다. 예를 들어, 제1형 콜라겐에 추가로, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 (i) 1% 내지 5%의 제3형 콜라겐, 5% 내지 10%의 제3형 콜라겐, 또는 1% 내지 10%의 제3형 콜라겐의 건조 중량을 포함하거나; 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%의 제3형 콜라겐의 건조 중량을 포함할 수 있으며; (ii) 1% 내지 5%의 제4형 콜라겐, 5% 내지 10%의 제4형 콜라겐, 또는 1% 내지 10%의 제4형 콜라겐의 건조 중량을 포함하거나; 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%의 제4형 콜라겐의 건조 중량을 포함할 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 예를 들어 가교결합제로 가교결합된다. 예시적인 가교결합제는 글루타알데하이드(glutaraldehyde) (예를 들어, 미국특허 번호 4,852,640, 5,428,022, 5,660,692 및 5,008,116 참조, 이들의 내용은 전체가 참조로써 본 발명에 인용됨), 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터(butanediol diglycidyl ether), 및 제니핀(genipin) (예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 번호 2003/0049301 참조, 이들의 내용은 전체가 참조로써 본 발명에 인용됨)을 포함한다. 추가적인 가교결합제 및 콜라겐을 가교결합하는 방법은 미국특허번호 5,880,242 및 6,117,979 및 Zeeman et al., 2000, J Biomed Mater Res. 51(4):541-8, van Wachem et al., 2000, J Biomed Mater Res. 53(1):18-27, van Wachem et al., 1999, J Biomed Mater Res. 47(2):270-7, Zeeman et al., 1999, J Biomed Mater Res. 46(3):424-33, Zeeman et al., 1999, Biomaterials 20(10):921-31에서 설명되며, 이들의 내용은 전체가 참조로써 본 발명에 인용된다.

4.1.1 제형(Formulations)

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 다양한 방법으로 제형화될 수 있으며, 제형의 유형은 예를 들어 ECM 조성물의 의도된 용도를 기초로 선택될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 유동성 기질, 예를 들어 주사기를 사용하여 투여될 수 있는 형태로 제형화된다. 따라서, 본 발명에 설명된 ECM 조성물을 포함하는 주사기가 제공된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 물 또는 인산염 버퍼 식염수에서, 예를 들어 용액 또는 현탁액으로, 예를 들어 구강 청결제로 제형화될 수 있다. 용액 내에서(즉, 유동성 기질로), 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 통상의 기술자에게 유용한 임의의 농도로 존재할 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 200-300 mg/ml, 100-200 mg/ml, 150-250 mg/ml, 0.1-100 mg/ml, 1-100 mg/ml, 1-75 mg/ml, 1-50 mg/ml, 1-40 mg/ml, 10-40 mg/ml 또는 20-40 mg/ml의 ECM을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml ECM, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 225 mg/ml, 250 mg/ml, 275 mg/ml, 또는 300 mg/ml ECM을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 약 200 mg/ml ECM을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 본 발명에 설명된 방법을 사용하여 제조된 동결건조된, 미세화된(micronized) ECM을 사용하여 통상의 기술자에 의해 제조되며, 예를 들어, 상기 동결건조된, 미세화된 ECM은 적절한 현탁 용액, 예를 들어 식염수를 동반하는 키트의 형태로 제공되며, 통상의 기술자는 현탁 용액 내 동결건조된, 미세화된 ECM을 현탁시킴으로써 유동성 기질 ECM 조성물을 용이하게 제조할 수 있다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 미립자, 예를 들어 파우더 형태로 제형화된다. 미립자로 존재하는 경우, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 미립자의 저장에 적합한 임의의 용기, 예를 들어 바이알(예를 들어, 유리 바이알)에 제공될 수 있다. 미립자로 제공될 때, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 통상의 기술자에게 유용한 임의의 농도로 용기에 제공될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 미립자 ECM 조성물은 200-300 mg, 100-200 mg, 150-250 mg, 50-100 mg, 25-50 mg, 10-25 mg, 5-10 mg, 또는 1-5 mg의 ECM을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 유동성 기질 ECM 조성물은 약 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 m, 45 mg, 50 m ECM, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 또는 300 mg ECM을 포함한다. 특정한 실시예에서, 본 발명은 약 200 mg ECM을 포함하는 미립자 ECM 조성물을 제공한다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명은 약 100 mg ECM을 포함하는 미립자 ECM 조성물을 제공한다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 시트, 즉 평면, ECM의 고체층으로 제형화된다. 시트로 존재할 때, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 의도된 목적에 적합한 임의의 두께 및 면적의 시트로 형상화될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 시트는 표준 크기, 예를 들어 5 x 5 cm 또는 8 x 8 cm의 크기로 제공되며, 이들의 사용 전에 통상의 기술자에 의해 조작(예를 들어, 절단)될 수 있으며, 예를 들어, 이들의 목적하는 용도, 예를 들어 상처 드레싱에 적합한 크기로 절단될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 약 0.1-0.15 mm, 0.15-0.2 mm, 0.1-0.2 mm, 0.2-0.25 mm, 0.25-0.3 mm, 또는 0.2-0.3 mm 두께를 갖는 시트로 제형화된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 약 0.1 mm, 0.15 mm, 0.2 mm, 0.25 mm, 또는 0.3 mm의 두께를 갖는 시트로 제형화된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 2 x 2 cm 시트, 3 x 3 cm 시트, 4 x 4 cm 시트, 5 x 5 cm 시트, 6 x 6 cm 시트, 7 x 7 cm 시트, 8 x 8 cm 시트, 또는 9 x 9 cm 시트로 제형화되며, 상기 시트는 약 0.1-0.15 mm, 0.15-0.2 mm, 0.1-0.2 mm, 0.2-0.25 mm, 0.25-0.3 mm, 또는 0.2-0.3 mm의 두께를 갖는다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 적어도 하나의 ECM 시트를 포함하는 라미네이트(laminates)가 제공된다. 특정한 실시예에서, 본 발명은 두개의 ECM 시트를 포함하는 라미네이트가 제공한다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 적어도 하나의 ECM 시트 및 적어도 하나의 다른 평면 탈세포화된 조직(예를 들어, 탈세포화된/탈수화된 양막(amniotic membrane), 섬유아세포 세포층을 보유하기 위해 완전히 탈세포화 또는 탈세포화된 것) 또는 평면 인공 조직 대체물을 포함하는 라미네이트가 제공된다. 특정한 실시예에서, 라미네이트는 접착제, 예를 들어 글루(예를 들어 천연 글루, 예를 들어 피브로넥틴, 피브린; 또는 합성 글루)의 존재 하에 서로 접촉하여, ECM 시트, 또는 하나 이상의 ECM 시트 및 다른 평면 탈세포화된 조직을 교체함으로써 제조될 수 있으며, 특정한 실시예에서, 라미네이트는 둘 이상의 ECM 시트, 또는 하나 이상의 ECM 시트 및 하나 이상의 평면 탈세포화된 조직을 함께 열 건조시킴으로써 제조될 수 있다.

4.1.1.1 비-ECM 성분

특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 ECM과 일반적으로 관련되지 않은 하나 이상의 성분을 포함하여 제형화된다.

일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 ECM 조성물이 개체, 예를 들어 이러한 투여가 필요한 인간 개체에 투여하기에 적합하도록, 약학적으로 또는 화장학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조합된다. 투여의 형태는 주사, 용액, 크림, 겔, 임플란트, 펌프, 안약, 에멀전, 현탁액, 마이크로스피어, 입자, 미립자, 나노입자, 리포좀, 페이스트, 패치, 정제, 경피 전달 장치, 스프레이, 에어로졸 및 통상의 기술자에게 알려진 다른 수단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 약학적으로 또는 화장학적으로 허용 가능한 담체는 통상의 기술자에게 일반적으로 알려져 있다. 본 발명에 사용된 용어 "약학적으로 또는 화장학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약학적으로 또는 화장학적으로 허용 가능한 비히클"은 물 또는 식염수, 겔, 크림, 연고, 용제, 희석제, 액체 연고 베이스, 연고, 페이스트, 임플란트, 리포좀, 미셀(micelle), 거대 미셀 등을 포함하는 임의의 액체, 고체 또는 반고체를 의미하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 불리한 생리학적 또는 화장학적 반응을 유발하지 않는 살아있는 동물 또는 인간 조직과 접촉하여 사용하는데 적절하며, 조성물의 다른 성분과, 예를 들어 ECM에 해로운 방식으로 접촉하지 않는다.

일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 활성 성분, 예를 들어 ECM 조성물에 추가로 활성 성분을 방출할 수 있는 것으로 구성된다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 생체 분자와 함께 제조 동안 또는 이후에 함침될 수 있다. 예시적인 생체 분자는 항생제(클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신 같은 것), 호르몬, 성장 인자, 항종양제, 항진균제, 항바이러스제, 진통제, 항히스타민제, 항염증제, 항감염제, 은 원소, 항생제, 살균 효소(리소좀 같은 것), 상처 치료제(PDGF, TGF를 포함하나 이에 한정되지 않는 사이토카인; 티모신), 히알루론산, 상처 밀폐제(트롬빈이 있거나 없는 피브린 같은 것), 및 세포 유인제 및 스캐폴딩 시약을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 적어도 하나의 성장 인자, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자 또는 상피 성장 인자로 함침된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 작은 유기 분자, 특정한 생화학적 과정의 특이적 억제자와 같은 것, 예를 들어 막 수용체 억제자, 키나아제 억제자, 성장 억제자, 및 항암 약물과 함께 함침될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 하이드로겔과 조합된다. 통상의 기술자에게 알려진 임의의 하이드로겔, 예를 들어 Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22; Peppas et al., 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Henincl et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorne et al., 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23; 또는 Schmedlen et al., 2002, Biomaterials 23: 4325-32에 개시된 하이드로겔 조성물 중 하나가 사용될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 하이드로겔은 ECM 조성물로 도포되며, 즉 ECM 조성물의 표면 상에 방출된다. 예를 들어, 하이드로겔은 ECM 조성물에 스프레이되거나, ECM 조성물의 표면에 포화되거나, ECM 조성물에 담그거나, ECM 조성물로 잠기거나 또는 ECM 조성물의 표면에 코팅될 수 있다. 본 발명에 제공된 방법 및 조성물에 유용한 하이드로겔은 폴리비닐알콜(PVA), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산, 덱스트란, 및 이의 유도체 및 유사체를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 통상의 기술자에게 알려진 임의의 물-상호작용성, 또는 수용성 폴리머로부터 제조될 수 있다.

4.1.2 세포

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 하나 이상의 유형의 세포를 포함하거나, 이들 세포와 함께 시드되거나, 이들과 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명에 설명된 ECM 조성물과 함께 배양되고 성장될 수 있으며, 또는 본 발명에 설명된 ECM 조성물 내부에 분산될 수 있다(예를 들어 ECM 유동성 기질 조성물에 첨가됨). 통상의 기술자는 줄기 세포 및 비-줄기세포를 포함하는, 기술분야에 알려진 임의의 세포 형태가 본 발명에 제공된 ECM 조성물과 함께 시드 및/또는 배양될 수 있음을 이해할 것이다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 줄기 세포와 함께 배양 및/또는 줄기 세포를 포함한다. 줄기 세포는 주어진 목적에 적절한 임의의 줄기 세포일 수 있으며, 전능성 또는 다능성 줄기 세포일 수 있으며, 간세포일 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 미국특허 제7,045,148호; 제7,468,276호; 제8,057,788호 및 제8,202,703호에 기재된 것과 같은 태반 줄기 세포와 함께 시드되거나 및/또는 이를 포함하며, 이들의 개시 내용은 그들의 전체가 참고로 본 발명에 인용된다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 줄기 세포, 조혈 전구 세포(예를 들어, 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포, 태아 혈액, 태반 혈액, 제대혈, 태반 관류액 등), 체세포 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 지방 줄기 세포 등과 함께 시드 및/또는 이들을 포함할 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 하나 이상의 유형의 비-줄기세포와 함께 시드 및/또는 이를 포함한다. 본 발명에 사용된 것처럼, "비-줄기 세포는" 최종적으로 분화된 세포를 의미한다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 다수의 섬유 아세포를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 ECM 조성물과 조합될 수 있는 비-줄기 세포는 섬유 아세포 또는 섬유 아세포 유사 세포, 진피 세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 심장 세포, 및 췌장 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 적어도 두 유형의 비-줄기 세포와 함께 시드 및/또는 이들을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상기 세포가 ECM 조성물에 부착되기에 충분한 시간 동안 상기 세포와 함께 배양된다. 이러한 실시예에 따라, 상기 ECM 조성물은 세포와 접촉시키기 전에, 예를 들어 시트, 플러그, 튜브 또는 다른 형태와 같은 유용한 형상으로 성형될 수 있다.

상기 ECM 조성물은 적어도 1 X 10⁶, 3 X 10⁶, 1 X 10⁷, 3 X 10⁷, 1 X 10⁸, 3 X 10⁸, 1 X 10⁹, 3 X 10⁹, 1 X 10¹⁰, 3 X 10¹⁰, 1 X 10¹¹, 3 X 10¹¹, or 1 X 10¹²의 세포와 함께 배양될 수 있으며; 또는 1 X 10⁶, 3 X 10⁶, 1 X 10⁷, 3 X 10⁷, 1 X 10⁸, 3 X 10⁸, 1 X 10⁹, 3 X 10⁹, 1 X 10¹⁰, 3 X 10¹⁰, 1 X 10¹¹, 3 X 10¹¹, or 1 X 10¹²의 세포 미만일 수 있다.

4.1.1. 특징

기술분야에 알려진 생화학 기초의 분석이 본 발명에 설명된 방법을 사용하여 생산된 ECM 조성물의 생화학적 조성물을 확안하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 함량은 예를 들어, 흡광도 분석, Layne, E, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzymology 3: 447-455, (1957); Stoscheck, C M, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990)), Scopes, R K, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); 및 Stoscheck, C M. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990))에 설명된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 그렇지 않으면, 변형된 Lowry 분석, 뷰렛 분석, Bradford 분석, 및 비신코니닉산(Bicinchoninic Acid) (Smith) 분석(예를 들어, Stoscheck, C M, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990) 참조)을 포함하는, 비색 기반 분석이 특정한 단백질의 함량을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 총 콜라겐 함량은 예를 들어, 하이드록시프롤린 또는 정량적 염료 기초의 분석 키트, 예를 들어, Biocolor Ltd, UK에서 제조된 SIRCOL™ 키트를 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 콜라겐 형태는 기술분야에 알려진 표준 방법, 예를 들어 ELISA 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 엘라스틴의 총 함량은 예를 들어, 정량적 염료 기초의 분석, 예를 들어, Biocolor Ltd, UK에서 제조된 염료 기초의 분석 키트(FASTIN)를 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 글리코사미노글리칸(GAG)의 총 함량은 예를 들어 Biocolor Ltd, UK에 의해 제조된 정량적 염료-기초의 분석 키트(BLYSCAN)을 사용하여 결정될 수 있다. GAG 함량은 또한 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 ELISA에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 라미닌 및 피브로넥틴의 총 함량은 예를 들어 ELISA 분석, 예를 들어 샌드위치 ELISA 분석, 예를 들어 Takara Bio Inc., Shiga, Japan로부터 키트로 제공된 라미닌 또는 피브로넥틴에 특이적인 ELISA 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 설명된 ECM 조성물은 개체, 예를 들어, 인간 개체의 조직과 비-면역원성 및 생체 적합성이다. 본 발명에 사용된 "생체 적합성"은 살아있는 조직에서 독성, 해롭거나, 또는 면역 반응 또는 거부 반응을 나타내지 않음으로써 생물학적으로 양립 가능할 수 있는 성질을 의미한다. 생체 적합성 분석은 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 생체 적합성을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 분석은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 세포 독성 분석(예를 들어, ISO MEM 용리 실험), 토끼 안구 자극 실험, 용혈 분석, 및 발열원성(pyrogenicity) 분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 멸균되어 제형화될 수 있으며, 따라서 미생물 오염이 없다. 미생물의 존재는 기술분야에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 적절한 세균 성장 배지, 예를 들어 콩 카제인(soy casein) 배지 또는 티오글리콜레이트 배지에 ECM 조성물의 직접적인 접종하여 결정될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 엔도톡신의 작은 양을 포함하거나, 없거나, 또는 검출되지 않는 양을 포함하도록 제형화될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 엔도톡신의 존재는 예를 들어, Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 실험(세균 엔도톡신 실험), 기술분야에 잘 알려진 인비트로(in vitro) 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 제형 당 20 미만의 엔도톡신 단위(EU)를 포함한다(예를 들어, 본 발명에 제공된 ECM의 시트는 20 미만의 EU를 포함한다).

