JP2644024B2 - 生体外で培養された上皮組織の移植片を保存する方法 - Google Patents

生体外で培養された上皮組織の移植片を保存する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1. 発明の分野 本発明は一般に細胞組織の凍結保存に関する。より特
定すれば、本発明は細胞培養で得られた上皮組織片の凍
結保存に関する。
2. 背景となる技術の要約 火傷を受けた組織（すなわち、細胞の障害または死を
もたらす十分量の蛋白変性で特徴づけられる組織）を治
療するための最近の進歩にも拘らず、火傷の犠牲による
死亡率はなお、非常に高い、もちろんそのような死亡率
のレベルは患者の年齢や火傷をうけた体表面の割合など
に大いに左右される。事実死亡率は50〜60％あるいはそ
れ以上の体表面において第３段階の火傷（すなわち、真
皮の全層が破壊される場合）になると急激に高まる。特
に、この場合には、血液循環系のショックが進んだり、
いくらか差し迫ったものではない敗血症あるいは電解質
バランスの損傷におびやかされたりする当面の問題に加
えて、体表面を大きく覆っている皮膚の欠失によって別
の（若干遅れて来る）問題が起されている。このような
表面あるいは外に出ている部分を失うことでの困難はそ
の全層にわたって完全に損傷をうけたり、破壊されてい
るので、直ちには回復できない傾向にあるということで
ある。
通常閉鎖している上皮の関門が外界環境に開かれる
と、感染や代謝性の併発症に加えて患者の局部的あるい
は全身的な症状を序々に悪化される慢性的な病理症状を
創出する。これらの問題全てがしばしば死に至ることも
ある火傷による犠牲を上まわることが多い。
それ故、緊急時の治療が克服される場合には、主な医
学的問題はできる限り効果的に素早く皮膚の欠損部を補
うことであることは明らかである。従来行われている医
療によれば、傷ついた部分が健全な火傷をうけていない
部分からとった組織を移植する（自家移植）ことによっ
て覆われる。しかしながら、火傷部分が例えば60〜70％
にもなると、移植のために使える組織は通常は十分でな
くなる。さらに、自家移植に供される部分自体全体の皮
膚をカバーすることができない部分となることになる。
この欠陥は自家移植に供される部分も回復が遅くなる傾
向にあり、治ゆ部分に悪影響をもたらすということとと
もに考えねばならない。医学的には同種の死体の皮膚、
凍結乾燥した異種の皮膚（例えばブタの）合成で作った
人工的な皮膚といったようなものを移植することによっ
て皮膚の失われた部分を覆うことも認められている。し
かしながら、これら代替物は異物であるので１〜６ヶ月
の中に自然に排除され、やがて自分の組織に置きかえら
れねばならないが、望ましくは自然に行われるのがよ
い。
アメリカ特許4,016,036、4,304,866、4,456,657に記
載された最近の方法は皮膚のケラチン細胞で得られるヒ
トの上皮層を培養する方法を教えている。この層はもち
ろん、自家性であろうから、後に拒絶や脱落が起こるこ
となく火傷部位をカバーすることができよう。これらア
メリカ特許にある方法は健全な供与者の部分から小片
（２〜3cm2）をとり出すことに基づいている。供与者の
組織を使って得られる上皮細胞のサスペンジョン（懸濁
液）を培養し、そして初代培養を継代することによって
増やす。二次、三次培養がコンフルエント（confluen
t）になると上皮細胞の多層に重なったシートが得られ
る。
かくして、いくつかの重大な問題は潜在的に克服でき
る。すなわち、重篤な火傷患者で健全な皮膚の残りが少
ない場合や高価なブタや死体あるいは人工皮膚等いずれ
もすぐには利用できないしまたそれを使うと抗体反応の
ために厳重に制御されねばならないものを使う必要性な
どの問題である。
他方、上記の方法によって得られる表皮細胞の培養物
は適当に増殖し、フィルム状のシートになるまでに３〜
