WO2023229039A1 - 細胞培養方法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to a method for culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells.
- An object of the present invention is to provide a novel method for culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells.
- One embodiment of the present invention is a method for culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells, which includes the step of culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells in a medium containing a culture supernatant of epithelial cells.
- culture supernatant does not need to substantially contain serum.
- the epithelial cells may be renal tubular cells, MDCK cells, renal tubular epithelial cells, or RL34 cells.
- the present invention can provide a novel method for culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells.
- the supernatant obtained by culturing rat myoblasts L6G8, canine kidney tubular cells MDCK, rat hepatocytes RL34, or a mixture of equal amounts thereof is used to culture bovine myoblasts.
- 2 is a graph showing the cell proliferation promoting effect obtained when culturing.
- a method for culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells is a culturing method that includes the step of culturing myoblasts or skeletal muscle stem cells in a medium containing a culture supernatant of epithelial cells.
- myoblasts and skeletal muscle stem cells for promoting proliferation are hereinafter referred to as "target cells for promoting proliferation” or simply “target cells.”
- epithelial cells for obtaining a culture supernatant are referred to as "cells that utilize conditioned medium” or simply "cells for culture supernatant.”
- the animal from which the target cells are derived is not particularly limited, but is preferably a vertebrate.
- the animal may be a mammal, reptile, bird, or amphibian, but preferably a domestic animal such as a human, cow, pig, rabbit, or chicken.
- the animal from which the cells for the culture supernatant are derived is also not particularly limited, but vertebrates are preferred.
- the animal may be a mammal, reptile, bird, or amphibian, but preferably a domestic animal such as a human, cow, pig, rabbit, or chicken.
- the animal from which these cells are derived may be the same or different from the animal from which the target cells are derived.
- Target cells may be primary cultured cells isolated from animal living bodies, established cultured cells derived from myoblasts or skeletal muscle stem cells, and pluripotent cells such as iPS cells and ES cells.
- the cells may be obtained by differentiating sexual stem cells into myoblasts or skeletal muscle stem cells.
- a method of adding a culture supernatant to a culture medium of target cells can be exemplified.
- the medium from which the culture supernatant is made is not particularly limited, but is preferably a serum-free medium, and examples thereof include DMEM, MEM ⁇ , F12, and the like.
- cells for the culture supernatant are seeded in a cell container at a density of 1 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ 1 ⁇ 10 7 cells/mL, and these cells are used for 1 to 30 days using these medium.
- the culture supernatant After culturing for some time, the culture supernatant can be collected. Thereafter, precipitates such as cell debris may be removed by centrifugation.
- the obtained culture supernatant may be used as is (i.e., 100% cell supernatant) to culture target cells, but fresh medium may be used at least 10%, at least 30%, at least 50%, or at least 70% Target cells may also be cultured using a medium to which % or more is added.
- the medium used at this time is not particularly limited, but it is preferably the same type of medium used to culture the cells for the culture supernatant.
- culture supernatants of two or more types of cells When using culture supernatants of two or more types of cells as a medium for target cells, it is possible to co-culture the two or more types of cells to obtain the culture supernatant and use the supernatant, but it is also possible to culture them separately. The supernatant may then be mixed.
- target cell culture medium In addition to adding culture supernatant to the target cell culture medium, it is also possible to co-culture cells that use culture supernatant and target cells, or to culture cells that use culture supernatant and target cells in separate containers.
- the target cells may be cultured in a medium containing the culture supernatant of cells using the culture supernatant by fluidly connecting the culture media between the containers and refluxing them.
- Myoblasts are mononuclear cells that proliferate and fuse to form multinucleated muscle fibers.
- Skeletal muscle stem cells include fetal and adult types, and adult skeletal muscle stem cells include satellite cells.
- epithelial cells include, for example, digestive epithelial cells such as bile duct epithelial cells and liver epithelial cells, respiratory epithelial cells such as lung epithelial cells and tracheal epithelial cells, excretory organ epithelial cells such as renal tubular epithelial cells, and bladder epithelial cells. Contains epithelial cells, etc.
- muscle was collected from bovine skeletal muscle and myoblasts were isolated.
- the collected cells were maintained in a medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) to make up 10% of the total medium.
