CN115089763A - 一种适用于3d打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法 - Google Patents

一种适用于3d打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于3D打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法。该制备方法包括：将明胶和硝酸钙溶于水中，搅拌，凝胶化，得到明胶水凝胶，放入含戊二醛的硫酸铵水溶液中反应，冲洗，浸泡在甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中，通过溶剂置换，得到交联的明胶甘油水凝胶，熔化并冷却至室温后，与3T3细胞或ADSC细胞混合。该方法制备得到的甘油水凝胶生物墨水具有较好的抑菌效果、稳定性、机械性、抗干燥性、抗冻性、形状保真度等一系列有利特性，并且在3D生物打印和冷冻保存过程中能够实现细胞保护，打印的组织也可以直接冷冻保存而无需添加冷冻保护剂，这在实际的生物医学应用中无疑具有广阔的前景。

Description

一种适用于3D打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法
技术领域
本发明属于生物墨水的制备领域，特别涉及一种适用于3D打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法。
背景技术
近年来，3D生物打印由于能够满足不同形态、不同细胞成分的3D组织模型的制备，因此在生物医学应用中发挥着越来越重要的作用，被广泛应用于再生医学、疾病建模和药物筛选等领域当中。生物墨水是实现3D生物打印的关键。水凝胶凭借着优异的生物相容性以及能够模拟细胞外基质的特点，成为了最常用的生物墨水材料。以往对水凝胶生物墨水的研究主要集中在组织3D生物打印后的细胞相容性和细胞存活率。尽管取得了重大进展，但目前3D生物打印仍面临以下挑战：(1)生物墨水的抑菌特性；(2)3D打印组织的长期形状保真度；(3)3D打印组织的冷冻保存。水凝胶体系为细菌生长提供潮湿封闭的愈合环境，同时在干燥和冷冻保存的过程中也会由于水分蒸发和冰晶形成而对细胞的生存造成不利影响，进而使材料失去使用价值。因此，对于生物打印的实际应用，非常需要一种新的生物墨水体系。
水在水凝胶生物墨水中起着至关重要的作用。水凝胶中存在的水可以分为三种状态：“自由水”、“弱结合水”和“结合水”。自由水与水凝胶的聚合物网络几乎没有相互作用，并表现出与普通纯水相似的热力学行为。结合水和水凝胶聚合物网络之间的相互作用很强。而弱结合水则处于两者之间。一般来说，水凝胶中的自由水在干燥环境中容易蒸发，在低温下容易结冰，同时也为细菌提供了生存环境，因此极大地限制了水凝胶生物墨水的实际应用。鉴于以上所有事实，需要提出一种新的设计原理，即通过调节生物墨水中水的状态来赋予其有利的特性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于3D打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种甘油水凝胶生物墨水的制备方法，包括：
(1)将明胶和硝酸钙溶于水中，搅拌，得到明胶水溶液，凝胶化，得到明胶水凝胶；
(2)将步骤(1)中明胶水凝胶放入含戊二醛的硫酸铵水溶液中反应，得到交联明胶水凝胶，冲洗，浸泡在甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中，溶剂置换，得到交联的明胶甘油水凝胶；
(3)将交联的明胶甘油水凝胶熔化并冷却至室温后，与3T3细胞或ADSC细胞混合，随后将该混合溶液放入冰箱中使其凝胶化，得到甘油水凝胶生物墨水。
优选地，所述步骤(1)中明胶、硝酸钙和水的质量比为4～8:1:15～25。
优选地，所述步骤(1)中凝胶化温度为0～10℃，凝胶化时间为20～40min。
优选地，所述步骤(2)中反应温度为室温，反应时间为8～16h。
优选地，所述步骤(2)中甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中甘油与硫酸铵水溶液的质量比为0.95:1-1:0.95。
优选地，所述步骤(2)中溶剂置换时间为8～16h。
本发明还提供一种上述制备方法制备得到的甘油水凝胶生物墨水。
本发明还提供一种上述甘油水凝胶生物墨水在3D生物打印中的应用。
本发明还提供一种甘油水凝胶组织，将甘油水凝胶生物墨水进行3D生物打印后获得。
本发明通过将甘油引入水凝胶中制成甘油水凝胶来作为一种新型生物墨水。甘油与水和聚合物网络之间形成了广泛的氢键，“自由水”含量降低，进而显着抑制细菌的生长、生物墨水中水的挥发和冻结。因此，甘油水凝胶生物墨水具有更宽的工作温度范围，也能适应更加严苛的工作环境。通过3D打印制得的甘油水凝胶支架通过抑制水的挥发表现出优异的形状保真度，并且在交联的明胶甘油水凝胶中的细胞比交联的明胶水凝胶中的细胞表现出更高的活力。