4.2. 세포외 기질 조성물을 제조하는 방법

일 양태에서, 본 발명은 태반 세포외 기질(ECM) 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 태반(예를 들어, 인간 태반)으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 양막, 융모막, 및 탯줄을 제거하는 단계; (ii) 태반 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 태반 조직을 처리하는 단계; (iii) 태반을 세제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 태반을 염기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계. 특정한 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어 인간 태반)의 융모막을 사용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 태반 조직을 처리하는 단계; (iii) 태반을 세제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 태반을 염기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계. 특정 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어, 인간 태반)의 융모막을 이용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후의 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 융모막을 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 처리하는 단계; (iv) 융모막을 세제를 포함하는 용액에 접촉시키는 단계; 및 (v) 그라인드 및 동결 건조하는 단계. 특정한 다른 실시예에서, 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하는 방법은 태반(예를 들어, 인간 태반)의 융모막을 사용하며, 상기 방법은 하기 단계를 순서대로 포함한다: (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (iii) 융모막을 융모막과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액에 처리하는 단계; (iv) 융모막을 첫 번째, 이후 두 번째 세제 용액을 포함하는 용액에 접촉시키며, 상기 용액은 세제 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA를 포함하는 단계; 및 (v) 동결 건조하는 단계. 중요한 것은, 본 발명에 설명된 ECM 조성물을 제조하는 방법은 본 발명에 설명된 특정한 특성을 갖는 ECM 조성물을 생성시키는 양으로 성분, 예를 들어, 염기, 세제, 킬레이트제를 사용한다.

본 발명에 제공된 ECM 생성 방법에 사용된 태반은 일반적으로 만삭 출생 이후에 수득되며, 새롭게 분리되거나 또는 미리 분리 및 냉동 보관될 수 있다. 일반적으로, 냉동 태반이 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 조성물을 제조하는데 사용되는 경우, 상기 태반은 예를 들어, 사용 전 실온에서 해동된다. 예를 들어, 상기 태반은 ~24시간 동안, 또는 사용을 위해 준비될 때까지 ~22-23℃에서 해동될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법에 따라 태반으로부터 ECM 조성물을 제조하기 전에, 상기 태반은 방혈, 즉 출산 후 잔류한 제대혈이 배액된다. 특정 실시예에서, 상기 태반은 본 발명에 제공된 방법에서 사용 전 70% 방혈, 80% 방혈, 90% 방혈, 95% 방혈 또는 99% 방혈된다.

태반 조직(예를 들어, 제거된 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)을 본 발명에 제공된 방법으로 가공된 태반 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액과 접촉시키는 단계는 혈액 및 혈액 성분뿐만 아니라 태반 조직과 일반적으로 관련된 세포 및 세포 파편을 제거한다. 따라서, 통상의 기술자는 세포의 삼투 파괴를 일으킬 수 있는 임의의 용액이 본 발명에 설명된 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, NaCl, 포타슘 클로라이드(KCl), 암모늄 설페이트, 모노사카라이드, 디사카라이드(예를 들어, 20% 수크로스), 친수성 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 글리세롤은 그들의 삼투 능력에 의해 세포를 파괴하는데 사용될 수 있다.

특정한 실시예에서, NaCl은 본 발명에 설명된 방법에서 사용된 태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)과 관련된 세포의 삼투적 파괴를 유발하는데 사용된다. 특정한 실시예에서, 약 0.25M, 0.5M, 0.75M, 1.0M, 1.25M, 1.5M, 1.75M, 2M, 2.25M or 2.5M NaCl을 포함하는 용액은 본 발명에 설명된 방법에 사용되는 태반 조직과 관련된 세포의 삼투적 파괴를 유도하는데 사용된다. 특정한 실시예에서, 약 0.25M to 5M, 약 0.5M to 4M, 약 0.75M to 3M, or 약 1.0M to 2.0M NaCl을 포함하는 용액은 본 발명에 설명된 방법에서 사용된 태반 조직과 관련된 세포의 삼투적 파괴를 유도하는데 사용된다.

삼투 파괴를 일으키는 용액과 태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)을 접촉시키는 단계는 통상의 기술자의 판단에 따라 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 단계는 약 0℃ 내지 30℃, 약 5℃ 내지 25℃, 약 5℃ 내지 20℃, 또는 약 5℃ 내지 15℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 단계는 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 또는 약 30℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 단계는 실온에서 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 단계는 37℃ ± 5℃에서 수행된다.

삼투 파괴를 일으키는 용액과 태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)을 접촉시키는 단계는 통상의 기술자의 판단에 따라 적절한 시간 동안 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 단계는 약 1-24 시간, 약 2-20 시간, 약 5-15 시간, 약 8-12 시간, 또는 약 2-5 시간 동안 수행 될 수있다. 특정한 실시예에서, 상기 단계는 실온에서 약 18-26 시간 동안 수행된다. 또 다른 특정 실시예에서, 상기 단계는 37 ℃ ± 5 ℃에서 약 18-26 시간 동안 수행된다.

세제와 태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)과 세제를 접촉시키는 단계는 본 발명에 제공된 ECM 조성물로부터 세포 및 세포 파편의 제거뿐만 아니라 핵산의 제거를 초래한다. 따라서, 본 발명에 설명된 방법에 사용된 세제는 통상의 기술자에게 알려진 세포 또는 세포내 막을 파괴할 수 있는 임의의 세제일 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 세제는 이온성이다. 예를 들어, 특정한 실시예에서, 상기 세제는 소듐 디옥시콜레이트, 디옥시콜린산, 또는 소듐 도데실설페이트이다. 특정한 실시예에서, 상기 세제는 양성이온성(zwitterionic)이다. 특정한 실시예에서, 상기 세제는 비이온성이다. 예를 들어, 특정한 실시예에서, 상기 세제는 TWEEN®-20과 같은 TWEEN® 세제, 또는 Triton X 100과 같은 Triton X 세제일 수 있다. 상기 콜라겐 조성물은 통상의 기술자의 판단에 의해 상기 조성물로부터 원치 않는 성분을 제거하기에 적합한 환경 하에 세제와 접촉될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법에서 사용된 세제는 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜산이다. 상기 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜산은 세포, 세포 파편, 및 핵산을 제거하기 위해 적절한 농도로 본 발명에 설명된 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 설명된 방법의 특정한 실시예에서, 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜산은 예를 들어, 약 1.5%, 약 2%, 또는 약 2.5%의 최종 농도로 사용될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜산은 약 2%의 최종 농도로 본 발명에 설명된 방법에서 사용된다.

본 발명에 설명된 방법의 특정한 다른 실시예에서, 예를 들어, 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산과 같은 첫 번째 세제 용액에서, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 함께, 세제, 예를 들어, 소듐 디옥시콜레이트, 또는 디옥시콜린산을 활용하는 방법은 예를 들어, 약 0.05 내지 약 0.1%, 약 0.05% 내지 약 0.2%, 약 0.2 내지 약 0.3%, 약 0.3% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.4 내지 약 0.5%의 최종 농도; 또는 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 또는 약 0.5%의 최종 농도로 사용될 수 있다. 특히 이러한 실시예에서, 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산은 약 0.067%의 최종 농도로 사용될 수 있다. 이러한 첫 번째 세제 용액 내 존재하는 킬레이트제에 관하여, 킬레이트제가 EDTA일 때, 이러한 EDTA는 예를 들어 약 1 내지 약 5 mM, 약 2 내지 약 5 mM, 약 2 내지 약 4mM, 약 3 내지 약 4mM, 약 3mM 내지 약 5mM. 약 5 내지 약 10 mM, 약 6 내지 약 10 mM, 약 7 내지 약 9mM, or 약 8 내지 약 10mM; or 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM or 약 10mM의 최종 농도로 사용될 수 있다. 상기 첫 번째 세제 용액의 특정한 실시예에서, 상기 용액은 약 0.067%의 최종 농도로 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산 및 약 4mM의 최종 농도로 EDTA를 포함할 수 있다.

본 발명에 설명된 방법의 실시예, 예를 들어 두 번째 세제 용액에서, 예를 들어, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA와 함께, 세제, 예를 들어 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산을 활용하는 방법에서, 이러한 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산은, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.1%, 약 0.05% 내지 약 0.2%, 약 0.2 내지 약 0.3%, 약 0.3% 내지 약 0.4%, or 약 0.4 내지 약 0.5%의 최종 농도로; 또는 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, or 약 0.5%의 최종 농도로 사용될 수 있다. 이러한 특정한 실시예에서, 상기 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산 약 0.2% 내지 약 0.6%, 산은 약 0.39%의 최종 농도로 사용될 수 있다. 이러한 두 번째 세제 용액 내 존재하는 킬레이트제에 대하여, 킬레이트제가 EDTA일 때, 이러한 EDTA는 예를 들어 약 1 내지 약 5 mM, 약 2 내지 약 5 mM, 약 2 내지 약 4mM, 약 3 내지 약 4mM, 약 3mM 내지 약 5mM. 약 5 내지 약 10 mM, 약 6 내지 약 10 mM, 약 7 내지 약 9mM, 또는 약 8 내지 약 10mM; 또는 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM 또는 약 10mM의 최종 농도로 사용될 수 있다. 첫 번째 세제 용액의 특정한 실시예에서, 상기 용액은 약 0.39%의 최종 농도의 소듐 디옥시콜레이트 또는 디옥시콜린산 및 약 8mM의 최종 농도로 EDTA를 포함할 수 있다.

태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)과 세제를 접촉시키는 단계는 통상의 기술자의 판단에 따라 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리는 약 0℃ 내지 30℃, 약 5℃ 내지 25℃, 약 5℃ 내지 20℃, 또는 약 5℃ 내지 15℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리는 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 또는 약 30℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리 단계는 실온에서 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리 단계는 37℃ ± 5℃에서 수행된다.

세제 처리(킬레이트제와 함께 또는 킬레이트제가 없이)는 통상의 기술자의 판단에 따라 적절한 시간 동안 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리는 약 1-24 시간, 밤새, 약 24-48 시간, 또는 약 48-72 시간 동안 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리 단계는 약 72시간 동안 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리 단계는 실온에서 약 72시간 동안 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 세제 처리 단계는 37℃ ± 5℃에서 약 72시간 동안 수행된다.

태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 및 탯줄이 제거된 태반 조직; 또는 태반으로부터 융모막)을 염기와 접촉시키는 단계는 본 발명에 제공된 ECM 조성물로부터 특정한 ECM 성분의 제거, 예를 들어, 이러한 ECM 성분을 변성함을 통해, 피브로넥틴 및 라미닌의 제거를 초래한다. 염기 처리에 대한 예시적인 기초는 생체 적합성 염기, 휘발성 염기 또는 ECM으로부터 용이하고 안전하게 제거되는 것으로 통상의 기술자에게 알려진 염기를 포함한다. 상기 염기는 예를 들어 0.2M 내지 1.0M의 농도로 통상의 기술자에게 알려진 임의의 유기 또는 무기 염기일 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 염기는 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 또는 소듐 하이드록사이드, 예를 들어 암모늄 하이드록사이드 용액, 포타슘 하이드록사이드 용액 또는 소듐 하이드록사이드 용액이다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법의 염기 처리 단계에 사용되는 염기는 소듐 하이드록사이드(NaOH)이다. NaOH는 예를 들어, 본 발명에 제공된 ECM 조성물로부터 라미닌 및 피브로넥틴의 제거에 적합한 임의의 농도로 본 발명에 설명된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, NaOH는 약 0.1M NaOH, 0.25M NaOH, 0.5M NaOH, 1M NaOH, 1.5M NaOH, 또는 2M NaOH의 농도로 본 발명에 설명된 방법에서 사용될 수 있다. 특정한 실시예에서, NaOH는 약 1M NaOH의 농도로 본 발명에 설명된 방법에서 사용된다.

상기 염기 처리 단계는 통상의 기술자의 판단에 따라 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 염기 처리는 약 0℃ 내지 30℃, 약 5℃ 내지 25℃, 약 5℃ 내지 20℃, 또는 약 5℃ 내지 15℃로 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리는 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 또는 약 30℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 실온에서 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 37℃ ± 5℃에서 수행된다.