- FBS fetal bovine serum
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Abstract
【課題】新規な筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。 【課題を解決するための手段】 本発明の筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法は、筋芽細胞または骨格筋幹細胞を、上皮細胞の培養上清を含む培地中で培養する工程を含む。
Description
本発明は、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法に関する。
従来、筋芽細胞を培養する標準培地は、１０％～２０％血清を含有するＤＭＥＭやＲＰＭＩ－１６４０であった（非特許文献１など参照）。
Cell Death Differ . 2019 Mar;26(3):426-442
本発明は、新規な筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施態様は、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の細胞を、上皮細胞の培養上清を含む培地中で培養する工程を含む、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法である。
なお、前記培養上清が、血清を実質的に含まなくてもよい。
また、前記上皮細胞は、腎臓尿細管細胞であってもよく、ＭＤＣＫ細胞であってもよく、尿細管上皮細胞であってもよく、ＲＬ３４細胞であってもよい。
本発明によって、新規な筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法を提供できる。
本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示すものであって、本発明をそれらに限定しない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本発明の一実施形態の筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法は、筋芽細胞または骨格筋幹細胞を、上皮細胞の培養上清を含む培地中で培養する工程を含む培養方法である。それによって、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の増殖を促進することができる。従って、以下、増殖を促進するための筋芽細胞および骨格筋幹細胞を、「増殖を促進するためのターゲット細胞」、または単に「ターゲット細胞」と称する。一方、培養上清を得るための上皮細胞は、「培養上清（conditioned medium）を利用する細胞」、または単に「培養上清のための細胞」と称する。
ターゲット細胞が由来する動物は特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましい。哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類のいずれであってもよいが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ニワトリなどの家畜動物であることが好ましい。
培養上清のための細胞が由来する動物も特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましい。哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類のいずれであってもよいが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ニワトリなどの家畜動物であることが好ましい。これらの細胞の由来する動物は、ターゲット細胞の由来する動物と同じであっても異なっていてもよい。
ターゲット細胞は、動物生体から単離した初代培養細胞であってもよいが、筋芽細胞または骨格筋幹細胞に由来する樹立された培養細胞であってもよく、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を筋芽細胞または骨格筋幹細胞に分化させて得られた細胞であってもよい。
培養上清を利用する細胞の培養上清を含む培地中でターゲット細胞を培養する具体的な方法としては、ターゲット細胞の培地に培養上清を添加する方法が例示できる。培養上清の元になる培地は、特に限定されないが、無血清培地であることが好ましく、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα、Ｆ１２等が例示できる。培養上清を単離する場合、培養上清のための細胞を１×１０４個／～１×１０７個／ｍＬの密度で細胞容器に播種し、これらの培地を用いて１～３０日程度培養した後で培養上清を回収することができる。その後、遠心して細胞残渣などの沈殿を除去してもよい。得られた培養上清は、そのまま用いて（すなわち、細胞上清１００％で）、ターゲット細胞を培養してもよいが、新鮮な培地を１０％以上、３０％以上、５０％以上、あるいは７０％以上加えた培地を用いてもターゲット細胞を培養してもよい。この時に用いる培地も特に限定されないが、培養上清のための細胞を培養するのに用いたのと同じ種類の培地であることが好ましい。２種以上の細胞の培養上清を、ターゲット細胞の培地に用いる場合、培養上清を得るための２種以上の細胞を共培養して、その上清を用いてもよいが、別々に培養して、その上清を混合してもよい。
ターゲット細胞の培地に培養上清を添加する方法のほかに、培養上清を利用する細胞とターゲット細胞を共培養すること、あるいは培養上清を利用する細胞とターゲット細胞を別の容器で培養し、容器同士の培地を流体連結して還流することによって、培養上清を利用する細胞の培養上清を含む培地中でターゲット細胞を培養してもよい。
筋芽細胞は単核であり、増殖し、融合して、多核の筋線維を形成する細胞である。骨格筋幹細胞は、胎児型と成人型を含み、成人型骨格筋幹細胞はサテライト細胞（衛星細胞）を含む。また、上皮細胞は、例えば、胆管上皮細胞、肝上皮細胞などの消化器系上皮細胞、肺上皮細胞、気管上皮細胞などの呼吸器系上皮細胞、尿細管上皮細胞、膀胱上皮細胞などの排出器系上皮細胞などを含む。
まず、ウシ骨格筋から筋肉を回収し、筋芽細胞を単離した。回収した細胞は、培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を全体培地の１０％になるように添加したものを用いて維持された。
一方、１０％ＦＢＳを添加した培地を用いて、ラット筋芽細胞Ｌ６Ｇ８、イヌ腎臓尿細管細胞ＭＤＣＫ、ラット肝細胞ＲＬ３４、またはこれらの等量混合細胞を３日間培養した後、培養上清を回収した。
ウシ筋芽細胞３ｘ１０４個を９６ウエルプレートに播種し、培地ＤＭＥＭに上記培養細胞株の上清を１００％添加した培地を用いて、４８時間培養した後、ＸＴＴ細胞増殖アッセイキット（コスモバイオ社）を用いて、細胞数を測定した。対照として、培地に、ＤＭＥＭ（陰性対照）および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（陽性対照）を用い、同様に細胞数を測定した。ＤＭＥＭを用いた場合の細胞数を１とし、それぞれの細胞数の相対値を算出し、図１に示すようにグラフ化した。
図１に示すように、培養上清を用いた場合、ＤＭＥＭに比べて、２～４倍の増殖率が得られた。このように、上皮細胞の培養上清を用いることによって、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の増殖を促進することができる。
Claims (9)
- 筋芽細胞または骨格筋幹細胞を、上皮細胞の培養上清を含む培地中で培養する工程を含む、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法。
- 前記上皮細胞由来の細胞が腎臓尿細管細胞または肝細胞である、請求項１に記載の培養方法。
- 前記腎臓尿細管細胞が、ＭＤＣＫ細胞である請求項２に記載の培養方法。
- 前記肝細胞が、ＲＬ３４細胞である請求項２に記載の培養方法。
- 前記培地が、血清を実質的に含まない培地である請求項１～４のいずれか一項に記載の筋芽細胞または骨格筋幹細胞の培養方法。
- 上皮細胞の培養上清を含む、筋芽細胞または骨格筋幹細胞の増殖促進剤。
- 前記腎臓尿細管細胞が、ＭＤＣＫ細胞である請求項６に記載の増殖促進剤。
- 前記肝細胞が、ＲＬ３４細胞である請求項６に記載の増殖促進剤。
- 前記培養上清が、血清を実質的に含まない、請求項７または８に記載の筋芽細胞または骨格筋幹細胞の増殖促進剤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23811911 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |