CN116920263A - 一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针及其制备方法和应用，制备步骤包括：一、制备泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体；二、冷冻水凝胶合成：泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体，加入含有光引发剂的缓冲液A，加热溶解后得到甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶，加入细胞冻存液CryoStor CS10得到冷冻水凝胶；三、制备冷冻微针：(1)冷冻针尖灌注，(2)冷冻基座填充，(3)程序性降温冷冻，脱模，制得冷冻微针。本发明冷冻微针可以快速有效的穿透皮肤，以一种微创和无痛的方式将多种干细胞或类器官精确递送到真皮层；分段式的冷冻微针，其纯液体的基座迅速融化，不会对皮肤造成永久性损伤。

Description

一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及属于医疗器械技术领域，具体涉及一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针及其制备方法和应用。
背景技术
一般来说，人类成熟的器官和组织萎缩、坏死后再生能力有限。而皮肤作为人体最大的器官，经历了创伤后可以自我修复，但成人的皮肤恢复能力有限。与婴儿皮肤不同，成人皮肤的自我修复一般会产生疤痕组织。尽管瘢痕形成实现了预防感染和防止脱水的基本功能，但瘢痕通常会阻碍皮肤功能的完全恢复，并且不能使皮肤附属器，如毛囊、汗腺和皮脂腺再生。其中毛囊的再生是皮肤最佳修复的标志。成人皮肤瘢痕和毛囊损伤可能导致永久性脱发。脱发是指局部或弥漫性区域的毛发缺失或脱落。雄激素性秃发(AGA)是最常见的非瘢痕性秃发，可导致皮肤固有功能的损伤，对患者的心理健康和生活质量产生巨大影响。遗憾的是，AGA的常规治疗不能增加毛囊的来源；因此，迫切需要开发新的再生和重建毛囊的方法。
为了推进毛囊替代疗法，科学家将工程和生命科学的原理相结合，开发可恢复、维持或改善组织功能的生物替代品。尤其是用于毛囊重建的组织工程方法具有良好的前景。经典的啮齿类动物的毛囊重建方法，如注射法、小室法和皮瓣法，已成功重建出了毛发。在注射法中，细胞通过在注射器中混合，并注射到皮肤的皮下层，之后它们根据注射体积形成不同大小的囊状结构。小室法是在体内产生全层皮肤缺损，在创面内放置一个硅酮腔，然后将细胞混合物注入腔室，使缺损的皮肤以及毛囊再生。同样，皮瓣法需要在皮肤中分离出全层带蒂皮瓣，然后，将覆盖有真皮细胞的完整表皮皮肤片置于无菌硅酮膜上，将硅酮膜植入皮瓣下，用组织粘合剂密封伤口。这三种经典的毛囊重建方法均可获得由细胞分化而来的新生毛囊，对于分析细胞间信号相互作用和发育生物学研究。然而，这三种方法都有一些局限性。几乎所有通过补片实验重建的毛囊都植入在解剖学异常的位置，因此无法突破皮肤表面形成生理导向的毛囊。虽然小室法产生的毛囊在形态上与天然毛囊相似，但它需要最大数量的细胞，并产生侵袭性伤口，这带来了感染风险和低耐受性的缺点。同样，皮瓣试验需要使用完整的表皮片和手术干预，有损伤和感染的风险。此外，植入硅酮片可引起异物炎症反应。最后，在三种经典的高频重建方法中，重建毛发的数量和位置难以控制。
微针技术是一种新兴的、微米级的、微创的递送方法。利用微针，靶向药物或小分子可以通过在角质层中无痛形成临时微通道递送到特定的皮肤层和其他组织。微米大小的微针不能到达位于真皮深处的疼痛感受器，所以它比皮下注射针引起的疼痛更少。然而，微针的生产需要使用特定的材料和工艺，以确保足够的机械强度来成功的经皮穿刺。微针已成功递送药物、金属离子、气体和纳米粒子等物质。该技术为组织器官重建提供了一种潜在的新策略。
然而，在传统微针的制备工艺中，通过使用水凝胶为材料进行微针的制备时，为了获得具有一定机械强度实现穿透皮肤角质层的微针，在制造微针的过程中需要一定时间的热烘干燥过程，通常是室温干燥24-48小时，或是30-35℃干燥5-6小时，在干燥的过程经由水凝胶中的水分蒸发，提升水凝胶的浓度，使水凝胶网络更加密集，从而使微针的机械强度得到提升。而干细胞的活性对周围环境非常敏感，热烘干的过程，在不适宜生存的温度以及逐渐缺乏水分以及养分的情况下，难以使干细胞维持良好活性，也因此目前还没有使用传统烘干法制备搭载活体有机物的微针出现，且目前能够在保持高机械强度的同时维持活体细胞的活力和干性的微针尚未开发出来。
