KR102253895B1 - 이중가교형(온도감응, 가시광감응형) 생체적합 키토산 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

이중가교형(온도감응, 가시광감응형) 생체적합 키토산 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드로겔 조성물 및 상기 하이드로겔 조성물을 이용하여 온도 가교 및 광가교의 이중가교가 가능한 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.

Description

이중가교형(온도감응, 가시광감응형) 생체적합 키토산 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법 {Dual-crosslinked (temperature sensitive, light sensitive) biocompatible chitosan hydrogel composition and its manufacturing method}
본 발명은 온도(열) 가교, 광가교, 또는 온도 가교 및 광가교의 이중가교된 구조를 가질 수 있는 하이드로겔 조성물 및 상기 하이드로겔 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
바이오 프린팅은 세포-함유 매체의 분배를 필요로 하기 때문에, 바이오 프린팅에서 소재의 세포적합성(cytocompatible)이 중요하다. 이를 위해 젤라틴, 젤라틴/키토산, 젤라틴/알지네이트, 젤라틴/피프로넥틴, 루트롤 F127(Lutrol F127)/알지네이트, 및 알지네이트 등의 재료를 사용한 하이드로겔이 바이오 프린팅에 사용되고 있다. 바이오 프린팅에 사용되는 상기 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물 등은 '바이오 잉크(bioink)'로도 지칭된다.
그런데, 바이오 프린팅에서는 세포의 배양이나 출력을 하는 경우 이물질이나 세균으로부터의 오염을 방지하는 것이 중요하며, 나아가 인체에 적용될 수 있도록 바이오 구조체의 정교함과 세밀함을 만족하고 또한, 세포 독성이나 세포적합성을 충분히 만족하는 구조물을 성형하는 것이 중요하다.
하이드로겔은 친수성이 우수하여 물을 쉽게 흡수할 수 있을 뿐만 아니라 강도, 모양 등을 쉽게 바꿀 수 있어 조직공학용 지지체 또는 약물전달 등에 사용되고 있다. 하이드로겔은 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 또는 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤되지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서, 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것이 특징이다.
한편, 하이드로겔의 생체적합성 고분자로 많이 사용되는 젤라틴은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질로써 생체 적합성이 높고 무독성의 생분해성 특성을 가지고 있다. 젤라틴은 비교적 낮은 온도와 농도에서도 점성을 부여하며, 젤라틴 용액은 냉각될 때 선명하고 탄력성 있는 열가역적 겔을 형성하지만, 수용액에서 쉽게 녹아버리기 때문에 그 안정성을 높여주기 위하여 포름알데히드, 또는 글루타알데히드 글루타알데히드와 같은 화학물질과의 가교 방법이 이용되고 있다. 그러나, 이들 가교제 성분이 내부에 미량이라도 잔류할 경우 이로 인해 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라 체내 이식 후 이들로 인한 주변 장기에 대해 독성을 나타낼 수 있다.
이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제2019-0016535호에서는 화학적 가교제 없이도 높은 점도 특성을 갖는 하이드로겔 조성물에 관하여 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1957415호 대한민국 공개특허 제2019-0016535호
본 발명은 온도(열) 가교, 광가교, 또는 온도 가교 및 광가교의 이중가교된 구조를 가질 수 있는 하이드로겔 조성물 및 상기 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일실시예에서,
하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 갖는 키토산 화합물을 포함하는 하이드로겔 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019047080924-pat00001
[화학식 2]
Figure 112019047080924-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019047080924-pat00003
화학식 1 내지 3에서,
R1은 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고,
R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 또는
Figure 112019047080924-pat00004
이며,
R5는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고,
p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
또한, 본 발명은 일실시예에서, 키토산 용액, 에폭시 화합물 및 메타크릴 무수물을 포함하는 혼합물로부터 하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 갖는 키토산 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019047080924-pat00005
[화학식 2]
Figure 112019047080924-pat00006
[화학식 3]
Figure 112019047080924-pat00007
화학식 1 내지 3에서,
R1은 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고,
R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 또는
Figure 112019047080924-pat00008
이며,
R5는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고,
p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
본 발명에 따른 키토산의 히드록시기와 아민기를 치환하여 제조된 하이드로겔 조성물을 이용하여, 체온 및 넓은 범위의 광(light)에서 민감한 키토산 하이드로겔을 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 하이드로겔은 키토산의 히드록시기를 치환하여 중성의 pH에서 키토산에 용해성기를 첨가하여 온도 반응성을 부여함으로써 체온과 유사한 온도에서 추가 가교제 없이 가교 결합할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 하이드로겔은 키토산의 아민기를 아크릴계 무수물을 이용하여 치환함으로써 하이드로겔의 강도를 향상시키고 세포 부착력을 부여할 수 있으며, 넓은 광 범위(또는 가시광) 하에서 가교 결합할 수 있다. 이에 따라, 자외선으로 인한 부작용을 최소화할 수 있고, 가볍고 유용한 하이드로겔을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 하이드로겔은 주사기와 튜브를 이용할 수 있는 점성을 가짐으로써 다양한 전달 방법에 적용할 수 있기 때문에 인쇄성을 가질 수 있으므로 4D 프린팅의 잉크로 활용 가능하다. 더불어, 실온의 물에서도 적절한 점도와 접착력으로 형상을 유지할 수 있고, 온도 가교 후에도 가벼운 가교가 가능하다는 특징이 있다.
도 1은 본 발명의 하이드로겔을 이용한 4D 바이오 프린팅을 위한 HBC-MA 활용의 개략도이다: (A) 광 가교 반응이 가능한 3% HBC-MA 용액을 pH 7.4로 설정한다. 압출된 실린더에 용액을 넣고 직접 수중에서 프린트한다. HBC-MA 용액은 물로 희석되지 않고, 압출된 모양을 유지하며 적색 광을 나타낸다.
(B) 상기 HBC-MA는 37 내지 40℃를 유지하는 물에서 온도 반응성을 나타내며, 온도 가교된 HBC-MA 하이드로겔은 분홍색을 띤다. 이때 동결 건조 하이드로겔을 SEM을 이용하여 내부 공극을 관찰하면 기공 크기가 커서 세포가 자유롭게 움직일 수 있다.
(C) 가시광선에 노출된 부분을 나타낸 것으로, 온도 가교에 의해 반응이 관측되는 상태에서도 가시광에 의한 광가교 현상이 발생한다. 가시광 가교된 하이드로겔은 황색을 나타낸다. 이때, 동결 건조 하이드로겔을 SEM을 이용하여 내부 공극을 관찰하면, 기공의 크기가 작아 세포가 통과 할 수 없는 크기이며 세포 부착으로 세포가 포착된다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 키토산, HBC 및 HBC-MA의 1H NMR을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 키토산, HBC 및 HBC-MA의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 실시예에 있어서, 3 중량% HBC-MA의 유변학 적 분석 및 G' 및 G"이 교차하는 겔화점을 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 실시예에 있어서, 다양한 pH 및 가시광선 노출 시간을 갖는 HBC-MA의 기계적 특성을 나타낸 것이다(*p<0.05, ***p<0.001).
도 6은 본 발명의 실시예에 있어서, WST-1 분석에 의한 NIH3T3 세포의 생존력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 오차 막대는 각 시료에 대한 반복 측정의 SE를 나타낸 것이다(각 그룹당 n=6).
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 실시예에 있어서, 온도 가교 결합된 HBC-MA 하이드로겔 내부의 SEM 이미지(도 7a), 이중 가교 HBC-MA 하이드로겔 내부의 SEM 이미지(도 7b), 및 이중 가교 HBC-MA 하이드로겔 내부의 700 배 확대된 SEM 이미지(도 7c)이다.
도 8a 내지 도 8e는 본 발명의 실시예에 있어서, 4D 프린팅의 가능성을 시험하기 위해 HBC-MA를 프린팅하여 가교시키는 과정을 나타낸 사진이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "4D(4th demension) 프린팅"은 미리 설계된 시간이나 임의 환경 조건이 충족되면 스스로 모양을 변경 또는 제조하여 새로운 형태로 바뀌는 제품(object)을 3D 프린팅하는 기술을 의미하고, 구체적으로는 물리적, 생물학적 물질 등 자가변형이 가능한 재료를 모양과 특성을 바꿀 수 있도록 프로그램하는 것을 의미한다. 여기서, 4D는 수학 또는 물리의 4차원(four-dimensional space)과는 상이한 의미이다.
본 발명에서, "알킬기"는 직쇄(linear) 또는 분지(branched) 상 포화 탄화수소로부터 유도된 작용기를 의미할 수 있다. 알킬기의 구체적인 예로서는, 메틸기(methyl group), 에틸기(ethyl group), n-프로필기(n-propyl group), 이소프로필기(iso-propyl group), n-부틸기(n-butyl group), sec-부틸기(sec-butyl group), t-부틸기(tertbutyl group), n-펜틸기(n-pentyl group), 1,1-디메틸프로필기(1,1-dimethylpropyl group), 1,2-디메틸프로필기, 2,2-디메틸프로필기, 1-에틸프로필기, 2-에틸프로필기, n-헥실기, 1-메틸-2-에틸프로필기, 1-에틸-2-메틸프로필기, 1,1,2-트리메틸프로필기, 1-프로필프로필기, 1-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 2-에틸부틸기, 2-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.
4D 프린팅, 바이오 프린팅 등 생체에 사용하는 소재 중 많이 사용되는 생체적합성 고분자인 키토산은 비독성, 생분해성, 및 생체적합성이 있으나, 중성 pH에서 불용성인 특성에 의해 응집하는 단점이 있다. 이에, 키토산을 중성에서 이용하여 그 활용을 다양한 분야로(의료 등) 넓히기 위해, 본 발명에서는, 체온과 유사한 온도에서 가교가 일어날 수 있게 하며 UV에 비해 무해한 파장대의 빛(가시광 등)을 매개체로 하여 가교가 일어남으로써 이중가교가 가능한 하이드로겔을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 갖는 키토산 화합물을 포함하는 하이드로겔 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019047080924-pat00009
[화학식 2]
Figure 112019047080924-pat00010
[화학식 3]
Figure 112019047080924-pat00011
화학식 1 내지 3에서, R1은 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 또는
Figure 112019047080924-pat00012
이며, R5는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
하나의 예로서, 상기 R1은 수소, 메틸기 또는 에틸기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 메틸기, 에틸기, 또는
Figure 112019047080924-pat00013
이며, R5는 수소 또는 메틸기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.30이며, 0.10≤r≤0.30이되, p>0인 조건을 만족할 수 있다.
또한, 하나의 예로서, 상기 R1은 수소, 메틸기 또는 에틸기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 메틸기, 에틸기, 또는
Figure 112019047080924-pat00014
이며, R5는 수소 또는 메틸기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.30≤q≤0.40이며, 0.30≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 1은 키토산을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 키토산 화합물은 하기 화학식 4로 나타내는 반복단위를 포함할 수 있다:
[화학식 4]
Figure 112019047080924-pat00015
상기 화학식 4에서, R6은 서로 독립적으로 수소 또는
Figure 112019047080924-pat00016
이고, R7은 R5는 수소 또는 메틸기이다.
