WO2020096004A1 - 動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置 - Google Patents

動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置 Download PDF

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一公 川島
雄毅 羽生
景太 福本
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Definitions

  • the present invention relates to an animal cell growth promoter, an animal cell culture medium, and an animal cell culture device.
  • a serum medium in which fetal bovine serum or the like is added to the medium as a factor having a function of maintaining cell growth or a serum-free medium in which hormones or growth factors are added in place of serum is generally used. ..
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2013-247927 discloses that rice bran extract has a growth promoting action on cultured animal cells.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2011-182736 discloses that the cell growth rate can be increased by culturing animal cells in a medium containing a hydrolyzate of a ⁇ -conglycinin concentrate.
  • JP-A-7-188292 discloses that a glycoprotein contained in the culture supernatant of human-derived fibroblasts promotes the growth of human vascular endothelial cells and hepatocytes.
  • JP-A-5-301893 discloses that a protein contained in a cell culture supernatant obtained by culturing a human-derived glioma cell line has a growth promoting effect on glial cells and fibroblasts.
  • the object of the present invention is to provide a novel animal cell growth promoter, animal cell culture medium and animal cell culture device.
  • One embodiment according to the present invention is an animal cell growth promoter containing, as an active ingredient, the culture supernatant of the embryonic membrane of an avian or reptile egg.
  • the egg may be a chicken egg.
  • the animal cell growth promoter may be a cell growth agent for muscle cells, visceral cells, or nervous cells, or a cell growth agent for liver cells, pancreatic cells, or oviduct cells.
  • Another embodiment of the present invention is a cell culture medium containing the cell growth promoter described in any of the above.
  • Another embodiment according to the present invention is a first culture tank for culturing cells derived from embryonic membrane of an avian or reptile egg, a second culture tank for culturing animal cells for the purpose of proliferation, and A first flow path for flowing the medium from the first culture tank to the second culture tank; a second flow path for flowing the medium from the second culture tank to the first culture tank; The cell culture medium is refluxed in the order of the first flow channel, the second culture tank, and the second flow channel, and the first flow channel and the second flow channel are set according to the state of the animal cells and / or the cell culture medium.
  • An animal cell culture device comprising: a medium flow rate control unit that controls the flow of the cell culture medium in a flow path.
  • a medium introduction path for introducing a fresh cell culture medium into the refluxing cell culture medium, and a medium removal for removing the cell culture medium after culturing from the refluxing cell culture medium The medium flow rate control unit further comprises a passage, and the medium flow control unit introduces the fresh cell culture medium from the medium introduction passage and the medium removal passage according to the state of the animal cell and / or the cell culture medium. The removal of the culture medium for cell culture after the culture may be controlled.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the cell proliferation apparatus in one embodiment of the present invention.
  • the tissue shown in the figure stomach, skeletal muscle, heart, gallbladder, intestine, brain, bursa of Fabricius and bone
  • 5 is a photograph of observation results showing that cell proliferation is promoted in cells of No. 1 is a graph quantitatively showing the results of FIG. 1 for liver, pancreas, and oviduct-derived cells in one example of the present invention.
  • cells derived from the tissues shown in the figure are a graph showing that cell proliferation is promoted by.
  • Birds or reptiles that are the origin of the eggs that collect the germinal membranes include, but are not limited to, quail, chickens, lizards, snakes, crocodiles, turtles, etc., and are birds or reptile animals that have germinal membranes of eggs. I wish I had it.
  • the embryonic membrane refers to a membrane tissue that is formed outside the embryo body during the development process of birds and reptiles, and has functions such as protection of the embryo, nutrition and respiration, and is not involved in the construction of the body after hatching or birth.
  • the serosa located on the outermost side of the embryo, the amniotic membrane that wraps the embryo body, the allantois that creates the urinary sac, the chorioallantoic membrane (CAM) in which the serosa and allantois are partially adhered, and the yolk.
  • CAM chorioallantoic membrane
  • Examples include the yolk sac that wraps.
  • the culture supernatant of the germinal membrane is a medium in which the germinal membrane is isolated and cultured.
  • the germinal membrane to be cultured may be one kind or a mixture of plural kinds among the above-mentioned membranes such as serosa, amniotic membrane, allantoic membrane, allantoic membrane and yolk sac.
  • the embryonic membrane can be collected from the egg by a known method (for example, see Eiji Ichishima: Chemistry and Biology, 13: 8, p489-497 (1975)).