类器官是一种基于3D体外细胞培养系统建立的，与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型；这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态；而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。类器官模型的构建通过运用组织特定胚层来源的细胞通过离心压缩、挤压至细胞外基质中构建分层的三维共培养的模型已在口腔、肠道、呼吸系统广泛研究，在毛囊组织工程及再生领域中同样也受到广泛关注。使用皮肤来源的细胞通过构建类器官后植入，能够成功重建毛囊，有望扩增毛囊的来源。然而，毛囊类器官的体内植入过程中面临着许多困难，如无法一步形成毛囊、需要制造有创的手术创伤、模型的构建以及植入操作复杂等。为了克服这些问题，需要一种方便、微创、高效和能够维持细胞活力的递送方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针的制备方法，包括如下步骤：
一、制备泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体；
二、冷冻水凝胶合成：
取步骤一制备的泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体，加入含有光引发剂的缓冲液A，加热溶解后得到浓度为80～120mg/ml的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶；取甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶，加入细胞冻存液CryoStor CS10，混匀，除菌，得到无菌的冷冻水凝胶；甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶与CryoStor CS10的体积比为1:0.8～1.2；
三、制备冷冻微针，包括如下步骤：
(1)冷冻针尖灌注：取制备的含有活体干细胞的溶液离心弃去上清液，用制备的冷冻水凝胶重悬细胞，将载有活细胞的冷冻水凝胶注入到无菌微针模具的针腔中，然后将微针模具离心除去针尖中滞留的空气并使混悬液中的细胞在模具针尖尖端密集；
(2)冷冻基座填充：在4～8℃环境下进行如下操作：去除微针模具上多余的水凝胶，使用紫外光照射微针针尖部分使原料交联，然后将细胞冻存液CryoStor CS2添加到微针模具中以填充基座，然后离心除去针尖中滞留的空气；
(3)程序性降温冷冻：将模具进行程序性降温冷冻，脱模，制得冷冻微针。
所述步骤(3)中程序性降温冷冻的具体方法为：将模具在-20℃～-30℃冷冻2～4小时，在低温下将冷冻微针从模具上脱模，然后在-70℃～-90℃冷冻2～4小时，最后在液氮中冷冻1～3小时，即制得冷冻微针。
步骤一中以甲基丙烯酸酐和明胶为原料制备泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体；
所述明胶选自猪皮明胶粉、鱼皮明胶粉、鱼鳞明胶粉、牛皮明胶粉、牛骨明胶粉、鸡皮明胶粉；甲基丙烯酸酐和明胶的使用量配比为5～7mL:10g，优选为6ml:10g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤二中所述光引发剂选自苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙、Irgacure-2959、Irgacure-184、Irgacure-907，所述缓冲液A为磷酸盐缓冲液或者碳酸氢钠缓冲液或者柠檬酸钠缓冲液；
所述甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的浓度为90～110mg/ml，其中光引发剂的浓度为0.8～1.2mg/ml；甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶与CryoStor CS10的配比为体积比为1:0.9～1.1。
所述步骤三中，
所述步骤(2)冷冻基座填充中，使用紫外光照射微针针尖部分12～60秒使原料交联；
所述步骤(3)程序性降温具体为：将模具在-20℃冷冻2小时，在干冰上将冷冻微针从模具上轻轻剥开放置于无菌容器中，然后在-80℃冷冻2小时，再在-196℃的液氮中冷冻1小时，即得冷冻微针。
