ES2836676T3

ES2836676T3 - Procedimiento de producción de un equivalente de piel y su uso para pruebas in vitro y trasplantes in vivo

Info

Publication number: ES2836676T3
Application number: ES16795323T
Authority: ES
Inventors: Gerd Lindner
Original assignee: Technische Universitaet Berlin
Current assignee: Technische Universitaet Berlin
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2021-06-28
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: WO2017084997A1; CN108472410A; US20200255808A1; DE102015119877B4; EP3377124B1; EP3377124A1; CN108472410B; DE102015119877A1

Abstract

Procedimiento para producir un equivalente de piel, que comprende las etapas de: a) producir una matriz dérmica que contiene una primera capa y una segunda capa, que comprende las etapas de: i) proporcionar la primera capa; ii) proporcionar una solución polimerizable que comprende un líquido y al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico; iii) añadir la solución polimerizable a la primera capa; iv) polimerizar la solución para formar la segunda capa; v) comprimir la segunda capa, en la que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se unen para formar la matriz dérmica; y vi) introducir al menos una cavidad en la matriz dérmica; b) introducir al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica producida en la etapa a) para producir un sustituto de piel; y c) añadir al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos al sustituto de piel para producir el equivalente de piel.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de producción de un equivalente de piel y su uso para pruebas in vitro y trasplantes in vivo

La piel es la interfaz entre el cuerpo y su entorno. Es la primera barrera decisiva para las influencias externas potencialmente dañinas como estrés mecánico o invasión de microorganismos patógenos. La importancia esencial de la piel para la salud humana se hace particularmente evidente cuando la capacidad de autorregeneración ya no es suficiente para mantener esta protección. Este es particularmente el caso de pacientes que sufren heridas agudas crónicas o extensas, tal como las causadas por lesiones como, por ejemplo, quemaduras. Si estas heridas no se tratan adecuadamente con terapias de restauración de la piel, estas afecciones tienen un impacto significativo en la calidad de vida e incluso pueden provocar la muerte.

Además de las posibilidades de restaurar la piel dañada, los equivalentes de piel generados artificialmente que, entre otras cosas, comprenden además los folículos pilosos, también se puede utilizar para el tratamiento terapéutico de las más variadas formas de caída del cabello, denominadas alopecias.

También existe la necesidad de un sistema de prueba adecuado que pueda usarse para investigar las causas de los diversos tipos de alopecia. Lo mismo se aplica a los exámenes de crecimiento, estructura y pigmentación del pelo. Además de la investigación biomédica, las industrias farmacéutica y cosmética en particular tienen una necesidad imperiosa de sistemas adecuados para probar la eficacia o toxicidad de sustancias en la piel o el cabello humanos.

En las últimas décadas, se han realizado grandes esfuerzos para imitar las estructuras complejas y las funciones de múltiples capas de la piel humana en forma de sustitutos de la piel. Por ejemplo, el documento EP 0 285 471 A describe la provisión de un equivalente de piel multicapa.

A pesar de los grandes avances en el desarrollo de la piel artificial, la estructura y función, que todavía son muy diferentes de la fisiología de la piel humana natural, plantean un problema. En particular, la implementación de folículos pilosos, tejido graso y un suministro vascular de piel artificial hasta ahora solo se ha implementado de manera insuficiente. Además, la producción de tal piel artificial hasta ahora no ha sido posible en gran escala, ya que los procedimientos de alto rendimiento para tales producciones son todavía limitados en la actualidad.

El objeto de la presente invención es reducir o evitar una o más desventajas de la técnica anterior. En particular, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento con el que se puedan producir equivalentes de piel.

La presente invención logra este objetivo proporcionando un procedimiento para producir un equivalente de piel, que comprende las etapas de: a) producir una matriz dérmica que contiene una primera capa y una segunda capa, que comprende las etapas de: i) proporcionar la primera capa; ii) proporcionar una solución polimerizable que comprende un líquido y al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico; iii) añadir la solución polimerizable a la primera capa; iv) polimerizar la solución para formar la segunda capa; v) comprimir la segunda capa, en la que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se unen para formar la matriz dérmica; y vi) introducir al menos una cavidad en la matriz dérmica; b) introducir al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica producida en la etapa a) para producir un sustituto de piel; y c) añadir al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos al sustituto de piel para producir el equivalente de piel.

El procedimiento de fabricación de la presente invención se lleva a cabo in vitro. Se entiende que “ in vitro” significa cualquier entorno que no esté dentro de un organismo vivo, por ejemplo, un cuerpo humano o animal. Por tanto, el procedimiento de detección in vitro según la invención no incluye expresamente un procedimiento que se lleve a cabo en el cuerpo humano o animal.

A menos que el contexto indique claramente lo contrario a continuación, el uso de formas singulares o formas plurales siempre incluye tanto el singular como el plural.

El procedimiento según la invención se refiere a la producción de un equivalente de piel. La expresión “equivalente de piel” denota un modelo de piel que se puede usar como un sustituto sustancialmente equivalente de la piel natural con respecto a su textura y función. El equivalente de piel presenta preferiblemente la forma y estructura aproximadas de una piel fisiológica.

El procedimiento según la invención para producir un equivalente de piel comprende las etapas de a) producir una matriz dérmica que contiene una primera capa y una segunda capa; b) introducir al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica producida en la etapa a) para la producción de un sustituto de la piel y c) agregar al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos como sustituto de la piel para producir el equivalente de piel.

En el procedimiento según la invención para producir un equivalente de piel, se produce una matriz dérmica en una primera etapa a). La producción de la matriz dérmica comprende las etapas de: i) proporcionar la primera capa; ii) proporcionar una solución polimerizable que comprende un líquido y al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico; iii) añadir la solución polimerizable a la primera capa; iv) polimerizar la solución para formar la segunda capa; v) comprimir la segunda capa, en la que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se combinan para formar la matriz dérmica; y vi) introducir al menos una cavidad en la matriz dérmica.

La matriz dérmica contiene dos capas, una primera capa y una segunda capa. En el presente caso, se entiende por “matriz dérmica” un sustrato de material que se utiliza en el procedimiento según la invención como material de partida para la producción del equivalente de piel. La matriz dérmica presenta similitudes estructurales con la estructura en capas de una piel fisiológica, por lo que la primera capa se asemeja a la estructura (sub)dérmica y la segunda capa se asemeja a la estructura papilar y reticular de la piel fisiológica.

En la etapa i), se proporciona la primera capa de la matriz dérmica. Preferiblemente, la primera capa de la matriz dérmica no contiene esencialmente células vivas.