本发明明胶与戊二醛通过席夫碱反应来形成相对稳定的交联聚合物网络。同时，席夫碱反应形成的动态亚胺键使交联在3D打印的剪切力下可逆地解离，并在打印后重新结合。这种动态结构的演变赋予甘油水凝胶剪切稀化和自恢复的性能，以确保其在室温下的可印刷性。这一特性也将克服现有生物墨水的典型限制(即通常需要在挤出后进行有害的交联反应(例如紫外光诱导的自由基加成)来赋予打印材料结构完整性和一定的机械性能)，并实现在整个3D打印过程中对细胞友好。
有益效果
与现有的基于水凝胶的生物墨水相比，本发明甘油水凝胶生物墨水具有较好的抑菌效果、稳定性、机械性、抗干燥性、抗冻性、形状保真度等一系列有利特性，并且在3D生物打印和冷冻保存过程中能够实现细胞保护，打印的组织也可以直接冷冻保存而无需添加冷冻保护剂，这在实际的生物医学应用中无疑具有广阔的前景。
本发明席夫碱反应形成的动态亚胺键赋予交联的明胶甘油水凝胶剪切稀化特性，从而防止细胞被挤压压力损坏。生物墨水表现出优异的自恢复特性，从喷嘴尖端挤出后能够快速恢复到凝胶状态，这克服了大多数水凝胶在打印后需要额外的交联步骤的限制。这两个特性赋予了交联的明胶甘油水凝胶在室温下的可印刷性。
附图说明
图1中a为交联明胶水凝胶的分子设计、制备和结构演化示意图；b为通过溶剂置换的方法由交联明胶水凝胶制备交联的明胶甘油水凝胶的示意图；c为不同交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的FTIR光谱；d为含不同浓度(NH4)2SO4的交联明胶水凝胶的拉伸应力-应变曲线；e为流变学测试中交联的明胶甘油水凝胶的粘度与频率的关系；f为低应变(1％,1H)和高应变(灰色部分,500％,1Hz)交替振荡循环测试中储能模量(G’)和损耗模量(G”)随应变的变化；g为3D打印甘油水凝胶的图像，比例尺:10mm。
图2中a为交联明胶水凝胶(Hyd)和交联的明胶甘油水凝胶(Gly)在37℃下储存不同时间后的弹性模量；b为在37℃下储存1天的交联明胶水凝胶的循环拉伸曲线；c为交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)在37℃下保存3天的照片，比例尺:10mm；d为交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶在37℃下储存不同时间的最大伸长率；e为在37℃下储存1天的交联的明胶甘油水凝胶的循环拉伸曲线；f为交联明胶水凝胶(Ⅰ,Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ,Ⅳ)在-80℃下保存3天的照片。甘油水凝胶在-80℃下保持可拉伸性，比例尺:10mm；g为交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶的DSC热分析图；h为交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶在-80℃下储存不同时间的T2弛豫曲线；i为冷冻保存时间对交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的T21比率的影响。
图3为甘油水凝胶生物墨水的抗菌特性，其中a为交联的明胶甘油水凝胶(Gly)和交联明胶水凝胶(Hyd)在第1天、第3天和第5天时对大肠杆菌的活/死测定(对于每组实验对象，左图是Syto9染色(活菌)，中间是碘化丙啶(PI)染色(死菌)，右图是叠加图。比例尺:100μm)；b为交联的明胶甘油水凝胶与交联明胶水凝胶种植大肠杆菌后细菌生长曲线；c为扫描电镜观察大肠杆菌在Gly和Hyd上5天时的细胞形态和膜损伤情况，比例尺:2μm和5μm；d为使用明场显微镜对霉菌在自然环境中的生长进行成像(对于每组实验对象，左图和右图分别拍摄了霉菌的胞体、菌丝，中间则同时包括了胞体和菌丝两种部位)；e为Gly和Hyd的霉菌活/死测定(对于每组实验对象，左图是Syto9染色(活菌)，中间是碘化丙啶染色(死菌)，右图是叠加图。比例尺:100μm)；f为通过SEM观察交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶上霉菌的细胞形态和膜损伤。比例尺:5μm、10μm、15μm。
图4为甘油水凝胶生物墨水的形状保真度。其中，a-b为交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶在0天、3天、1周、2周、3周时的表面形态变化；c为由交联明胶水凝胶或交联的明胶甘油水凝胶制成的心脏支架随时间的重量保持曲线；d为由交联明胶水凝胶或交联的明胶甘油水凝胶制成的心脏支架随时间的长度保留曲线；e为由交联明胶水凝胶或交联的明胶甘油水凝胶制成的心脏支架随时间的宽度保留曲线。
图5为甘油水凝胶生物墨水中细胞在3D生物打印和冷冻保存期间的活力。其中，a为对3D生物打印1天后Gly组和Hyd组中3T3s细胞的活/死测定(对于每组实验对象，左图是Calein-AM染色(活细胞)，中间是碘化丙啶染色(死细胞)，右图是叠加图。比例尺:100μm)；b-d为对冷冻保存1天、3天和7天后Gly组和Hyd组中ADSC细胞的活/死测定。比例尺:100μm；e为3D生物打印1天后3T3s细胞的死/活百分比统计结果；f-h为冷冻保存1天(f)、3天(g)和7天(h)后ADSCs细胞的死/活百分比的统计结果，误差条代表SDs，每组n≥3，与对照组相比，***p<0.01。