所述微针模具的每个针体底部直径为600-800μm，高度为1000-1200μm，针尖-针尖的间距为1500-2500μm。
所述活体干细胞包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞；含有活体干细胞的冷冻水凝胶中细胞含量为0.8～1.4×106mL-1；
优选所述活体干细胞为皮肤干细胞，所述皮肤干细胞包括皮肤表皮干细胞和真皮干细胞，其中皮肤表皮干细胞和真皮干细胞的细胞量比例为1～9:1～9，优选1～5:1～5或者1～3:1～3或者1～2:1～2；
本发明的再一目的是提供一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针，采用上述任一项所述的制备方法制备得到。
本发明的最后一目的是提供上述的冷冻微针在制备用于透皮递送活体干细胞的微针中的应用。
优选地，上述应用技术方案中，所述冷冻微针负载皮肤干细胞，用于重建毛囊治疗脱发。
本发明通过自然环境中的水结冰的物理改变，带来的新的启发，通过低温冷冻的方式能够在实现机械强度的提升的同时，避免使用对干细胞有害的热烘干制备过程。然而，单纯的使用水冷冻成冰进行携带活细胞是存在问题的，因为冻融的过程中，冰晶会对细胞有所损伤。虽然冰晶的形成是不可避免的，但细胞冻存液可用于增强溶液的低温耐受性，减少对冻存细胞的损伤。本发明选用含有二甲基亚砜是的细胞冻存液制备微针，在细胞冷冻过程中，二甲基亚砜增加了细胞膜的孔隙率，使水可以更自由地流过细胞膜；此外，二甲基亚砜可以通过增加细胞内溶质浓度来阻止水晶体的形成，从而帮助低温下的水的玻璃化，减少细胞损伤；实现微针负载、递送活细胞的目的。
本发明的有益效果是：
在本发明中，我们构建了用于毛囊重建的负载类器官的分段式冷冻微针，通过优化细胞冻存液和甲基丙烯酸化明胶，使用含二甲基亚砜的细胞冻存液以及甲基丙烯酸化明胶合成开发了一种冷冻凝胶，该冷冻凝胶既适用于微针的制备，也适用于维持干细胞存活。由冷冻凝胶制备的微针具有强大的机械强度，可以快速有效的穿透皮肤，以一种微创和无痛的方式将类器官精确递送到真皮层。分段式的冷冻微针，其纯液体的基座迅速融化，不会对皮肤造成永久性损伤。由冷冻凝胶制备的冷冻微针，其搭载的毛囊类器官在皮肤内经历了一系列发育过程，最终重建成熟的毛囊。重建的毛发能够以仿生的形式突破皮肤表面并具有结构及功能的完整，稳定重建了毛乳头细胞、交感神经、竖毛肌等结构。
附图说明
图1是冷冻水凝胶和甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的傅里叶红外光谱图。
图2是本发明的冷冻微针的制备方法流程图。
图3是本发明冷冻微针的结构示意图。
图4是本发明冷冻微针的实物图。
图5是本发明的冷冻微针和热烘干制备的传统微针的扫描电子显微镜图。
图6是本发明的冷冻微针室温下融化过程。
图7是本发明的冷冻微针压缩后形态。
图8是本发明的冷冻微针及融化后微针的机械强度检测结果。
图9是本发明的的冷冻微针及融化后微针的弹性模量统计结果。
图10是本发明的冷冻微针透皮递送细胞组织学切片图。
图11是本发明冷冻微针及传统烘干法制备的微针中活细胞与死细胞的分布。
图12是本发明冷冻微针及传统烘干法制备的微针中活细胞与死细胞的统计结果。
图13是本发明的冷冻微针中体外培养的毛囊类器官细胞的荧光色踪三维重建图。
图14是本发明的冷冻微针用于动物体内实现突破皮面生长毛发实验图。
图15是平视视角放大观察重建毛囊图。
图16是重建毛囊比例统计图。
图17是重建毛囊进行石蜡病理切片取材及伊红-苏木素染色。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，可商购获得。
主要试剂和材料来源：
A型猪皮明胶粉：CAS号:9000-70-8。
聚二甲基硅氧烷(PDMS)微针模具：采用市售常规PDMS微针模具。
实施例1
一、甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体制备
泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体可以采用商品化的水凝胶前体产品，也可以采用现有技术报道的制备方法制备。
本实施例中甲基丙烯酸酰化明胶是将甲基丙烯酸酐与明胶混合成为甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶溶液，制备方法参照文献(Kong B,ChenY,Liu R,Liu X,Liu C,Shao Z,Xiong L,Liu X,SunW,Mi S.Fiber reinforced GelMAhydrogel to induce theregeneration ofcorneal stroma.Nat Commun.2020Mar 18；11(1):1435.)，合成步骤如下：