La primera capa de la matriz dérmica puede comprender una sustancia cutánea natural. Se entiende que “sustancia de la piel” significa un material que se asemeja a la estructura similar al tejido conectivo de la (sub)dermis de una piel fisiológica o que presenta esta estructura. Preferiblemente, la sustancia cutánea natural se ha descelularizado antes de su uso en el procedimiento según la invención. Por ejemplo, la sustancia cutánea natural puede ser una piel de donante. Esta piel de donante es de origen animal. La piel de donante se deriva preferiblemente de un animal vertebrado, que puede ser un mamífero, pájaro, reptil o anfibio, preferiblemente un pájaro o mamífero. Este mamífero puede ser un ser humano, mono, cerdo, perro, gato o roedor, preferiblemente un ser humano. Una piel de donante de origen humano se conoce en la técnica, por ejemplo, con el nombre de Epiflex®.

La piel del donante puede provenir de cualquier región corporal adecuada, por ejemplo, del área del tronco como, por ejemplo, del pecho, el estómago o la espalda, o de las extremidades como, por ejemplo, de brazos o piernas.

Una vez que se ha eliminado la piel del donante, esta piel puede someterse a una o más etapas de limpieza para eliminar de la piel las posibles sustancias que interfieren.

Tal etapa de limpieza puede comprender, por ejemplo, la eliminación de células vivas.

La primera capa de la matriz dérmica puede comprender una sustancia cutánea artificial. Por ejemplo, la sustancia de piel artificial puede ser un material que comprenda proteínas estructurales, preferiblemente colágeno y/o elastina, de manera particularmente preferible, colágeno y elastina. Una sustancia de piel artificial se conoce en la técnica, por ejemplo, con el nombre Matriderm®.

En la siguiente etapa ii), se proporciona una solución polimerizable. Esta solución polimerizable es capaz de convertirse de un estado líquido a un estado esencialmente sólido en una reacción de polimerización. La solución polimerizable comprende un líquido. El líquido puede ser, por ejemplo, agua, una solución salina o un medio nutritivo. El líquido se puede tamponar.

La solución polimerizable tiene preferiblemente un pH de 2 a 12, preferiblemente de 4 a 10, de manera particularmente preferida de 5 a 9, de manera muy particularmente preferible, de 6 a 8.

La solución polimerizable comprende, además, al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico. La solución polimerizable preferiblemente comprende colágeno. En el caso del colágeno, se trata preferiblemente de un colágeno de tipo I, II, III, IV o V, preferiblemente de colágeno de tipo I. La solución polimerizable también comprende preferiblemente colágeno, elastina y ácido hialurónico.

El al menos un polímero está contenido en la solución polimerizable en una concentración de > 0,01%, preferiblemente del 0,01% al 50%, de manera particularmente preferida, del 0,1% al 10%, de manera muy particularmente preferible, del 0,125% al 5%.

La solución polimerizable puede contener adicionalmente células. En este caso, se trata preferiblemente de células vivas. Las células pueden ser de origen mesenquimal, por ejemplo, células madre mesenquimales multipotentes, que son células precursoras del tejido conectivo. Las células son preferiblemente células de tejido conjuntivo, de manera particularmente preferible, fibroblastos.

En la siguiente etapa iii), se añade la solución polimerizable a la primera capa.

En la siguiente etapa iv), la solución se polimeriza para formar la segunda capa de la matriz dérmica. Esto tiene lugar preferiblemente a una temperatura > temperatura ambiente. Una temperatura en el intervalo de 18 °C a 25 °C se determina como “temperatura ambiente”. La solución se polimeriza preferiblemente a una temperatura de > 25 °C, preferiblemente > 30 °C, de particular preferencia, de 30 °C a 50 °C, de manera muy particularmente preferible, de 35 °C a 45 °C, de manera particularmente preferible, a 37 °C hasta 42 °C.

La polimerización de la solución para formar la segunda capa puede tener lugar en condiciones esencialmente estáticas o en movimiento. Preferiblemente, la polimerización tiene lugar con movimientos giratorios, basculantes o de agitación. La polimerización de la solución para formar la segunda capa también puede tener lugar en condiciones que combinen ambos procedimientos antes mencionados, de modo que la reacción de polimerización se inicie primero con movimiento y luego finalice en condiciones esencialmente estáticas.

La polimerización de la solución para formar la segunda capa tiene lugar durante al menos 1 min, preferiblemente durante 2 min a 24 h, de manera particularmente preferida durante 5 min a 12 h, de manera particularmente preferible durante 10 min a 4 h, de manera muy particularmente preferible durante 15 min a 1 h.

Opcionalmente antes de la etapa iv), el polímero en la solución polimerizable se puede estructurar mediante movimiento. La estructuración del polímero provoca una distribución uniforme del polímero en la solución, de modo que la segunda capa polimerizada resultante presente una estructura esencialmente uniforme.

En la siguiente etapa v), tiene lugar la compresión de la segunda capa, por lo que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se unen para formar la matriz dérmica. La segunda capa se puede comprimir por centrifugación, sedimentación o la acción de fuerza mecánica. En el caso de la acción mecánica de la fuerza, se trata preferiblemente de una presión. Una parte del contenido líquido que se elimina de la segunda capa por compresión puede ser absorbida por la primera capa.

Al comprimir, la primera y segunda capas se combinan para formar la matriz dérmica. La matriz dérmica presenta un espesor de capa de al menos 0,1 mm, preferiblemente de 0,25 mm a 10 mm, de manera especialmente preferible, de 0,5 mm a 5 mm, de manera muy especialmente preferible, de 1 mm a 3 mm. La primera capa y la segunda capa dentro de la matriz dérmica pueden presentar espesores de capa respectivos iguales o diferentes. La primera capa presenta un espesor de capa de al menos 0,01 mm, preferiblemente de 0,05 mm a 5 mm, de manera especialmente preferida de 0,1 mm a 2,5 mm. La segunda capa tiene un espesor de capa de al menos 0,01 mm, preferiblemente de 0,05 mm a 5 mm, de manera especialmente preferida de 0,1 mm a 2,5 mm.

En la siguiente etapa vi), se introduce al menos una cavidad en la matriz dérmica. Las cavidades de la matriz dérmica presentan un diámetro medio de > 0,001 mm a 5 mm, preferiblemente de 0,005 mm a 1 mm, de manera especialmente preferible, de 0,01 mm a 0,08 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,02 mm a 0,06 mm, especialmente preferible de 0,05 mm a 0,04 mm. Las cavidades de la matriz dérmica tienen una profundidad de > 0,05 mm a 10 mm, preferiblemente de 0,1 mm a 8 mm, de manera especialmente preferible de 0,15 mm a 6 mm, de manera muy especialmente preferible de 0,2 mm a 4 mm, de manera especialmente preferible de 0, 5 mm a 2,5 mm.