  • the embryo membrane can be isolated by the following method. First, after fertilized eggs are incubated for a predetermined period under conditions suitable for artificial hatching, the eggshell is split, and (1) the allantoic membrane is obtained by taking out the swollen membrane generated from the ventral side of the posterior part of the digestive tract of the embryo. (2) The amniotic membrane can be obtained by taking out the transparent membranous tissue around the fetus in which blood vessels are not running, and (3) the yolk sac is the membranous tissue surrounding the yolk.
  • the serosa can be obtained by removing the outermost membranous tissue surrounding all the elements in the egg. Further, when the incubation time is extended, the serosa and the allanto partially fuse to form the chorioallantoic membrane. At this time, the chorioallantoic membrane is in contact with the eggshell and can be obtained by taking out the membrane tissue in which blood vessels are running.
  • the optimal incubation period may be determined depending on each animal and the target membrane tissue. For example, in the case of chicken eggs, 4 days to 21 days are preferable, 10 days to 18 days are more preferable, and 13 days to 15 days is more preferred.
  • these embryonic membranes When culturing these embryonic membranes, they may be cultured in a membranous state, but by physically disrupting the membrane or performing enzymatic treatment with a protease (eg, collagenase, elastase, dispase, papain). Alternatively, cells derived from the embryonic membrane may be isolated and cultured.
  • a protease eg, collagenase, elastase, dispase, papain.
  • cells derived from the embryonic membrane may be isolated and cultured.
  • a medium used for general animal cell culture can be used, and examples thereof include, but are not limited to, DMEM and F12.
  • supplements usually added as a medium additive may be added.
  • the conditions used for usual animal cell culture can be used, and typically, a carbonate buffer medium is used for culturing at 5% CO 2, 37 ° C. It is not limited and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the culture time is not particularly limited, but is preferably 1 to 7 days, more preferably 2 to 6 days. After culturing, the supernatant may be collected and added to the cell culture medium as it is, but a medium obtained by removing solid matters such as cell debris by filtration or centrifugation may be added.
  • the amount of the culture supernatant added to the cell culture medium is not particularly limited as long as it is an effective amount at which the growth effect of the cultured cells is recognized, but the final concentration in the medium is preferably 20% or more, more preferably 35% or more. , 50% or more is more preferable.
  • the type of animal cells to be cultured in the cell culture medium to which this culture supernatant is added is not particularly limited, and muscle cells such as smooth muscle cells, cardiomyocytes and skeletal muscle cells, heart cells, hepatocytes, cells derived from the stomach Examples thereof include visceral cells such as cells derived from intestines, and neural cells such as nerve cells and glial cells.
  • muscle cells such as smooth muscle cells, cardiomyocytes and skeletal muscle cells, heart cells, hepatocytes, cells derived from the stomach
  • visceral cells such as cells derived from intestines
  • neural cells such as nerve cells and glial cells.
  • the animal species from which the cells are derived is not particularly limited, and examples thereof include humans, mice, rats, monkeys and pigs.
  • this culture supernatant obtained by culturing cells derived from embryonic membrane to the animal cell culture medium, it is possible to promote the growth of the cultivated animal cells. Therefore, this culture supernatant can be used as an animal cell growth promoter.
  • the cell expansion device of the present invention comprises a first culture tank for culturing cells derived from embryonic membrane of an avian or reptile egg, a second culture tank for culturing animal cells for the purpose of proliferation, and a first culture.
  • the cell culture medium is refluxed in the order of the channel, the second culture tank, and the second channel, and the first channel and the second channel are flown according to the state of the animal cells and / or the cell culture medium.
  • a medium flow rate control unit that controls the flow of the cell culture medium.
  • the first culture tank culture according to the method for culturing cells derived from embryonic membrane, which is performed when preparing the animal cell growth promoting agent as described above, is performed.
  • the second culture tank culturing according to the culturing method of culturing animal cells in the medium to which the animal cell growth promoter is added as described above is performed.
  • the first culture tank and the second culture tank are fluidly connected by the first flow path and the second flow path.
  • the first culture tank 11 and the second culture tank 12 may be directly connected by the first flow channel 21 and the second flow channel 22.
  • one or a plurality of other culture tanks may be provided, and the other culture tank and the first culture tank 11 or Various configurations can be considered for connection with the two culture tanks 12.
  • a third culture tank 13 is provided in the middle of the first flow path 21, and the flow path extends from the first culture tank 11 through the third culture tank 13 to the second culture tank 13. It may be connected to the tank 12.