(1)称取10gA型猪皮明胶粉以及100mL磷酸盐(PBS)缓冲液，将10gA型猪皮明胶粉加入100mL磷酸盐缓冲液中，置于50℃水浴锅中持续搅拌3小时充分溶解，配置形成100ml/ml的水凝胶前体溶液。
(2)然后，缓慢滴加6mL甲基丙烯酸酐，以0.1mL/分钟的速度加入到水凝胶前体溶液中，在50℃下反应3小时。
(3)随后，加入500mL40℃磷酸盐缓冲液稀释用于终止甲基丙烯酸化反应。
(4)为进一步去除未反应的甲基丙烯酸酐和其他组分(杂质、有害物质)，将磷酸盐缓冲液稀释后的溶液用分子量截止值为12-14kDa的透析袋(Solarbio，货号：YA1051)在40℃下透析7天。每12小时更换一次去离子水。
(5)纯化后的溶液置于-80℃冰箱过夜后，置于-105℃的真空冷冻干燥机中冻干2天，得到不含磷酸盐缓冲液以及残留甲基丙烯酸酐成分的白色多孔泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体，置于干燥密封袋中避光储存。
二、用于搭载活体细胞的冷冻水凝胶合成
按照如下步骤操作：
(1)可光交联的100mg/ml甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶配置：称取100mg的上一步制备的甲基丙烯酸酰化明胶前体泡棉，加入1ml配制好的光引发剂1mg/ml苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(CAS号：85073-19-4)的磷酸盐缓冲液。
(2)置于60℃水浴锅中隔水加热溶解30分钟，每10分钟搅拌一次，得到可在405nm紫外光下进行交联的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶，用于步骤(3)。
(3)具有冷冻保存液的冷冻水凝胶合成：抽取1ml的步骤(2)加热溶解得到的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶，加入1ml的含有100ml/ml二甲基亚砜的CryoStor CS10冻存液(STEMCELLTechnologies，货号：07930，其中含有100mg/ml二甲基亚砜)于离心管中充分混匀，由于等比稀释，最终配置形成终浓度含有50mg/ml甲基丙烯酸酰化明胶及50mg/ml二甲基亚砜的的冷冻水凝胶。
(4)将步骤(3)得到的冷冻水凝胶通过0.22μm细菌滤器过滤，形成无菌的冷冻水凝胶。
三、冷冻水凝胶压片法傅里叶红外光谱检测进行冷冻凝胶成分基团分析
按照如下步骤操作：
(1)取干燥的1mg合成完成的冷冻水凝胶及1mg甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶作为检测样本。
(2)分别与200mg的干燥溴化钾，置于研钵中充分研细并混和均匀研磨至少1分钟。
(3)将混合后的样本放置于压片模具，在15MPa的压力下压维持60s，得到半透明锭片。
(4)将模具套及试样锭片的插板直接插到NicoLET iS 50FT-IR的检测仪器样品架内进行测定。
结果如图1所示：冷冻水凝胶(图上标记为Cryo-GelMA)和甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶(图上标记为GelMA)的傅里叶红外光谱图，图中纵坐标为透光率，横坐标为波数。3317cm-1处为O-H伸缩振动和N-H伸缩振动的叠加谱；3090cm-1处为＝CH2伸缩振动；2952cm-1处为CH3反对称伸缩振动；1642cm-1、1553cm-1、1244cm-1分别是甲基丙烯酸化明胶中的酰胺Ⅰ-Ⅲ的典型特征吸收峰范围；1080cm-1和1037cm-1处C-O-H弯曲振动；695cm-1处对应于水分子的摇摆振动。而冷冻水凝胶其大致光谱及酰胺基团与甲基丙烯酸化明胶相近，由于细胞冻存液的引入，在1018cm-1处出现了最强的特征峰，此处对应于C-O-C反对称伸缩振动根据整体图谱分析为醚基。
四、原代皮肤来源活真皮及表皮细胞提取
按照如下步骤操作：