Preferiblemente se introducen 1 a 400 cavidades/cm2 en la matriz dérmica, preferiblemente 10 a 200/cm2, de manera particularmente preferible 20 a 100/cm2, de manera muy particularmente preferible 30 a 100/cm2. Las cavidades se pueden introducir en la matriz dérmica a intervalos regulares o irregulares, preferiblemente las cavidades se introducen en la matriz dérmica a intervalos regulares.

La al menos una cavidad se puede introducir eliminando material de la matriz dérmica. La al menos una cavidad se introduce preferiblemente en la matriz dérmica perforando, cortando o usando un molde de impresión. La perforación se realiza, por ejemplo, con ayuda de una aguja, en particular una aguja hueca. El corte se puede realizar, por ejemplo, por medio de un bisturí, si es necesario con la ayuda de otras herramientas como pinzas para retirar el material extirpado de la matriz dérmica.

Alternativamente, la al menos una cavidad se puede introducir en la matriz dérmica utilizando un molde de impresión. El molde comprende una base. La base se puede moldear de varias formas, por ejemplo, puede tener una base redonda, ovalada o angular. La base puede ser plana o estructurada. El molde de impresión comprende preferiblemente al menos un cilindro. Por “cilindro” se entiende un cuerpo cilindrico alargado que es adecuado para introducir una cavidad en la matriz dérmica. El al menos un cilindro tiene un diámetro de > 0,001 mm a 5 mm, preferiblemente de 0,005 mm a 1 mm, de manera especialmente preferible, de 0,01 mm a 0,08 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,02 mm a 0,06 mm, de manera especialmente preferible, de 0,05 mm a 0,04 mm. El al menos un cilindro tiene una longitud de > 0,05 mm a 10 mm, preferiblemente de 0,1 mm a 8 mm, de manera especialmente preferible, de 0,15 mm a 6 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,2 mm a 4 mm, de manera especialmente preferible, de 0,5 mm a 2,5 mm.

El al menos un cilindro está preferiblemente unido a la base, y el al menos un cilindro está integrado de manera particularmente preferible en la base. El al menos un cilindro está preferiblemente alineado perpendicular a la superficie de la base.

El molde de impresión comprende preferiblemente > 1 cilindro. El molde de impresión comprende preferiblemente de 10 a 10.000 cilindros, de manera especialmente preferible, de 20 a 5000, de manera muy especialmente preferible, de 100 a 1000. Los cilindros pueden presentarse en el molde de impresión a intervalos regulares o irregulares. Los cilindros se presentan preferiblemente en el molde de impresión a intervalos regulares.

Preferiblemente, el al menos un cilindro presenta una cavidad al menos en parte, muy preferiblemente, el cilindro es esencialmente hueco por completo.

El al menos un cilindro puede presentar un ensanchamiento en forma de embudo en uno de sus extremos. De preferencia, en este caso, el cilindro es esencialmente hueco por completo. La expansión en forma de embudo del cilindro presenta un diámetro de > 0,01 mm en su extremo exterior, preferiblemente de 0,1 mm a 4 mm, de manera especialmente preferible, de 0,2 mm a 3 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,3 mm a 2,5 mm, con especial preferencia de 0,5 mm a 2 mm.

Asimismo, el molde de impresión comprende preferiblemente al menos una elevación. El término “elevación” denota una elevación que es esencialmente cónica. La elevación presenta preferiblemente la forma de un cono recto, siendo la punta del cono preferiblemente redondeada. Con la ayuda de esta al menos una elevación, se imprime una estructura ondulada en la matriz dérmica, que es similar a la estructura de la papila fisiológica de la piel natural en el borde epidermis/dermis. La base de la elevación cónica presenta un diámetro de > 0,01 mm, preferiblemente de 0,1 mm a 4 mm, de manera especialmente preferible, de 0,2 mm a 3 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,3 mm a 2,5 mm, con especial preferencia de 0,5 mm a 2 mm. La punta redondeada del cono presenta un diámetro de > 0,001 mm, preferiblemente de 0,01 mm a 3,5 mm, de manera especialmente preferible, de 0,1 mm a 2,5 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,2 mm a 2 mm, con especial preferencia de 0,3 mm a 1 mm.

Preferiblemente, la al menos una elevación está fijada a la base, y la al menos una elevación está integrada de manera particularmente preferida en la base. También es posible que la al menos una elevación sea una unidad de estructuración que dé a una base estructurada una forma correspondiente. La altura de la al menos una elevación está preferiblemente orientada perpendicular al área de la base.

El molde de impresión comprende preferiblemente > 1 elevación. El molde de impresión comprende preferiblemente de 10 a 10.000 elevaciones, de manera especialmente preferible, de 20 a 5000, de manera muy especialmente preferible, de 100 a 1000. Las elevaciones pueden presentarse en el molde de impresión a intervalos regulares o irregulares. Preferiblemente, las elevaciones están presentes en el molde de impresión a intervalos regulares.

El molde de impresión comprende preferiblemente al menos un cilindro y al menos una elevación. El molde de impresión comprende preferiblemente de 10 a 10.000 cilindros y elevaciones, de manera especialmente preferible, de 20 a 5000, de manera muy especialmente preferible, de 100 a 1000. Los cilindros y/o elevaciones pueden presentarse cada una en el molde de impresión a intervalos regulares o irregulares. Los cilindros y/o elevaciones están presentes preferiblemente en el molde de impresión a intervalos regulares, y los cilindros y las elevaciones están presentes preferiblemente en el molde de impresión a intervalos regulares. Los cilindros y las elevaciones se presentan preferiblemente en el molde de impresión de tal manera que estén esencialmente desplazados entre sí.

La base del molde de impresión, el al menos un cilindro y/o la al menos una elevación pueden estar hechas, por ejemplo, de metal, plástico, caucho o silicona como, por ejemplo, el polidimetilsiloxano (PDMs ) o pueden comprender estos materiales. La base del molde de impresión, el al menos un cilindro y la al menos una elevación están compuestos preferiblemente del mismo material. De manera especialmente preferible, la base, el al menos un cilindro y la al menos una elevación están configurados como un molde de impresión de una pieza.

Las etapas de procedimiento iv), v) o vi) para la producción de la matriz dérmica pueden tener lugar una tras otra y/o simultáneamente. La al menos una cavidad se introduce preferiblemente en la matriz dérmica en la etapa vi) durante o después de la polimerización en la etapa iv). Las etapas iv) y vi) se llevan a cabo de manera especialmente preferible, en forma simultánea, de modo que la introducción de la al menos una cavidad en la matriz dérmica tiene lugar preferiblemente durante la polimerización. De manera especialmente preferible, las etapas iv) y vi) se llevan a cabo en forma simultánea, teniendo lugar la polimerización preferiblemente en movimiento, de manera especialmente preferible, con movimientos giratorios, basculantes o de agitación.