염기 처리 단계는 통상의 기술자의 판단에 따라 적절한 시간 동안 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 약 15분 내지 30분, 30분 내지 1시간, 1 내지 2시간, 2 내지 4시간, 4-8 시간, 8-12 시간, 또는 약 12-24 시간 동안 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 약 30분 동안 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 실온에서 약 30분 동안 수행된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 염기 처리 단계는 37℃ ± 5℃에서 약 30분 동안 수행된다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 설명된 단계의 어느 것 또는 모두는 멸균 상태에서 수행된다. 추가적 실시예에서, 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조되는 ECM 조성물은 통상의 기술자에게 명백하고 하기에 설명된 기술에 따라 추가로 멸균된다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 양막, 융모막, 및 탯줄을 제거하는 단계; (ii) 태반 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1 M NaCl)에 남아있는 태반 조직을 두며 태반 조직을 균질화하는 단계; (iii) 태반 조직을 세제를 포함하는 용액, 예를 들어 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 소듐 디옥시콜레이트)와 접촉시키는 단계; (iv) 태반 조직을 예를 들어 물로 세척하는 단계; (v) 태반 조직을 염기, 예를 들어 소듐 하이드록사이드(NaOH, 예를 들어 1 M NaOH)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (vi) 중성 pH(예를 들어, pH 6.0-8.0) 또는 이와 유사하도록 태반 조직을 포함하는 용액에 산 용액, 예를 들어, 염산(HCl)을 첨가하는 단계; 및 (vii) 용액의 액체 부분으로부터 태반 조직을 분리(예를 들어, 원심분리에 의해)하고 태반 조직을 수집함으로써 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 제조되는 ECM 조성물은 일반적으로 본 발명에 설명된 ECM 제형, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질의 형태인 것을 제조하기 위해, 나중에 사용하기 위해 수득 후 동결 및 저장될 수 있거나, 또는 수득 직후 사용될 수 있는, 페이스트(ECM 페이스트)의 형태이다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 양막, 융모막, 및 탯줄을 제거하는 단계; (ii) 태반을 조각들, 예를 들어, 2 x 2 센티미터의 조각들로 자르는 단계; (iii) 1.5 리터 1 M NaCl 용액 내 태반 조직을 위치시키고 태반 조직을 균질화하는 단계(예를 들어 Omni Mixer Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA)를 사용), (iv) 균질화된 태반 조직을 처리 용기(예를 들어, 주머니(bag))에 넣고 1 M NaCl을 9.2 리터의 부피로 첨가하는 단계; (v) 균질화된 태반 조직을 1 M NaCl로 세번 세척하는 단계, 상기 세척은 (a) 10분 동안 혼합기에서 처리 용기를 교반하는 단계, (b) 10분 동안 태반 조직을 처리 용기 내에 침전시키는 단계, 및 (c) 중력 배수에 의해 6.2리터의 상등액을 제거하는 단계를 포함함; (vi) 세척된 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 혼합기에 남아있는 1 M NaCl 용액에서 혼합시키는 단계 (vii) 상기 설명된 것처럼, 상기 태반 조직을 물로 네번 세척하는 단계; (viii) 세척된 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 혼합기상에 물과 혼합시키는 단계; (ix) 물과 밤새 혼합 이후, 상기 설명된 것처럼 최종 시간을 물로 세척한 후, 2% 소듐 디옥시콜레이트의 농도를 위해, 6.2 L의 3% 소듐 디옥시콜레이트를 혼합물에 첨가하는 단계; (x) 상기 태반 조직을 실온에서 ~72시간 동안 혼합기상에 2% 소듐 디옥시콜레이트 용액에서 혼합시키는 단계; (xi) 상기 설명된 방식으로, 물 속에서 상기 태반 조직을 다섯번 세척하는 단계; (xii) 물의 최종 첨가 이후, 염기성 용액을 초래하는 1M NaOH의 첨가를 통해 용액의 pH를 약 10-12로 조정하는 단계; (xiii) 상기 태반 조직을 실온에서 ~30분 동안 혼합기상에 염기성 용액에서 혼합시키는 단계; (xiv) 0.1 N HCl을 사용하여 용액의 pH를 약 7.0-7.5로 조정하는 단계; 및 (xv) 처리 용기로부터 상등액을 제거(예를 들어, 원심분리를 통해)하고 태반 조직을 수집함에 따라 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수집하는 단계; (ii) 태반 융모막과 관련된 세포의 삼투적 파괴를 초래하는 용액, 예를 들어, 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1 M NaCl)에 태반 융모막을 위치시키고 태반 융모막을 균질화하는 단계; (iii) 상기 태반 융모막 조직을 세제, 예를 들어, 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 소듐 디옥시콜레이트)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단게; (iv) 상기 태반 융모막 조직을, 예를 들어 물로 세척하는 단계; (v) 상기 태반 융모막 조직을 염기, 예를 들어 소듐 하이드록사이드(NaOH, 예를 들어, 1 M NaOH)를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (vi) 산 용액, 예를 들어, 염산(HCl)을 태반 융모막 조직을 포함하는 용액에 첨가하여 중성 pH 또는 이와 가깝게 조절(예를 들어, pH 6.0-8.0)하는 단계; 및 (vii) 용액의 액체 부분으로부터 상기 태반 융모막 조직을 분리(예를 들어, 원심분리를 통해)하고 상기 태반 융모막 조직을 수집함에 따라 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 따라 제조되는 ECM 조성물은 일반적으로 본 발명에 설명된 ECM 제형, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동 기질의 형태인 것을 제조하기 위해, 나중에 사용하기 위해 수득 후 동결 및 저장될 수 있거나, 또는 수득 직후 사용될 수 있는, 페이스트(ECM 페이스트)의 형태이다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제 처리, 세척, 염기 처리)는 실온에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제 처리, 세척, 염기 처리)는 37℃ ± 5℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 세척 단계는 1-3회 동안 1/2 내지 2리터 부피의 유체를 사용하여 수행된다.

다른 특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막을 수득하는 단계; (ii) 태반을 조각들, 예를 들어, 2 x 2 센티미터의 조각들로 자르는 단계; (iii) 1.5 리터 1 M NaCl 용액 내 태반 조직을 위치시키고 태반 융모막 조직을 균질화하는 단계(예를 들어 Omni Mixer Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA)를 사용), (iv) 균질화된 태반 조직을 처리 용기(예를 들어, 주머니(bag))에 넣고 1 M NaCl을 9.2 리터의 부피로 첨가하는 단계; (v) 균질화된 태반 조직을 1 M NaCl로 세번 세척하는 단계, 상기 세척은 (a) 10분 동안 혼합기에서 처리 용기를 교반하는 단계, (b) 10분 동안 태반 조직을 처리 용기 내에 침전시키는 단계, 및 (c) 중력 배수에 의해 6.2리터의 상등액을 제거하는 단계를 포함함; (vi) 세척된 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 혼합기에 남아있는 1 M NaCl 용액에서 혼합시키는 단계; (vii) 상기 설명된 것처럼, 상기 태반 융모막 조직을 물로 네번 세척하는 단계; (viii) 세척된 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 혼합기상에 물과 혼합시키는 단계; (ix) 물과 밤새 혼합 이후, 상기 설명된 것처럼 최종 시간을 물로 세척한 후, 2% 소듐 디옥시콜레이트의 농도를 위해, 6.2 L의 3% 소듐 디옥시콜레이트를 혼합물에 첨가하는 단계; (x) 상기 태반 융모막 조직을 실온에서 ~72시간 동안 혼합기상에 2% 소듐 디옥시콜레이트 용액에서 혼합시키는 단계; (xi) 상기 설명된 방식으로, 물 속에서 상기 태반 조직을 다섯번 세척하는 단계; (xii) 물의 최종 첨가 이후, 염기성 용액을 초래하는 1M NaOH의 첨가를 통해 용액의 pH를 약 10-12로 조정하는 단계; (xiii) 상기 태반 조직을 실온에서 ~30분 동안 혼합기상에 염기성 용액에서 혼합시키는 단계; (xiv) 0.1 N HCl을 사용하여 용액의 pH를 약 7.0-7.5로 조정하는 단계; 및 (xv) 처리 용기로부터 상등액을 제거(예를 들어, 원심분리를 통해)하고 태반 융모막 조직을 수집함에 따라 ECM 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 세척 단계는 유체의 1/2 내지 2리터의 부피를 사용하여 수행된다.

다른 특정한 실시예에서, ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터(예를 들어, 출생 직후의 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막, 예를 들어 융모막판을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 융모막 조직을 융모막 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어, 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 0.5 M NaCl)에 위치시키는 단계; (iv) 상기 융모막 조직을 세제, 예를 들어, 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 2% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트)를 포함하는 용액과 접촉시키고 린스, 예를 들어 물로 린스하는 단계; 및 (v) 그라인드 및 동결 건조하는 단계를 포함한다. 상기 ECM 조성물, 일반적으로 페이스트(ECM 페이스트)는 제형화, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동성 기질과 같은 다양한 형상 및 형태로 밀링(milled) 및 제형화될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제 처리, 린스)는 실온에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제 처리, 린스)는 37℃ ± 5℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 린스 단계는 1-3회 1/2 내지 2리터 부피의 유체를 사용하여 수행된다.

특정한 실시예에서, ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 순서대로 (i) 만삭 출생 직후 모체로부터 인간 태반을 수득, 또는 해동, 실온에서 약 24시간 동안 해동되는 미리 분리 동결된 인간 태반을 수득하는 단계; (ii) 0.5M NaCl에서 세척된 태반을 세척하는 단계; (iii) 태반, 및 태반의 잔여 융모막판으로부터 양막, 탯줄 및 진성 탈락막(decidua parietalis)을 제거하는 단계; (iv) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (v) 상기 융모막을 0.5 M NaCl 및 물로 린스하는 단계; (vi) 상기 융모막을 2% 디옥시콜린산에서 밤새 린스한 후, 다중 물 린스, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 물 린스하는 단계; 및 (vii) 상기 처리된 융모막을 그라인드 및 동결 건조시키는 단계를 포함한다. 상기 ECM 조성물, 일반적으로 페이스트(ECM 페이스트)는 제형화, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동성 기질과 같은 다양한 형상 및 형태로 밀링(milled) 및 제형화될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, NaCl 처리, 디옥시콜린산 처리, 린스)는 실온에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, NaCl 처리, 디옥시콜린산 처리, 린스)는 37℃ ± 5℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 린스 단계는 1-3회 1/2 내지 2리터 부피의 유체를 사용하여 수행된다.

또 다른 특정한 실시예에서, ECM 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 태반으로부터 (예를 들어, 출생 직후 모체로부터 수득된 태반으로부터, 또는 저장된 태반으로부터) 융모막, 예를 들어 융모막판을 수득하는 단계; (ii) 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 융모막 조직을 융모막 조직과 관련된 세포의 삼투 파괴를 일으키는 용액, 예를 들어, 소듐 클로라이드(NaCl, 예를 들어, 1.0 M NaCl)에 위치시키는 단계; (iv) 상기 융모막 조직을 세제, 예를 들어, 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 0.05%-0.2% 또는 0.3%-0.6% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트) 및 EDTA(예를 들어, 1-5mM EDTA 또는 5-10 mM EDTA)를 포함하는 첫 번째 세제 용액과 접촉시키는 단계; (v) 상기 융모막 조직을 세제, 예를 들어 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트(예를 들어, 0.05%-0.2% 또는 0.3%-0.6% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트) 및 EDTA(예를 들어, 1-5mM EDTA 또는 5-10 mM EDTA)를 포함하는 두 번째 세제 용액과 접촉시키고, 예를 들어 물을 통해 린스하는 단계; 및 (vi) 제형화, 예를 들어 탈세포화된 ECM 페이스트를 형성하기 위해 밀링되고 용액(예를 들어, 물 또는 인산염 버퍼 식염수) 내 재현탁되고, 다양한 형상 및 형태, 예를 들어 ECM 시트, ECM 미립자 제형, 또는 ECM 유동성 기질로 제형화된, 전체 융모막을 생산하기 위해 동결 건조시키는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 발명의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제/EDTA 처리, 린스)는 실온에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 다양한 단계(예를 들어, 삼투 파괴, 세제/EDTA 처리, 린스)는 37℃ ± 5℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 린스 단계는 1-3회 동안 1/2 내지 2리터 부피의 유체를 사용하여 수행된다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 순서대로 (i) 만삭 출생 이후 모체로부터 즉시 인간 태반을 수득하거나, 또는 해동된, 예를 들어 약 24시간 동안 실온에서 해동된 사전 분리된 동결 인간 태반을 수득하는 단계; (ii) 태반으로부터 양막, 탯줄 및 진성 탈락막을 제거하고, 상기 태반의 융모막판을 고정하는 단계; (iii) 융모막을 스크래핑 및 세척하는 단계; (iv) 1.0 M NaCl 및 물에서 융모막을 린스하는 단계; (v) 상기 융모막을 0.067% 디옥시콜린산 및 4mM EDTA를 포함하는 첫 번째 세제 용액에서 밤새 린스한 후, 다중 물 린스, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 물 린스하는 단계; (vi) 상기 융모막을 0.39% 디옥시콜린산 및 8mM EDTA를 포함하는 두 번째 세제 용액에서 밤새 린스한 후, 다중 물 린스, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 물 린스하는 단계; 및 (vii) 처리된 융모막을 동결 건조하는 단계를 포함한다. 상기 생산된 조성물은 추가적 제형화, 예를 들어 밀링 및 제형화에 적합한 탈세포화된 ECM 페이스트이다. 특정한 실시예에서, 상기 방법의 다양한 단계(예를 들어, NaCl 처리, 디옥시콜린산/EDTA 처리, 린스)는 실온에서 수행된다. 상기 발명의 다양한 단계(예를 들어, NaCl 처리, 디옥시콜린산/EDTA 처리, 린스)는 37℃ ± 5℃에서 수행된다. 특정한 실시예에서, 상기 린스 단계는 1-3회 동안 1/2 내지 2리터 부피의 유체를 사용하여 수행된다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 시트를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) 상기 ECM 페이스트를, 예를 들어 물에 현탁하고, 시트의 제형화에 적절한 기질에 현탁된 ECM 조성물을 첨, 예를 들어, 몰드(mold)에 상기 ECM을 첨가하는 단계; (iii) 상기 ECM을 동결시키는 단계; (iv) 상기 동결된 ECM을 동결 건조하는 단계; (v) 상기 동결 건조된 ECM을 기질로부터 제거하고 물에 담그는 단계; 및 (vi) 상기 ECM을, 예를 들어 진공 건조기를 사용하여 건조시키는 단계를 포함한다. 재수화 이후, 및 건조 전, 본 발명에 제공된 ECM 시트는 임의의 유용한 형태, 예를 들어, 블록, 튜브, 또는 다른 형태로 제조될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 미립자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 설명된 방법에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) 상기 ECM 페이스트를 예를 들어 물에 현탁시키는 단계; (iii) 상기 ECM을 동결시키는 단계; (iv) 상기 동결된 ECM을 동결 건조시키는 단계; 및 (v) 상기 동결 건조된 ECM을 밀링하는 단계를 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명은 ECM 유동성 기질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 따라 ECM 페이스트를 제조하는 단계; (ii) 상기 ECM 페이스트를 예를 들어 물에 현탁하는 단계; (iii) 상기 ECM을 동결시키는 단계; (iv) 상기 동결된 ECM을 동결 건조시키는 단계; 및 (v) 상기 동결 건조된 ECM을 미세화하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 식염수에서 미세화된 ECM의 재현탁에 따라 ECM 유동성 기질이 제조된다.

본 발명에 설명된 방법에 따라 생산된 ECM 조성물의 동결 건조는 기술분야에 알려진 임의의 방법으로 수행될 수 있으며, 일반적으로 상기 ECM 조성물이 실질적으로 건조, 예를 들어 물 중량비가 약 30%, 25%, 20%, 25%, 20%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%까지 진행된다.

4.2.1. 선택적 추가 처리

특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법은 추가 단계, 예를 들어, 세포의 삼투 파기를 일으킬 수 있는 용액, 세제, 또는 염기 외에 다른 제형과 함께 제조되는 ECM 조성물을 처리하는 단계를 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법은 BENZONASE®과 함께 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조될 수 있는 ECM 조성물의 처리를 포함한다. BENZONASE®는 일반적으로 모든 형태의 DNA 및 RNA를 공격하고 분해하는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 유래의 유전적으로 조작된 엔도뉴클레아제이다. 따라서, BENZONASE®는 생산되는 ECM 조성물이 핵산이 없도록(또는 실질적으로 없도록) 하기 위해 본 발명에 설명된 방법에 따라 사용될 수 있다. BENZONASE®로 처리 이후, 처리된 ECM 조성물은 높은 pH, 이후 낮은 pH, BENZONASE®의 불활성화에 적합한 조건으로 유도될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 방법은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 함께 본 발명에 설명된 방법에 따라 제조되는 ECM 조성물의 처리를 포함한다. EDTA는 통상의 기술자에게 잘 알려진 금속 킬레이터이며, 본 발명에 제공된 ECM 조성물로부터 이가(divalent) 금속 이온을 제거하기 위해 본 발명에 제공된 방법에 따라 사용될 수 있다. EDTA는 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 상기 ECM 조성물로부터 씻어낼 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물 내 콜라겐은 가교결합될 수 있다. 가교 결합은 통상의 기술자에게 알려진 임의의 가교결합제, 예를 들어 상기 설명된 가교결합제로 이루어질 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 가교결합제는 글루타르알데하이드이며, 상기 가교결합은 통상의 기술자에게 알려진 콜라겐의 글루타르알데하이드 가교결합의 방법에 따라 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 가교결합제는 1.4-부탁디올 디글리시딜 에터 또는 제니핀이다.

4.2.2. 저장

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 실온(예를 들어, ~22-25℃)에서 저장된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 차갑게 보관, 예를 들어 약 0℃, 약 4℃, 또는 약 8℃의 온도로 냉장된다. 일부 실시예에서, 상기 ECM은 냉장 보관되지 않는다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 즉, 0℃ 이하, 예를 들어, -10℃, -15℃, -20℃, -25℃, -30℃, -35℃, -40℃, -45℃, -50℃, -55℃, -60℃, -65℃, -70℃, -75℃, -80℃, 또는 -85℃, 또는 보다 차가운 온도에서, 냉동 보관된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 상기 냉동 및 보관은 0℃ 내지 -10℃, -10℃ 내지 -20℃, -20℃ 내지 -30℃, -30℃ 내지 -40℃, -40℃ 내지 -50℃, -50℃ 내지 -60℃, -60℃ 내지 -70℃, 또는 -70℃ 내지 -80℃ 사이의 온도에서 일어난다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 멸균 및 비 산화 조건 하에 저장된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 12개월 또는 그 이상 동안 상기 구체적인 온도의 어느 하나로 저장된다.