(1)安乐死新生鼠(品系：C57BL/6)及消毒新生鼠皮肤表面：使用药物吸入法进行动物安乐死，在通风橱内将滴加了乙醚的棉花，置于离心管中，将4只新生鼠放入离心管中，密封20分钟，取出安乐死的新生鼠后，妥善弃去乙醚。随后，将新生鼠浸没到酒精消毒液中震荡消毒2分钟，去除皮肤表面的杂质及细菌，重复消毒2次。随后，用磷酸盐缓冲液反复冲洗新生鼠3次去除多余酒精。
(2)剥离完整新生鼠皮肤：使用无菌解剖工具在60mm无菌培养皿内进行新生鼠皮肤分离。使用眼科剪去除新生鼠四肢及尾部，保留其完整躯干。使用眼科剪于鼠背部正中线从头顶至尾部剪开皮肤。随后，使用眼科镊略微分离皮肤与皮下组织，夹住游离皮肤，从尾部向头部撕脱，完整剥离新生鼠皮肤。
(3)漂洗分离的皮肤：在3个无菌培养皿中加入适量的磷酸盐缓冲液。将分离的皮肤以真皮面朝下置于皿中展开漂洗，去除分离过程产生的血液以及残留的皮下组织活内脏。依次在3个培养皿中充分漂洗，直到所有皮肤都收集完成后置于1个新的培养皿。
(4)中性酶消化及终止：取4ml 1mg/ml中性蛋白酶37℃水浴箱中预热。取预热的10ml 1mg/ml中性蛋白酶加入装有分离新生鼠皮肤的培养皿中，真皮面朝下充分展开使皮肤完整浸没于中性蛋白酶中，置于孵箱内37℃孵育1小时加入4ml磷酸盐缓冲液终止消化。
(5)分离真皮及表皮组织：使用眼科镊在单张皮肤边缘处按压真皮，同时夹住上方表皮，从真皮上完整成片剥离。将白色不透明的表皮及棕红色凝胶状真皮分别置于不同的培养皿中。
(6)胶原酶消耗真皮及终止：使用眼科剪将真皮组织剪碎，取4ml 2mg/ml(w/v)的I型胶原酶加入真皮组织，置于孵箱内37℃孵育1小时，使用4ml磷酸盐缓冲液终止消化。
(7)胰蛋白酶消化表皮及终止：使用眼科剪将表皮组织剪碎，取4ml 2.5mg/ml的胰蛋白酶加入表皮组织，置于孵箱内37℃孵育15分钟，使用4ml磷酸盐缓冲液终止消化。
(8)使用70μm直径的细胞滤网过滤大块组织，分别得到含有活真皮干细胞的溶液以及含有活表皮干细胞的溶液。
实施例2
一、透皮递送活体细胞的分层冷冻微针制备
取实施例1步骤二制备得到的无菌的冷冻水凝胶、步骤四制备得到的含有活真皮与表皮干细胞的溶液制备本发明的冷冻微针，按照如下步骤操作(流程图如图2所示)：
(1)微针膜具准备：制作冷冻微针的模具统一使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)微针模具，由母模制备而来的微针模具，每个针体底部(即针体上与针尖相反的一端)直径为600-800μm，高度为1000-1200μm。这些针腔以5×5阵列排列，针尖-针尖的间距为2000μm。所有聚二甲基硅氧烷模具均需经过75％酒精浸泡30分钟，置于生物安全柜中，紫外线照射消毒30分钟，以确保无菌标准符合要求。
(2)冷冻针尖灌注：将含有真皮和表皮干细胞的溶液混合在同一15mL离心管中，其中表皮干细胞和真皮干细胞的细胞数量比为1﹕2，然后150xg 3分钟离心机离心，弃去上清液后，再用600μL的液态冷冻水凝胶重悬细胞，使得冷冻水凝胶中活干细胞总含量为0.8～1.4×106个/mL。将载有活细胞的冷冻水凝胶注入到聚二甲基硅氧烷微针模具，将装有细胞/水凝胶混合物的微针模具放置于6孔细胞培养板中，置于离心机中，以710xg离心3分钟，除去针尖中滞留的空气的同时，能够使混悬液中的细胞在模具针尖尖端密集地浓缩。
(3)冷冻基座填充：使用移液枪抽吸溢出针尖部分的多余水凝胶及细胞。使用405nm紫外光照射微针针尖部分使原料交联12s。微针基座部分，使用新鲜无菌的细胞冻存液CryoStor CS2(STEMCELL Technologies，货号：07932，其中含有20mg/ml二甲基亚砜)添加到模具中以填充基座。以上灌注模具的所有操作以及离心过程均在4℃的环境下操作，以利细胞活力的维持。
(4)程序性降温步骤：将模具在-20℃冷冻2小时，在干冰上将冷冻微针从模具上轻轻剥开，放置于600mm的无菌细胞培养皿，然后在-80℃冷冻2小时，-196℃的液氮中冷冻1小时，即制得本发明的冷冻微针，其结构示意图如图3所示，所获得的冷冻微针的实物图如图4所示，为区分分层的针尖与基座，于针尖中加入了亚甲基蓝进行观察。
二、本发明的冷冻微针扫描电子显微镜检测
(1)扫描电镜拍摄前处理：将制备的冷冻微针在-80℃真空冷冻干燥机中冷冻干燥24小时。
(2)对冷冻干燥后的冷冻微针样本移至真空中进行喷镀法，使样本表面附有导电的金属处理。
(3)用双面碳导电胶带黏贴微针基座，调整预设拍摄胶滴后，将其粘于样品台上增加导电性能，置于扫描电镜扫描中观察，拍照记录。
三、热烘干制备的传统微针扫描电子显微镜检测
为比较传统方法--热烘干制备的传统微针与本发明的冷冻微针，按照如下方法制备了传统微针并进行扫描电子显微镜检测：
(1)在PDMS微针模具中加入10％(w/v)甲基丙烯酸化明胶，并置于50℃的真空环境中进行除泡。
(2)在1000xg离心5分钟后，将载有水凝胶的微针模具暴露在紫外线下照射交联30秒。
(3)将模具在30-35℃烘箱中，放置干燥24小时，将微针阵列从微针模具中分离出来。
(4)对热烘干燥微针装置移至真空中进行喷镀法，使样本表面附有导电的金属处理。
(5)用双面碳导电胶带黏贴微针基座，调整预设拍摄胶滴后，将其粘于样品台上增加导电性能，置于扫描电镜扫描中观察，拍照记录。
本发明的冷冻微针和热烘干制备的传统微针的扫描电子显微镜图如图5所示：对于本发明的搭载细胞的冷冻微针，观察到密集多孔的表面微结构，这有利于活体细胞的物质交互以及细胞间的交流，有利于细胞的迁移聚集以及物质代谢，为活体细胞提供了较好的搭载介质。而传统烘干法制备的微针表面光滑致密无孔隙，缺少了给予细胞迁移聚集的空间以及物质交换的孔隙。
实施例3本发明冷冻微针的性能测试
检测实施例2中制备的本发明的冷冻微针的性能：
一、冷冻微针融化后形态维持评价
(1)将冷冻微针针尖朝上放置于开放环境室温下。
(2)于5秒、30秒、60秒、120秒、180秒时，使用高清摄像机进行微针装置表面观察拍摄。
如图6所示，低温冷冻后的微针接触空气中的水分子，于针尖表面形成白色的冰晶，180秒后冷冻凝胶制备的冷冻微针完全融化，仍可维持良好形态，说明失去冰晶强度的水凝胶在光交联赋予的氢键下仍具有一定强度支持形态维持。
二、冷冻微针机械强度检测
(1)为评价本发明的冷冻微针机械力，采用本发明冷冻的微针和冷冻微针融化后的微针(记名为融化后的微针)进行比较。
(2)融化的冷冻凝胶微针，为经过完整程序性降温的过程，-20℃冷冻2小时，-80℃冷冻2小时，-196℃的液氮中冷冻1小时。由液氮中取出后，放置于室温至少3分钟，待冷冻微针材质呈现均匀透亮的凝胶微针形态。
(3)预冷材料力学测量系统：在进行检测之前，在材料力学测量系统(Ametek LS1，USA)的平台上放置一个底部平整的不锈钢圆盘，使用-196℃的液氮对不锈钢圆盘进行预冷至少3分钟，随时补充液氮。
(4)将冷冻微针的针尖朝上平整放置，使用直径5mm的平头不锈钢圆柱形传感器，以每分钟0.5mm的恒定速度垂直向下。检测的施力由垂直方向向下垂直地施加到微针的尖端。
冷冻微针压缩后形态如图7所示：可见针尖压缩变平，发生形变。
微针的机械强度检测结果如图8所示：本发明冷冻微针无明显的断裂点，说明具有冰晶结构的冷冻微针，在针体具有良好的抵抗形变的能力。
计算微针的弹性模量，结果如图9所示，可见对比融化后的微针，低温冷冻所形成的冰晶使微针的刚度提升了110倍，说明了冷冻赋予了微针优异的机械性能。
三、冷冻微针的透皮能力检测
(1)预标记细胞：首先，在细胞装载入微针模具前，添加5μL的NucBlue LiveReadyProbes(Invitrogen,USA)细胞核染料到细胞混悬液中，置于37℃敷箱中，避光孵育15分钟。待孵育完成后，170xg离心3分钟，使用磷酸盐缓冲液进行漂洗3次。
(2)在最后一次离心弃去上清液后，添加冷冻凝胶进入离心管中重悬细胞后注入模具，基座添加CS2冻存液。
(3)经过程序性降温后，将制备完成的带有NucBlue标记细胞的冷冻微针，由液氮中取出后迅速用拇指按压法，将微针瞬间插入猪皮肤和裸鼠皮肤。
(4)待微针基座融化后，使用组织包埋剂垂直包埋皮肤组织。
(5)在-20℃冰箱中冷冻完成后，进行冷冻切片后在荧光显微镜下观察(Zeiss,AxioImager D2，德国)。
使用细胞核染料标记干细胞的冷冻微针，按压于鼠皮上实现透皮递送，经过病理学切片及显微镜的观察，如图10所示，证实了冷冻微针具有透皮递送细胞的能力。
四、冷冻微针中细胞的活力检测
(1)使用镊子将冷冻凝胶制备的冷冻微针由液氮中取出后，放置于共聚焦皿中，将共聚焦皿漂浮于37℃水浴锅中，隔水加热，进行复苏。
(2)按照Calcein-AM/PI活死细胞染色试剂盒(品牌：Solarbio，货号：CA1630)，进行活死染色的检测。简言之，按照Calcein-AM/PI活死细胞染色试剂盒配置染色工作液，将1μL的Calcein-AM染料与1μL的PI染料加入1mL的试剂配套染色缓存液中，以此比例按需配置工作液总量。
(3)于共聚焦皿中的微针37℃敷箱中，避光孵育30分钟后，于LSM980激光共聚焦显微镜下观察及拍摄并进行三维重建。
(4)图像统计分析：细胞活率的计算由ImageJ进行图像分析，由GraphPad Prism进行柱状图绘制。