  • FIG. 1 (B) a third culture tank 13 is provided in the middle of the first flow path 21, and the flow path extends from the first culture tank 11 through the third culture tank 13 to the second culture tank 13. It may be connected to the tank 12.
  • FIG. 1 (B) a third culture tank 13 is provided in the middle of the first flow path 21, and the flow path extends from the first culture tank 11 through the third culture tank 13 to the second culture tank 13.
  • a third culture tank 13 is provided independently of the second culture tank 12, and the flow channels are the first flow channel 21 and the second flow channel 22. Separately, a third channel 31 and a fourth channel 32 that fluidly connect the first culture tank 11 and the third culture tank 13 may be provided.
  • the cells are cultured in the first culture tank 11 or the second culture tank 12. Can affect or influence their culture.
  • the influence of the culture in the first culture tank 11 and the culture in the culture tanks other than the second culture tank 12 from the culture in the first culture tank and the culture in the second culture tank There are various possible effects on the culture in the first culture tank and the culture in the second culture tank.
  • cell growth, cell differentiation, tissue morphogenesis, pH adjustment of the medium Examples include prevention of bacterial contamination.
  • the third culture tank 13 cells that are different from the cells in the second culture tank 12 and that can grow in a medium in which cells derived from germinal membrane are cultivated.
  • the cells can be simultaneously grown in the second culture tank 12 and the third culture tank 13.
  • by culturing cells derived from the embryonic membrane different from the first culturing tank 11 in the third culturing tank 13 it is possible to further promote the growth of the cells cultivated in the second culturing tank 12. it can.
  • the cells cultured in the third culture tank 13 are cells capable of growing in a medium in which cells derived from germinal membranes are cultured and secreting factors that grow the cells cultured in the second culture tank 12. Good.
  • the tanks may be connected to each other by a pipe, and the pipe may form a flow path.
  • a valve may be installed in these pipes.
  • the medium flow rate control unit monitors the state of the cells being cultured and / or the medium for cell culture, and according to the state, the flow of the medium for cell culture in each flow path through this valve (for example, flow velocity, flow rate, etc.). ) May be controlled.
  • the structure of the valve is not particularly limited as long as it is a well-known structure such as a flange type or a screw type, and the method for adjusting the valve is not particularly limited, and a known structure such as an air-driven type, an electromagnetic type, an electric type, or a hydraulic type is used. Any adjustment method may be used. Further, in order to prevent the backflow of the cell culture medium in the tube, the tube may be provided with a check valve.
  • Examples of the state of the cells and / or cell culture medium monitored by the medium flow rate control unit include, but are not limited to, the state of cell proliferation, the state of cell differentiation, and the pH of the medium.
  • the state of cell proliferation can be determined by, for example, counting the number of cells per unit area or measuring the ratio of the area occupied by cells to the bottom area of the plate.
  • the state of cell differentiation can be determined by measuring fluorescence by, for example, introducing into the cells a marker gene that expresses upon differentiation and emits fluorescence.
  • the pH of the medium for example, the pH may be directly measured, or a pigment that changes depending on the pH may be added to the medium and the color may be used for the determination.
  • a fertilized egg of a chicken is incubated at 37 ° C, and 14 days later, the eggshell is broken, and the membrane tissue in contact with the eggshell and in which blood vessels are running is taken out as chorioallantoic membrane, while the membrane surrounding the yolk is taken out.
  • the tissue was taken out as an yolk sac and each of these membrane tissues was immersed in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). These membrane tissues were physically finely cut with tweezers or the like, and then centrifuged to remove the supernatant.
  • a collagenase solution (200 IU / mL) was added to each isolated membrane tissue, and the mixture was kept at 37 ° C for 1 hour and then centrifuged again to remove the supernatant.
  • HBSS was added to each collagenase-treated membrane tissue, filtered through a 40 ⁇ m filter, and the resulting filtrate was centrifuged to remove the supernatant to collect chorioallantoic membrane-derived cells or yolk sac-derived cells.
  • the chorioallantoic membrane-derived cells or yolk sac-derived cells are preserved, the cells are suspended in a cell freezing solution (10% DMSO solution) and frozen by gradually cooling to -80 ° C, and then -80 ° C. Saved in.
  • the chorioallantoic membrane-derived cell or yolk sac-derived cell obtained in (1) contains 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (PS) solution
  • FBS fetal bovine serum
  • PS penicillin-streptomycin
  • the cells were seeded in a cell culture dish (diameter 10 cm) at a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells / dish, and the amount was 2 to 3 at 37 ° C. and 5% CO 2 environment. Cultured for 4 days.