4.2.3. 멸균

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 이러한 조성물을 멸균하는데 통상의 기술자에게 알려진 기술에 따라 멸균된다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 방사선, 예를 들어 감마선에 의해 멸균된다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 멸균은 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 전자선 조사를 통해 수행된다. 예를 들어, Gorham, D. Byrom (ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122 참조. 적어도 99.9%의 박테리아 또는 다른 잠재적인 오염 유기체를 사멸하기에 충분한 임의의 방사선 투여량은 본 발명에 제공된 방법의 범위 내이다. 특정한 실시예에서, 적어도 18-25 kGy의 투여량은 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 최종 살균을 달성하는데 사용된다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 엔도톡신을 통과하고 ECM 조성물을 보유하는 필터를 통해 여과된다. 임의의 필터 크기, 엔도톡신의 여과를 위해 통상의 기술자에게 알려진, 예를 들어 30 kDa가 사용될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 필터는 5 kDa 내지 100 kDa 사이이며, 예를 들어, 상기 필터는 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa 또는 약 100 kDa이다. 상기 필터는 본 발명에 제공된 ECM 조성물과 호환 가능한 통상의 기술자에게 알려진 임의의 물질, 셀룰로오스 또는 폴리에터설폰 같은 것 일 수 있다. 상기 필터는 통상의 기술자에 의해 목적하는 바에 따라 여러 번 반복될 수 있다. 엔도톡신은 표준 기법에 따라 검출되어 제거(clearance)를 모니터링할 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 바이러스 입자가 없거나 감소된 ECM 조성물을 제조하기 위해 여과된다. 바이러스를 제거하기 위해 유용한 통상의 기술자에게 알려진 임의의 필터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1000 kDa 필터가 파보바이러스, A형 간염 바이러스 및 HIV의 제거 또는 감소를 위해 사용될 수 있다. 750 kDa 필터는 파보바이러스 및 A형 간염 바이러스의 제거, 또는 감소를 위해 사용될 수 있다. 500 kDa 필터는 파보바이러스의 제거 또는 감소를 위해 사용될 수 있다. 상기 필터는 본 발명에 제공된 ECM 조성물과 호환 가능한 통상의 기술자에게 알려진 임의의 물질, 셀룰로오스 또는 폴리에터설폰 같은 것 일 수 있다. 상기 필터는 통상의 기술자의 의도에 따라 여러 번 반복될 수 있다. 바이러스의 존재는 제거(clearance)를 모니터링하는 표준 기술에 따라 검출될 수 있다.

4.3. 용도

본 발명에 제공된 ECM 조성물(4.1절 참조)은 조직 또는 기질 재료의 패치 또는 플러그, 보철, 및 기타 임플란트를 포함하는 조작된 조직 및 기관의 제조에 상기 ECM 조성물의 용도; 조직 스캐폴딩과 같은 ECM 조성물의 용도; 상처의 회복 또는 드레싱에 상기 ECM 조성물의 용도; 지혈 장치로서 상기 ECM 조성물의 용도; 봉합, 수술 및 정형외과용 나사, 수술 및 정형외과용 플레이트, 합성 임플란트를 위한 천연 코팅 또는 성분, 미용 임플란트 및 지지체와 같은 조직 수리 및 지지에 사용하기 위한 장치로서 ECM 조성물의 용도; 기관 또는 조직을 수리 또는 지지하기 위한 구조적 지지체로서 ECM 조성물의 용도; 물질 전달을 위한 ECM 조성물의 용도; 생체 조작 플랫폼으로써 ECM 조성물의 용도; 세포에 따른 물질의 효과를 실험하기 위한 플랫폼으로써 ECM 조성물의 용도; 및 세포 배양에 ECM 조성물의 용도를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 방법으로 많은 목적을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 상기 ECM 조성물은 미용 목적을 위해 사용될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 용도는 개체에 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 투여를 필요로 한다.

본 발명에 사용된 것처럼, 용어 "개체"는 영장류(예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 랫 및 마우스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 동물을 의미한다. 특정한 실시예에서, 상기 개체는 인간이다.

개체에 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 인비보(in vivo) 투여 방법은 구강 투여(예를 들어, 협측(buccal) 또는 설하 투여), 국소 도포, 에어로졸 도포, 경피 투여, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 및 수술적 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 용도의 일부로서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 크림, 겔, 용액, 현탁액, 리포좀, 미립자의 형태로, 또는 치료학적 및 화장학적 화합물의 제형화 및 전달의 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려진 다른 수단으로 적용될 수 있다. 피하 투여를 위한 적절한 제형의 일부 예시는 임플란트, 저장소(depots), 바늘, 캡슐 및 삼투압 펌프를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구강 투여를 위해 적절한 제형의 일부 실시예는 페이스트, 패치, 시트, 액체, 시럽, 현탁액, 에어로졸 및 미스트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 경피 투여를 위해 적절한 제형의 일부 예시는 크림, 페이스트, 패치, 스프레이 및 겔을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 피하 투여를 위한 적절한 전달 메커니즘의 일부 예시는 임플란트, 저장소, 니들, 캡슐 및 삼투 펌프를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 원하는 생리학적 또는 약학적 결과를 만들기 위해 임의의 형태 및/또는 농도로 개체에 투여될 수 있다. 상기 ECM 조성물의 형태 및 농도는 원하는 치료학적 종점, 작용 부위 또는 체액에서 원하는 유효 농도 및 투여 유형에 의존한다. 개체에 물질의 투여에 관한 정보는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, L. S. Goodman and A. Gilman, eds, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, and Katzung, Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Conn., (6th Ed. 1995)와 같은 참고문헌에서 찾을 수 있다. 목적하는 치료의 기술분야에서 통상의 임상의는 투여되는 환경 및 물질에 의한 필요에 따라, 특정한 형태 및 농도, 및 투여의 빈도를 선택할 수 있다.

4.3.1. 상처 치료에 용도

특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상처의 치료에 사용된다.

일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 상처 부위에 개체의 피부 위에 직접적으로 ECM 조성물을 위치시켜, 상처가 커버되도록 함으로써 상처를 치료하는데 사용된다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 임플란트, 예를 들어, 피하 임플란트처럼 ECM 조성물을 사용함으로써 상처를 치료하는데 사용된다. 통상의 기술자는 상기 ECM 조성물의 특정한 제형이 이러한 용도에 적절함을 인지할 것이다. 예를 들어, 시트로 제형화된 ECM 조성물은 개체의 피부 상 상처 위에 ECM 시트를 위치시킴으로써, 상처를 치료하는데 사용될 수 있다.

특정한 실시예에서, 상처의 치료에 사용될 때, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 혈소판 유래 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 변형 성장 인자 베타, 혈관신생 인자, 항생제, 항진균제, 살정자제, 호르몬, 효소, 및 효소 억제제를 포함하며, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 약학적 활성제를 포함하여 제제화된다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물로 치료될 수 있는 상처는 상피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처(예를 들어, ECM 조성물은 봉합선으로부터 혈액의 누출을 방지하기 위해 수술 동안 문합(anastosmosis) 주변을 랩(wrapped)할 수 있다), 선천적 상처(예를 들어, 영양장애 표피 박리(dystrophic epidermolysis bullosa)), 압력 궤양(예를 들어, 욕창 궤양), 부분 및 전체 두께 상처, 정맥 궤양, 당뇨 궤양, 만성 혈관성 궤양, 터널/손상(tunneled/ undermined) 상처, 수술 상처(예를 들어, 공여 부위/이식편, Moh's 수술 이후, 레이져 수술 이후, 족질환진료(podiatric), 상처 벌어짐), 트라우마 상처(예를 들어, 찰과상, 열상, 2도 화상, 및 피부 눈물), 및 상처 배출을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 1도 화상, 2도 화상(부분 두께 화상), 3도 화상(전체 두께 화상), 화상 상처의 감염, 절단된 및 비절단된 화상 상처의 감염, 종전에 이식되거나 치료된 화상 상처로부터 상피의 소실, 및 화상 상처 농가진을 포함하나, 이에 제한되지 않는 화상 및/또는 화상과 관련된 상태를 치료하는데 사용된다.

4.3.2. 치과(Dental)

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치과 질병 및 질환의 치료에 사용된다.

일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치주 수술, 치주 조직의 재생을 위해 유도된 조직 재생, 유도된 골 재생, 및/또는 뿌리 범위에 사용된다. 이러한 방법들은 일치된 양측 치주 결함, 치간 인트라보니(intrabony) 결함, 심층 3-벽 인트라보니 결함, 2-벽 인트라보니 결함, 및 인트라보니 결함 2 및 3을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 치주 인트라보니 결함의 재생을 촉진하는 ECM 조성물의 용도를 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 양측 결함, 쌍구 협측(paired buccal) 클래스 II 하악 대구(mandibular molar) 분기(furcation) 결함, 및 양측 하악 분기 결함을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 클래스 II 분기 결함의 치료에 사용된다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치주병 및 치은염을 포함하나, 이에 제한되지 않는 치주 질병의 치료에 사용된다. 일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어, 개체의 하나 이상의 치주낭으로 클로헥시딘 글루코네이트와 같은 항생제와 함께 침윤될 수 있는, 예를 들어, 5 mm 이상의 ECM 조성물을 삽입함을 통해 치주 질병을 갖는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다.

4.3.3 구강 병변

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 구강 병변의 치료에 사용되며, 상기 병변은 치과 절차 또는 구강 수술에 의해 유발되지 않는다. 특정한 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 개채에 투여, 예를 들어, 구강 병변에 투여하는 단계를 포함하는 구강 병변을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 맥락에서, "치료학적으로 유효한 양"은 구강 병변의 적어도 하나의 증상 또는 양태를 감소 또는 제거하는 ECM 조성물의 양을 의미한다. 예를 들어, 상기 ECM 조성물은 병변을 회복하기 위해 투여될 수 있으며, 또는 예를 들어 경구 병변에 의해 야기되거나 또는 관련된 통증 또는 염증을 감소시키기 위해 일시적으로 투여될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 치료의 수단으로 구강 병변으로 직접적인 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 구강 병변의 적어도 일부분의 주변부 또는 인접부에 투여된다. 이러한 투여는 예를 들어, 구강 병변의 적어도 일부, 또는 전체에 ECM 조성물의 시트를 배치함으로써 될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 페이스트로 구강 병변에 투여된다. 특정한 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 스프레이 또는 에어로졸의 형태로 구강 병변에 투여된다. 특정한 실시예에서, ECM 조성물은 용액의 형태, 예를 들어 구강 세척제로 구경 병변에 투여된다.

본 발명에 제공된 방법에 따라 치료되는 구강 병변은 구강 병변을 유발하기 위해 기술분야에 알려진 임의의 상태 또는 처리에 의해 유발될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 처리된 구강 병변은 박리, 예를 들어 낙설성 구강 질환에 의해 유발되거나 관련된다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 처리된 구강 병변은 아프타성(aphthous) 궤양, 예를 들어 베체트병(Behcet's disease)에 의해 유발되거나 일부인 아프타성 궤양이다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 치료되는 구강 병변은 개체의 턱의 골괴사에 의해 유발되거나 이와 관련된다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 치료되는 구강 병변은 이식편 대 숙주 질병에 의해 유발되거나 이와 관련된다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 처리되는 구강 병변은 구강 병변을 갖는 개체에 의해 멜팔란(melphalan)의 사용에 의해 유발되거나 이와 관련된다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 처리된 구강 병변은 화학 요법, 예를 들어 종양, 혈액암, 또는 다른 유형의 암을 치료하기 위해 개체에 투여되는 화학 요법에 의해 유발되거나 관련된다. 특정한 실시예에서, 상기 구강 병변은 화학요법 후 구강 점막염 또는 화학요법 유도된 구강 점막염에 의해 유발된다. 다른 구체적 실시예에서, 상기 구강 병변은 아프타성 구내염, 예를 들어, 특발성 아프타성 구내염이거나 이로 진단된다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 구강 병변은 구강 병변을 갖는 개체에 의해 mTOR(라파마이신(rapamycin)의 포유동물 표적) 억제자의 사용에 의해 유발되거나 이와 관련된다. 다른 구체적 실시예에서, 상기 구강 병변은 구강 병변을 갖는 개체의 5-플루오로우라실에 의해 유발되거나 이와 관련된다.

구체적 실시예에서, 상기 구강 병변은 화학 요법에 의해 유발되거나 이와 관련되며, 예를 들어 화학요법제의 사용에 의해 유발되거나 이와 관련되며, 상기 화학요법제는 예를 들어, 알킬화제(예를 들어 부설판(busulfan), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine) 또는 멜팔란(melphalan); 항-대사물질(예를 들어, 5-플루오로우라실, 메토트레세이트(methotrexate), 젬시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine), 또는 플루다라빈(fludarabine); 항종양 효과를 갖는 항생제(예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 또는 이다루비신(idarubicin); 또는 유사분열 억제제(예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 또는 비노렐빈(vinorelbine)이다. 다른 구체적 실시예에서, 치료, 예를 들어 화학요법의 과정을 받고 있거나 받은 상기 개체 내 상기 구강 병변의 발달은 상기 치료 과정의 조기 종결을 초래하거나, 초래할 것으로 예상된다. 이러한 맥락에서, "조기 종결"은 상기 구강 병변의 결과로서 부분적으로 또는 전체적으로, 상기 개체에 처방된 것보다 빠르게 치료 과정을 종결하는 것을 의미한다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 치료된 구강 병변은 치료를 필요로 하는 개체에 항체의 투여에 의해 유발되거나 이와 관련된다. 특정한 실시예에서, 상기 항체는 항-CD20 항체이다. 보다 구체적인 실시예에서, 상기 항체는 리툭시맙(rituximab) (예를 들어, RITUXAN®), 오파투무맙(ofatumumab) (예를 들어, ARZERRA®), 벨투주맙(veltuzumab) 또는 오크렐리주맙(ocrelizumab)이다. 다른 실시예에서, 상기 항체는 항 종양 괴사 인자 항체이다. 보다 구체적인 실시예에서, 상기 항체는 아달리무맙(adalimumab) (예를 들어, HUMIRA®), 에타네셉트(etanercept) (예를 들어, ENBREL®), 인플리시맙(infliximab) (예를 들어, REMICADE®), 세르토리주맙 페골(certolizumab pegol) (예를 들어, CIMZIA®), 나탈리주맙(natalizumab) (예를 들어, TYSABRI®) 또는 골리무맙(golimumab) (예를 들어, SIMPONI®)이다. 다른 구체적 실시예에서, 항체 치료 과정을 받고 있거나 받은 상기 개체에서 상기 구강 병변의 발달은 상기 항체 치료의 과정을 조기 종결시킨다. 이러한 맥락에서, "조기 종결"은 상기 구강 병변의 결과로서 부분적으로 또는 전체적으로, 상기 개체에 처방된 것보다 빠르게 항체 치료 과정을 종결하는 것을 의미한다.

4.3.4 공극 충진 (Void filling)

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체의 몸체 내에 공극을 밀봉, 충진, 및/또는 기타 치료하기 위해 사용된다. 본 발명에 사용된 것처럼, 용어 "공극(void)"는 예를 들어, 노화, 질병, 수술, 선천적 이상, 또는 이들의 조합에 의해 생성되는 개체 내 원치 않는 어느 빈 공간을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 공극은 개체의 몸체로부터 종양 또는 다른 매스(mass)의 수술적 제거 이후에 생성될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물로 채워질 수 있는 공극의 비제한적 예시는 개체의 몸체의 임의의 기관 또는 조직 내에 갈라진 틈(fissure), 누관(fistula), 게실(divercula), 동맥류(aneurysm), 낭포, 병변, 또는 다른 원치 않는 임의의 빈 공간을 포함한다.

일부 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 소변, 또는 다른 생물학적 유체의 누출을 방지하기 위해, 조직, 기관, 또는 몸체의 다른 구조(예를 들어, 혈관), 또는 인접 조직, 기관 또는 구조 사이의 연결부 내 틈(crevice), 갈라진 틈(fissure), 또는 누관의 전체 또는 일부를 충진, 밀봉 및/또는 기타 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 내장 사이의 누공으로, 또는 개체의 몸체의 외부에 내장으로부터 개구(opening) 또는 구멍(orifice)으로 주사, 이식, 트레드(threaded) 또는 투여될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 이들 병리학적 상태에 의해 형성된 공극 또는 결함을 충진 및 조직의 섬유아세포 침윤, 치유 및 내성장을 촉진하는데 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 개체 내 누공을 충진, 밀봉 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 개체에 주사 또는 투여하는 단계를 포함한다. 상기 ECM 조성물은 누공 구멍의 하나로 바늘을 통한 주사에 의해 개체에 투여될 수 있으며, 구멍의 대부분 또는 가지(branches)의 모두를 충진한다. 그렇지 않으면, 상기 ECM 조성물의 스트링(strings) 또는 막대는 구멍을 통해 누공 병변으로 트레드(threaded)될 수 있으며, 또는 콜라겐이 카테터로 개체로 도입될 수 있다. 항문(anal), 동정맥(arteriovenous), 방광, 경동맥 해면(carotid-cavernous), 외부, 위, 장, 정수리, 타액, 질, 및 항문 및 직장의 누공, 또는 이들의 조합과 같은, 다양한 유형의 누공이 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 충진, 밀봉 및/또는 치료될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 개체 내 게실(diverticulum)을 충진, 밀봉 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 개체에 주사 또는 투여하는 단계를 포함한다. 게실은 장 및 방광 등과 같은 관상 또는 낭상 기관으로부터 파우치 또는 색(sac) 구멍인 비정상적인 생리학적 구조이며, 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 충진 또는 보강(augmented)될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 개체에 낭포를 충진, 밀봉 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 개체에 주사 또는 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 낭포는 거짓낭(pseudocyst)이며, 이는 예를 들어 액체의 축적을 가지나, 상피 또는 다른 멤브레인 라이닝(membranous lining)을 포함하지 않는다. 충진, 밀봉 및/또는 치료될 수 있는 낭포의 추가적인 비제한적인 실시예는 피지선(sebaceous), 유피(dermoid), 뼈, 또는 장액낭(serous cysts), 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체로부터 불필요하고 원치 않는 성장물, 유체, 세포, 또는 조직의 수술적, 화학적 또는 생물학적 제거의 결과로 만들어진 임의의 공극의 전체 또는 일부를 충진하기 위해 주사 또는 투여될 수 있다. 상기 ECM 조성물은 잔류 및 주변 조직을 보강, 치료 과정을 돕고, 감염의 위험을 최소화하기 위해 공극의 부위에 국소적으로 주사 또는 투여될 수 있다. 이러한 보강은 유방암 수술, 종양성 결합 조직, 뼈 조직 또는 연골 조직 등의 제거 수술과 같은, 종양 절제 이후 생성된 공극 부위에 특히 유용하다.

4.3.5 조직 벌킹

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 조직 벌킹을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 것처럼, "조직 벌킹"은 외부 작용 또는 효과에 의해 개체의(예를 들어 인간의) 비-피부 연부 조직의 자연적인 상태의 어느 변화를 의미한다. 본 발명에 포함된 조직은 근육 조직, 결합 조직, 지방 및 신경 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 조직은 괄약근, 방광 괄약근 및 요도를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 많은 기관 또는 몸의 일부일 수 있다.

4.3.6 요실금(Urinary Incontinence)

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 요실금(스트레스 요실금)의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 이는 기침, 재채기, 웃음 또는 운동과 같은 내복부 압력의 증가를 초래하는 활동으로 발생하는 소변의 갑작스러운 누출이다. 이러한 실시예에 따라, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 예를 들어 개체의 괄약근 조직을 보강, 이에 따라 개체에서 개선 또는 회복하기 위해 개체에 주사될 수 있다. 상기 ECM 조성물은 요실금의 조절 및/또는 치료를 위해 요도의 주변에 조직 벌크(bulk)를 증가시키기 위해 요도 주위로 주사 또는 투여될 수 있다. 스트레스 요실금에 개선은 조직 벌크를 증가시키고 이에 따라 소변의 유출에 대한 저항력을 증가시킴으로써 달성될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 요도 주변의 부위로, 예를 들어, 소변이 누출되는 요도 내 구멍을 막기 위해 또는 소변이 막혔을 때 단단하게 밀봉하도록 요도의 벽을 두껍게 하기 위해, 개체에 주사 또는 투여된다.

다른 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 방광 출구에서 요도의 근육 바로 바깥의 요도 주위의 개체에 주사되거나 투여된다. 벌킹 물질의 투여는 피부를 통해, 요도를 통해, 또는 여성의 경우 질을 통해 수행될 수 있다.

4.3.7 방광요관 역류(Vesicoureteral Reflux)

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은, 방광으로부터 신장까지의 소변의 역행하는 흐름을 특징으로 하는, 방광요관 역류(VUR)(또는 요관 역류)의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시예에 따라, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 주사 또는 투여될 수 있으며, 상기 개체의 요관 벽은 보강되며, VUR의 증상은 감소 또는 제거된다. 상기 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 요관 구멍 아래의 배뇨 백킹(detrusor backing)으로 내시경 가이드 하에서와 같이, 주사(예를 들어, 서브트리고날(subtrigonal) 주사) 또는 투여될 수 있다.

4.3.8 위식도 역류병 (Gastroesophageal Reflux Disease)

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 위식도 역류병(GERD)의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 이는 일반적으로 하부 식도 괄약근(LES)-식도가 위장에 합류하는 곳의 근육 판―이 적절하게 닫히지 않고, 완화 또는 약화되고, 위 내용물이 누출되거나, 또는 식도로 역류되기 때문에 일어나는 질환이다. 이러한 실시예에 따라, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 주사 또는 투여될 수 있으며, 상기 개체의 LES는 보강되며, GERD의 증상은 감소 또는 제거된다. 일부 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 식도 위 접합부의 수준에서 식도벽에 내시경 가이드 하에 투여된다. 역류를 막기 위해, 벌크 효과는 유지된 물질과 이에 따른 조직 반응의 조합으로부터 발생한다. 상기 ECM 조성물은 표준 또는 대구경(예를 들어, 큰 게이지) 주사 바늘을 통해 투여될 수 있다.

4.3.9 성대 및 후두

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 질병, 질환(신경 질환과 같은), 또는 성대(폴드(folds)) 및/또는 후두(보이스 박스) 중 하나 또는 양쪽에 영향을 미치는 다른 비정상의 관리 또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 성대 및 후두의 질병, 질환 또는 다른 비정상의 비제한적 예시는 성문 무능력(glottic incompetence), 한쪽 성대 마비, 양쪽 성대 마비, 마비성 발성장애, 비마비성 발성장애, 경련성 장애 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 성대의 불완전한 마비("부전(paresis)"), 일반적으로 약화된 성대, 예를 들어 노령에 의한 것("노인성 후두(presbylaryngis)"), 및/또는 성대의 흉터(예를 들어, 이전의 수술 또는 방사선 요법으로부터)와 같이, 성대가 부적절하게 닫히게 하는 질병, 질환 또는 다른 비정상을 관리 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 성대가 한번 갖는 벌크(성대 주름 접힘 또는 위축에서와 같이) 또는 유동성(마비에서와 같이)이 부족한 개체에 성대 주름(fold)을 지지 또는 벌크하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 성대 및/또는 다른 후두의 연부 조직은 본 발명에 제공된 ECM 조성물로 단독 또는 다른 치료 또는 약제와 조합하여 보강될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 다른 성대 주름과 접촉할 수 있도록, 하나(또는 양쪽)의 성대 주름을 보강하거나 벌크를 추가한다.

통상의 기술자에게 잘 알려진 많은 절차 중 어느 하나가 개체의 성대(들) 또는 후두에 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 굴곡진 바늘이 개체의 구강을 통해 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 주사하기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 바늘(보다 큰 게이지, 짧은 바늘과 같은 것)은 개체의 피부 및 목젖(Adam's apple)을 통해 직접적으로 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 주사하기 위해 사용될 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 성대 마비를 관리 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체에 상기 ECM 조성물을 주사 또는 투여함으로써, 한쪽 또는 양쪽 성대 마비, 또는 개체에 이와 관련된 증상을 관리 또는 치료하기 위해 사용되며, 상기 성대 주름 닫힘이 개체에서 개선된다. 일 실시예에서, ECM 조성물은 하나(또는 양쪽)의 마비된 성대 주름을 보강 또는 벌크를 추가하여, 다른 성대 주름과 접촉할 수 있도록 한다. 개체에 ECM 조성물의 주사는 개체의 입을 통해 또는 피부 및 목젖을 통해 직접적일 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 임의의 발성의 장애 또는 말하기 불편함인, 발성장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

4.3.10 성문 무능력(Glottic Incompetence)

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 성문 무능력을 관리 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 경피적 후두 콜라겐 보강은 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 개체의 후두로 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 주사를 통해 일어날 수 있다. 일부 경우에, 상기 개체는 후두의 목소리 기능, 증가된 근육 강직도, 및 갑상피열 연골(thyroarytenoid)의 근육 움직임에 대한 감소된 능력에 영향을 주는 발성 부전(hypophonia) 및/또는 성문 무능력을 갖는다. 다른 실시예에서, 발성 부전(hypophonia)은 파킨슨 병의 결과이다. 일 실시예에서, 상기 ECM 조성물은 개체의 성대에 상기 ECM 조성물을 주사 또는 투여함으로써 이것이 필요한 개체에 성문 무능력의 관리 또는 치료를 위해 사용될 수 있으며, 상기 주사는 성대를 보강하고 성문 닫힘을 개선하여, 성문 무능력이 개체에서 감소되거나 제거되도록 한다.

4.3.11 바이오엔지니어링(Bioengineering)

다른 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 조직 또는 기관을 바이오엔지니어링하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 조직 교체 적용을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 사용하여 제조될 수 있는 바이오엔지니어링 성분의 예시는 뼈, 치아 조직, 관절, 연골, 골격근, 평활근, 심근, 힘줄, 반월판, 인대, 혈관, 스텐트, 심장 판막, 각막, 중이(ear drums), 신경 가이드(nerve guides), 조직 또는 기관 패치 또는 실란트, 손실 조직에 대한 필러, 화장학적 회복을 위한 시트, 피부(피부를 동등하게 만들기 위해 세포가 첨가된 시트), 기도와 같은 목의 연조직 구조, 후두개, 및 후두, 코 연골, 발목뼈(tarsal) 플레이트, 기도 고리(tracheal rings), 갑상 연골, 및 모뿔 연골과 같은 다른 연골 구조, 결합 조직, 혈관 이식편 및 이의 구성요소, 및 국소 도포를 위한 시트, 및 간, 신장, 및 췌장과 같은 기관의 회복 또는 대체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

4.3.12 화장학적 적용

본 발명에 제공된 ECM 조성물은 화장학적 적용에 보다 유용하다. 일반적으로, 이러한 화장학적 용도는 본 발명에 제공된 ECM 조성물이 개체의 피부 내 또는 위에 라인(lines), 주름(creases), 및 다른 주름(wrinkles)을 충진하여 보다 부드럽고 보다 어려 보이는 외관을 회복한다는 사실에 기초한다.

특정한 실시예에서, 본 발명에 제공된 ECM 조성물은 개체에 피부 보강을 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 개체에 피부 보강 방법은 보강이 필요한 개체의 얼굴 또는 몸의 부위에 본 발명에 제공된 ECM 조성물의 주사 또는 투여를 포함하며, 상기 개체의 얼굴 또는 몸의 부위는 콜라겐의 투여 전 부위에 비해 보다 보강된다. 본 발명에 사용된 "피부 보강"은 외부 활동 또는 효과에 의해, 개체의(예를 들어 인간의) 피부 및 관련된 부위의 자연적 상태의 어떠한 변화를 의미한다. 피부 보강에 의해 변화될 수 있는 피부의 비제한적인 부위는 표피, 피부, 피하층, 지방, 입모근(arrector pill muscle), 모발 줄기(hair shaft), 땀구멍, 피지샘, 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명에 제공된 ECM 조성물의 화장학적 용도의 예시는 얼굴의 주름진 또는 함몰된 부위를 보강 및/또는 개체의 얼굴 및 몸의 부위에 풍부함을 추가 또는 증가시키기 위한 ECM 조성물의 용도; 주름, 움푹 파짐 또는 다른 주름(예를 들어, 안면 주름(frown lines), 미간 주름(worry lines), 눈가 잔주름(crow's feet), 마리오네트 주름), 스트레치 마크, 내부 및 외부 흉터(손상, 상처, 사고, 물림, 또는 수술로부터 발생한 흉터와 같은)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 피부 결함을 치료하기 위한 ECM 조성물의 용도; "쑥 들어간(hollow)" 눈 및 눈 주변의 다크 서클을 초래하는 가시적인 혈관을 보정하기 위한 ECM 조성물의 용도; 하부 눈꺼풀 성형술로부터 안구 밑 지방 패드를 적극적으로 제거한 후 눈 하부의 보정, 적극적인 협측 지방 추출 후 뺨 아래쪽의 보정, 및 코성형의 결과, 피부 이식 또는 지방 흡입의 자국과 같이 다른 수술로 인해 유도된 불규칙함의 보정을 포함하는, 성형 수술을 보정 또는 보충하기 위한 ECM 조성물의 용도; 얼굴 또는 몸의 흉터(예를 들어, 상처, 수두, 또는 여드름 흉터)를 보정하기 위한 ECM 조성물의 용도; 얼굴 재성형을 위한 ECM 조성물의 용도를 포함한다.

5. 키트

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명에 제공된 키트는 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하며, 상기 ECM 조성물은 시트로 제형화된다. 상기 ECM 시트는 멸균 형태로 제공되며, 파우치에 포장된다. 이러한 키트에 제공된 ECM의 시트는 다양한 크기(예를 들어, 5 x 5 cm 또는 9 x 9 cm) 및 두께(예를 들어, 1.5-2.5 mm)일 수 있으며, 의사가 사용, 예를 들어 상처 드레싱에 사용하기 위해 준비된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 상기 ECM 조성물은 유동성 기질로 제형화될 수 있다. 이러한 키트에서, ECM 조성물은 멸균 형태로 제공되며, 미세화된 ECM으로 유리 바이알에 포장된다. 이러한 바이알은 미세화된 ECM의 다양한 양, 예를 들어 200 mg의 미세화된 ECM을 포함할 수 있다. 유동성 기질로 제형화된 ECM 조성물을 포함하는 키트는 현탁 용액(예를 들어, 식염수)와 같은 미세화된 ECM의 현탁액으로 사용하기에 적합한 성분 및 바늘이 있는 주사기 및 유동성 어플리케이터를 추가로 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 ECM 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 상기 ECM 조성물은 미립자로 제형화된다. 이러한 키트에서, ECM 조성물은 멸균 형태로 제공되며, 밀링된 ECM으로 유리 바이알에 포장된다. 이러한 바이알을 다양한 양의 밀링된 ECM, 예를 들어 100 mg 또는 200 mg의 밀링된 ECM을 포함할 수 있다.

본 발명에 제공된 키트는 키트에 제공된 ECM 조성물을 사용하는 것에 대한 설명서와 함께 라벨 또는 라벨링을 포함할 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 키트는 키트 내 ECM 조성물을 투여하기 위한 수단과 같이, ECM 조성물이 유용하도록 하는 방법을 수행하기에 유용한 구성, 예를 들어 하나 이상의 스프레이 병, 핀셋, 주걱(spatula)(페이스트 또는 미립자의 적용을 위해), 캐뉼라, 카테타 등을 포함할 수 있다.

6. 실시예

6.1. 실시예 1: 태반의 ECM을 제조하는 방법

본 실시예는 페이스트로 초기에 제형화되는 태반의 ECM을 제조하는 방법을 기술한다.

방법 1: 사전에 분리된, 동결된 인간 태반을 수득하고 실온에서 ~24시간 해동하였다. 태반을 해동한 이후, 양막, 융모막, 및 탯줄을 태반으로부터 제거하고 폐기하였다. 그 다음, 상기 태반을 가공을 위해 2 x 2 센티미터의 조각으로 절단하였다.

이후 상기 태반 조직을 1.5 리터의 1 M NaCl 용액을 포함하는 용기(receptacle)에 두고 Omni Mixer Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA)를 사용하여 균질화하였다. 이후, 균질화된 태반 조직을 가공 주머니에 두고, 상기 백을 9.2 리터의 총 부피로 1 M NaCl 용액으로 채웠다. 이후 균질화된 태반 조직은 하기와 같이 1 M NaCl 용액에서 세번 세척하였다: (i) 가공 주머니를 10분 동안 궤도(orbital) 혼합기에서 교반하는 단계, (ii) 상기 태반 조직을 10분 동안 가공 주머니에 가라 앉히는 단계, (iii) 중력 배액을 통해 6.2리터의 상등액을 가공 주머니로부터 제거하는 단계로, 혼합물로부터 혈액 및 파편을 제거함.

세 번째 세척 단계 이후, 세척된 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 궤도 혼합기 상에 1 M NaCl 용액(3리터의 총 혼합물) 내에서 혼합시켰다. 그 다음, 상기 태반 조직을 상기 NaCl 세척에 설명된 것과 동일한 방법으로 멸균 수로 네번 세척하였다. 물로 네번 세척 이후, 상기 태반 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 궤도 혼합기 상 물에 혼합시켰다(3리터의 총 혼합물). 물에서 ~18-26 시간 혼합 이후, 상기 태반 조직을 상기 설명된 것처럼 물로 네번 세척하였고, 혼합물 내 2% 소듐 디옥시콜레이트의 최종 농도를 위해 이후 6.2 L의 3% 소듐 디옥시콜레이트를 혼합물에 첨가시켰다.

상기 태반 조직을 실온에서 ~72시간 동안 궤도 혼합기 상 2% 소듐 디옥시콜레이트 용액 내 혼합시켰다. ~72 시간 혼합 이후, 상기 태반 조직을 상기 설명된 방법으로 멸균수로 다섯번 세척하였다. 물의 최종 첨가 이후, 상기 용액의 pH는 염기성 용액을 초래하는 1 M NaOH의 드랍 방식(dropwise) 첨가를 통해 약 10-12로 조정되었다. 상기 태반 조직은 실온에서 ~30분 동안 궤도 혼합기 상 염기성 용액 내에 혼합시켰다. ~30분의 혼합 이후, 상기 용액의 pH를 0.1 N HCl의 드랍 방식 첨가를 통해 약 7.0-7.5로 조정되었다.

이후 상등액을 가공 주머니로부터 제거하고 남아있는 태반 조직을 수집하고 원심분리하였다. 원심분리 이후, 최종 단계로 상등액을 제거하고 수집된 태반 조직을 멸균수에 재현탁시키고, 다시 원심분리한 후, 상등액을 폐기하였다. 결과물 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 태반 ECM을 나타내었고, 백색 페이스트의 형태였다.

방법 2: 처리를 위해 방출되면, 냉동 인간 태반을 2-8℃로 해동시킨 후 생물학적 안전 캐비닛(BSC)로 옮긴 다음, 방법 1에서와 같이 처리하였다. 상기 태반 조직을 이의 저장 용기로부터 제거하고 멸균 일회용 트레이에 두었다. 이후 상기 태반을 과도한 혈액 및 혈전을 제거하기 위해 세척한 이후 작은 분절로 절단하였다. 상기 절단된 태반 물질을 멸균수에 현탁시킨 후, 태반 ECM으로부터 세포 및 세포 파편을 보다 효과적으로 분리 및 제거하는 기계적 균질화기를 사용하여 균질화하였고, 이는 증가된 표면적을 갖는 작은 조직 미립자를 발생시켰다. 태반으로부터 균질화된 조직을 멸균 1 M 소듐 클로라이드 용액을 갖는 멸균 가공 주머니로 옮겼다. 상기 조직을 궤도 혼합기 상 혼합을 통해 멸균 1 M 소듐 클로라이드(NaCl)로 몇번 세척하였고; 상기 태반 조직을 가라 앉히기 위해 NaCl 용액을 교환한 후, 배수 및 추가적인 멸균 1 M NaCl 용액으로 리프레쉬하였다. 상기 태반 조직을 1 M NaCl 용액 내 흔듬(shaking)과 함께 18-24 시간 동안 둔 이후, 멸균수로 반복 세척하였다. 모든 가공 단계는 실온에서 수행되었다. 상기 태반 조직을 높은 농도의 소듐 클로라이드, 이후 물에 노출시키는 것은 혈액의 조직, 혈액 성분, 세포 및 세포 파편을 청소하기 위하여, 조직에 "삼투 충격"을 주는 것이다. 상기 태반 조직에 다음 단계, 세제 세척 전에 두 번째 "삼투 충격"을 주었다.

상기 린스된 태반 조직을 실온에서 바이오-가공 주머니 내에서 흔들면서 멸균 0.1-0.3% 소듐 디옥시콜레이트(DOC) 용액 및 4-8 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액과 함께 48-72시간 동안 두었다. 멸균수로 린스 이후, 상기 조직을 18-24시간 동안 DOC/EDTA로 두 번째 세척하였다. 멸균수는 이후 조직을 린스 및 DOC 및 EDTA를 제거하는데 사용되었다.

물 세척의 완료에 따라, 상기 상등액을 바이오-가공 주머니로부터 제거하고 2 mM 마그네슘 클로라이드의 및 10 U/mL의 BENZONASE®, pH 8-9의 용액으로 교체하고, 실온에서 18-24시간 동안 혼합하였다. BENZONASE®는 모든 형태의 핵산(RNA & DNA)을 분해하는 엔도뉴클레아제다; 생성되는 보다 짧은 폴리뉴클레오티드 절편은 태반 조직의 순차적인 린스로 세척된다.

잔여 핵산을 제거하기 위해 태반 조직을 린스한 이후, 상기 물질을 바이러스 비활성화 단계로 낮은 및 높은 pH로 처리하였다. 첫 번째 단계에서, 상기 태반 조직을 멸균 0.67 M NaCl 용액의 존재 하에 3.3 또는 그 미만의 pH로 두고, 22 +/- 1℃에서 24시간 동안 궤도 혼합기 상 혼합하였다. 두 번째 단계에서, 용액의 pH는 소듐 하이드록사이드(NaOH)를 사용하여 13 이상으로 조정하였고, 22 +/- 1℃로 최소 4시간 동안 궤도 혼합기 상에서, 바이오-가공 주머니 내에 혼합시켰다. NaOH 노출의 종료시, 용액의 pH는 5.5-9.0의 범위로 조정되었다.

산 및 염기 처리의 완료 시, 상기 조직을 1M NaCl과 함께 배양하고 48-72 시간 동안 궤도 혼합기 상에 혼합하였다. NaCl 처리 이후, 상기 태반 ECM을 파편 및 잔여 오염물을 제거하기 위해 18-24시간 동안 멸균수로 세척하였다. 상청액을 원심분리함을 통해 ECM 페이스트를 제조하였다. 상기 ECM 페이스트를 상기 생산물이 제형화되고 멸균될 때까지 -20℃에서 저장하였다.

시트와 같은 제형: ECM 시트를 제조하기 위해, 상기 ECM 페이스트를 24-48시간 동안 2℃ 내지 22℃에서 해동시키고, 생물학적 안전 캐비닛 내 멸균 인산염 버퍼 내에 재현탁시켰다. 상기 조직을 균질화 ECM 현탁액을 제조하기 위해 균질화하고, 멸균 플라스틱 몰드로 분배하고 냉동시켰다. 상기 ECM의 냉동 몰드는 동결 건조를 사용하여 탈수시켰다. 생성된 탈수된 ECM 웨이퍼(wafers)를 멸균수로 재수화한 이후 실온에서 18-36 시간 동안 진공-보조 건조기 상에 압축시켰다(compacted). 시트를 이중 파우치에 두고, 의료용 밀봉 장치를 사용하여 밀봉하고, 감마선을 사용하여 멸균하였다.

미립자와 같은 제형: ECM 미립자를 생산하기 위해, 상기 ECM 페이스트를 멸균수에 재현탁시키고, 몰드로 옮기고, Controlled Rate Freezer (Thermo Scientific, Marietta, OH)를 사용하여 냉동시키고, 48시간 동안 냉동 건조기(LabConco, Kansas City, MO) 내 동결 건조시켰다. 상기 동결 건조된 ECM은 제트 밀(Fluid Energy, Telford, PA)을 사용하여 밀링되었고, ECM 미립자를 생성하였다. 상기 밀링된 ECM 파우더를 앰버(amber) 유리 바이알에 채우고 밀봉하였다.

유동성 기질과 같은 제형: ECM 유동성 기질을 ECM 미립자를 사용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, ECM 유동성 기질은 동결 건조된, 밀링된 ECM(예를 들어 멸균수 또는 식염수 용액 내 ECM 미립자)를 현탁시킴으로써 제조될 수 있다.

6.2. 실시예 2: ECM 조성물의 콜라겐 내용물의 결정

본 실시예는 ECM 조성물의 콜라겐 함량의 분석을 설명한다.

미립자, 시트 또는 유동성 기질 형태로 실시예 1에 설명된 것처럼 제조된 ECM 조성물을 비색질(colorimetric) 하이드로프롤린 분석을 사용하여 총 콜라겐 함량을 분석하였다. 콜라겐은 매우 높은 프롤린 농도를 갖는 특별한 단백질이다. 추가로, 콜라겐은 하이드록시프롤린으로 번역 후 변형된다. 이와 같이, 뜨거운 염산 내 가수분해된 콜라겐으로부터 수득될 수 있는 하이드록시프롤린의 정량은 콜라겐의 정량을 위한 대리(surrogate)로 사용될 수 있다.

ECM 샘플은 110 ℃로 6 N HCl을 사용하여 가수분해 되고, 이후 하이드록시프롤린은 클로라민-T(N-클로로 4-메틸벤젠설폰아미드)를 사용하여 피롤-2-카르복실산(피롤)로 산화되었다. 색깔은 4-디메틸아미노벤즈알데하이드(DMAB)를 사용하여 발달되었고, 하이드록시프롤린 함량은 550 nm에서 흡광도를 판독함을 통해 결정되었다. 샘플 흡광도는 하이드록시프롤린의 알려진 양을 사용하여 하이드록시프롤린 표준 곡선에 대해 보정되었다(interpolated).

상기 ECM 조성물은 ECM 조성물의 중량 대비 31 중량%의 총 콜라겐 내지 53 중량%의 총 콜라겐의 범위를 포함하는 것으로 결정되었다(표 1). 14/16 샘플은 ECM 조성물의 중량 대비 34% 내지 43%의 총 콜라겐의 범위에 속하였으며, 12/16은 ECM 조성물의 중량 대비 37% 내지 42%의 범위에 속하였다. 대조적으로, 돼지의 방광 기질로부터 유도된 비교대상(comparator) 기질 생산물(MATRISTEM® 상처 기질 시트 또는 MATRISTEM MICROMATRIX® 미립자) 및 소태아 혈청 피부 기질(PRIMATRIX™ 피부 리페어 기질)은 각각 67%, 67%, 및 69% 총 콜라겐 중량비를 포함하는 것으로 나타났다.

ECM 조성물의 건조 중량 대비 총 콜라겐의 백분율

샘플	유형	콜라겐 중량%
1	미립자	37
2	시트	43
3	미립자	42
4	미립자	34
5	시트	41
6	미립자	38
7	미립자	38
8	유동성 기질	42
9	시트	38
10	미립자	53
11	미립자	40
12	미립자	42
13	미립자	38
14	미립자	37
15	미립자	42
16	미립자	31
돼지 방광 기질	시트	67
돼지 방광 기질	미립자	67
소태아혈청 피부 기질	시트	69

6.3. 실시예 3: ECM 조성물의 엘라스틴 함량의 결정

본 실시예는 ECM 조성물의 엘라스틴 함량의 분석을 설명한다.

미립자 또는 시트로서 실시예 1의 설명에 따라 제조된 ECM 조성물을 파스틴 엘라스틴 분석 키트(Fastin Elastin Assay kit) (BioColor, Ltd. (UK)을 사용하여 엘라스틴 함량을 분석하였으며, 이는 실험 샘플로부터 추출되고 용해된 알파-엘라스틴을 염색하기 위한 염료로 5, 10, 15, 20-테트라페닐-21, 23-폴핀 테트라-설포네이트(TPPS)를 사용한다. 엘라스틴은 100℃에서 0.25 M 옥살산 내 ECM 조성물 샘플로부터 추출된다. 엘라스틴은 트리클로로아세트산 및 염산(TCA/HCl)과 함께 침전된 후, TPPS로 염색되었다. 상기 TPPS는 이후 엘라스틴으로부터 분리하였고, 방출된 TPPS 수준은 분광광도법을 통해 정량하였다. ECM 조성물 내 엘라스틴 수준은 엘라스틴 표준 곡선에 대해 보정(interpolation)을 통해 결정하였다.

상기 ECM 조성물은 ECM 조성물의 중량 대비 13% 내지 29%의 엘라스틴의 범위를 갖는 것으로 결정되었다(표 2). 14/16 샘플은 ECM 조성물의 중량 대비 16% 내지 24%의 엘라스틴의 범위 내에 속하며, 13/16 샘플은 ECM 조성물의 17% 내지 24%의 엘라스틴의 범위 내에 속하며, 및 10/16 샘플은 ECM 조성물의 20% 내지 24%의 엘라스틴의 범위 내에 속한다. 대조적으로, 돼지의 방광 기질로부터 유도된 비교대상(comparator) 기질 생산물(MATRISTEM® 상처 기질 시트 또는 MATRISTEM MICROMATRIX® 미립자)는 4%의 엘라스틴을 포함하는 것으로 나타났다. 엘라스틴은 소태아 혈청 피부 기질(PRIMATRIX™ 피부 리페어 기질)에서는 검출되지 않았다.

표 2 및 3에서, 샘플 8은 표 1 내 샘플 8과 동일한 ECM 조성물을 나타낸다. 그러나, 분석된 ECM 조성물의 유형은 다르다(즉, ECM 조성물의 유동성 기질 형태는 표 1에 분석된 반면, ECM 조성물의 미립자 형태는 표 2 및 3에서 분석됨).