상기 키토산 화합물은 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위가 광 및 열 중 어느 하나에 의해 가교된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 키토산의 히드록시기와 아민기가 치환되어 가교된 구조를 가짐으로써, 체온과 유사한 온도 및 광에 민감한 키토산 하이드로겔 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 키토산의 히드록시기를 치환하여 중성의 pH에서 키토산에 용해성기를 첨가하여 온도 반응성을 부여함으로써 체온과 유사한 온도에서 추가 가교제 없이 가교 결합할 수 있다. 또한, 키토산의 아민기를 아크릴계 무수물을 이용하여 치환함으로써 하이드로겔의 강도를 향상시키고 세포 부착력을 부여할 수 있으며, 가시광 하에서 가교 결합할 수 있다. 이로 인해 자외선으로 인한 부작용을 최소화할 수 있고, 가볍고 유용한 하이드로겔을 제공할 수 있다.
상기 키토산 화합물은 30 내지 50℃의 온도에서 가교된 구조를 유지할 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산 화합물은 30 내지 45℃, 30 내지 40℃, 30 내지 35℃, 35 내지 50℃, 40 내지 50℃, 또는 45 내지 50℃의 온도에서 가교된 구조를 유지할 수 있다.
상기 키토산 화합물은 300 nm 내지 800nm의 파장을 갖는 광 조사 조건에서 가교된 구조를 유지할 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산 화합물은 300 내지 700 nm, 300 내지 600 nm, 300 내지 500 nm, 300 내지 400 nm, 400 내지 800 nm, 500 내지 800 nm, 600 내지 800 nm, 또는 700 내지 800 nm 범위의 파장을 갖는 광 조사 조건에서 가교된 구조를 유지할 수 있다.
상기 키토산의 분자량은 50,000 내지 190,000 Da일 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산의 분자량은 50,000 내지 150,000 Da, 50,000 내지 120,000 Da, 50,000 내지 100,000 Da, 50,000 내지 80,000 Da, 80,000 내지 190,000 Da, 120,000 내지 190,000 Da, 또는 150,000 내지 190,000 Da일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔은 점성이 좋으며 주사기와 튜브를 이용할 수 있는 점성을 가짐으로써 다양한 전달 방법에 적용할 수 있기 때문에 인쇄성을 가질 수 있으므로 4D 프린팅의 잉크로 활용 가능하다. 더불어, 실온의 물에서도 적절한 점도와 접착력으로 형상을 유지할 수 있고, 온도 가교 후에도 가벼운 가교가 가능하다는 특징이 있다.
예를 들어, 도 1은 본 발명의 하이드로겔 조성물을 4D 프린팅에 이용하는 경우, 프린팅 과정을 나타낸 개략도이다: (A) 압출된 실린더에 하이드로겔 조성물을 넣고 직접 수중에서 프린트하며, 하이드로겔 조성물은 물로 희석되지 않고, 압출된 모양을 유지하며 적색 광을 나타냄.
(B) 상기 하이드로겔 조성물은 30 내지 50℃를 유지하는 물에서 온도 반응성을 나타내며, 온도 가교된 하이드로겔은 분홍색을 띰. 이때 하이드로겔은 내부 공극(기공) 크기는 세포 부착 시 세포가 자유롭게 움직일 수 있을 정도로 큰 크기임.
(C) 상기 하이드로겔의 가시광선에 노출된 부분을 나타낸 것으로, 온도 가교에 의해 반응이 관측되는 상태에서도 가시광에 의한 광가교 현상이 발생할 수 있음. 가시광 가교된 하이드로겔은 황색을 나타내며, 이때 하이드로겔은 내부 공극의 크기가 작아 세포가 통과할 수 없는 크기이므로, 세포 부착 시 세포가 포착됨.
또한, 본 발명은 키토산 용액, 에폭시 화합물 및 메타크릴 무수물을 포함하는 혼합물로부터 하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 갖는 키토산 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019047080924-pat00017
[화학식 2]
Figure 112019047080924-pat00018
[화학식 3]
Figure 112019047080924-pat00019
화학식 1 내지 3에서,
R1은 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 또는
Figure 112019047080924-pat00020
이며, R5는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
하나의 예로서, 상기 R1은 수소, 메틸기 또는 에틸기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 메틸기, 에틸기, 또는
Figure 112019047080924-pat00021
이며, R5는 수소 또는 메틸기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.30이며, 0.10≤r≤0.30이되, p>0인 조건을 만족할 수 있다.
또한, 하나의 예로서, 상기 R1은 수소, 메틸기 또는 에틸기이고, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 메틸기, 에틸기, 또는
Figure 112019047080924-pat00022
이며, R5는 수소 또는 메틸기이고, p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.30≤q≤0.40이며, 0.30≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족할 수 있다.
상기 하이드로겔 조성물은 키토산 용액과 에폭시 화합물을 혼합하여 반응시켜 키토산의 수산기(OH기)를 치환(에폭시화)한다(제1 반응). 상기 반응에 의해 키토산에 수용성 및 온도 반응 특성을 부여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 반응은 중성 pH에서 불용성 키토산에 용해성기를 첨가하여 수용성 키토산을 생성하고 온도 반응성을 부여할 수 있다. 이때 실온(24℃) 이하에서는 용액 상태로 유지되며, 체온과 유사한 30 내지 50℃에서는 하이드로겔을 형성할 수 있고, 온도가 다시 실온 이하가 되면 용액 상태로 되돌아갈 수 있다.
상기 에폭시 화합물은 화학식 6으로 나타내는 화합물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다:
[화학식 6]
Figure 112019047080924-pat00023
화학식 6에서, R9는 수소 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기이다.
상기 제1 반응된 키토산 용액은 메타크릴 무수물과 혼합하여 반응시켜 키토산의 아민기를 메타크릴화(제2 반응)하여 상기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 갖는 키토산 화합물를 포함하는 하이드로겔 조성물을 제조할 수 있다. 상기 메타크릴 무수물은 상기 제1 반응된 키토산이 상대적으로 약한 가교 결합력을 가지며 세포 부착성이 낮으므로, 이를 보완하기 위해 수행되었다. 이에 따라, 자외선으로 인한 부작용을 최소화하기 위해 보다 유용한 하이드로겔을 제공할 수 있는 하이드로겔을 제조할 수 있다.
상기 메타크릴 무수물은 하기 화학식 5로 나타내는 화합물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다:
[화학식 5]
Figure 112019047080924-pat00024
화학식 5에서, R8은 수소 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기이다.
구체적으로, 키토산 화합물을 제조하는 단계는, 키토산 용액과 에폭시 화합물을 반응시켜 화학식 1 및 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 중간 화합물을 형성하는 단계; 및 상기 중간 화합물과 메타크릴 무수물을 반응시켜 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 중간 화합물을 형성하는 단계 이전에, 염기 화합물을 이용하여 키토산 용액의 pH를 중성, 구체적으로는 키토산 용액의 pH를 6 내지 8로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 염기 화합물은 암모니아(NH3), 수산화암모늄(NH4OH), 수산화마그네슘(Mg(OH)), 수산화칼륨(KOH), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화나트륨(NaOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화알루미늄(Al(OH)3), 수산화철(Fe(OH)2), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산칼륨(K2CO3), 메틸아민(CH3NH2) 및 아닐린(C6H5NH2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔 조성물을 제조한 후, 하이드로겔 조성물을 온도 가교시킬 수 있다. 온도 가교는 체온과 비슷한 온도에서 수행될 수 있으며 추가 가교제 없이도 용이하게 가능하다. 상기 온도 가교하는 것은 30 내지 50℃ 온도 범위에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 온도 가교는 30 내지 45℃, 30 내지 40℃, 30 내지 35℃, 35 내지 50℃, 35 내지 45℃, 37 내지 50℃, 40 내지 50℃, 또는 45 내지 50℃에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 온도 가교 후 상기 온도 범위를 유지하여, 이후 광가교 시에도 30 내지 50℃의 온도를 유지하는 것일 수 있다.
상기 하이드로겔 조성물은 액체 상태이고, 이를 온도 가교하여 하이드로겔을 제조하면 겔(gel) 상태이므로 액체 상태일 때 보다 활용성이 증가하지만 여전히 강도가 낮기 때문에, 따라서 광가교를 추가하여 하이드로겔을 제조함으로써 강도를 증가시켜 용도를 다양화하고자 하였다.
이에, 상기 온도 가교한 후, 광가교를 수행할 수 있다. 하이드로겔 조성물을 광가교시키는 것은, 하이드로겔 조성물에 광개시제를 혼합하고, 가시광을 조사하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 광가교 시 광의 파장은 300 내지 800 nm 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 광의 파장은 300 내지 700 nm, 300 내지 600 nm, 300 내지 500 nm, 300 내지 400 nm, 400 내지 800 nm, 500 내지 800 nm, 600 내지 800 nm, 또는 700 내지 800 nm 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 광의 파장은 광개시제 물질에 따라 요구되는 범위가 결정될 수 있으며, 본 발명에 따른 광가교 시 다양한 범위의 광개시제의 사용이 가능하다.
상기 광개시제는 트리에탄올아민, N-비닐카프로락탐, 리튬 아릴포스피네이트, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 벤질디메틸케탈, 에틸벤조인에테르, 이소프로필벤조인에테르, 2,2-디에톡시아세토페논, 2-히드록시-2-메틸-1-페닐프로판-1-온, 1-히드록시시클로헥실페닐케톤, 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 벤질벤조에이트, 에오신와이, 리보플라빈, 로즈벵갈, 및 벤조일이소부틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
상기 온도 가교 및 광가교된 하이드로겔은, 가시광선에 노출되면 색이 변하는 시각 효과를 가질 수 있고, 온도 가교는 pH가 중성일 때 발생하여 중성 pH에서 하이드로겔을 형성하기 위한 초고속 가교 속도를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔은 체온 및 pH 조건에 적합하며 넓은 파장 범위에서 반응할 수 있다. 그 결과 체온 범위 내에서 온도 가교가 일어나고 300 내지 800 nm의 범위에서 광가교된 하이드로겔을 형성할 수 있다. 이에 따라, 온도 상승으로 수십 초 내에 가교가 일어나고, 온도가 낮을 때 가교가 해제되도록 가역성을 갖는 온도에서 가교 하이드로겔이 형성될 수 있고, 이때 하이드로겔 내부의 기공(pore) 공간은 넓고 낮은 접착제일 수 있다. 또한, 300 내지 800 nm 범위의 광, 구체적으로, 가시광에 의해 광가교된 하이드로겔이 형성될 수 있고, 이때 하이드로겔 내부의 기공 공간은 좁아졌으며 구조적으로 매우 탄력적일 수 있으며, 높은 탄성 및 접착성을 나타낼 수 있다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 물질
키토산(MW 50-190 kDa, DD 75-85 %), 메타크릴산 무수물, 1,2-에폭시부탄, EosinY(염료 함량 99%), TEA (트리에탄올 아민), NVP (1-비닐-2-피롤리디논, 나트륨 수산화물 억제제,> 99 %)는 Sigma Co.Ltd에서 구입했다. 본 실시예에서 사용된 다른 모든 화학 약품은 분석 등급의 것이다.
2. 히드록시부틸 메틸아크릴아미드 키토산( Hydroxybutyl methylacrylamide chitosan, HBC - MA )의 제조
본 실시예에서 HBC-MA를 제조하기 위하여, 먼저 키토산(저분자, Sigma-aldrich) 1 g을 0.1 M HCl 60 mL에 완전히 용해하였다. 상기 키토산 용액을 5 M의 KOH를 이용하여 pH 6으로 조절하였다. pH의 조절 후 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane) 20 mL를 첨가하고, 1,2-에폭시부탄의 휘발을 피하기 위하여 24 시간 동안 잘 저어 주었다. 이때, 키토산의 히드록시기와 에폭시부탄은 염기촉매 에폭사이드 반응을 한다. 상기 반응은 24 시간 동안 55℃에서 수행되었다. 모든 반응이 완료된 후 원심 분리를 이용하여 1,2-에폭시부탄을 제거하여 히드록시부틸 키토산(Hydroxybutyl chitosan, HBC) 용액을 제조하였다. 상기 HBC 용액을 -20℃에서 동결시킨 후 1 일 동안 냉동고에서 냉동시킨 다음, 약 4 일 동안 동결-건조 공정 후에 순수한 HBC로 제조하였다.
상기 수득된 HBC 1 g을 0.1 M HCl 60 mL에 하룻밤 동안 용해시킨 후, 15 mL의 메타크릴산 무수물(methacrylic anhydride)을 첨가하였다. 이때, 마그네틱 바를 사용하여 교반하였고, 기포가 발생하지 않도록 250 rpm의 회전 속도를 사용하였다. 이때, 키토산의 아미노기와 메타크릴산 무수물은 마이클 반응(Michael reaction)을 한다. 4 시간 동안 반응시킨 후, 5 M의 KOH를 이용하여 용액의 pH를 7로 조절하였다. 투석 튜브(dialysis tube)(12 내지 14 kDa)를 이용하여 희석하였고, 남아있는 메타크릴산 무수물을 증류수를 1 일에 2 회씩 교체하여 일주일 동안 제거하였다. 메타크릴산 무수물의 제거 후, -20℃에서 동결시킨 후, 이를 1 일 동안 냉동고에서 추가로 동결시킨 다음, 4 일 동안 동결-건조시켜 순수한 히드록시부틸 메틸아크릴아미드 키토산(Hydroxybutyl methylacrylamide chitosan, HBC-MA)을 수득하였다.
[ 실험예 ]
1. 1H 핵자기공명(1H Proton Nuclear Magnetic Resonance , 1H-NMR) 분광법 측정
키토산(CS), HBC 및 HBC-MA의 화학 구조를 FTIR-4100 (Jasco, JAPAN)을 사용하여 분석하였고, 모든 샘플을 1%(w/v)의 중수(Deuterium Oxide, D2O) 중 0.25% 중수소 염화물(Deuterium chloride, DC1)에 용해시키고 500 MHz FT-NMR 분광기(Varian Ltd., USA)를 사용하여 분석하였다.
HBC-MA를 볼텍싱(vortexing)에 의해 1%(w/v)의 중수(Deuterium Oxide, D2O) 중 0.25% DC1에 용해시켰다. 대조군으로서, 동일한 용매에서 히드록시부틸-키토산(hydroxybutyl-chitosan) 및 키토산도 동일한 농도로 제조하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 500 MHz FT-분광기를 사용하여 기록하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 2.06 ppm의 피크는 N-아세틸 글루코사민의 3 개의 양성자에 기인하고, 2.99 ppm의 피크는 글루코사민 잔기(H-2)의 양성자에 귀속된다. 3.5 ppm에서 4.0 ppm까지의 피크는 비-아노머 양성자(non-anomeric protons)(H-3, H-4, H-5, H-6)에 해당한다. HBC의 1H NMR 스펙트럼에서, 0.92 ppm에서의 새로운 신호는 히드록시부틸의 메틸기의 치환으로 인해 나타난다. 5.7 및 6.11 ppm은 메타크릴아미드(methacrylamide)를 대체하여 메타크릴로일기(methacrylolyl groups)에서 공유 결합으로서 발생하는 메틸렌 피크이다. 메타크릴로일기의 메틸 양성자를 가진 HBC-MA에 결합된 MA로 1.8 ppm을 표지하였다. 이것은 하이드록실-부틸 치환에 대한 키토산의 HBC로의 치환이 -NH2의 양성자에 메타크릴아미드의 성공적인 첨가를 가져온다는 것을 증명하였다. 메타크릴화도는 C-키토산 잔기의 H3-H6 피크의 적분 면적 대 3.3 및 3.8 ppm(H-5)의 적분 면적 대 5.6 및 6.4 ppm에서의 메타크릴레이트기(methacrylate group)의 CH2 피크의 적분 면적(H-2)이다. 1 H NMR에 의한 방법을 이용하여 변성(modification) 후의 키토산의 메타크릴화 정도는 24.8%이었다.
2. FTIR 분광법
FTIR 비교를 통해 HBC-MA의 합성을 확인할 수있었다. FTIR 분석은 키토산(CS), HBC 및 HBC-MA의 화학 구조를 FTIR-4100 (Jasco, JAPAN)을 사용하여 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
키토산의 FTIR에서 3247 내지 3398 cm-1 영역의 광대역은 OH와 NH의 진동의 중첩에 해당한다. 1024와 1067 cm-1의 밴드는 키토산에서 6-OH의 독특한 밴드를 나타냈다. 1153 cm-1 피크는 일반적으로 비대칭 C-O-C 브릿지에 기인한다. 2911 및 2873 cm-1의 흡수 밴드는 C-H 대칭 및 비대칭 스트레칭으로 나타낼 수 있다. HBC의 FTIR에서 주로 6-OH를 나타내는 1020 내지 1060 cm-1의 밴드는 FTIR 키토산 스펙트럼의 밴드보다 적다. 2944 내지 2892 cm-1 및 1585 cm-1에서의 새로운 피크는 1,2-에폭시부탄의 도입으로 인해 새로 형성된 CH3기의 굽힘 및 C-H 신장을 나타낸다. 하이드록시부틸기(hydroxybutyl group)는 주로 6-OH로 치환됨을 알 수 있었다. HBC-MA의 FTIR에서, NH2 밴드와 관련된 1614 cm-1에서 HBC-MA의 피크 상승이 관찰되었다. 새로 형성된 아미드 3, 2 및 1 밴드의 흡광도는 1306 cm-1, 1542 cm-1 및 1710 cm-1에서 일치했다. 이로 인해, HBC로부터 HBC-MA로의 추가 치환된 것을 확인할 수 있었다.
3. 유동학적 ( rheological ) 분석
레오미터(rheometer)가 용액에서 하이드로겔로의 변화의 동적 기계적 특성을 측정하기 위해 사용되었고, 3% HBC-MA 하이드로겔을 MCR302 레오미터(Anton Paar Ltd., Austria)를 사용하여 측정하였다. 측정 조건은 가열 속도 1℃/min, 주파수 1 rad/s에서 HBC 수용액의 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")을 측정하였고, 이 과정에서 온도는 4에서 50℃로 증가시켰다.
측정 결과는 도 4a 및 도 4b에 나타내었으며, 도 4a는 3 중량% HBC-MA의 유변학적 분석을 나타낸 것이고, 도 4b는 G' 및 G"이 교차하는 겔화점을 나타낸 것이다.
겔화점은 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")이 동일한 온도로 정의된다. 손실 탄성률(G")은 그래프의 시작 부분에서 4℃의 저장 탄성률(G')보다 높지만 두 탄성률 모두 매우 낮은 수치를 나타낸다. 온도가 상승함에 따라 졸-겔 전이가 일어나면서 저장 탄성률도 약간 상승한다. 27.2℃에서 G'와 G"는 동일하고, 27.2℃는 겔화점이며, 온도가 겔화점을 지나 상승함에 따라 저장 탄성률이 보다 빠른 속도로 증가하였다. 반대로, 온도가 낮아지면, 이미 알려진 바와 같이 이전 연구들에 의해 가역적으로 변화될 수 있다는 것이 확인되었다. 이것은 HBC-MA의 겔화 조건이 생체적합성 환경과 매우 유사함을 나타낸다. 즉, 온도 가교-하이드로겔은 체온과 유사한 환경에서 형성될 수 있음을 알 수 있다.
4. 기계적 시험
프리폴리머(prepolymer) 용액을 직경 8 mm 및 높이 2.5 mm인 PDMS 몰드에 넣고, 40℃ PBS가 담긴 페트리 접시 내에 슬라이드 글래스 위에 놓았다. 각각의 샘플들을 40℃의 PBS에서 10 초, 20 초 및 30 초 동안 35 mW/cm2 가시광선(450 내지 550 nm)에 노출시켰다. 또한, 15% 메타크릴레이션 정도(methacrylation degree)를 갖는 HBC-MA를 각각 10 초, 20 초 및 30 초 동안 pH 6.4, 7.4 및 8.4에서 노출시켰다.
슬라이드 글래스를 꺼낸 후 조심스럽게 몰드를 제거하고 kimwipe로 가볍게 닦았다. 0.05 N의 방아쇠 하중(trigger load)과 0.05 mm/s의 시험 속도로 텍스쳐 분석기(brookfield)를 사용하여 시험하였다. 압축 계수는 5 내지 15% 변형에 해당하는 선형 영역의 기울기로 결정되었다.
측정 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었으며, 도 5a는 상이한 가시광선 노출 시간을 갖는 HBC-MA의 기계적 특성을 나타낸 것이고, 도 5b는 상이한 pH 노출 시간을 갖는 HBC-MA의 기계적 특성을 나타낸 것이다.
가시광선 노출 시간 및 pH의 영향에 대한 하이드로겔의 기계적 특성은 우선, 30 초 내에 하이드로겔을 형성하는 초고속 가교 속도를 가진다. 일반적으로 pH 7.4의 HBC-MA 3%(w/v)의 대표적인 곡선에서 볼 수 있듯이, 가시광선 노출 시간을 늘리면 모든 3 가지 시료 pH 농도에 대한 모든 변형률에서의 강성이 증가함을 알 수 있다. 압축 계수는 pH 값에서 유의하게 높았다. 이러한 거동은 10 초에 관찰되었지만 통계적으로 유의하지는 않았다. 마찬가지로 동일한 pH 값을 같은 시간에 사용하면 가시광선 노출 시간이 약간 증가함에 따라 모든 조건에서 계수가 급격히 증가하였다. 모든 조건은 10 초인 시료를 제외하고 유의한 차이가 있었다(*p<0.05, ***p<0.001). 오차 막대는 8 개의 시료에 대해 수행된 측정의 표준편차(standard deviations, SD)를 나타낸 것이다.
5. WST -1( water - soluble tetrazolium salt -1) 분석법
세포 생존력에 대한 HBC-MA 농도의 효과를 평가하기 위해, NIH3T3을 상이한 농도의 HBC-MA 용액을 함유하는 배지와 함께 배양하였다. 대조군으로서, NIH3T3 세포의 세포 독성을 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)만을 사용하여 배지에서 배양한 시료를 이용하였다.
구체적으로, NIH3T3 섬유아세포(fibroblast)를 10% 소태아혈청(FBS)을 함유한 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)에서 배양하고 유지시켰다. 상기 세포는 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양 배지는 매일 교체하였다. 세포 배양에 대한 HBC-MA 용액의 독성 효과를 조사하기 위해, 4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설폰산염으로 세포의 생존력을 시험하였다(WST-1 분석). HBC-MA 용액(2 mg/mL)을 제조하였고, 0.22 μm 공극 크기(MillexTM, MA)를 갖는 PES 주사기 필터를 사용하여 멸균시켰다. 멸균된 HBC-MA 용액을 세포 배양 배지에 첨가하였고, 최종 농도는 0.002, 0.02, 0.2, 1 및 2 mg/mL이었다. 세포를 50 U/mL 페니실린이 보충된 DMEM(10% FBS) 100 μL에 96-well 플레이트에 웰(well)당 10,000 세포로 접종하였고 5% CO2 대기에서 37℃로 24 시간 동안 배양한 후, 주어진 농도의 DMEM 배지에서 100 μL HBC-MA를 첨가하였다. 24, 48 및 72 시간 배양 후, WST-1 분석을 시험하였다. 1 웰당 DMEM 배지 100 mL에서 배양한 세포에 10 μL의 WST-1을 넣고 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 시료의 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계(Microplate Spectrophotometer)(Biotek Instruments, Inc., USA)를 사용하여 480 nm에서 측정하였다.
측정 결과는 도 6에 나타내었고, 오차 막대는 각 시료에 대한 반복 측정의 표준 오차(standard error, SE)를 나타낸 것이다(각 그룹당 n=6).
도 6을 참조하면, 2.0 mg/mL의 고농도에서도 NIH3T3 섬유아세포의 흡광도 그래프는 대조군에 비해 상당히 높았으며 통계적으로 중요하다(p<0.001). 세포 생존 능력은 HBC-MA가 없는 대조군에 대한 72 시간에 2.0 mg/mL의 흡광도에 비해 약 28% 더 높은 흡광도를 나타냈다. 결론적으로, HBC-MA는 NIH3T3 섬유아세포에 대해 독성을 나타내지 않았다.
6. 주사전자현미경 분석
HBC-MA하이드로겔의 형태에 대한 교차 결합 방법의 영향을 SEM으로 관찰하였다. 상이한 조건에서 형성된 하이드로겔 샘플을 구조적 붕괴를 방지하기 위해 액체 질소 하에서 동결-건조시켰다. 24 시간 동안 동결 건조시킨 후, 모든 샘플을 날카로운 칼로 절단하여 내부에 대한 명확한 관찰을 제공하였다. 동결 건조된 HBC-MA 샘플을 카본 테이프를 통해 스터브(stub)에 고정시키고 백금으로 코팅하였다. 단면 형태는 전계 방출 주사전자현미경으로 측정되었다. 형태학은 SU-8010 주사전자현미경(Hitachi, Japan)을 사용하여 조사되었다.
도 7a는 온도 가교 결합된 HBC-MA 하이드로겔 내부의 SEM 이미지, 도 7b는 이중 가교 HBC-MA 하이드로겔 내부의 SEM 이미지, 및 도 7c는 이중 가교 HBC-MA 하이드로겔 내부의 700 배 확대된 SEM 이미지를 나타내었다.
SEM 이미지는 가교 방법에 따라 하이드로겔의 공극 크기의 차이를 명확하게 나타내었다. 모든 SEM 샘플을 3% HBC-MA와 혼합하였다. SEM으로 관찰된 기공은 수화된 하이드로겔의 기공 크기보다 크다. 그러나, 동일한 방식으로 동결 건조된 샘플은 그 구조에 동일한 영향을 미쳤다. 온도 가교 하이드로겔은 기공을 형성하고 다공성이지만 기공이 작지 않았다. 한편, 온도 가교 결합 후에 부가적인 광가교 결합을 갖는 하이드로겔은 상대적으로 보다 많은 기공을 형성하였고 작은 직경의 기공을 형성하여 우수한 기계적 특성을 나타내며 단단한 네트워크 구조를 유도하였다.
7. 4D 프린팅의 가능성 시험
상기 실시예에서 제조된 HBC-MA(15%)를 0.05 M HCl에 3%(W/V)로 완벽하게 녹인 후, 에오신 Y(Eosin Y) 0.1 mM, 1.5% 트리에탄올아민(triethanolamine, TEOA),　1% N-비닐카프로락탐(N-vinylcaprolactam, VC)을 상기 HBC-MA 용액에 첨가하였다. 교반이 완료된 후 NaOH를 이용하여 pH를 7.4에 맞춰주었다. HBC-MA 용액은 0.22 μm 기공 크기를 갖는 PES 주사기 필터(MillexTM, MA)를 사용하여 멸균시켰다. 공기 방울을 완전히 제거한 후 제조된 HBC-MA 용액은 주사기에 옮겨 담고 20G needle을 준비하였다. HBC-MA 용액은 항상 상온보다 서늘한 곳에 보관되었다. 3차 증류수를 오토클레이브에 멸균시킨 후 40℃를 유지시켜 페트리 디쉬에 옮겨 담아 멸균된 수중공간을 만들었다. 20G needle이 달린 주사기를 이용하여 HBC-MA 용액을 얇게 분사하였다. 주사기의 압축력은 손으로 조절하였다. 시료의 모양은 자유자재로 만들어 낼 수 있었으며, 곡선과 직선이 혼합된 디자인으로 하였다. 가시광 필터(450 내지 550 nm)가 설치된 Omnicure S2000(Lumen Dynamics, Canada)를 사용하여 광가교시켰고, 광 세기는 35 mW/cm2이었다. 시료와 광원의 거리가 2.5 cm 유지되도록 하였다. 선형으로 이루어진 시료를 따라서 빛에 노출시켰다.