  • fertilized chicken eggs were incubated at 37 ° C, and 14 days later, the eggshells were broken and the chicken embryos were taken out.
  • a stomach, skeletal muscle, heart, gall bladder, intestine, brain, bursa of Fabricius and bone were isolated from the embryonic day 14 chicken, and each was immersed in an HBSS solution. Then, cells derived from each tissue were isolated by the same method as in (1).
  • the culture solution of cells derived from each tissue was removed from the dish, and PBS was added to wash the cells. After removing the PBS, a trypsin-EDTA solution was added and the cells were detached by incubating at 37 ° C. for 1 to 2 minutes, and then FBS / PS-containing DMEM was added to stop the reaction. All the solution containing the detached cells was collected and centrifuged to obtain cells. Further, FBS.PS was added to the cells to suspend the cells, and 20 ⁇ L of the cell suspension was mixed with 20 ⁇ L of trypan blue solution. The number of live cells not stained with trypan blue in this cell suspension was counted under a microscope using a hemocytometer.
  • FIG. 3 shows the average number of cells and the standard error in the case of using the chorioallantoic membrane culture supernatant for cells derived from the liver, pancreas, and oviduct in three petri dishes.
  • the addition of chorioallantoic membrane culture supernatant resulted in approximately 2.5 to 4 times more cells than the case without addition of chorioallantoic membrane culture supernatant.
  • the addition of chorioallantoic membrane culture supernatant resulted in approximately 2.5 to 4 times more cells than the case without addition of chorioallantoic membrane culture supernatant. was growing.
  • the present invention has made it possible to provide a novel animal cell growth promoter, an animal cell culture medium, and an animal cell culture device.

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Abstract

【課題】本発明は、新規な動物細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。具体的には、鳥類または爬虫類の卵の胚膜の培養上清を動物細胞増殖促進剤として用いる。例えば、動物細胞培養用培地に、鳥類または爬虫類の卵の胚膜の培養上清を有効成分として含有する細胞増殖剤を添加することにより、動物細胞の増殖を促進することができる。

Description

動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置
　本発明は、動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置に関する。
　動物細胞の培養においては、一般に細胞増殖を維持する機能を有する因子として培地にウシ胎児血清等を添加した血清培地や血清の代わりにホルモンや増殖因子などを添加した無血清培地が用いられている。
　それらの因子以外に、特開２０１３－２４７９２７号公報には、米糠抽出物が培養動物細胞に対して増殖促進作用を有することが開示されている。また、特開２０１１－１８２７３６号公報には、β－コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した培地で動物細胞を培養すると細胞増殖率を高めることができることが開示されている。さらに、特開平７－１８８２９２号公報には、ヒト由来の線維芽細胞の培養上清に含まれる糖蛋白質がヒト血管内皮細胞及び肝実質細胞の増殖を促進することが開示されている。さらに、特開平５－３０１８９３号公報には、ヒト由来グリオーマ細胞株を培養した細胞培養上清に含まれる蛋白質がグリア細胞や線維芽細胞に対する増殖促進効果を有することが開示されている。
　本発明は、新規な動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置を提供することを目的とする。
　本発明にかかる一実施態様は、鳥類または爬虫類の卵の胚膜の培養上清を有効成分として含有する動物細胞増殖促進剤である。前記卵がニワトリ卵であってもよい。前記動物細胞増殖促進剤が、筋肉系細胞、内臓系細胞、または神経系細胞に対する細胞増殖剤であってもよく、肝臓細胞、膵臓細胞、輸卵管細胞に対する細胞増殖剤であってもよい。
　本発明にかかる他の一実施態様は、上記いずれかに記載の細胞増殖促進剤を含有する細胞培養用培地である。
　本発明にかかる他の一実施態様は、鳥類または爬虫類の卵の胚膜由来の細胞を培養する第１の培養槽と、増殖を目的とする動物細胞を培養する第２の培養槽と、第１の培養槽から第２の培養槽へ培地を流す第１の流路と、第２の培養槽から第１の培養槽へ培地を流す第２の流路と、第１の培養槽、第１の流路、第２の培養槽、第２の流路の順に細胞培養用培地を還流させ、前記動物細胞及び／又は前記細胞培養用培地の状態に従って、第１の流路及び第２の流路における前記細胞培養用培地の流れを制御する培地流量制御部と、を備える動物細胞培養装置である。また、前記還流する前記細胞培養用培地に新鮮な細胞培養用培地を導入するための培地導入路と、前記還流する前記細胞培養用培地から培養後の細胞培養用培地を除去するための培地除去路と、をさらに有し、前記培地流量制御部は、前記動物細胞及び／又は前記細胞培養用培地の状態に従って、前記培地導入路からの前記新鮮な細胞培養用培地の導入及び前記培地除去路からの前記培養後の細胞培養用培地の除去を制御するものであってもよい。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１８年１１月８日付で出願した日本国特許出願２０１８－２１０９１０に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施形態における細胞増殖装置の模式図である。 本発明の一実施例において、ニワトリ卵漿尿膜の培養上清を培地に添加した場合に、図に示した組織（胃、骨格筋、心臓、胆嚢、腸、脳、ファブリキウス嚢及び骨）由来の細胞で細胞増殖が促進されることを示す観察結果の写真である。 本発明の一実施例において、肝臓、膵臓、および輸卵管由来の細胞について、図１の結果を定量的に示したグラフである。 本発明の一実施例において、ニワトリ卵卵黄嚢の培養上清を培地に添加した場合に、図に示した組織（胃、筋肉、心臓、肝臓、腸、脳、ファブリキウス嚢及び骨）由来の細胞で細胞増殖が促進されることを示すグラフである。
　本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝動物細胞増殖促進剤＝＝
　本開示の動物細胞増殖促進剤は、鳥類または爬虫類の卵の胚膜の培養上清を有効成分として含有する。
　胚膜を採取する卵の由来である鳥類または爬虫類は、ウズラ、ニワトリ、トカゲ、ヘビ、ワニ、カメなどが例示できるが、これらに限定されず、卵の胚膜を有する鳥類または爬虫類の動物であればよい。
　ここで胚膜とは、鳥類・爬虫類の発生過程において、胚体外に形成され、胚の保護・栄養・呼吸などの機能を果し、孵化または出生後の体の構築には加わらない膜組織を意味し、例えば、胚の最外側に位置する漿膜、胚体を包む羊膜、尿嚢をつくる尿膜、漿膜と尿膜とが部分的に癒着した漿尿膜(chorioallantoic membrane: CAM)、卵黄を包む卵黄嚢などが挙げられる。
　胚膜の培養上清とは、胚膜を単離して培養した培地のことである。培養する胚膜は、上述した漿膜、羊膜、尿膜、尿漿膜、卵黄嚢などの膜のうち、一種類を培養しても、複数種類を混合して培養してもよい。