총 ECM 조성물의 건조 중량 대비 엘라스틴의 백분율

샘플	유형	엘라스틴 중량%
1	미립자	17
2	시트	20
3	미립자	17
4	미립자	16
5	시트	24
6	미립자	24
7	미립자	20
8	미립자	21
9	시트	22
10	미립자	13
11	미립자	17
12	미립자	22
13	미립자	20
14	미립자	29
15	미립자	25
16	미립자	23
평균:		21
매트리스템 상처 기질(MatriStem Wound Matrix)	시트	4
매트리스템 마이크로기질(Matristem Micromatrix)	미립자	4
프리매트릭스 시트(Primatrix Sheet)	시트	검출되지 않음

6.4. 실시예 4: ECM 조성물의 피브로넥틴 함량의 결정

본 실시예는 ECM 조성물의 피브로넥틴 함량의 분석을 설명한다.

미립자 또는 시트로 실시예 1의 개시와 같이 제조된 ECM 조성물은 TaKaRa 피브로넥틴 EIA 키트(Mountain View, CA)를 사용하여 피브로넥틴 함량을 분석하였고, 이는 두-단계 절차에 의해 피브로넥틴을 검출하는 두가지 마우스 단일클론 항-인간 피브로넥틴 항체를 활용하는 샌드위치 ELISA 방법에 기초한다.

15 mg의 ECM 조성물을 3 mL의 추출 버퍼(2 M 요소, 0.05 M PO4, 2 mM PMSF, pH 7.1)과 혼합하고 4시간 동안 스틸(stir) 플레이트에서 혼합하였다. 이후 상기 샘플을 20분 동안 10,000 Xg로 원심분리하였다. 상등액을 분석시까지 -20℃에서 저장하고, 즉시 사용하였다. TaKaRa 피브로넥틴 EAI 키트를 사용하여 16가지 ECM 조성물 샘플의 분석은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 피브로넥틴 농도의 표준 곡선은 시판중인 동결건조된 피브로넥틴을 사용하여 수행하였으며, 샘플 피브로넥틴 농도는 곡선으로부터 보정하였다.

ECM 조성물의 피브로넥틴 함량은 ECM 조성물의 mg 당 197 ng의 피브로넥틴(ECM 조성물의 중량 대비 0.0197%)으로, 및 21.3 ng/mg 내지 361.3 ng/mg의 범위로, 낮았다. 돼지 방광 기질의 샘플(MATRISTEM® 상처 기질 시트 또는 MATRISTEM MICROMATRIX® 미립자) 및 소태아 혈청 피부 기질(PRIMATRIX™ 피부 리페어 기질)을 실험하였으나 분석에서 피브로넥틴 함량을 나타내지 않았으며, 분석에 사용된 항체가 소태아혈청 또는 돼지 기질과 교차 반응을 하지 않기 때문인 것으로 추측된다.

총 ECM 조성물의 건조 중량 대비 피브로넥틴의 백분율

샘플	유형	평균 ng/mg
1	미립자	332.7
2	시트	181.0
3	미립자	114.8
4	미립자	270.0
5	시트	21.3
6	미립자	194.1
7	미립자	112.6
8	미립자	150.1
9	시트	71.8
10	미립자	138.1
11	미립자	97.0
12	미립자	200.7
13	미립자	217.0
14	미립자	361.3
15	미립자	342.8
16	미립자	346.8
평균		197.0
매트리스템 마이크로기질(Matristem Micromatrix)	미립자	검출되지 않음
매트리스템 상처 기질(MatriStem Wound Matrix )	시트	검출되지 않음
프리매트릭스(PriMatrix)	시트	검출되지 않음

6.5. 실시예 5: ECM 조성물의 라미닌 조성물의 결정

실시예 1에서 설명된 것처럼 제조되고 시트 또는 미립자로 제형화된 ECM 조성물의 16개 샘플을 TaKaRa 라미닌 EIA 키트를 사용하여 라미닌 함량을 분석하였다. 상기 키트는 두 단계 절차를 통해 라미닌을 검출하기 위하여 두가지 마우스 단일클론 항-인간 라미닌 항체를 활용하는 샌드위치 ELISA 방법에 기초한다. 추가적으로, 2M 요소 버퍼를 사용하여 라미닌에 대한 특이적 추출 방법이 개발되었다. 라미닌 농도의 표준 곡선은 시판중인 동결건조된 라미닌을 사용하여 수행하였고, 샘플 라미닌 농도는 곡선으로부터 보정하였다.

결과: 라미닌은 16개 ECM 샘플들의 어느 하나에서 검출되지 않았다. 또한 라미닌은 비교를 위해 분석된 돼지 방광 기질(시트 또는 미립자) 또는 소태아 혈청 피부 시트의 어느 하나에서 검출되지 않았다.

6.6. 실시예 6: ECM 조성물의 생체 적합성

실시예 1의 개시에 따라 제조되고 시트, 미립자, 또는 유동성 기질로 제형화된 ECM 조성물을 연구 시작 시 4.7-6.3개월령 및 2.4-2.9 kg 체중을 갖는 알비노 뉴질랜드 화이트 래빗에서 생체 적합성을 실험하였다. 대조군으로, ECM 시트는 MATRISTEM® 상처 기질(돼지 방광 기질)과 비교되고, ECM 미립자는 MATRISTEM MICROMATRIX®와 비교되고, ECM 유동성 기질은 INTEGRA™ 유동성 상처 기질(콜라겐 및 글리코사미노글리칸)과 비교되었다.

실험 항목 사용된 양/부위(site)

ECM 미립자 5.0-5.4 mg

ECM 유동물 50 μL

ECM 시트 1 x 3 x 10 mm 조각

MATRISTEM® 미립자 5.0-5.4 mg

Integra 유동성 50 μL

매트리스템 시트 1 x 3 x 10 mm 조각

유동성 기질의 제조: ECM 유동물(Flowable) 및 INTEGRA™ 유동물은 3 mL 바이알 엑세스 주사기로 2 mL 초과의 주사용수를 흡인(aspirating)하고, 공기 방울을 제거하고, 2 mL의 부피로 조절하여 제조하였다. 이후 캐뉼라를 바이알 엑세스 주사기로부터 제거하였다. 이후 상기 주사기를 2 mL 물을 포함하는 ECM 주사기에 끝에서 끝(tip-to-tip)을 연결하였다. 상기 물을 바이알 엑세스 주사기에서 바이알 엑세스 주사기로 천천히 주사하고, 파우더가 균질하게 수화될 때까지 앞뒤로 10 내지 15번 움직여 조심스럽게 혼합하였다. 전체 재구성된 페이스트를 하나의 주사기에 주입하였다. 이후 빈 주사기를 폐기하고 빈 1 mL 주사기를 ECM 잔여 페이스트 주사기에 연결하고, 1 mL의 ECM 유동물 또는 INTEGRA™ 유동물 페이스트를 1 mL 주사기에 옮겼다. 이러한 마지막 단계는 두 번째 1 mL 주사기로 반복하였다. 상기 페이스트를 각 투여를 위한 1 mL 주사기로 로드하기 전에 재혼합하였다. INTEGRA™ 유동물은 주사용 식염수 3.0 mL와 혼합하였다. 상기 실험 및 대조군 항목은 충진된 1 mL 주사기를 사용하여 직접적으로 적용하였다.

이식(Implantation): 각 동물에 대해, 척추 주위(paravertebral) 근육 양쪽의 근막(fascia)을 통해 연장되는, 등의 중심선 위로 2-4 cm 피부 절개를 만들었다. 각 이식 부위에 대해, 5 mm 절개를 척추 주변 근육으로 만들어졌고, 이식 부위 사이에 약 2.5 cm를 허용하는, 중간선으로부터 약 2cm 및 근육 섬유 축에 평행한 작은 주머니가 이식을 위한 지혈과 함께 생성되었다. 네가지 실험 또는 네가지 대조군 항목은 척추 주위 근육의 한쪽 측면에 이식하였다. 각 그룹에 대해 실험 항목은 오른쪽 측면에 이식하였고 대조군 항목은 왼쪽 측면에 이식하였다. 이후 모든 이식 부위는 비흡수성 봉합으로 폐쇄되었고, 상기 피부 절개는 봉합 및/또는 피부 스태플(staple)로 폐쇄되었다. 50 μL의 유동성 제형, 5 mg의 미립자 제형 및 1개 조각(1 x 3 x 10 mm)의 시트 제형을 근육의 만들어진 주머니에 이식하였다. 대조군 항목은 50 μL의 소태아로부터 유래된 상처 기질 제품(INTEGRA™ Flowable), 5 mg의 미립자 제형의 돼지 방광으로부터 유래된 세포외 기질(MATRISTEM MICROMATRIX®), 및 돼지 방광 세포외 기질로부터 유래된 시트 제형(1 x 3 x 10 mm)(MATRISTEM WOUND MATRIX®)이다. 동물들은 이식 후 1, 2 또는 4주에 죽였고, 조직 검사를 수행하였다.

결과: ECM 시트는 돼지 방광 기질에 비해 명백하게 보다 낮은 조직 반응성을 보였다. 이식 후 1주일에, 방광 기질(UBM) 시트 주변의 조직은 과립화 및 염증 반응의 뚜렷한 징후를 보인 반면(도 1A), ECM 시트는 과립구의 약간의 침입을 갖는 근육 조직 배열을 보였다. 2주 및 4주째에, 과립화는 여전히 UBM 시트 주변에서 명백한 반면(도 1C 및 1E), ECM 시트 주변의 조직은 과립화를 거의 보이지 않았으며 정상인 것으로 보였다(도 1D 및 1F). 상기 ECM 시트는 이식 후 1, 2 및 4주에 자극성이 없는 것으로 보였다.

ECM 미립자 및 유동성 기질은 또한 대조군 미립자 또는 유동성 기질에 비해 보다 낮은 반응성을 야기했다(도 2 및 3). 예를 들어, 이식 후 1주일째에, ECM 미립자는 염증을 가리키는 일부 과립화를 보였으나(도 2B), UBM 미립자 보다 현저하게 낮은 반면(도 2A),

2주 및 4주째에, ECM 미립자는 UBM 입자에 비해 과립화의 현저한 감소(각각 도 2D 및 2F)를 보였으며, 2주 및 4주째에 상당한 염증을 여전히 나타냈다(각각 도 2C 및 2E). 유사하게, 소태아 유래된 상처 기질 산물(INTEGRA™ Flowable)이 1주째에 과립화를 보이고(도 3A), 2주 및 4주째에 흉터(도 3C 및 3E에 밝은 부분)를 보이는 반면, ECM 유동물은 1주째에만 실질적인 염증 반응을 보이고(도 3B), 2주 및 4주째에는 거의 완전한 치유를 보였다(각각 도 3D 및 3F).

6.7. 실시예 7: 태반 융모막으로부터 태반 ECM을 제조하는 방법

본 실시예는 초기에 페이스트로 제형화되는, 태반 융모막으로부터 태반 ECM을 생산하는 방법을 설명한다.

방법 1: 사전에 분리된, 동결된 인간 태반을 수득하고 ~24시간 동안 실온에서 해동하였다. 태반이 해동된 이후, 융모막을 태반으로부터 수득하였다. 그 다음 태반을 가공을 위해 2 x 2 센티미터 조각으로 절단하였다.

이후 태반 융모막 조직을 1 M NaCl의 1.5리터를 포함하는 용기에 두고, Omni Mixer Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA)를 사용하여 균질화하였다. 그 다음, 균질화된 태반 융모막 조직을 가공 주머니에 두고, 상기 주머니를 1 M NaCl 용액으로 채워 9.2 리터의 총 부피로 만들었다. 이후 균질화된 태반 융모막 조직을 하기와 같이 1 M NaCl 용액에서 세번 세척하였다: (i) 10분 동안 궤도 혼합기 상에 가공 주머니를 교반하는 단계, (ii) 태반 융모막 조직을 10분 동안 가공 주머니에 가라 앉히는 단계, 및 (iii) 6.2 리터의 상등액을 중력 배액을 통해 가공 주머니로부터 제거하는 단계, 상기 단계는 혼합물로부터 혈액 및 잔해를 제거함.

세 번째 세척 단계 이후, 세척된 태반 융모막 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 궤도 혼합기 상에 1 M NaCl 용액(3 리터의 총 혼합물)에서 혼합하였다. 이후, 상기 태반 조직을 상기 NaCl 세척과 동일한 방법으로 멸균수로 네번 세척하였다. 물에서 네 번째 세척 이후, 태반 융모막 조직을 실온에서 ~18-26 시간 동안 궤도 혼합기 상에 물에 혼합시켰다(3 리터의 총 혼합물). 물에서 ~18-26 시간 혼합 이후, 태반 융모막 조직을 상기 설명처럼 물로 마지막으로 세척한 후, 6.2L의 3% 소듐 디옥시콜레이트를 혼합물에 첨가하여, 혼합물 내 2%의 소듐 디옥시콜레이트의 최종 농도로 만들었다.

상기 태반 융모막 조직을 실온에서 ~72 시간 동안 궤도 혼합기 상에 2% 소듐 디옥시콜레이트 용액 내 혼합시켰다. ~72 시간 혼합 이후, 태반 융모막 조직을 상기 설명된 방법으로 멸균 수로 다섯번 세척하였다. 최종 물 첨가 이후, 염기성 용액을 초래하는 1M NaOH의 드랍 방식 첨가를 통해 용액의 pH를 약 10-12로 만들었다. 상기 태반 융모막 조직을 실온에서 ~30분 동안 궤도 혼합기 상에 염기성 용액 내에서 혼합시켰다. ~30분 혼합 이후, 용액의 pH를 0.1 N HCl의 드랍 방식 첨가를 통해 약 7.0-7.5로 조정하였다.

이후 상등액을 가공 주머니로부터 제거하고 남아있는 태반 융모막 조직을 수집하고 원심분리하였다. 원심분리 이후, 상등액을 제거하고 최종 단계로서, 수집된 태반 융모막 조직을 멸균수에 재현탁시키고, 및 다시 원심분리한 후 상청액을 폐기하였다. 생성된 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 태반 ECM을 나타내며, 백색 페이스트의 형태이다.

방법 2: 처리를 위해 방출되면, 냉동된 인간 태반은 2-8℃에서 해동시킨 후 생물학적 안전 캐비닛(BSC)로 옮겼다. 상기 태반을 저장 용기로부터 제거하고 멸균 일회용 트레이에 두었다. 이후 상기 태반을 과량의 혈액 및 혈전을 제거하기 위해 세척하였다. 태반의 융모막을 수득하고 작은 조각으로 절단하였다. 절단된 태반 융모막 물질을 멸균수에 현탁시킨 후, 기계적 균질기를 사용하여 균질화하였고, 이는 증가된 표면적을 갖는 작은 조직 입자를 발생시켜, 태반 ECM으로부터 세포 및 세포 파편의 분리 및 제거를 보다 효율적이게 하였다. 태반 융모막으로부터 균질화된 조직을 멸균 1 M 소듐 클로라이드 용액과 함께 멸균 가공 주머니로 옮겼다.

상기 조직을 궤도 혼합기 상에 흔듬을 통해 멸균 1 M 소듐 클로라이드(NaCl)로 여러 번 세척하고, 상기 NaCl 용액을 태반 조직을 침전시키기 위해 교환한 후, 배수 및 추가적인 멸균 1 M NaCl 용액으로 리프레쉬하였다. 상기 태반 조직을 멸균 1M NaCl 용액에 흔듬과 함께 18-24시간 동안 둔 후, 멸균수로 세척을 반복하였다. 모든 가공 단계는 실온에서 수행하였다. 태반 융모막 조직을 소듐 클로라이드의 높은 농도, 이후 물에 노출시키는 것은, 혈액의 조직, 혈액 성분, 세포 및 세포 파편을 세척하도록, 조직에 "삼투 충격"을 주기 위한 것이다. 상기 태반 조직을 다음 단계, 세제 세척 전에 두 번째 "삼투 충격"을 주었다.