４週間必要である。言いかえると、火傷をうけた患者は
はじめの３〜４週間は火傷部分を守ることなく置かれね
ばならない。このはじめの期間がもちろん、最も重要な
時期で従って健全な皮膚の移植が非常に役立つであろう
期間である。
加えてこれらアメリカ特許にみられる培養上皮細胞層
は採取後数時間以内に使われねばならない。なぜなら増
殖した上皮を遠くの利用センターにまで運搬ができるよ
う十分に維持できる保存方法を開発できていないからで
ある。
文献には皮膚標本を凍結保存するための試みについて
の多くの報告がある。例えばメイ（May）等；「−70℃
に保管される断熱容器を用いた皮膚の凍結保存」、クラ
イオバイオロジー誌、第22巻205〜14頁（1985年）；メ
イ（May）等；「皮膚銀行における最近の発展と凍結保
存された皮膚の臨床利用」73（４）ジャーナル・オブ・
メディカル・アソシェーション・オブ・ジョージア、第
75巻、233〜36（1984年）；ヤング（Yang）等；「コラ
ーゲン細胞表面上でのヒトの上皮細胞の生育」キャンサ
ー・リサーチ誌、第41巻（10号）4093〜4100（1981
年）；ビアギーニ（Biagini）等；「液体窒素中での皮
膚の保存。超構造的研究」ジャーナル・オブ・キューテ
ナス・パソロジー誌、第６巻、５〜17頁（1979年）；テ
イラー（Taylor）；「皮膚の凍結保存、討議と注釈」ク
ライオバイオロジー誌、第３巻、（２号）1966年；バク
スター（Baxter）等；「皮膚の凍結保存、総説」、移植
プロシーディングス第17巻（６号）補巻４号、112〜120
頁（1985年）。これやその他の文献は凍結された上皮組
織では細胞の大部分が融解された後代謝を行うことがで
きることを証明している。しかしながら、上皮組織層は
自己移植あるいは他家移植として使われようとしたり、
火傷をふさぐために作用させる場合には、比較的高含量
の細胞分裂のできる細胞を凍結保存した後に含んでいな
ければならない。しっかりした生物的特性をもった細胞
層を用意することにはそれが細胞分裂と層をなす分化が
可能であることが必要である。これまではこの可能性に
ついて凍結され解凍された培養上皮標本については証明
されていない。
培養された細胞層においてそれを支持する真皮質を欠
いた細胞の動向に及ぼす凍結と解凍の影響を確実に予言
できない。その層は表層蛋白に結合された細胞を含み２
〜３の細胞の厚みのみである。それらは完全に層をなし
た上皮組織の形に分化されない。凍結と解凍は細胞の中
や細胞間に氷の結晶の形成があり、拡張や縮小があり、
その各々が個々の培養細胞や細胞層全体に予測できない
影響をもっている。
凍結された培養皮膚移植物を利用することは貯蔵と輸
送を行わせるに利点があり、また培養と外科手術スケジ
ュールの調整がよりよくできるであろうから何回かの移
植を要する患者にとっても利点がある。そのような製品
が開発されれば、「組織銀行」、あるいは緊急事態に頼
りになる異種に広げられた皮膚を保管しておく施設など
の設立を実現することができよう。
培養した異種移植を凍結しておきすぐに利用できるよ
うにするといくつかの臨床的応用ができる。例えば、本
発明者は深い第２級の火傷が培養された異種移植をする
とずっと早く治ゆする証拠をもっている。第３級の火傷
として臨床的にみられた限定時な深度の障害は受け手の
皮膚細胞によって再び上皮細織化されたがその細胞の成
長とおそらくは移動も培養された異種移植物によって強
く刺激された。
培養された異種移植物はまたは分離した厚さの移植片
に利用された供与者側の場所に使われた。これによって
４日後にもその部分における組織のよい堆積がみられ
た。
ここに記された方法は試験管内で増やされた粘膜の凍
結保存にも成功裡に利用できる。この点においては本発
明者は増殖した粘膜は生検標本からスタートし皮膚の表
皮細胞から上皮細胞層を作るのに示された方法論に従っ
て生体外で得ることができることを示した。本発明者は