상기 과정 및 결과는 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다.
주사기에 담긴 용액은 40℃가 유지되는 물속에 분사되는 순간부터 온도 가교 반응을 일으키기 시작하였다. 아주 빠른 시간 내에 반응이 이루어졌다. 약 10 초 정도의 시간이 흐르면 불투명한 색을 띠면서 가교반응을 시각적으로도 확인할 수 있었다. 반응물은 체온과 유사한 온도에서 적당한 점성 및 탄성(약 400 Pa)을 가지는 하이드로겔이 되었다. 또한 내부적으로 기공을 가진 스캐폴드(scaffold)를 구성하였다. 그러나, 3% HBC-MA가 온도 가교된 하이드로젤의 세포 부착률은 상당히 떨어졌다. 기공 크기가 커서 세포의 유입이 용이하지만 유출의 문제점도 있다. 온도 가교만을 이용한 프린팅은 세포를 담지하기엔 어려움이 많은 것으로 사료된다. 본 실험예에서 여기에 가시광을 노출시켰다. contrast filter를 이용하여 관찰하였다. 가시광에 노출된 하이드로젤은 수중에서도 빛을 흡수하여 발광하였다. 하이드로젤은 물속에서도 가시광에 빠르게 반응하였다. 또한, 온도 가교 후에도 가시광 가교에 어려움은 없었다. 그러나, 광원 면적의 한계가 있어 선형으로 이루어진 샘플을 따라가며 빛에 노출시켰다. 더 많은 빛을 흡수한 부분일수록 황색에 가까워졌다. 샘플 전체적으로 색이 옅어졌음을 알 수 있었다. 광가교 반응물은 UV에 비해 많은 안전성을 가지는 가시광 파장대에서 탄력성 있는 강도(20 내지 50 kPa)를 지니는 광가교 하이드로겔이 되었다. 강도가 높아진 하이드로젤은 핀셋을 이용하여 자유롭게 옮길 수 있었다. 메타크릴레이트 치환에 의해 광가교된 키토산 하이드로젤은 세포 부착률이 향상된다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 키토산 화합물을 포함하고,
    상기 키토산 화합물은 광 및 열에 의해 가교된 구조이며,
    30 내지 50℃의 온도 조건 및 400 내지 800nm의 파장을 갖는 광 조사 조건에서 가교된 구조를 유지하는 하이드로겔 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021010121327-pat00025

    [화학식 2]
    Figure 112021010121327-pat00026

    [화학식 3]
    Figure 112021010121327-pat00027

    화학식 1 내지 3에서,
    R1은 메틸기이고,
    R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소 또는
    Figure 112021010121327-pat00028
    이며,
    R5는 메틸기이고,
    p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
  2. 제1항에 있어서,
    p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.30이며, 0.10≤r≤0.30이되, p>0인 조건을 만족하는 하이드로겔 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.30≤q≤0.40이며, 0.30≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족하는 하이드로겔 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    키토산 화합물은 하기 화학식 4로 나타내는 반복단위를 포함하는 하이드로겔 조성물:
    [화학식 4]
    Figure 112021010121327-pat00031

    상기 화학식 4에서,
    R6은 서로 독립적으로 수소 또는
    Figure 112021010121327-pat00032
    이고,
    R7은 메틸기이다.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 키토산 용액, 에폭시 화합물 및 메타크릴 무수물을 포함하는 혼합물로부터 하기 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 키토산 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 하이드로겔 조성물의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112021010121327-pat00033

    [화학식 2]
    Figure 112021010121327-pat00034

    [화학식 3]
    Figure 112021010121327-pat00035

    화학식 1 내지 3에서,
    R1은 메틸기이고,
    R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 수소 또는
    Figure 112021010121327-pat00036
    이며,
    R5는 메틸기이고,
    p, q 및 r은 키토산 화합물에 포함된 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위의 몰 분율로서, p+q+r=1이고, 0.20≤q≤0.50이며, 0.20≤r≤0.50이되, p>0인 조건을 만족한다.
  9. 제8항에 있어서,
    메타크릴 무수물은 하기 화학식 5로 나타내는 화합물인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물의 제조방법:
    [화학식 5]
    Figure 112021010121327-pat00037

    화학식 5에서,
    R8은 메틸기이다.
  10. 제8항에 있어서,
    에폭시 화합물은 하기 화학식 6으로 나타내는 화합물인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물의 제조방법:
    [화학식 6]
    Figure 112021010121327-pat00038

    화학식 6에서,
    R9는 메틸기이다.
  11. 제8항에 있어서,
    키토산 화합물을 제조하는 단계는,
    키토산 용액과 에폭시 화합물을 반응시켜 화학식 1 및 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 중간 화합물을 형성하는 단계; 및
    상기 중간 화합물과 메타크릴 무수물을 반응시켜 화학식 1 내지 3으로 나타내는 반복단위를 포함하는 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    중간 화합물을 형성하는 단계 이전에,
    염기 화합물을 이용하여 키토산 용액의 pH를 6 내지 8로 조절하는 단계를 더 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 염기 화합물은 암모니아(NH3), 수산화암모늄(NH4OH), 수산화마그네슘(Mg(OH)), 수산화칼륨(KOH), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화나트륨(NaOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화알루미늄(Al(OH)3), 수산화철(Fe(OH)2), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산칼륨(K2CO3), 메틸아민(CH3NH2) 및 아닐린(C6H5NH2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 하이드로겔 조성물의 제조방법.
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