린스된 태반 융모막 조직을 실온에서 생물-가공 주머니 내 흔듬과 함께 멸균 0.1-0.3% 소듐 디옥시콜레이트(DOC) 용액 및 4-8 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액과 함께 48-72 시간 동안 두었다. 멸균수로 린스한 이후, 상기 조직을 18-24시간 동안 DOC/EDTA로 두 번째 세척하였다. 이후 멸균수를 조직을 린스 및 DOC 및 EDTA를 제거하는데 사용하였다.

물 세척의 완료 시, 상청액을 생물 가공 주머니로부터 제거하고, 2 mM 마그네슘 클로라이드 및 10 U/mL의 BENZONASE®, pH 8-9의 용액으로 교체하고, 실온에서 18-24시간 동안 혼합하였다. BENZONASE®은 모든 형태의 핵산(RNA & DNA)을 분해하는 엔도뉴클레아제다; 생성된 보다 짧은 폴리뉴클레오티드 절편을 태반 조직의 순차적 린스로 세척하였다.

잔여 핵산을 제거하기 위해 태반 융모막 조직을 린스한 이후, 바이러스 비활성화 단계로 물질에 낮은 및 높은 pH 처리하였다. 첫 번째 단계에서, 태반 융모막 조직을 멸균 0.67 M NaCl 용액의 존재 하에 3.3 또는 그 미만의 pH로 두고, 22 +/- 1℃로 24시간 동안 궤도 혼합기 상에 혼합하였다. 두 번째 단계에서, 용액의 pH를 소듐 하이드록사이드(NaOH)를 사용하여 13 이상으로 조절한 후, 22 +/- 1℃에서 최소 4시간 동안 궤도 혼합기 상에, 생물 가공 주머니에 혼합하였다. NaOH 노출의 종료 시, 용액의 pH는 5.5-9.0의 범위로 조정되었다.

산 및 염기 처리의 완료시, 상기 조직을 1M NaCl과 함께 배양하고 48-72 시간 동안 궤도 혼합기 상에 혼합하였다. NaCl 처리 후, 태반 융모막 ECM을 파편 및 잔여 오염물을 제거하기 위해 18-24 시간 동안 멸균수로 세척하였다. ECM 페이스트는 현탁액을 원심분리함으로써 생성되었다. ECM 페이스트는 생산물이 제형화될 때까지 -20℃ 냉동고에서 저장되고 멸균되었다.

시트와 같은 제형: ECM 시트를 제조하기 위해, 상기 ECM 페이스트를 24-48시간 동안 2℃ 내지 22℃에서 해동하고, 생물학적 안전 캐비닛 내 멸균 인산염 버퍼 내에 재현탁시켰다. 상기 조직을 균질 ECM 현탁액을 제조하기 위해 균질화하고, 이를 멸균 플라스틱 몰드로 분배하고 냉동시켰다. 냉동된 ECM의 몰드를 동결 건조를 사용하여 탈수하였다. 생성된 탈수된 ECM 웨이퍼(wafers)는 멸균수로 재수화한 후 실온에서 18-36시간 동안 진공 보조 건조기로 압축시켰다. 시트를 이중 파우치에 두고, 의료용 밀봉 장치를 사용하여 밀봉하고, 표지하고, 감마선을 사용하여 멸균하였다.

미립자와 같은 제형: ECM 미립자를 생성하기 위해, 상기 ECM 페이스트를 멸균수에 재현탁시키고, 몰드에 옮기고, Controlled Rate Freezer (Thermo Scientific, Marietta, OH)를 사용하여 냉동시키고, 48시간 동안 냉동 건조기(LabConco, Kansas City, MO)에서 동결 건조시켰다. 동결 건조된 ECM을 제트 밀(Fluid Energy, Telford, PA)을 사용하여 밀링하고, ECM 미립자를 제조하였다. 밀링된 ECM 파우더는 앰버 유리 바이알에 충진 및 밀봉될 수 있다.

유동성 기질과 같은 제형: ECM 유동성 기질은 ECM 미립자를 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로 ECM 유동성 기질은 동결 건조된, 밀링된 ECM를 재현탁시킴으로써(예를 들어 멸균수 또는 식염수 내 ECM 미립자) 제조될 수 있다.

ECM의 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 및/또는 라미닌 함량은 각각 실시예 2, 3, 4, 및 5에서 설명된 방법으로 분석될 수 있다. 추가로, ECM의 생체 적합성은 실시예 6에 설명된 방법으로 측정될 수 있다.

6.8. 실시예 8: 태반 융모막으로부터 태반 ECM을 생산하는 방법(2)

본 실시예는 초기에 페이스트로 제형화된, 태반 융모막으로부터 태반 ECM 조성물을 생성하는 방법을 설명한다.

만기 출산 이후 모체로부터 즉시 수득된 인간 태반, 또는 냉동되는 사전에 분리된 냉동 인간 태반이 활용된다. 상기 태반을 0.5M NaCl로 세척하였다. 양막, 탯줄 및 진성 탈락막을 태반으로부터 제거하고, 융모막판을 남긴 후 이를 스크래핑 및 세정하였다. 스크랩되고 세정된 융모막을 0.5 M NaCl 및 물로 린스한 후, 2% 디옥시콜린산에 밤새 린스한 후, 물로 수회 린스하였다. 이후 처리된 융모막을 그라인드하고 동결 건조하였다. 생성된 조성물은 추가적 제형화, 예를 들어 밀링 및 제형화를 위해 적절한 탈세포화된 ECM 페이스트이다.

시트와 같은 제형: ECM 시트를 만들기 위해, 상기 ECM 페이스트를 24-48시간 동안 2℃ 내지 22℃에서 해동하고, 생물학적 안전 캐비닛에 멸균 인산염 버퍼에 재현탁시켰다. 상기 조직을 균질 ECM 현탁액으로 제조하기 위해 균질화하고, 멸균 플라스틱 몰드에 분배하고 동결시켰다. ECM의 동결된 몰드를 동결 건조를 사용하여 탈수시켰다. 생성된 탈수된 ECM 웨이퍼를 멸균수로 재수화한 이후 실온에서 18-36 시간 동안 진공 보조된 건조기로 압축시켰다. 시트를 이중 파우치에 두고 의료용 밀봉기를 사용하여 밀봉하고, 표지하고, 감마선을 사용하여 멸균하였다.

미립자와 같은 제형: ECM 미립자를 만들기 위해, ECM 페이스트를 멸균수에 재현탁시키고, 몰드에 옮기고, Controlled Rate Freezer (Thermo Scientific, Marietta, OH)를 사용하여 냉동시키고, 48시간 동안 동결 건조기(LabConco, Kansas City, MO)에 냉동 건조시켰다. 동결 건조된 ECM을 제트 밀(Fluid Energy, Telford, PA)을 사용하여 밀링하고, ECM 미립자를 제조하였다. 밀링된 ECM 파우더는 앰버 유리 바이알에 충진 및 밀봉될 수 있다.

유동성 기질과 같은 제형: ECM 유동성 기질은 ECM 미립자를 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, ECM 유동성 기질은 동결 건조된, 밀링된 ECM을 현탁시킴(예를 들어 멸균수 또는 식염수 용액 내 ECM 미립자)을 통해 제조될 수 있다.

ECM의 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 및/또는 라미닌 함량은 각각 실시예 2, 3, 4 및 5에 설명된 방법으로 분석될 수 있다. 추가로, ECM의 생체 적합성은 실시예 6에 설명된 방법으로 측정될 수 있다.

6.9. 실시예 9: 태반 융모막으로부터 태반 ECM을 생산하는 방법(3)

본 실시예는 태반 융모막으로부터 태반 ECM 조성물을 생산하는 방법을 개시한다.

만기 출산 이후 모체로부터 즉시 수득된 인간 태반이 활용된다. 양막, 탯줄 및 진성 탈락막을 태반으로부터 제거하고, 융모막판을 남긴 후 이를 스크래핑 및 세정하였다. 스크랩되고 세정된 융모막을 1.0 M NaCl 및 물로 린스한 후, 0.067% 디옥시콜린산 및 4mM EDTA를 포함하는 용액으로 밤새 린스한 후, 물로 수회 린스하였다. 이후 상기 융모막을 0.39% 디옥시콜린산 및 8mM EDTA를 포함하는 용액에서 밤새 린스한 후, 물로 수회 린스하였다. 이후 처리된 전체 융모막을 동결 건조시켰다.

시트와 같은 제형: ECM 시트를 만들기 위해, 상기 ECM을 24-48시간 동안 2℃ 내지 22℃에서 해동하고, ECM 페이스트를 만들기 위해 생물학적 안전 캐비닛 내 멸균 인산염 버퍼에 재현탁시켰다. 상기 조직을 균질 ECM 현탁액으로 제조하기 위해 균질화하고, 멸균 플라스틱 몰드에 분배하고 동결시켰다. ECM의 동결된 몰드를 동결 건조를 사용하여 탈수시켰다. 생성된 탈수된 ECM 웨이퍼를 멸균수로 재수화한 이후 실온에서 18-36 시간 동안 진공 보조된 건조기로 압축시켰다. 시트를 이중 파우치에 두고 의료용 밀봉기를 사용하여 밀봉하고, 표지하고, 감마선을 사용하여 멸균하였다.

미립자와 같은 제형: ECM 미립자를 만들기 위해, ECM 페이스트를 만들기 위해 상기 ECM을 멸균수에 재현탁시키고, 몰드에 옮기고, Controlled Rate Freezer (Thermo Scientific, Marietta, OH)를 사용하여 냉동시키고, 48시간 동안 동결 건조기(LabConco, Kansas City, MO)에 냉동 건조시켰다. 동결 건조된 ECM을 제트 밀(Fluid Energy, Telford, PA)을 사용하여 밀링하고, ECM 미립자를 제조하였다. 밀링된 ECM 파우더는 앰버 유리 바이알에 충진 및 밀봉될 수 있다.

이러한 방법을 사용하여 생성되고 사전 멸균된, ECM 조성물의 특징은 하기 표 4에 요약된 건조 중량 특성을 나타내었다:

콜라겐	43-68%
엘라스틴	18-21%
피브로넥틴	27-5322 ng/mg (<0.05%)
라미닌	28-568 ng/ml (<0.05%)
글리코사미노글리칸	0.2 - 1.2 μg/mg (<0.05%)
사이토카인	<80 pg/mL (below level of detection)
성장 인자	<80 pg/mL (below level of detection)
디옥시콜린산	<300 parts per million (below level of detection)
무세포(Cell-free)	>90%
무세포파편(Cellular debris-free)	>90%

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허출원이 구체적 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것처럼 본 발명에 참고로 인용된다. 이해를 명료하게 하기 위한 설명 및 예시의 방법으로써 전술한 내용이 일부 상세하게 설명되었으나, 본 명세서에 제공된 교시에 비추어 당업자에게는 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않는 소정의 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 명백하다.

Claims

약 35-55%의 콜라겐 및 약 10-30%의 엘라스틴을 포함하는 세포외 기질(ECM) 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 라미닌을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 미만의 피브로넥틴, 검출되지 않는 양의 라미닌, 및 검출되지 않는 양의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
약 40-70%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하는 ECM 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 라미닌을 포함하는 조성물.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 및 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM은 태반의(placental) ECM인 조성물.
제13항에 있어서, 상기 태반의 ECM은 인간 태반의 ECM인 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 시트(sheet)로 제형화된 조성물.
제15항에 있어서, 상기 시트는 약 1.5 내지 2.5 mm 두께인 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미립자(particulate)로 제형화된 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유동성 기질로 제형화된 조성물.
약 35-55%의 콜라겐 및 약 10-30%의 엘라스틴을 포함하며, 하기 방법에 따라 제조된 ECM 조성물: (i) 태반으로부터 양막(amnion), 융모막(chorion), 및 탯줄(umbilical cord)을 제거하는 단계; (ii) 나머지 태반 조직을 1 M NaCl을 포함하는 용액에 위치시키는 단계; (iii) 상기 태반 조직을 균질화하는 단계; (iv) 상기 태반 조직을 2% 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (v) 상기 태반 조직을 물로 세척하는 단계; (vi) 상기 태반 조직을 1 M 소듐 하이드록사이드를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (vii) 상기 태반 조직을 포함하는 용액을 중성 pH로 조절하는 단계; 및 (viii) 상기 태반 조직을 수집하는 단계.
제19항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조성물.
제19항 또는 20항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 라미닌을 포함하는 조성물.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 미만의 피브로넥틴, 검출되지 않는 양의 라미닌, 및 검출되지 않는 양의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
약 40-70%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하며, 하기 방법에 따라 제조된 ECM 조성물: (i) 태반으로부터 융모막을 수집하는 단계; (ii) 상기 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 상기 융모막 조직을 0.5 M NaCl을 포함하는 용액에 위치시키는 단계; (iv) 상기 융모막을 2% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (v) 상기 융모막을 물로 린스(rinsing)하는 단계; 및 (vi) 그라인드(grinding) 및 동결 건조시키는 단계.
제24항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조성물.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 라미닌을 포함하는 조성물.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제24항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제29항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 및 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
약 40-70%의 콜라겐 및 약 15-25%의 엘라스틴을 포함하며, 하기 방법에 따라 제조되는 ECM 조성물: (i) 태반으로부터 융모막을 수집하는 단계; (ii) 상기 융모막을 스크래핑(scraping) 및 세척하는 단계; (iii) 상기 융모막을 1.0 M NaCl을 포함하는 용액에 위치시키는 단계; (iv) 상기 융모막을 약 0.05-0.1% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트 및 약 3mM-5mM EDTA를 포함하는 첫 번째 세제 용액과 접촉시킨 후, 물로 린스하는 단계; (iv) 상기 융모막을 약 0.05-0.1% 디옥시콜린산 또는 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 두 번째 세제 용액과 접촉시킨 후, 물로 린스하는 단계; (v) 및 동결 건조시키는 단계.
제31항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조성물.
제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 라미닌을 포함하는 조성물.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제35항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 또는 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제36항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 피브로넥틴, 약 0.1% 미만의 라미닌, 약 0.1% 미만의 글리코사미노글리칸, 및 검출되지 않는 양의 사이토카인, 성장 인자 및 디옥시콜린산을 포함하는 조성물.
제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM은 태반의 ECM인 조성물.
제38항에 있어서, 상기 태반의 ECM은 인간 태반의 ECM인 조성물.
제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 시트(sheet)로 제형화된 조성물.
제40항에 있어서, 상기 시트는 약 1.5 내지 2.5 mm 두께인 조성물.
제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미립자로 제형화된 조성물.
제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유동성 기질로 제형화된 조성물.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 조성물을 개체(subject)에 투여하는 단계, 또는 개체에 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포외 기질(ECM)을 필요로 하는 개체의 치료 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 구강 병변을 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 요실금을 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 방광요관 역류를 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 위식도 역류병을 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 성대 및/또는 후두 중 하나 또는 둘 다에 영향을 미치는 질병, 질환, 또는 이상(abnormality)을 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 성문 무능력(glottic incompetence)을 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 ECM은 신경 가이드(nerve guide)로 사용되는 방법.
제44항에 있어서, 상기 ECM은 힘줄 랩(tendon wrap)으로 사용되는 방법.
제44항에 있어서, 상기 ECM은 경막(dural) 대체물로 사용되는 방법.
제44항에 있어서, 상기 개체는 미용적 결함을 갖는 방법.
제54항에 있어서, 상기 미용적 결함은 주름(wrinkles), 함몰, 주름(creases), 스트레치 마크(stretch marks), 흉터, 쑥 들어간 눈(hollow eyes), 또는 눈 주위에 다크 서클을 초래하는 가시적인 혈관인 방법.