また、試験管内で増やされた粘膜が口腔内の粘膜移植を
必要とする患者に成功裡に移植されうることを示してい
る。
本発明の目的は凍結されたとき永久的な自家移植物と
してあるいは一時的な傷口を治ゆするための他家移植物
として作用する培養され、凍結保存された上皮組織層を
適用することによって皮膚の傷を処置する方法を提供す
ることである。また医師による操作を容易にし、皮膚の
火傷、潰瘍やその他の傷口と治療するのに有用な形で培
養された上皮組織層を保管し、運搬し、そして活用する
ことができるような方法を提供することである。もう一
つの目的は永久的な自家移植物あるいは一時的な他家移
植物とするために細胞分裂と層を成すような分化を可能
にする貯蔵に耐える上皮組織の傷口の手当用品を提供す
ることにある。これらやその他の本発明についての目的
や特徴は下記の記載、図表、及び請求項範囲において明
らかにされよう。
発明の要約 本発明は試験管内（in vitro）で培養せれたコンフル
エント状態の上皮細胞の移植可能な細胞層を保存する方
法を提供している。望ましい層は培養されたコンフルエ
ント状の表皮細胞を含み、もっと好ましくは上皮性表皮
細胞を含んでいる。
本発明はまた、保存され培養上皮細胞の輸送を可能に
しそれ故凍結保存された増殖他家性上皮のバンクの設立
を可能にしている。
本発明によれば、移植できる培養上皮細胞層が従来か
ら用いられている栄養剤を含んだ培地と凍結保存剤中で
培養される。この層は予めきめられた期間培養され、そ
の後最終的には約−100℃の温度にまで凍結される。使
われる冷媒は最初のゆっくりした時期と後でより早く冷
やす時期で特徴づけられる。
この方法は非接着性の支持体につけられた培養上皮細
胞の凍結されたコンフルエント状の細胞層から成る保存
して安定な上皮性の傷口の手当用品にすることができ
る。解凍し傷口の表面に適用するとき細胞の層は代謝的
に準備ができており、細胞分裂して層をなした分化をし
て永久的な自己移植物やあるいは一時的な異種移植物に
することができる。すなわちもし細胞層が患者からとっ
た上皮細胞から作られるとその適用は永久的な自己移植
となる。ヒトの上皮細胞から培養された層は他の患者に
適用されれば素晴しい代謝能のある一時的な傷口修復の
ための他家移植物になる。
図面の簡単な説明 第1a図は本発明に従って処理される前の培養ヒト上皮
細胞層の光学顕微鏡写真である。
第1b図は本発明に従って処理されてから解凍された第
１図の培養上皮細胞層の光学的顕微鏡写真である。
第２図は第1b図の培養上皮細胞層の電子顕微鏡写真で
ある。
発明の詳細な記載 本発明はすでに記したアメリカ特許4,016,036、4,30
4,866、4,456,657によって作られるような上皮細胞のフ
ィルム状薄層を利用した。これら特許はここに明示され
ている。層はまず培地、望ましくは凍結保存剤を含んだ
栄養培地中でインキュベートすることによって安定化さ
れる。
細胞内の凍結保存剤の濃度はこの方法の成功には重要
な要因がある。凍結保存剤は望ましくは大凡８〜15重量
％を含み、好ましくはグリセロールまたはジメチルスル
ホキシドである。より好ましくは凍結保存剤は約10重量
％で使われるグリセロールである。細胞層は大凡室温で
培養され、望ましくは15分間を超えない。この点におい
ては、培養時間は本発明者がその時間の長さが細胞の生
存率と移植された表皮細胞がコロニーを形成する能力に
著しく影響することを証明しているのでかなり厳格であ
ることが判っている。特に、インキュベーションの期間
をかえたテストを行うと非常に短時間のインキュベート
時間（約２分以下の）やかなり長い（約15分以上）のあ
とでは表皮細胞のコロニーを形成する能力にかなりはっ
きりした減少が示される。一方、コロニー形成能は４〜
７分間の時間では大いに増加し５〜７分間で最大とな
る。凍結保存剤の細胞内濃度に相当する量はより高濃度
で短時間のインキュベート時間または低濃度でより長い
インキュベート時間を使うことで細胞内に導入される。
インキュベーションの後、上皮細胞層は凍結法にかけ
られるがその場合の温度は温度の低下を終期よりもスタ
ート時におそくするように厳密に制御される。ゆっくり
した冷却勾配、例えば−２℃/minを超えず、好ましくは
−１℃/minが０℃のすぐ上下の温度のところで用いられ
る。凍結点以下に下げるときはより早く行える。細胞が
凍結点以下に冷却されるまえは２〜３分間冷却をつづけ
るのが望ましい。凍結の頂点で凍結しつつある細胞層は
最大−80℃に、もっと望ましくは最大−100℃に達せら
れる。この状態では、処理された上皮細胞層は少くとも
３ヶ月間位はその形態学的、機能的特性を本質的に変え
ることなく維持される。事実、本発明に従って処理され
ることで得られた上皮細胞層片は形態学上及び移植能の
両方の点で凍結保存にかけられることのない新鮮な培養
物から得られるものと比べられる。
この層は望ましくは凍結の前に非接着性の支持体に接
触して置かれる。鉱油ゼリーで処理された従来からある
殺菌ガーゼがよく作用する。支持体は凍結の間や解凍さ
れた後の壊れやすい薄層を操作するのに援けになる。支
持体はまた、皮膚の傷口の表面に適用したあとで薄層を
一時的に覆うカバーとしても用いられる。
この点において、第1a図が本発明の過程にかける前の
細胞層を説明しており一方第1b図は本発明の凍結工程に
かけ、解凍された細胞層を示している。すなわち第1b図
の層が移植に使えるものである。第1a図及び第1b図の相
方の層とも固定され、包埋され、切片にされ、そしてヘ
マトキシリン・エオシンで染色した。第２図は第1a図の
試験管内（in vitro）で培養された上皮細胞層の電子顕
微鏡写真である。これらの顕微鏡写真から、本発明は基
底細胞層がよく保たれておりまた細胞間構造もよく保た
れている結果を示すことが明らかである。
処理された層を用いるとき、数分間37℃でインキュベ
ートし、次いで生理的食塩水かまたは適当な培養液で洗
うことで十分である。
火傷部位を被覆するのに加えて、保存された上皮細胞
層は例えば、腫瘍に対する組織形成や再生手術における
ような他の領域に有効に適用できることを知るべきであ
る。
in vitroで増やされ保存された粘膜もまた口腔手術に
利用され得る。
以下の実施例は発明の望ましい内容の一例を説明して
いるが、これは発明の目指すものを限定するとして考え
ていないし、そう見なすべきものでもない。
実 施 例 表皮細胞の培養物はここに取り上げている既述のアメ
リカ特許の方法を利用して得られる。特に、アメリカ特
許4,016,036によって得られるコンフルエント状の表皮
細胞の二次培養をその培養フラスコからはがしワセリン
をコートしたガーゼに移し、アメリカ特許の4,304,866
で示された方法に従って金属管状の手術用クリップを使
って固定させる。
これらの培養された組織片はそれから無菌条件下に12
×20殺菌済のポリエステル／ポリエチレン／アルミニウ
ム製のバッグ（Gambro,S.A.社製−18、カレー通−75885
パリ市）に移し（各バッグに３個の移植物）、それから
100mlの培地をバッグに加えた。その培地は下記の組成
である：− ダルベッコーの改変で イーグル培地 54重量％ ハムF12 27重量％ ウシ胎児血清（FCS） ９重量％ グリセロール 10重量％ グルタミン 4mM アデニン 1.8×10-4M インスリン 5mcg/ml トランスフェリン 5mcg/ml トリヨードサイロニン ２×10-9M ハイドロコーチゾン 0.4mcg/ml 上皮細胞成長因子 10ng/ml ペニシリン・ストレプトマイシン 50U/ml 袋を温度的に封じて５〜７分間室温でインキュベート
した。それから袋を適当な容器に入れ、そして適当なプ
ログラマブル・フリーザーに移した（そのようなフリー
ザーの例はプログラマブル温度コントローラーPTC−300