图6为不同交联度的交联明胶甘油水凝胶(从左到右分别为N10G0.2T、N10G0.6T、N10G1T)在水浴(37℃)中保存的照片，其中a-f的浸泡时间分别为0h、12h、24h、48h、72h和168h，比例尺:10mm。
图7为3D打印甘油水凝胶的图像。包括“SCMC”(a)和“DHU”(b)的两个字母图像以及正方形(c)和圆形(d)的两种图形图案。
图8为甘油水凝胶的抗干燥特性。其中a为原始的交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)的照片，比例尺:10mm；b为交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)在37℃下放置1天后的照片，比例尺:10mm；c为交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)在37℃下放置7天后的照片，比例尺:10mm；d为原始交联明胶水凝胶的循环拉伸曲线；e-g为原始的交联的明胶甘油水凝胶(e)和在37℃下放置3天(f)和7天(g)的交联的明胶甘油水凝胶的循环拉伸曲线。
图9为交联的明胶甘油水凝胶的抗冻性能。其中a为交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)在-80℃下放置1天后的照片；b为交联明胶水凝胶(Ⅰ，Ⅱ)和交联的明胶甘油水凝胶(Ⅲ，Ⅳ)在-80℃下放置7天后的照片。
图10为交联的明胶甘油水凝胶的抗菌特性。其中a为将大肠杆菌接种在交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶之间的膜片上，观察LB培养基中0天、1天、3天和5天天细菌浊度的变化；b为大肠杆菌在37℃下孵育0天和1天后的生长情况；c为在交联的明胶甘油水凝胶与交联明胶水凝胶上接种后，在4℃的储存条件下观察交联明胶水凝胶与交联的明胶甘油水凝胶表面上的霉菌情况。
图11为外耳道状的甘油水凝胶的形状保真度。其中a为交联明胶水凝胶在0天、3天、1周、2周和3周时的物理图谱；b为交联的明胶甘油水凝胶在0天、3天、1周、2周和3周时的物理图谱。
图12为交联的明胶甘油水凝胶的细胞相容性。其中a-b为3T3细胞接种在交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶膜片上，在荧光染色、Calein-AM(活细胞染色)和PI(死细胞染色)存在下进行0-3天的生长，比例尺:100μm；c为接种在交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶上的3T3细胞的CCK-8增殖；d-e为接种在交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶上的ADSCs在生长0-3天的荧光染色图，比例尺:100μm；f为接种在交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶上的ADSC细胞的CCK-8增殖。
图13为交联的明胶甘油水凝胶3D生物打印过程中的细胞保护。其中a-b为3D生物打印1天后对Gly组和Hyd组中3T3s和ADSCs的活/死测定；c-d为3D生物打印1天后3T3s和ADSCs细胞的死/活百分比。
图14为交联的明胶甘油水凝胶的冷冻保存和复苏。其中a-c为交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶混合细胞在冷冻和复苏之前、之后的形态；d-e为混合细胞的水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶经过冷冻和复苏1天、3天和7天后其内部ADSCs(d)和3T3(e)细胞的细胞活力，误差条代表SD，每组n≥3，与对照组相比，***p<0.01；f为Gly组和Hyd组在第1天、第3天和第7天对冷冻保存的3T3s细胞进行活/死测定；比例尺:100μm；g-i为3T3s在冻存1天、3天和7天后的死/活百分比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
试剂来源：
明胶(A型，来自猪皮，300Bloom)和甘油(≥99.0％)购自Sigma-Aldrich。(NH4)2SO4(≥99.5％)购自Titan(Shanghai),Inc.。戊二醛(50％in H2O)购自Macklin。Ca(NO3)2·4H2O(≥99.0％)由国药化工有限公司提供。实验使用去离子水。所有试剂均按原样使用。
通过万能试验机(MTS E42)研究力学性能。在单轴拉伸试验中，加载速率为50mmmin-1。循环拉伸试验中，加载和卸载速率均为20mm min-1，拉伸应变范围为100％，循环次数为10次。
差示扫描量热仪(204F1,NETZSCH)用于研究交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的热性能。温度变化率为10℃/min。