为了进一步证明实施例2中传统烘干法制备的微针无法用于干细胞的递送，以及本发明的冷冻微针具有维持活体细胞的能力，通过细胞活死染色标记，评估两种方法制备的微针中细胞的活性。结果如图11、12所示，冷冻凝胶通过冷冻法制备的微针中活细胞仍维持在70％以上；而热烘干法制备的微针中，细胞均丧失了细胞活力，无活细胞。实验证实本发明的冷冻微针可用于递送活细胞等物质。
五、冷冻微针递送的活细胞及荧光示踪
(1)共聚焦皿注模：为了观察经冻存复苏后微针针体中的DCs与ECs的迁移和分化，预先在共聚焦皿中灌注10:1的PDMS及配套固化剂，并使用锥形微针阵列母模在共聚焦培养皿中构建了相同微针形状的PMDS模具。
(2)细胞色踪标记：将5μL绿色荧光示踪剂CellTrackerTMCM-DiO加入真皮细胞混悬液中，5μL红色荧光示踪剂CellTrackerTMCM-DiI加入到表皮细胞混悬液中，各自于37℃敷箱中避光孵育20分钟，磷酸盐缓冲液漂洗3次。
(3)制备分层冷冻微针装置：细胞染色完成后，参照实施例4中分层冷冻微针的制备方式进行制备。
(4)递送至共聚焦皿模具：将液氮冷冻后的分层微针插入共聚焦的模具中。
(5)添加培养基：待基座完全溶解后，加入1ml 10％FBS/DMEM(v/v)培养基，静置30分钟后再进行换液，随后每2天换液一次。
(6)共聚焦显微镜拍摄及图像三维重建：培养变化在激光共聚焦显微镜(Zeiss,LSM980，德国)下观察并拍照，图像进行三维重建。
通过绿色荧光探针标记真皮细胞及红色荧光探针标记表皮细胞，在图13A中，可以清晰的观察到，在最初递送完成时，细胞大多密集分布在底部，但仍有散在细胞分布在距离针尖600μm的位置。随后，离散的细胞逐渐聚集，形成直径约100μm的聚集体。结果表明，经复苏后的细胞在冷冻凝胶所提供的三维环境中培养，具有进一步聚集以及自组装的能力，能有效的保护及维持细胞-细胞间相互作用、细胞特有的自组装能力以及分化潜能，为细胞提供适当的三维环境。
进一步在倒置显微镜下观察，如图13B，可见细胞递送至共聚焦注模后的模型中，细胞由第0天离散的状态，经第3天、第7天形成细胞团块，在第14天可见黑褐色的毛芽样结构，证实了由冷冻凝胶制备的冷冻微针递送的细胞，具有进一步自组装及分化的能力。
实施例4使用本发明的冷冻微针进行毛囊重建
(1)冷冻微针装置保存：将实施例2中制备的本发明冷冻微针，使用装有-196℃液氮的不锈钢加棉液氮盆暂时保存。
(2)麻醉及消毒动物：先将裸鼠(品系：Nu/NuNude，年龄：7周龄)使用10mg/ml戊巴比妥进行腹腔注射麻醉，待裸鼠完全麻醉后，使用75％酒精棉片擦拭裸鼠后背正中部位的鼠皮进行消毒。
(3)按压冷冻微针透皮递送活细胞：使用不锈钢加棉液氮盆将冷冻微针移至裸鼠旁，减少微针在室温下接触时间。使用左手展开裸鼠背部皮肤，使皮肤展平获得一定程度张力。使用镊子将冷冻微针由液氮中取出，针尖朝下放置于鼠皮表面。使用拇指迅速且施力均匀地按压微针基座至有轻微突破感。
(4)持续按压微针基座约3-5分钟，待基座融化后擦拭多余液体，完成透皮递送装载活细胞。
在本实施例中，为评估冷冻微针对干细胞分化潜能的维持，通过使用异种移植小鼠模型，我们将制备完成的搭载毛囊类器官的冷冻微针按压在裸鼠后背皮肤，将类器官递送至鼠真皮层内。经过14天可见矩阵分布的黑色毛干突破裸鼠皮肤表面生长，如图14所示，证实了本发明的冷冻微针递送活细胞，可实现干细胞的进一步分化，在毛囊重建的应用领域中，能够实现微创重建毛囊。
进一步由平视视角放大观察重建毛囊，如图15所示，可见第7天重建位点色泽加深，第14天出现簇状突破皮面生长毛发。重建毛囊的比例如图16所示，为25个位点中，可见11个位点有突破皮面生长毛发。通过对重建毛囊进行石蜡病理切片取材及伊红-苏木素染色后，如图17所示，可见切片图正中，黑色重建的毛发突破表皮角质层生长，其重建毛囊结构与裸鼠本身结构不同。

Claims (10)

1.一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、制备泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体；
二、冷冻水凝胶合成：
取步骤一制备的泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体，加入含有光引发剂的缓冲液A，加热溶解后得到浓度为80～120mg/ml的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶；取甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶，加入细胞冻存液CryoStor CS10，混匀，除菌，得到无菌的冷冻水凝胶；甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶与CryoStor CS10的体积比为1:0.8～1.2；