　胚膜は、公知の方法で卵から採取することができる（例えば、一島英治：化学と生物，１３巻８号，ｐ４８９－４９７（１９７５）などを参照のこと）。例えば、具体的には、以下のような方法で胚膜を単離できる。まず、有精卵を所定期間人工孵化に適した条件でインキュベートした後、卵殻を割り、（１）尿膜は、胚の消化管後部の腹側から生じている膨らんだ膜を取り出すことで得ることができ、（２）羊膜は、胎児の周囲に存在する血管の走行していない透明の膜組織を取り出すことで得ることができ、（３）卵黄嚢は、卵黄を包んでいる膜組織を取り出すことで得ることができ、（４）漿膜は、卵内のすべての要素を囲んだもっとも外側にある膜組織を取り出すことで得ることができる。さらに、インキュベートする時間を長くすると、漿膜と尿膜は部分的に融合し、漿尿膜となる。この時期に、漿尿膜は、卵殻と接していて、血管が走行している膜組織を取り出すことで得ることができる。インキュベートする期間は、各動物によって、また目的の膜組織によって、最適期間を適宜決めればよく、例えばニワトリ卵の場合、４日～２１日間が好ましく、１０日～１８日間がより好ましく、１３日～１５日間がさらに好ましい。これら胚膜を培養する際、膜状のまま培養してもよいが、物理的に膜を破砕したり、プロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、パパインなど）で酵素処理を行ったりすることにより、胚膜から胚膜由来の細胞を単離して培養してもよい。
　胚膜の培養には、一般的な動物細胞培養に利用する培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２などが例示できるが、これらに限定されない。この培地には、培地添加剤として通常配合されているサプリメントを添加してもよい。培養条件も、通常の動物細胞培養に用いられる条件を使用することができ、典型的には、炭酸バッファー系の培地を用いて、５％ＣＯ２、３７℃で培養するが、培養条件はこれに限定されず、当業者が適宜選択することができる。培養時間は特に限定されないが、１～７日間が好ましく、２～６日間がより好ましい。培養後は、上清を回収し、そのまま細胞培養用培地に添加してもよいが、フィルトレーションや遠心分離などで、細胞残渣などの固形物を除去して得られる培地を添加してもよい。細胞培養用培地への培養上清の添加量は、培養細胞の増殖効果が認められる有効量であれば特に制限されないが、培地中の最終濃度は２０％以上が好ましく、３５％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましい。
　この培養上清を添加した細胞培養用培地で培養する動物細胞の種類は特に限定されず、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などの筋肉系細胞、心臓細胞、肝細胞、胃由来の細胞、腸由来の細胞などの内臓系細胞、または神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞が例示できる。細胞が由来する動物種も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタなどが例示できる。
　このように、胚膜由来の細胞を培養して得られた培養上清を動物細胞培養用培地に添加することにより、培養している動物細胞の増殖を促進させることができる。従って、この培養上清を動物細胞増殖促進剤として用いることができる。
　なお、胚膜由来の細胞の培養上清を動物細胞増殖促進剤として用いる場合、同時に他の細胞増殖因子を用いても構わない。
＝＝細胞増殖装置＝＝
　本発明の細胞増殖装置は、鳥類または爬虫類の卵の胚膜由来の細胞を培養する第１の培養槽と、増殖を目的とする動物細胞を培養する第２の培養槽と、第１の培養槽から第２の培養槽へ培地を流す第１の流路と、第２の培養槽から第１の培養槽へ培地を流す第２の流路と、第１の培養槽、第１の流路、第２の培養槽、第２の流路の順に細胞培養用培地を還流させ、前記動物細胞及び／又は前記細胞培養用培地の状態に従って、第１の流路及び第２の流路における前記細胞培養用培地の流れを制御する培地流量制御部と、を備える。
　第１の培養槽では、上述したような、動物細胞増殖促進剤を調製する際に行う胚膜由来の細胞の培養方法に準じた培養を行う。第２の培養槽では、上述したような、動物細胞増殖促進剤を添加した培地で動物細胞を培養する培養方法に準じた培養を行う。
　第１の培養槽と第２の培養槽は、第１の流路と第２の流路とで流体接続されている。例えば、図１（Ａ）のように、第１の培養槽１１と第２の培養槽１２が第１の流路２１と第２の流路２２とで直接接続されていてもよい。第１の培養槽１１と第２の培養槽１２が流体接続されている限り、１つあるいは複数の他の培養槽を設けてもよく、他の培養槽と、第１の培養槽１１または第２の培養槽１２との接続も様々な構成が考えられる。例えば、図１（Ｂ）のように、第１の流路２１の途中に第３の培養槽１３を設け、流路が第１の培養槽１１から第３の培養槽１３を通じて第２の培養槽１２に接続されていてもよい。あるいは、図１（Ｃ）のように、第２の培養槽１２とは独立に、第３の培養槽１３を設け、流路も、第１の流路２１と第２の流路２２とは別に、第１の培養槽１１と第３の培養槽１３を流体接続する第３の流路３１と第４の流路３２を設けてもよい。（Ｂ）や（Ｃ）の場合、第３の培養槽１３で培養する細胞を適当に選択することによって、その細胞が第１の培養槽１１での培養や第２の培養槽１２での培養から影響を受けたり、それらの培養に影響を及ぼしたりすることができる。
　ここで、第１の培養槽１１での培養や第２の培養槽１２以外の培養槽での培養が、第１の培養槽での培養や第２の培養槽での培養から受ける影響や、第１の培養槽での培養や第２の培養槽での培養に与える影響は様々なものが考えられ、例えば、細胞の増殖、細胞の分化、組織の形態形成、培地のｐＨ調製、培地への細菌混入予防などが例示できる。
　例えば、具体的には、第３の培養槽１３に、第２の培養槽１２とは異なる細胞であって、胚膜由来の細胞を培養した培地で増殖できる細胞を入れておくことで、第２の培養槽１２と第３の培養槽１３で、同時に細胞を増殖させることができる。あるいは、第３の培養槽１３で、第１の培養槽１１とは異なる胚膜由来の細胞を培養することによって、第２の培養槽１２で培養している細胞の増殖をさらに促進させることができる。あるいは、第３の培養槽１３で培養する細胞が、胚膜由来の細胞を培養した培地で増殖でき、かつ第２の培養槽１２で培養する細胞を増殖させる因子を分泌する細胞であってもよい。
　槽と槽の間は管で接続され、その管が流路を形成してもよい。また、これらの管には、弁が設置されていてもよい。培地流量制御部が、培養している細胞及び／又は細胞培養用培地の状態をモニターし、その状態に従い、この弁を介して各流路における細胞培養用培地の流れ（例えば、流速、流量など）を制御してもよい。
　弁の構造は特に限定されず、フランジ形、ねじ込み形などの公知の構造であればよく、弁の調整方法も特に限定されず、空気駆動式、電磁式、電動式、油圧式などの公知の調整方法であればよい。また、細胞培養用培地の管内での逆流を防ぐため、管に逆止弁を備えていてもよい。
　培地流量制御部がモニターする細胞及び／又は細胞培養用培地の状態とは、例えば、細胞の増殖の様子や、細胞の分化の様子、培地のｐＨなどが例示できるが、これらに限定されない。細胞の増殖の様子は、例えば、単位面積当たりの細胞数を数えたり、プレートの底面積に対する細胞の占める面積の割合などを測ったりすることで判断できる。細胞の分化の様子は、例えば、分化すると発現して蛍光発光するマーカー遺伝子を細胞に導入しておくことによって、蛍光を測定することで判断できる。培地のｐＨは、例えば、直接ｐＨを測定してもよく、あるいはｐＨによって変化する色素を培地に添加しておき、その色で判断してもよい。
（１）漿尿膜又は卵黄嚢の単離方法
　試験に用いる漿尿膜又は卵黄嚢は、以下の方法によってそれぞれ単離した。
　ニワトリの有精卵を３７℃でインキュベートし、１４日後に卵殻を割って、卵殻と接していて、血管が走行している膜組織を漿尿膜として取り出すとともに、一方で卵黄を包んでいる膜組織を卵黄嚢として取り出し、これらの膜組織をＨＢＳＳ（Hank’s Balanced Salt Solution ）中にそれぞれ浸漬した。これらの膜組織をピンセットなどで物理的に細かく裁断した後、遠心分離を行い、上清を除去した。
　単離した各膜組織に、コラゲナーゼ溶液（２００ＩＵ／ｍＬ）を加えて３７℃で１時間保持した後、再度遠心分離を行い、その上清を除去した。このコラゲナーゼ処理した各膜組織にＨＢＳＳを加え、４０μｍのフィルターでろ過し、得られた濾液を遠心分離して上清を除去することにより漿尿膜由来細胞又は卵黄嚢由来細胞を回収した。なお、漿尿膜由来細胞又は卵黄嚢由来細胞を保存する場合には、これを細胞凍結液（１０％ＤＭＳＯ溶液）に懸濁し、－８０℃まで徐々に冷却することにより凍結し、－８０℃で保存した。
（２）漿尿膜又は卵黄嚢の培養方法
　（１）で得られた漿尿膜由来細胞又は卵黄嚢由来細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン・ストレプトマイシン（ＰＳ）溶液を含有したＤＭＥＭ（以下、ＦＢＳ・ＰＳ含有ＤＭＥＭと称する）に加え、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの濃度で細胞培養用ディッシュ（直径１０ｃｍ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２～４日間培養した。
（３）培養上清の回収方法
　（２）で示した培養方法によって調製した漿尿膜培養液又は卵黄嚢培養液を０．２２μｍのフィルターを用いてろ過し、得られた濾液を動物細胞増殖促進剤として動物細胞培養に用いた。なお、調製した培養上清を保存する場合には、－２０℃で凍結して保存した。
（４）動物細胞培養
（４-１）各組織からの細胞の単離方法
　培養に用いるニワトリ細胞は、以下の方法によって単離した。
　まず、ニワトリの有精卵を３７℃でインキュベートし、１４日後に卵殻を割って、ニワトリ胚を取り出した。このニワトリ１４日胚から胃、骨格筋、心臓、胆嚢、腸、脳、ファブリキウス嚢及び骨を単離し、それぞれＨＢＳＳ溶液に浸漬した。その後、（１）と同様の方法で各組織由来の細胞を単離した。