通过将交联的明胶甘油水凝胶置于37℃水浴环境中进行耐温测试。此外，交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的干燥和冷冻处理分别在37℃烘箱和-80℃冰箱中进行。
通过衰减全反射傅里叶变换红外(ATR-FTIR)(Nicolet iS5，Thermo FisherScientific，USA)测量化学结构。
低场核磁共振(LF-NMR)(MesoMR23-060H-I,Niumag,Inc.,China)用于检测冷冻过程中材料内部水分分布的变化。
交联的明胶甘油水凝胶的频率扫描实验采用DHR-2流变仪(美国TA Instruments)在25℃和1％的恒定应变下，在100～0.1rad/s的剪切速率范围内进行。
交联的明胶甘油水凝胶的自恢复实验通过使用DHR-2流变仪(美国TAInstruments)在25℃和1Hz下交替进行低应变(1％,60s)和高应变(500％,60s)的循环振荡扫描。
细胞培养：
3D激光扫描系统用于形状分析。使用Konica Minolta Vivid 910和PolygenEditing Tools2.21版(Konica Minolta，Tokyo，Japan)从阳模和支架收集表面图像数据。这些数据由Rapid Form 2006(INUS，韩国首尔)和HP xw6200(惠普，中国上海)进一步处理。将从支架获得的所得数据与来自作为标准的阳模的数据进行比较。小于1mm的体素变化被认为是相似的，这些相似体素的数量除以总体素的数量来计算相似度。
细胞相容性：按照制造商的说明，通过用绿色荧光染料Calcein AM染色活细胞和用红色荧光染料碘化丙啶(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit，beyotime，China)染色坏死细胞来确定细胞活力。使用荧光显微镜(DMI3000B，Leica，Germany)记录图像。
根据制造商的说明，进行细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定(Do JindoLaboratories，Japan)测定细胞活力。简而言之，将1×104个细胞接种在96孔板的每个孔中，并用无血清培养基洗涤3次。将CCK-8工作缓冲液(200μL)添加到每个孔中，并在细胞培养箱中培养2小时。使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific)检测OD 450nm处的吸光度。每1天在OD 450nm处记录吸光度值。
实施例1
明胶水凝胶的制备：将30g明胶粉末和5g的Ca(NO3)2·4H2O溶于去离子水(100g)中，在50℃下搅拌至澄清无气泡。随后，将一定量的明胶水溶液挤入表面皿中，放入冰箱30分钟等待其凝胶化。
交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶的制备：制备交联明胶水凝胶或交联的明胶甘油水凝胶的反应溶液配方见表1。将制备的明胶水凝胶在室温下放入含戊二醛的硫酸铵水溶液中，反应12h后，制成了交联明胶水凝胶。用水冲洗3次，再将交联明胶水凝胶浸泡在由甘油和硫酸铵水溶液制成的混合溶液中，其中甘油与硫酸铵水溶液的质量比为1:1。再经过12小时的溶剂置换，得到交联的明胶甘油水凝胶。
作为对比，交联明胶水凝胶是通过将合成的交联明胶水凝胶浸泡在与合成过程中用到的相同浓度的硫酸铵水溶液中12小时制成的。
将明胶水凝胶简称为N0G0，交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶分别简称为NxGyT和NxGy，其中“N”、“G”和“T”分别代表硫酸铵、戊二醛和甘油，“x”代表浓度交联反应和浸渍过程中使用的(NH4)2SO4溶液的浓度，“y”代表交联反应中使用的戊二醛浓度。混合溶液中甘油的质量分数为50％。
表1：制备交联明胶水凝胶或交联的明胶甘油水凝胶的反应溶液配方
Figure BDA0003567568120000071
通过引入戊二醛并随后进行溶剂置换，制备了基于动态共价交联的明胶甘油水凝胶(图1a-b)。傅里叶变换红外(FTIR)光谱表明，在1630cm-1附近，由C＝O和C＝N伸缩振动产生的酰胺I带的强度显着增加，这证实了戊二醛和明胶之间形成了亚胺键(图1c)。对于交联的明胶甘油水凝胶，除上述变化外，O-H伸缩峰(3280cm-1)的增强强度表明甘油、水和聚合物网络之间形成了更强的氢键。
在水浴(37℃)中对不同交联程度的甘油水凝胶进行了耐温试验。如图6所示，低交联度的甘油水凝胶(N10G0.2T)在浸泡12小时后部分水解，24小时后完全消失。作为比较，N10G0.6T(中等交联度)和N10G1T(高交联度)凝胶在水浴(37℃)中浸泡7天后均保持完整的形态，表明它们在生理温度和水介质中的稳定性。鉴于高浓度戊二醛的潜在毒性，本实施例使用的交联工艺的优化配方确定为制备具有中等交联度的甘油水凝胶(N10G0.6T)的配方。
与不含硫酸铵的凝胶(N0G0.6)相比，在(NH4)2SO4水溶液中浸泡后，凝胶(N10G0.6)的拉伸强度和最大伸长率分别提高了3倍和5倍(图1d，表2)。FTIR光谱中C-H弯曲振动和CH3对称变形振动峰(1452cm-1)强度的增加也证明了(NH4)2SO4形成的强疏水相互作用(图1c)。
表2：含不同浓度硫酸铵的交联明胶水凝胶的机械性能
Figure BDA0003567568120000072
作为一种动态共价键，亚胺键可以在3D打印的剪切力下可逆地解离，并在打印后重新结合，赋予交联的明胶甘油水凝胶剪切稀化特性(图1e)，从而防止细胞被挤压压力损坏。此外，通过交替施加低应变(1％)和高应变(500％)，交联的明胶甘油水凝胶能够从低应变下的凝胶状行为(G'>G″)迅速转变为在高应变下的溶胶状行为(G'<G")，并在去除应变后迅速恢复，这表明材料具有优异的自恢复特性(图1f)。这一特性也同样归因于交联网络的动态性，满足了材料从喷嘴尖端挤出后需要快速恢复到凝胶状态的要求，同时也克服了大多数水凝胶在打印后需要额外的交联步骤的限制。这两个特性赋予了交联的明胶甘油水凝胶在室温下的可印刷性，并通过3D打印字母图案(“SCMC”和“DHU”)和一些图形图案(包括手、肾、肝、心、圆圈和正方形)得到了证实(图1g和图7)。
交联的明胶甘油水凝胶是通过用甘油代替部分自由水制备的。由于自由水含量的减少以及甘油、水和聚合物网络之间形成的氢键，交联的明胶甘油水凝胶表现出优异的抗干燥性能并保持高稳定性。将交联明胶水凝胶(N10G0.6)和交联的明胶甘油水凝胶(N10G0.6T)同时置于37℃的干燥环境中以测试它们的抗干燥性能。经过一天的处理后，原来透明的水凝胶发生脱水并变得不透明(图8a-bⅠ-Ⅱ)，模量从0.07±0.01MPa增加到2.97±0.84MPa(图2a)，同时其循环拉伸曲线也表现出明显的变化并具有显着的滞后性(图2b，图8d)。放置3天和7天后，交联明胶水凝胶几乎失去了拉伸性(图2cⅠ-Ⅱ，图8c,Ⅰ-Ⅱ)，并且变得很脆，最大伸长率显着降低至小于20％(图2d)，而弹性模量分别增加了2,100倍和3,200倍(表3)。相比之下，交联的明胶甘油水凝胶在整个测试过程中保持高透明度和拉伸性(图2cⅢ-Ⅳ，图8a-cⅢ-Ⅳ)，机械性能也保持相对稳定(表4)。前三天模量基本保持不变，直到第七天略有增加(0.28±0.03MPa)，但仍然远小于交联明胶水凝胶1天后的模量(图2a)。3天内交联的明胶甘油水凝胶的最大伸长率随着放置时间的增加而增加，在第7天下降至119.78±4.78％(图2d)，这可能是由于失水量增加所致，但仍显着高于同期水凝胶的伸长率(16.42±3.34％)。此外，在37℃下放置1天后的交联的明胶甘油水凝胶循环拉伸试验结果显示滞后可忽略不计，并且几乎与原始滞后一致(图2e，图8e)，在第三天和第七天也都保持了弹性(图8f,g)。上述结果表明，交联的明胶甘油水凝胶是优于水凝胶的，更适合长期应用的生物墨水材料。
表3：交联明胶水凝胶在37℃下放置不同时间的机械性能
Figure BDA0003567568120000081
表4：交联的明胶甘油水凝胶在37℃下放置不同时间的机械性能
Figure BDA0003567568120000082
Figure BDA0003567568120000091
由于甘油和水之间形成广泛的氢键，甘油的引入赋予了交联的明胶甘油水凝胶优异的防冻性能。如图2f和图9所示，交联明胶水凝胶在-80℃冷冻成黄色固体并变脆，而交联的明胶甘油水凝胶在-80℃储存后保持可拉伸性。为了更好地理解交联的明胶甘油水凝胶抵御低温的能力，使用差示扫描量热法(DSC)来表征交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的防冻性能。如图2g所示，在曲线上观察到一个在-22℃左右的尖峰，这归因于交联明胶水凝胶中冰晶的形成。对于交联的明胶甘油水凝胶，在-100℃至20℃的DSC图中未检测到结晶峰，表明其具有优异的低温耐受性。此外，还通过非破坏性低场核磁共振(LF-NMR)测试对交联明胶水凝胶和交联的明胶甘油水凝胶的自旋-自旋弛豫时间(T2，也称为横向弛豫时间)进行了评估，进而检测其内部的水分分布状态。如图2h所示，每个样品曲线上的三个峰与凝胶中水的三种状态相关联，即结合水(对应于T21，浅灰色区域)、弱结合水(对应于T22，灰色区域)和自由水(对应T23，深灰色区域)。对于交联的明胶甘油水凝胶，甘油的引入降低了正常条件下自由水的含量，也使得谱图上的三个峰移至较低的弛豫时间，同时结合水的含量(96.63±0.32％，表5)高于水凝胶的结合水含量(84.73±0.46％，图2i，表6)。这些现象归因于甘油和水分子之间的强氢键。这些结果证明了交联的明胶甘油水凝胶更优异的环境适应性和性能稳定性，可有效扩大相应生物墨水的应用温度范围。
表5：不同冷冻时间对交联的明胶甘油水凝胶中水的分布的影响。
Figure BDA0003567568120000092
表6：不同冷冻时间对交联明胶水凝胶中水的分布的影响。
Figure BDA0003567568120000093
实施例2
将3mLLB培养基和300μL氨苄青霉素加入10μL大肠杆菌溶液中制备细菌溶液。将大肠杆菌溶液(大肠杆菌ATCC25922)在37℃下以200rpm孵育24小时。24小时后，用细菌溶液研究生物墨水的抗菌作用。将在亚抑制浓度的大肠杆菌(革兰氏阴性)或真菌存在下培养1、3和5天后收集的成熟生物膜重新悬浮在0.9％生理盐水中。生物膜在室温下用Syto9(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)和PI(Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)分别以2nmol ml-1和20nmol ml-1的最终浓度在暗室中染色10分钟。将10μl染色溶液用移液枪吸取到生物膜上，然后立即用盖玻片覆盖载玻片。在激光共聚焦显微镜系统(TCS SP8，Leica，Germany)下检查所有样本。
当OD 600nm为0时，将单克隆菌落大肠杆菌溶液在37℃振荡培养。然后将培养基置于37℃，200rpm振荡，在OD 600nm处记录吸光度值，每次1日。
收集与大肠杆菌(革兰氏阴性)细菌或真菌一起培养的成熟生物膜，置于载玻片上并在～4℃下用2.5％戊二醛固定5小时。用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液轻轻洗涤3次后，使用一系列分级酒精步骤对样品进行脱水，然后使用乙酸异戊酯对样品进行脱水，最后用液态二氧化碳进行临界点干燥，以保护生物膜的完整性。金属喷涂后，使用日立SU8000扫描电镜观察拍照。
交联的明胶甘油水凝胶膜片上大肠杆菌(大肠杆菌；革兰氏阴性)的活/死染色和细菌生长曲线评估了交联的明胶甘油水凝胶的抑菌性能。实际上，基于活/死细菌成像和细菌生长曲线，交联的明胶甘油水凝胶组与交联明胶水凝胶组相比，表现出对大肠杆菌的显著生长抑制(图3a,b和图10)。同时，大肠杆菌的扫描电子显微镜(SEM)照片显示交联明胶水凝胶表面光滑且细胞膜完整，而交联的明胶甘油水凝胶表面呈现出凹形和褶皱，并且细胞膜变形(图3c)。但令人惊讶的是，交联的明胶甘油水凝胶表现出比交联明胶水凝胶更好的抑菌作用(图3d-f和图10b,c)，而这是通过调控自由水来实现的。甘油的存在降低了细菌细胞的自由水。大多数生物体无法应对自由水含量低的环境，要么死亡，要么脱水并处于休眠状态。此外，甘油通过促进扩散渗透细菌细胞并抑制水从细菌细胞中流出。根据细胞壁的阻力，渗透压升高并导致膜变弱和细胞裂解。这也是迄今为止报道的第一项在水凝胶中添加甘油以抑制细菌生长的研究。
实施例3
使用交联的明胶甘油水凝胶(N10G0.6T)和交联明胶水凝胶(N10G0.6)模拟了人类心脏(图4a,b)和耳朵的形状(图11a,b)。在对支架进行3D生物打印后，交联的明胶甘油水凝胶结构在体外培养过程中都基本保持其原始心脏形状，在第三天和第三周时分别保留了98.07％和78.96％的形状相似性，而交联明胶水凝胶随着时间的推移显示出快速收缩，在第三天和第三周时仅分别保留了89.42％和43.59％的形状相似性(图4a,b)。此外，与交联明胶水凝胶相比，心形的交联的明胶甘油水凝胶显示出更强的结构完整性，包括重量、长度和宽度(图4c-e)。对上述结果的解释可能是由于甘油和水分子之间形成的氢键抑制了水的挥发，从而赋予了凝胶优异的抗干燥性能。这些研究证实，交联的明胶甘油水凝胶生物墨水比典型的交联明胶水凝胶生物墨水具有更好的长期形状保真度和耐久性，这为未来的多组织3D生物打印提供了新思路。
实施例4
细胞培养：从大鼠腹股沟区域的脂肪组织中分离出ADSC。然后，将脂肪组织切成小块，在无血清低葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM；HyClone,USA)中用0.1％(w/v)II型胶原酶(NB4；Serva,Heidelberg,Germany)在37℃下处理1小时。将细胞浓缩，然后接种到含有10％FBS的DMEM中的组织培养瓶中。传代前将细胞培养至80％汇合。传代2-3次的ADSC用于实验。ADSC细胞在添加5％胎牛血清、1％MSC生长补充剂、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素和谷氨酰胺的MSC培养基(Sciencell，USA)中，在37℃，含5％CO2的潮湿环境中生长，每3天更换一次培养基。更换培养基后，细胞开始快速增殖，当细胞达到70-80％汇合时，进行融合传代培养。然后除去培养基，用0.25％胰蛋白酶消化细胞并收集。细胞悬液用1000rpm离心5min，重悬于含1％青霉素/链霉素和5％FBS的1ml MSC中，随后在37℃、5％CO2的条件下于10cm培养皿中培养(1:4接种物)。每3天更换一次培养基。
实施例5
3D打印甘油水凝胶油墨的制备：将交联的明胶甘油水凝胶置于水浴(90℃)中12小时使其完全熔化，然后将该溶液放入冰箱中使其凝胶化。
混合细胞的3D打印甘油水凝胶油墨和水凝胶油墨的制备：将交联的明胶甘油水凝胶置于水浴(90℃)中12小时使其完全熔化。待其冷却至室温后，倒入15μl的细胞培养液(3T3细胞或ADSC细胞)进行混合，随后将该混合溶液放入冰箱中使其凝胶化。