三、制备冷冻微针，包括如下步骤：
(1)冷冻针尖灌注：取制备的含有活体干细胞的溶液离心弃去上清液，用制备的冷冻水凝胶重悬细胞，将载有活细胞的冷冻水凝胶注入到无菌微针模具的针腔中，然后将微针模具离心除去针尖中滞留的空气并使混悬液中的细胞在模具针尖尖端密集；
(2)冷冻基座填充：在4～8℃环境下进行如下操作：去除微针模具上多余的水凝胶，使用紫外光照射微针针尖部分使原料交联，然后将细胞冻存液CryoStor CS2添加到微针模具中以填充基座，然后离心除去针尖中滞留的空气；
(3)程序性降温冷冻：将模具进行程序性降温冷冻，脱模，制得冷冻微针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中程序性降温冷冻的具体方法为：将模具在-20℃～-30℃冷冻2～4小时，在低温下将冷冻微针从模具上脱模，然后在-70℃～-90℃冷冻2～4小时，最后在液氮中冷冻1～3小时，即制得冷冻微针。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤一中以甲基丙烯酸酐和明胶为原料制备泡棉样的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶前体；
所述明胶选自猪皮明胶粉、鱼皮明胶粉、鱼鳞明胶粉、牛皮明胶粉、牛骨明胶粉、鸡皮明胶粉；甲基丙烯酸酐和明胶的使用量配比为5～7mL:10g，优选为6ml:10g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤二中所述光引发剂选自苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙、Irgacure-2959、Irgacure-184、Irgacure-907，所述缓冲液A为磷酸盐缓冲液或者碳酸氢钠缓冲液或者柠檬酸钠缓冲液；
所述甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的浓度为90～110mg/ml，其中光引发剂的浓度为0.8～1.2mg/ml；甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶与CryoStor CS10的配比为体积比为1:0.9～1.1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，
所述步骤(2)冷冻基座填充中，使用紫外光照射微针针尖部分12～60秒使原料交联；
所述步骤(3)程序性降温具体为：将模具在-20℃冷冻2小时，在干冰上将冷冻微针从模具上轻轻剥开放置于无菌容器中，然后在-80℃冷冻2小时，再在-196℃的液氮中冷冻1小时，即得冷冻微针。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述微针模具的每个针体底部直径为600-800μm，高度为1000-1200μm，针尖-针尖的间距为1500-2500μm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述活体干细胞包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞；含有活体干细胞的冷冻水凝胶中细胞含量为0.8～1.4×106mL-1；
优选所述活体干细胞为皮肤干细胞，所述皮肤干细胞包括皮肤表皮干细胞和真皮干细胞，其中皮肤表皮干细胞和真皮干细胞的细胞量比例为1～9:1～9，优选1～5:1～5或者1～3:1～3或者1～2:1～2。
8.一种透皮递送活体干细胞的冷冻微针，其特征在于：采用权利要求1至7任一项所述的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述的冷冻微针在制备用于透皮递送活体干细胞的微针中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述冷冻微针负载皮肤干细胞，用于重建毛囊治疗脱发。
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