Después de la producción de la matriz dérmica en la etapa a), en la etapa b) del procedimiento según la invención se introduce al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en al menos una cavidad de la matriz dérmica para producir un sustituto de piel. Una, varias o todas las cavidades de la matriz dérmica se recubren preferiblemente con proteínas de la matriz extracelular antes de que se introduzca el folículo piloso y/o el germen del folículo piloso en la etapa b).

La expresión “folículo piloso” describe las estructuras naturales que rodean la raíz del pelo y, por lo tanto, anclan el pelo en la piel. El folículo piloso comprende dos capas en sección transversal, a saber, una vaina de folículo piloso epitelial exterior y otra interior. La vaina de la raíz del pelo epitelial exterior representa una hendidura en forma de embudo de la capa basal de la piel, que forma una cubierta para la raíz del pelo. La vaina de la raíz del pelo epitelial interno comprende la raíz del pelo y está compuesta por tres capas, a saber, una capa interna (cutícula), una capa intermedia (capa de Huxley) y una capa externa (capa de Henle). En el folículo piloso desembocan glándulas que producen y eliminan sebo y otras sustancias como, por ejemplo, fragancias. En las proximidades de las glándulas sebáceas, los músculos del folículo piloso, los músculos arrectores pilorum, también se adhieren al folículo piloso, que puede erizar el pelo y son responsables de la llamada “piel de gallina”. Además, las fibras nerviosas finas terminan en el folículo piloso, que sirven al sentido del tacto y controlan los músculos del folículo piloso. De acuerdo con la invención, la expresión “folículo piloso” también incluye una estructura de microfolículos que es incompleta en comparación con los microfolículos naturales y que puede incluir la vaina de la raíz del pelo epitelial externa y/o interna, pero sin contener otros tipos de células como células musculares o nerviosas, vasos sanguíneos, etc., de modo que el folículo piloso presenta un tamaño reducido en comparación con los folículos pilosos naturales. Un folículo piloso presenta una forma tridimensional, posiblemente espacialmente limitada, que es similar a la apariencia tridimensional de un folículo piloso fisiológico. Los folículos pilosos pueden presentar una estructura polar, por ejemplo, una protuberancia puntiaguda en un lado del folículo piloso, que recuerda a las estructuras de la morfogénesis capilar temprana.

Por tanto, el folículo piloso utilizado puede ser un folículo piloso aislado de un tejido. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para eliminar folículos pilosos del tejido. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente del tejido de acuerdo con los estándares de buenas prácticas médicas. Preferiblemente, los folículos pilosos se eliminan del tejido de modo que permanezcan sustancialmente intactos, es decir, sin daños. La eliminación de los folículos pilosos del tejido se puede realizar, por ejemplo, de la siguiente manera: i) separación de la epidermis de la dermis que está debajo o del tejido graso en el tejido, preferiblemente utilizando un bisturí; ii) preparación del pelo de la dermis o del tejido graso del tejido. El pelo eliminado incluye el folículo piloso en su extremo proximal. Opcionalmente, antes de la etapa ii), la dermis o el tejido graso se pueden comprimir para que los folículos pilosos presentes en ellos se puedan disecar más fácilmente. La compresión se puede realizar con pinzas, por ejemplo. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente bajo un microscopio.

El tejido del que se pueden obtener los folículos pilosos proviene de un mamífero. Este mamífero puede ser un ser humano, mono, cerdo, perro, gato o roedor, preferiblemente un ser humano. Por tanto, el mamífero representa un donante del tejido contenido en el folículo piloso.

El tejido comprende preferiblemente piel. El tejido se puede obtener de cualquier región del cuerpo con pelo, preferiblemente de la cabeza, cejas, barba, área genital, pierna u otras regiones del cuerpo. El tejido se obtiene preferiblemente mediante biopsia.

Antes de retirar los folículos pilosos del tejido, este tejido puede someterse a una o más etapas de limpieza para eliminar del tejido las posibles sustancias que interfieran.

Preferiblemente, se utilizan folículos pilosos alogénicos para el equivalente de piel, es decir, el donante del tejido del que se aíslan los folículos pilosos y el receptor del equivalente de piel que comprende los folículos pilosos aislados pertenecen a la misma especie, es decir, por ejemplo, tanto los donantes como los receptores son humanos. Se prefiere usar particularmente folículos pilosos autólogos para el equivalente de piel, es decir, que el donante del tejido del que se aíslan los folículos pilosos y el receptor del equivalente de piel que comprende los folículos pilosos aislados son la misma persona, por ejemplo, el mismo ser humano.

También es posible que la formación de folículos pilosos tenga lugar en las cavidades de la matriz dérmica. Para ello, en la etapa b) del procedimiento según la invención, se introduce al menos un germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica.

La expresión “germen del folículo piloso” se refiere a una etapa temprana de un folículo piloso a partir del cual se desarrolla este folículo piloso. El germen del folículo piloso presenta preferiblemente al menos la mitad del tamaño de una papila de piel fisiológica (DP, abreviatura de papila dérmica en inglés) de un folículo piloso después de su aislamiento. El germen del folículo piloso también tiene preferiblemente la forma aproximada de una DP fisiológica de un folículo piloso después de su aislamiento. Los gérmenes del folículo piloso se componen de aproximadamente 2 a 20.000 células, preferiblemente de 10 a 15.000, de manera especialmente preferible, de 1.000 a 10.000, de manera muy especialmente preferible, de 1.500 a 5.000 células.

El germen del folículo piloso incluye fibroblastos de la papila cutánea (DPF, abreviatura de fibroblastos de la papila capilar dérmica en inglés). El germen del folículo piloso también puede contener fibroblastos de tejido conectivo (CTSF, abreviatura de fibroblastos de la vaina de tejido conectivo en inglés). Opcionalmente, el germen del folículo piloso comprende al menos una población celular adicional seleccionada de células endoteliales, células de fracciones vasculares estromales (SVF), queratinocitos (KC), melanocitos (MC) o fibroblastos como, por ejemplo, CTSF.

Los DPF para el germen del folículo piloso se aíslan de al menos una DP, originándose la DP de al menos un folículo piloso.