作为对比，混合细胞的3D打印水凝胶油墨是通过将交联明胶水凝胶置于水浴中熔化后，在室温下混合15μl的细胞培养液，最后在冰箱中凝胶化后制得的。
3D打印程序：使用直接挤出式3D打印机(BS4.2，GESIM)和内径为220μm的微喷嘴进行打印。水凝胶油墨在室温条件下印刷。所有打印路径均由操作软件(GesimRobotics)控制。所有3D模型都是使用3ds Max、3DBuilder和GesimRobotics软件设计的。
用于3D生物打印的甘油水凝胶，无需支撑浴材料。通过用荧光染料、钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色来确定通过打印过程获得的交联的明胶甘油水凝胶中封闭的细胞的活力。
按照制造商的说明，通过用绿色荧光染料Calcein AM染色活细胞和用红色荧光染料PI染色坏死细胞来确定冷冻保存的细胞活力。在激光共聚焦显微镜系统(TCS SP8，Leica，Germany)下检查所有样本。
实施例6
交联的明胶甘油水凝胶膜片上的3T3(小鼠)和大鼠脂肪干细胞(rADSCs)的活/死染色和CCK-8测定揭示了交联的明胶甘油水凝胶维持细胞活力和增殖的卓越能力(图12)。细胞保护是3D生物打印过程中的关键要素。制备用于细胞活力测定的3T3s和凝胶混合物的3D生物打印墨水。将生物墨水打印1天后，交联的明胶甘油水凝胶生物墨水中Calcein-AM+3T3s的比例(52.05±6.32％)显着高于交联明胶水凝胶中的比例(29.38±11.29％)，(p<0.05)，(图5a,e，图13a,c)。交联的明胶甘油水凝胶生物墨水中ADSC的细胞活力也高于交联明胶水凝胶中的细胞活力(图13b,d)。此外，用交联的明胶甘油水凝胶生物墨水进行3D生物打印不需要像水凝胶生物墨水那样额外使用培养基，因此不仅更方便，而且更不容易受到污染。基于上述结果，推测甘油对交联的明胶甘油水凝胶和细胞中的水具有较高的结合能力，可以将材料中的自由水转化为结合水的形式，抑制甘油水凝胶和细胞中的水分蒸发。上述观察结果可能是由于交联的明胶甘油水凝胶生物墨水作为细胞外基质(ECM)的替代品，以减少由于生物打印中缺乏ECM支持而导致的失巢凋亡的损失。此外，甘油形成吸附层，然后改变磷脂酰胆碱(细胞膜的主要脂质成分)的结构排列，随后脂质分子区域的扩大和凝胶相中胆碱方向的改变导致双层结构的改变。这些变化限制了酰基链并改变了脂质顺序，导致结构更加刚性。甘油可减少因低渗引起的细胞内水分子外流，导致细胞收缩和细胞死亡。
为了评估生物墨水在-80℃下对冷冻保存细胞的影响，在交联的明胶甘油水凝胶和交联明胶水凝胶中使用了ADSCs(图14a-c)，并对冻存1、3、7天后的ADSCs进行了活力测定(图5b-d,图14d)。如图5f-h所示，冷冻保存和恢复后1、3、7天Calcein-AM+ADSC在交联的明胶甘油水凝胶中的比例分别为79.05±4.70％、55.84±5.47％和62.09±9.74％，而交联明胶水凝胶中的Calcein-AM+ADSCs比例仅为11.37±6.09％、21.94±8.22％和13.99±4.39％，这表明交联的明胶甘油水凝胶中冷冻保存的细胞活力明显高于交联明胶水凝胶(p<0.05)。在3T3s中也得到了类似的结果(图14e-i)。基于上述结果，推测交联的明胶甘油水凝胶生物墨水在生物打印、3D打印组织的冷冻保存过程中具有细胞保护特性。
上述甘油水凝胶生物墨水的冷冻保存结果可能会受到水的动态变化的影响。甘油一直被用作一种可渗透的冷冻保护剂，可以穿透细胞膜提供细胞内冷冻保护。因为它们可以通过极性相互作用定位在磷脂的极性头部周围，并取代定位的水分子，然后渗透到细胞膜中。同时，甘油还可以通过氢键相互作用与水分子结合，通过“双因素冷冻损伤”理论抑制细胞内冰晶的形成或生长，提高冷冻保存细胞的存活能力。另一方面，甘油减少了由细胞外自由水形成的冰晶数量，并且甘油水凝胶生物墨水的结晶峰低于明胶水凝胶。因此我们推测甘油水凝胶生物墨水的作用机制是3D打印过程中对细胞的保护能力和抑制冰晶的形成。这样，甘油水凝胶不仅可以作为生物3D打印的支架材料，而且打印的组织可以直接冷冻保存，无需添加冷冻保护剂，这无疑在未来生物3D打印的临床应用中具有广阔的前景。

Claims (9)

1.一种甘油水凝胶生物墨水的制备方法，包括：
(1)将明胶和硝酸钙溶于水中，搅拌，得到明胶水溶液，凝胶化，得到明胶水凝胶；
(2)将步骤(1)中明胶水凝胶放入含戊二醛的硫酸铵水溶液中反应，得到交联明胶水凝胶，冲洗，浸泡在甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中，溶剂置换，得到交联的明胶甘油水凝胶；
(3)将交联的明胶甘油水凝胶熔化并冷却至室温后，与3T3细胞或ADSC细胞混合，随后将该混合溶液放入冰箱中使其凝胶化，得到甘油水凝胶生物墨水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中明胶、硝酸钙和水的质量比为4～8:1:15～25。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中凝胶化温度为0～10℃，凝胶化时间为20～40min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应温度为室温，反应时间为8～16h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中甘油与硫酸铵水溶液的质量比为0.95:1-1:0.95。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂置换时间为8～16h。