（４-２）各組織からの細胞の培養方法
　各組織由来の細胞は、ＦＢＳ・ＰＳ含有ＤＭＥＭに（３）で調製した漿尿膜培養上清又は卵黄嚢培養上清を等量加えた培養用培地を用いて、（２）と同様の方法で培養を行った。なお、対照として、漿尿膜培養上清又は卵黄嚢培養上清を添加せずにＦＢＳ・ＰＳ含有ＤＭＥＭのみの培地を用いた以外は同じ条件で培養した細胞を用いた。
（４-３）各培養における、細胞数の計測方法
　（４－２）の結果を、肝臓、膵臓、輸卵管、胃、筋肉、心臓、腸、脳、ファブリキウス嚢及び骨由来の細胞について、定量的に評価した。ここで、各組織由来の細胞数は、以下の方法によって計測した。
　まず、各組織由来の細胞の培養液をディッシュから除去し、ＰＢＳを加えて細胞をそれぞれ洗浄した。ＰＢＳを取り除いた後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で１～２分間インキュベートして細胞を剥離させた後、ＦＢＳ・ＰＳ含有ＤＭＥＭを加えて反応を停止させた。剥離した細胞を含む溶液をすべて回収し、これを遠心分離することで細胞を得た。さらに、この細胞にＦＢＳ・ＰＳを加えて懸濁し、この細胞懸濁液２０μＬとトリパンブルー溶液２０μＬとを混合した。この細胞懸濁液中で、トリパンブルーで染色されていない生きた細胞の数を、顕微鏡下で、血球計算盤を用いて計測した。
（４－４）結果
　まず、漿尿膜培養上清を添加した培地で約３～５日間培養した時の細胞を位相差顕微鏡で観察した。図２にその細胞の写真を示すが、どの細胞を培養した場合も、（３）で調製した漿尿膜培養上清を添加した場合のほうが、漿尿膜培養上清を添加しない場合より細胞数が多かった。これは、添加した漿尿膜培養上清によって細胞の増殖が促進されたことを示している。
　この結果を定量的に示すため、肝臓、膵臓、輸卵管由来の細胞に対して漿尿膜培養上清を用い、３個のシャーレで実験した場合の細胞数の平均と標準誤差を図３に示したが、肝臓、膵臓、輸卵管由来の細胞のいずれの場合も、漿尿膜培養上清を添加したほうが、漿尿膜培養上清を添加しない場合に比べて約２．５～４倍に細胞が増殖していた。
　次に、卵黄嚢培養上清を添加した培地を用いて、胃、筋肉、心臓、肝臓、腸、脳、ファブリキウス嚢及び骨由来の細胞に対する増殖促進効果についても同様に調べたところ（ｎ＝２）、図４に示したように、いずれの場合も卵黄嚢培養上清を添加した場合のほうが、漿尿膜培養上清を添加しない場合より細胞数が多かった。これは、添加した卵黄嚢培養上清によって細胞の増殖が促進されたことを示している。
　本発明によって、新規な動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置を提供することができるようになった。

Claims (8)

  1. 　鳥または爬虫類の有精卵由来の胚膜の培養上清を有効成分として含有する動物細胞培養増殖促進剤
  2. 　前記胚膜が羊膜、漿尿膜及び卵黄嚢からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の動物細胞増殖促進剤。
  3. 　前記卵が鶏卵である、請求項１又は２に記載の動物細胞増殖促進剤。
  4. 　筋肉系細胞、内臓系細胞、または神経系細胞に対する細胞増殖剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の動物細胞増殖促進剤。
  5. 　肝臓細胞、膵臓細胞、輸卵管細胞に対する細胞増殖剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の動物細胞増殖促進剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞増殖促進剤を含有する細胞培養用培地。
  7. 　鳥類または爬虫類の卵の胚膜由来の細胞を培養する第１の培養槽と、
    　増殖を目的とする動物細胞を培養する第２の培養槽と、
    　第１の培養槽から第２の培養槽へ培地を流す第１の流路と、
    　第２の培養槽から第１の培養槽へ培地を流す第２の流路と、
    　第１の培養槽、第１の流路、第２の培養槽、第２の流路の順に細胞培養用培地を還流させ、前記動物細胞及び／又は前記細胞培養用培地の状態に従って、第１の流路及び第２の流路における前記細胞培養用培地の流れを制御する培地流量制御部と、を備える動物細胞培養装置。
  8. 　前記還流する前記細胞培養用培地に新鮮な細胞培養用培地を導入するための培地導入路と、
    　前記還流する前記細胞培養用培地から培養後の細胞培養用培地を除去するための培地除去路と、をさらに有し、
    　前記培地流量制御部は、前記動物細胞及び／又は前記細胞培養用培地の状態に従って、前記培地導入路からの前記新鮮な細胞培養用培地の導入及び前記培地除去路からの前記培養後の細胞培養用培地の除去を制御する、請求項７に記載の動物細胞培養装置。
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