Los métodos para la obtención de DP o DPF son conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en las publicaciones EP 2274419 B1 y DE 101 62814 B4. La provisión de la DP del folículo piloso y el aislamiento del DPF de la DP puede llevarse a cabo, por ejemplo, de la siguiente manera: los folículos pilosos aislados son fijados, por ejemplo, al tallo del pelo con pinzas y la vaina de tejido conectivo es separado, por ejemplo, diametralmente del tallo del pelo con otro par de pinzas para que el bulbo se dé la vuelta al revés y el DPF y el tallo del pelo con la matriz capilar estén expuestos. Esto permite que la DP se separe del resto del folículo piloso que, por ejemplo, se puede hacer con una aguja o una cánula.

A continuación, las DP aisladas se transfieren, por ejemplo, a un recipiente de cultivo celular y se fijan mecánicamente en la superficie del recipiente de cultivo celular. Preferiblemente, los DPF se obtienen bloqueando mecánicamente la DP aislada en el fondo del recipiente de cultivo celular, por ejemplo, utilizando una punta de aguja o un bisturí. La morfología de la DP sigue siendo aproximadamente la misma, pero la lámina basal de la DP está ligeramente perforada para que el DPF pueda migrar fuera de la DP. El DPF también se puede obtener de la DP utilizando separación enzimática.

Existe la posibilidad de que los DPF sean intercultivados después de su aislamiento y antes de su uso en el procedimiento según la invención, por ejemplo, para reproducirlos. De manera correspondiente, el DPF usado en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser descendientes o clones del DPF originalmente aislado.

Los folículos pilosos de los que se aíslan las DP y los DPF proceden del tejido. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para eliminar folículos pilosos del tejido. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente del tejido de acuerdo con los estándares de buenas prácticas médicas. Preferiblemente, los folículos pilosos se eliminan del tejido de modo que permanezcan sustancialmente intactos, es decir, sin daños. Los folículos pilosos se pueden eliminar del tejido, por ejemplo, como sigue: i) separación de la epidermis de la dermis subyacente o tejido graso en el tejido, preferiblemente usando un bisturí; ii) preparación del pelo de la dermis o del tejido graso del tejido. El pelo eliminado incluye el folículo piloso en su extremo proximal. Opcionalmente, antes de la etapa ii), la dermis o el tejido graso se pueden comprimir para que los folículos pilosos presentes en ellos se puedan disecar más fácilmente. La compresión se puede realizar con pinzas, por ejemplo. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente bajo un microscopio.

El tejido del cual se pueden obtener los folículos pilosos, por ejemplo, para el aislamiento de la DP o DPF, procede de un mamífero. Este mamífero puede ser un ser humano, mono, cerdo, perro, gato o roedor, preferiblemente un ser humano. Por tanto, el mamífero representa un donante del tejido contenido en el folículo piloso, siendo particularmente preferido el mamífero un paciente humano que sufre alopecia.

Antes de eliminar del tejido los folículos pilosos, por ejemplo, para el aislamiento de la DP o DPF, este tejido puede someterse a una o más etapas de limpieza con el fin de eliminar del tejido las posibles sustancias interferentes existentes.

Además del DPF, el germen del folículo piloso también puede contener fibroblastos de tejido conectivo (CTSF). El CTSF para el germen del folículo piloso proviene de al menos un folículo piloso.

El aislamiento del CTSF del folículo piloso se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la siguiente manera: los folículos pilosos aislados son fijados, por ejemplo, al tallo del pelo con pinzas y la vaina de tejido conectivo es separado, por ejemplo, diametralmente del tallo del pelo con otro par de pinzas, de manera que el bulbo se invierte. Esto permite que la parte proximal del bulbo con los CTSF se separe del resto del folículo piloso, lo que se puede hacer, por ejemplo, con una aguja o una cánula.

Existe la posibilidad de que los CTSF después de su aislamiento y antes de su uso en el procedimiento según la invención sean intercultivados, por ejemplo, para replicarlos. De manera correspondiente, los CTSF utilizados en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser descendientes o clones del CTSF originalmente aislado.

Los folículos pilosos de los que se aíslan los CTSF provienen de tejido. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para eliminar folículos pilosos del tejido. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente del tejido de acuerdo con los estándares de buenas prácticas médicas. Preferiblemente, los folículos pilosos se eliminan del tejido de modo que permanezcan sustancialmente intactos, es decir, sin daños. Los folículos pilosos se pueden eliminar del tejido, por ejemplo, de la siguiente manera: i) separación de la epidermis de la dermis subyacente o tejido graso en el tejido, preferiblemente usando un bisturí; ii) preparación del pelo de la dermis o del tejido graso del tejido. El pelo eliminado incluye el folículo piloso en su extremo proximal. Opcionalmente, antes de la etapa ii), la dermis o el tejido graso se pueden comprimir para que los folículos pilosos presentes en ellos se puedan disecar más fácilmente. La compresión se puede realizar con pinzas, por ejemplo. Los folículos pilosos se eliminan preferiblemente bajo un microscopio.

El tejido del cual se pueden obtener los folículos pilosos, por ejemplo, para el aislamiento de los CTSF, proviene de un mamífero. Este mamífero puede ser un ser humano, mono, cerdo, perro, gato o roedor, preferiblemente un ser humano. Por tanto, el mamífero representa un donante del tejido contenido en el folículo piloso, siendo particularmente preferente el mamífero un paciente humano que sufre de alopecia.

Antes de eliminar del tejido los folículos pilosos, por ejemplo, para el aislamiento de los CTSF, este tejido puede someterse a una o más etapas de limpieza con el fin de eliminar del tejido las posibles sustancias interferentes existentes.

Los DPF y CTSF se obtienen así de folículos pilosos aislados. En este caso, los DPF y CTSF se pueden obtener del mismo folículo piloso. Los DPF y CTSF también se pueden obtener de diferentes folículos pilosos. Si los DPF y los CTSF se obtienen de diferentes folículos pilosos, estos folículos pilosos pueden haberse aislado del mismo tejido, por ejemplo, de un tejido que se tomó, por ejemplo, de la zona del cuello de la cabeza de un donante. Si los DPF y los CTSF se obtienen de diferentes folículos pilosos, estos folículos pilosos también pueden haber sido aislados de diferentes tejidos, de modo que, por ejemplo, uno de los tejidos, por ejemplo, se extrajo del área del cuello de la cabeza de un donante y el otro tejido, por ejemplo, de la barba de un donante. En este último caso, el donante puede ser el mismo donante o un donante diferente. Si es un donante diferente, este es preferiblemente un donante alogénico. Preferiblemente es el mismo donante, es decir, autólogo.

Además de los DPF y opcionalmente de los CTSF, el germen del folículo piloso también puede contener al menos una población celular adicional seleccionada de células endoteliales, células de fracciones vasculares estromales (SVF), queratinocitos (KC), melanocitos (MC) o fibroblastos. Las células endoteliales (EZ) que pueden estar presentes en el germen del folículo piloso pueden aislarse usando procedimientos conocidos en la técnica anterior para obtener EZ.