7.一种如权利要求1所述制备方法制备得到的甘油水凝胶生物墨水。
8.一种如权利要求7所述甘油水凝胶生物墨水在3D生物打印中的应用。
9.一种甘油水凝胶组织，其特征在于，将权利要求1所述甘油水凝胶生物墨水进行3D生物打印后获得。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101020061A (zh) * 2007-03-06 2007-08-22 西安交通大学 一种超声控释含药明胶微凝胶的制备方法
CN105879109A (zh) * 2016-03-31 2016-08-24 武汉华同信生物科技有限公司 一种医用胶粘剂及其制备方法
US20180117215A1 (en) * 2017-10-11 2018-05-03 Maryam Eslami Scaffold for skin tissue engineering and a method of synthesizing thereof
US20180355127A1 (en) * 2015-12-02 2018-12-13 University Of Otago Light-activated preparation of hydrogels
CN112759774A (zh) * 2020-12-28 2021-05-07 华南理工大学 一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用
CN113372580A (zh) * 2021-06-17 2021-09-10 西北工业大学 复合水凝胶的制备方法及细胞微环境仿生体系构建方法
CN113563607A (zh) * 2021-07-01 2021-10-29 广州达康基因技术有限公司 一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法
CN113633817A (zh) * 2021-06-24 2021-11-12 上海长征医院 原位聚合强力黏附的抗菌止血水凝胶及其制备方法与应用
CN113818095A (zh) * 2021-08-27 2021-12-21 东华大学 一种基于霍夫迈斯特效应的可大规模制备可降解明胶水凝胶纤维的湿法纺丝方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101020061A (zh) * 2007-03-06 2007-08-22 西安交通大学 一种超声控释含药明胶微凝胶的制备方法
US20180355127A1 (en) * 2015-12-02 2018-12-13 University Of Otago Light-activated preparation of hydrogels
CN105879109A (zh) * 2016-03-31 2016-08-24 武汉华同信生物科技有限公司 一种医用胶粘剂及其制备方法
US20180117215A1 (en) * 2017-10-11 2018-05-03 Maryam Eslami Scaffold for skin tissue engineering and a method of synthesizing thereof
CN112759774A (zh) * 2020-12-28 2021-05-07 华南理工大学 一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用
CN113372580A (zh) * 2021-06-17 2021-09-10 西北工业大学 复合水凝胶的制备方法及细胞微环境仿生体系构建方法
CN113633817A (zh) * 2021-06-24 2021-11-12 上海长征医院 原位聚合强力黏附的抗菌止血水凝胶及其制备方法与应用
CN113563607A (zh) * 2021-07-01 2021-10-29 广州达康基因技术有限公司 一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法
CN113818095A (zh) * 2021-08-27 2021-12-21 东华大学 一种基于霍夫迈斯特效应的可大规模制备可降解明胶水凝胶纤维的湿法纺丝方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P.J.史密斯等: "《植物体细胞遗传学简明教程》", 东北师范大学出版社, pages: 386 - 271 *

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