Las EZ pueden obtenerse de vasos linfáticos o vasos sanguíneos, preferiblemente de vasos linfáticos o vasos sanguíneos que se encuentran cerca de los folículos pilosos. Las EZ se obtienen preferiblemente de un donante humano. En forma especialmente preferible, se trata en este caso de EZ autólogas. Existe la posibilidad de que las EZ sean intercultivadas después de su aislamiento y antes de su uso en el procedimiento según la invención, por ejemplo, para reproducirlas. De manera correspondiente, las EZ usadas en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser descendientes o clones de las EZ originalmente aisladas.

El germen del folículo piloso puede comprender células de la fracción vascular estromal (SVF). Las FVS comprenden diferentes poblaciones celulares como precursoras de células grasas (preadipocitos), células endoteliales, células musculares endoteliales, fibroblastos, macrófagos o células sanguíneas. La FVS se puede obtener, por ejemplo, mediante escisión de tejido graso o liposucción. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para obtener las SVF. El aislamiento de FVS a partir de tejido adiposo se describe, por ejemplo, en la publicación WO 2014036094 A1. La SVF se obtiene preferiblemente de un donante humano, de manera particularmente preferida es una SVF autóloga. Es posible que ciertos componentes de la SVF se eliminen de la SVF después de haber sido obtenidos del donante, lo que puede realizarse mediante una o más etapas de lavado, limpieza o aislamiento o separando o eliminando deliberadamente los componentes. Asimismo, es posible intercultivar las SVF después de su aislamiento y antes de su uso en el procedimiento según la invención, por ejemplo, para replicarlas. De manera correspondiente, las SVF utilizadas en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser descendientes o clones de la SVF originalmente aislada. Debido a la presencia de SVF, se logra una multiplicación celular aumentada o más rápida de DPF y CTSF y la formación de los gérmenes del folículo piloso se acelera en consecuencia.

Además, el germen del folículo piloso puede comprender queratinocitos (KC), melanocitos (MC) y/o CTSF. Los KC, MC y/o CTSF no tienen que provenir de un folículo piloso, sino que se pueden obtener de otros tejidos de mamíferos, por ejemplo, la piel. Los procedimientos para obtener KC, MC y CTSF son conocidos por el experto en la técnica y se encuentran, por ejemplo, en la publicación DE 101 62 814 B4 y en Toma et al., Stem cells 23, 727-37 (2005), Barrandon and Green, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5390 - 4 (1985) Tobin et al., J. Invest. Dermatology 104 (1), 86-88 (1995) y Magerl et al., Methods Exp. Dermat. 11, 381 - 385 (2002). La al menos una población celular adicional se puede obtener preferiblemente de un folículo piloso y/o se obtiene de un folículo piloso.

Los KC, MC y/o CTSF se pueden obtener del mismo folículo piloso. Los KC, MC y/o CTSF también se pueden obtener de diferentes folículos pilosos. Si los KC, MC y/o CTSF se obtienen de diferentes folículos pilosos, estos folículos pilosos pueden haber sido aislados del mismo tejido, por ejemplo, de un tejido que se extrajo, por ejemplo, de la zona del cuello de la cabeza de un donante. Si los ^{K c , M c}y/o CTSF se obtienen de diferentes folículos pilosos, estos folículos pilosos también pueden haberse aislado de diferentes tejidos, de modo que, por ejemplo, uno de los tejidos se extrajo, por ejemplo, del área del cuello de la cabeza de un donante y otro tejido se extrajo, por ejemplo, de la barba de un donante. En este último caso, el donante puede ser el mismo donante o un donante diferente. Si es un donante diferente, este es preferiblemente un donante alogénico. Preferiblemente es el mismo donante, es decir, autólogo.

La al menos una población celular adicional se obtiene de manera particularmente preferida del mismo folículo piloso del que se aisló la DP. Es posible que los KC, MC y/o CTSF, después de su aislamiento y antes de su uso en el procedimiento según la invención para producir los folículos pilosos, sean intercultivados, por ejemplo, para reproducirlos. De manera correspondiente, los KC, MC y/o CTSF usados en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser descendientes o clones de los KC, ^{M c}y/o CTSF originalmente aislados.

Preferiblemente, el germen del folículo piloso comprende DPF y CTSF. El germen del folículo piloso comprende de manera especialmente preferible, DPF, CTSF y SVF. El germen del folículo piloso comprende, de manera muy especialmente preferible, DPF, CTSF, SVF, KC y MC.

El germen del folículo piloso puede comprender un recubrimiento que contiene una o más proteínas de matriz extracelular diferentes tales como colágeno IV, fibronectina y/o laminina. Este recubrimiento puede ser creado por el propio DPF o CTSF mientras forman el germen del folículo piloso. Alternativa o adicionalmente, el germen del folículo piloso también puede recubrirse con una o más proteínas de matriz extracelular diferentes después de que se haya formado.

Si se introduce un germen de folículo piloso en la matriz dérmica en la etapa b) del procedimiento según la invención, esta etapa b) se puede realizar, por ejemplo, de la siguiente manera: las cavidades de la matriz dérmica se recubren preferiblemente primero con proteínas de la matriz extracelular y luego se pueblan con DPF y/o CTSF. Preferiblemente, CTSF se introducen primero en las cavidades y luego DPF. A continuación, se pueden introducir opcionalmente EZ y/o SVF en las cavidades. En una etapa siguiente, se añaden MC y/o KC, preferiblemente MC y KC.

La introducción de al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la matriz dérmica crea un sustituto de la piel. Según la invención, se entiende por “sustituto de la piel” un sustituto de la piel que no es totalmente adecuado. El sustituto de piel se entiende como un producto intermedio a partir del cual se fabrica el equivalente de piel.

Preferiblemente, después de la etapa b), el sustituto de piel se incuba durante al menos 10 minutos antes de que se lleve a cabo la etapa c). La incubación se lleva a cabo preferiblemente durante 20 minutos a 48 horas, de manera especialmente preferible, durante 30 minutos a 24 horas, de manera especialmente preferible, durante 1 hora a 12 horas.

En la siguiente etapa c) del procedimiento según la invención, al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos se añade al sustituto de piel para producir el equivalente de piel. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para obtener adipocitos, células nerviosas y células glandulares.

Preferiblemente, después de la etapa c) del procedimiento de acuerdo con la invención, el equivalente de piel se incuba durante al menos 10 minutos antes de que se use adicionalmente el equivalente de piel, por ejemplo, como un trasplante o para probar sustancias. La incubación se lleva a cabo preferiblemente durante al menos 20 minutos, de manera especialmente preferible, durante 1 hora a 21 días, de manera especialmente preferible, durante 5 a 15 días, de manera muy especialmente preferible, durante 8 a 12 días.

La presente invención también se refiere a un equivalente de piel que se produce mediante el procedimiento según la invención.

La presente invención también abarca un injerto que comprende una cantidad eficaz del equivalente de piel, opcionalmente junto con adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

En una realización, el procedimiento para producir el equivalente de piel comprende las etapas: a) producir una matriz dérmica que contiene una primera capa y una segunda capa, que comprende las etapas: i) proporcionar la primera capa; ii) proporcionar una solución polimerizable que comprende un líquido y al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico; iii) añadir la solución polimerizable a la primera capa; iv) polimerizar la solución para formar la segunda capa; v) comprimir la segunda capa, en la que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se unen para formar la matriz dérmica; y vi) introducir al menos una cavidad en la matriz dérmica; b) introducir al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica producida en la etapa a) para producir un sustituto de piel; y c) añadir al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos al sustituto de piel para producir el equivalente de piel. La primera capa es preferiblemente una sustancia para la piel artificial, de manera particularmente preferida la sustancia para la piel artificial comprende colágeno y/o elastina, de manera particularmente preferible, colágeno y elastina.

La solución polimerizable comprende cómo polímero colágeno, preferiblemente colágeno de tipo I. Particularmente preferiblemente, la solución polimerizable comprende además células de tejido conjuntivo, preferiblemente fibroblastos.

Antes de la etapa iv), el polímero se estructura preferiblemente en la solución polimerizable por movimiento.

La polimerización de la solución para formar la segunda capa en la etapa iv) y la introducción de al menos una cavidad en la matriz dérmica en la etapa vi) preferiblemente se llevan a cabo simultáneamente. La etapa iv) y la etapa vi) se llevan a cabo de manera especialmente preferible, simultáneamente y con movimiento, de manera especialmente preferible, con movimiento de giro.

La segunda capa se comprime preferiblemente en la etapa v) mediante centrifugación.

Preferiblemente, en la etapa b), se introduce al menos un germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica, estando recubierta la cavidad de manera particularmente preferible con proteínas de la matriz extracelular antes de que se introduzcan CTSF y luego DPF en la cavidad. Preferiblemente, EZ y/o SVF también se introducen en la cavidad. Luego se añaden MC y/o KC, preferiblemente MC y KC, a las cavidades.

En la etapa c), se añaden preferiblemente EZ, adipocitos, MC y/o KC al sustituto de piel generado en la etapa b), preferiblemente EZ, adipocitos, MC y KC. Las células nerviosas y las células de las glándulas se añaden de manera particularmente preferida al sustituto de la piel.

La presente invención también se refiere al uso del equivalente de piel que se ha producido mediante el procedimiento según la invención y/o al trasplante que comprende el equivalente de piel para la restauración terapéutica de la piel o el tratamiento de cantidades reducidas de piel. Aquí se prefiere que se utilicen células alogénicas para la producción del equivalente de piel, lo que significa que el donante de las células utilizadas y el receptor del equivalente de piel producido pertenecen a la misma especie, es decir, que tanto los donantes como los receptores son, por ejemplo, personas. Para el tratamiento terapéutico de una condición de cantidad de piel reducida, se prefiere particularmente que se utilicen células autólogas para producir el equivalente de piel, lo que significa que el donante de las células utilizadas y el receptor del equivalente de piel producido son idénticos, por ejemplo, la misma persona.

La presente invención también se refiere al uso del equivalente de piel según la invención para el ensayo in vitro de sustancias en cuanto a propiedades cosméticas, farmacológicas o tóxicas.

La presente invención también se refiere al uso del equivalente de piel según la invención para pruebas in vitro de sustancias reguladoras de la piel y/o del pelo.

La presente invención también comprende un kit para realizar el procedimiento según la invención. Para ello, el kit puede comprender el equivalente de piel según la invención y/o el trasplante para realizar, por ejemplo, el procedimiento de la invención para la restauración terapéutica de la piel o el tratamiento de una afección de piel reducida o la selección de sustancias. Si es apropiado, el kit también puede contener instrucciones de uso para usar el kit y/o para llevar a cabo el procedimiento según la invención. Además, el kit puede contener otros componentes para la realización del procedimiento según la invención, tales como recipientes de reacción, filtros, soluciones y/u otros medios.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para el cribado in vitro de sustancias con propiedades reguladoras de la piel y/o el pelo, cuyo procedimiento comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra del equivalente de piel; b) dividir la muestra apropiada en porciones; c) incubar al menos una porción con sustancias por ensayar; y d) comparar los parámetros de las propiedades de la piel y/o el pelo en la porción con otra porción que no se incubó con las sustancias.

La presente invención también comprende un sistema de prueba que comprende el equivalente de piel producido según el procedimiento según la invención para la investigación in vitro de las causas de la caída del cabello relacionada con una enfermedad.

La invención se explica a continuación con más detalle en base a ejemplos de realización y las figuras asociadas.

Figuras

Figura 1 Imagen fotográfica de una matriz dérmica.

Figura 2 Imagen fotográfica de un equivalente de piel, un folículo piloso y gérmenes del folículo piloso.

Figura 3 Imagen fotográfica de una forma de impresión para introducir cavidades en una matriz dérmica.

Figura 4 Dibujo esquemático de una forma de impresión para introducir cavidades en una matriz dérmica. A: vista en sección, B: vista en planta.

Figura 5 Dibujo esquemático de una forma de impresión para introducir cavidades en una matriz dérmica. A: vista en planta de la parte superior del formulario de impresión, B: vista en planta de la parte inferior del formulario de impresión, C y D: vista lateral.

Ejemplos

Aislamiento de los diferentes tipos de células de los folículos pilosos

El aislamiento de DPF, CTSF, MC, KC del folículo de pelo humano tiene lugar en una forma modificada de los protocolos estándar (por ejemplo, descritos en “Magerl et al.”). Los folículos pilosos aislados de las biopsias con sacabocados o los folículos pilosos preparados de los trasplantes de pelo FUT se fijan al tallo del pelo con pinzas y la vaina de tejido conectivo se corta y se separa cuidadosamente de modo diametral con otro par de pinzas para que el bulbo se voltee del revés y la papila dérmica y el tallo del pelo con la matriz del pelo queden expuestos. Como resultado, la parte proximal del bulbo con los fibroblastos de la vaina de tejido conectivo y la papila dérmica se pueden separar muy fácilmente del resto del folículo piloso con la ayuda de una aguja/cánula. El tallo del pelo, que contiene los queratinocitos y melanocitos de la matriz capilar necesarios, está preparado en forma óptima para su posterior cultivo.

Las papilas dérmicas y las vainas de tejido conjuntivo extraídas de esta manera de los folículos pilosos extraídos se recogen cada una en un recipiente separado con medio. DPF y CTSF se separan de la asociación de tejidos y se aíslan por medio de una digestión suave del tejido utilizando un disociador de tejidos y el kit de extracción asociado (por ejemplo, disociador gentleMACS N° 130-093-235, kit de disociación de piel completa N° 130-101-540, Miltenyi Biotec). Para ello, los fragmentos de tejido aislados (papila dérmica, vaina de tejido conjuntivo y tallo piloso con células epiteliales/neuroectodérmicas), 435 ml de tampón L y una mezcla de enzimas de 12,5 mg de enzima P y/o 4,50 mg de enzima D y/o 2,5 se colocan mg de enzima A en un tubo C gentleMACS y se mezclan cuidadosamente.

La muestra se incuba en un baño de agua a 37 °C durante 1-3 horas o durante la noche, en donde los tiempos de incubación más largos aumentan el rendimiento celular. Después de la incubación, la muestra se diluye añadiendo 0,5 ml de medio de cultivo celular frío. El tubo C se cierra y se fija al revés en la manga del disociador gentleMACS. A continuación, se ejecuta el programa “h_skin_01”. Una vez finalizado el programa, se agrega una breve etapa de centrifugación para recolectar el material de muestra en la parte inferior. Las células se pueden lavar con medio fresco y la suspensión celular se puede separar a través de un filtro de 70 |jm. Se puede prescindir de la adición de enzimas como se describió anteriormente, que son indeseables en la terapia autóloga directa, con la ayuda de más ciclos de disociación, aunque entonces deben esperarse rendimientos celulares más bajos.

Producción de células de la fracción vascular estromal (FVS)

Una fracción de 1 litro de una liposucción tumescente de grasa abdominal subcutánea o de la cadera se extrae y procesa, por ejemplo, con el procedimiento establecido PureGraft™ (Cytori GmbH, Suiza). Se centrifuga y concentra para eliminar la solución tumescente. Luego se digiere en colagenasa NB 6 al 0,15% (p/v) grado GMP de Clostridium histolyticum (0,12 U/mg de colagenasa; SERVA Electrophoresis GmbH) diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco) durante 60 minutos a 37 °C. Después de centrifugar a 180 g durante 10 minutos, se descarta la capa rica en lípidos y se lava el sedimento celular una vez con PBS. Los eritrocitos se disuelven mediante incubación durante 2 minutos en tampón de lisis (cloruro de amonio 0,15 M, Sigma-Aldrich). La fracción vascular estromal (FVS) obtenida se recoge en medio completo (KM, Gibco).

Preparación de un equivalente de piel

El equivalente de la dermis se construye sobre la base de una matriz de colágeno/elastina de 2 mm de espesor (Matriderm®, Dr. Suwelack Skin & Health Care AG). Una pieza se perfora con un punzón redondo y se transfiere a un Transwell®. Se cubre con hielo con una solución de colágeno I que contiene fibroblastos dérmicos. El sello de silicona con los cilindros se gira ligeramente. Luego, el gel se polimeriza durante 15 minutos y luego se transfiere a una centrífuga. Después de la centrifugación, se elimina el agua y las cavidades formadas se recubren una tras otra con ECM y se colonizan las células del folículo piloso.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir un equivalente de piel, que comprende las etapas de:

a) producir una matriz dérmica que contiene una primera capa y una segunda capa, que comprende las etapas de: i) proporcionar la primera capa;

ii) proporcionar una solución polimerizable que comprende un líquido y al menos un polímero seleccionado de colágeno, elastina y/o ácido hialurónico;

iii) añadir la solución polimerizable a la primera capa;

iv) polimerizar la solución para formar la segunda capa;

v) comprimir la segunda capa, en la que la compresión reduce el contenido de fluido de la segunda capa y la primera capa y la segunda capa se unen para formar la matriz dérmica; y

vi) introducir al menos una cavidad en la matriz dérmica;

b) introducir al menos un folículo piloso y/o germen de folículo piloso en la al menos una cavidad de la matriz dérmica producida en la etapa a) para producir un sustituto de piel; y

c) añadir al menos una población celular adicional seleccionada de fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, células nerviosas, células glandulares, melanocitos o queratinocitos al sustituto de piel para producir el equivalente de piel.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la primera capa comprende una sustancia cutánea natural o una sustancia cutánea artificial.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la primera capa no contiene células vivas.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución polimerizable contiene adicionalmente células.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, antes de la etapa iv), el polímero en la solución polimerizable se estructura por movimiento.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la compresión de la segunda capa se realiza mediante centrifugación, sedimentación o acción de fuerza mecánica.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas iv), v) o vi) del procedimiento tienen lugar una tras otra y/o simultáneamente.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la introducción de la al menos una cavidad en la matriz dérmica en la etapa vi) tiene lugar durante o después de la polimerización en la etapa iv), preferiblemente durante la polimerización.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la al menos una cavidad se introduce en la matriz dérmica mediante perforación, corte o mediante un molde de impresión.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que las cavidades tienen un diámetro medio de > 0,001 mm a 5 mm, preferiblemente de 0,005 mm a 1 mm, de manera especialmente preferible, de 0,01 mm a 0,08 mm, de manera muy especialmente preferible, de 0,02 mm a 0,06 mm, con especial preferencia de 0,05 mm a 0,04 mm.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las cavidades tienen una profundidad de > 0,05 mm a 10 mm, preferiblemente de 0,1 mm a 8 mm, de manera particularmente preferible, de 0,15 mm a 6 mm, de manera muy particularmente preferible, de 0,2 mm a 4 mm, con especial preferencia de 0,5 mm a 2,5 mm.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una, varias o todas las cavidades de la matriz dérmica se recubren con proteínas de la matriz extracelular antes de introducir el folículo piloso y/o el germen del folículo piloso en la etapa b).

13. Equivalente de piel producido por el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Trasplante que comprende una cantidad eficaz de equivalente de piel de acuerdo con la reivindicación 13, opcionalmente junto con adyuvantes farmacéuticamente tolerables.

15. Procedimiento para la selección in vitro de sustancias con propiedades reguladoras de la piel y/o el pelo, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra del equivalente de piel de acuerdo con la reivindicación 13;

b) dividir la muestra en porciones;

c) incubar al menos una porción con sustancias por ensayar; y

d) comparar los parámetros de las propiedades de la piel y/o del pelo en la porción con otra porción que no fue incubada con las sustancias.