として知られ、プレーナー・プロダクト社から市販され
ている）。組織片をそれから次のような凍結プログラム
よ用いて凍結した。
初発温度 ＋25℃ ＋３℃まで −５℃/min ４分間休止し −７℃まで −１℃/min −40℃まで −25℃/min −25℃まで ＋15℃/min −40℃まで −２℃/minそして −100℃まで −３℃/min 最終温度が−100℃に到達したとき、プラスチック袋
を適当な予め２時間−80℃に冷やしておいた金属製容器
に移した。金属容器はそれから急速に−80℃フリーザー
に移された。
凍結した上皮細胞層の入った袋は温度上昇を避けてさ
えいれば長距離でも輸送できる。凍結細胞膜は少くとも
３ヶ月間−80℃に保存され、その間その形態学的及び機
能的特性を維持している。
この凍結されたフィルムを使用する必要があるとき
は、フリーザーから30袋をとり出し、直ちに37℃の湯浴
に浸しそして約10分間インキュベートされる。それから
袋を２〜３秒間70％エタノール中に浸す。その後袋を無
菌的条件で開けて上皮細胞層をとり出し、無菌容器に移
して培養液または生理的、食塩水で完全に洗って使用す
る。解凍したシートの細胞に対して密着するのに適した
基質となる従来から使われている傷口の手当剤を使用で
きる。そのシートは外側に向いた裏打ちで傷面と対面接
触するように設置しそして穏やかにシートを押しつける
ことによってその裏打ちが傷面の形になるようにされ
る。より広範な面積に対しては何枚ものシートを使えば
よい。
もちろん、これまでの方法のいろいろな改良法はこれ
らの技術に精通した者の考えの及ぶところにあり、その
ような改良法などは以下に述べる特許請求項によってカ
バーされる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−29992（ＪＰ，Ａ) 特公 昭40−834（ＪＰ，Ｂ１) 米国特許3940943（ＵＳ，Ａ) Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. ５，Ｎｏ．４（1969），Ｐ．262−269

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のステップを含む上皮細胞シートを保
    存する方法。 ａ） 凍結保存剤を含む培地中で、室温において２分か
    ら15分の時間、上皮細胞シートを培養し、 ｂ） その上皮細胞シートを０℃の僅か上の温度から０
    ℃の僅か下の温度範囲において、−２℃/minを超えない
    ゆっくりした冷却速度で凍結する。
  2. 【請求項２】凍結保存剤がグリセロール又はジメチルス
    ルホキシドである請求項１の保存する方法。
  3. 【請求項３】凍結保存剤が８〜15重量％の濃度で栄養培
    地に添加される請求項１の保存する方法。
  4. 【請求項４】室温での培養が４分から７分間続けられる
    請求項１〜３のいずれか１項の保存する方法。
  5. 【請求項５】上皮細胞シートが細胞培養によって得られ
    る請求項１〜４のいずれか１項の保存する方法。
  6. 【請求項６】上皮細胞シートが最大−80℃の温度で凍結
    される請求項１〜５のいずれか１項の保存する方法。
  7. 【請求項７】培地が実質的に： イーグル培地のダルベッコ修飾液 54重量％ ハムF12培地 27重量％ 孔牛胎児血清（FCS） ９重量％ グリセロール 10重量％ グルタミン 4mM アデニン 1.8×10-4M インシュリン 5mcg/ml トランスフェリン 5mcg/ml トリヨードサイロニン ２×10-9M ハイドロコーチゾン 0.4mcg/ml 上皮細胞成長因子 10ng/ml ペニシリン・ストレプトマイシン 50U/ml を含む請求項１〜６のいずれか１項の保存する方法。
  8. 【請求項８】開始温度 ＋25℃ −５℃／分で ＋３℃まで ４分間休止し； −１℃／分で −７℃まで −25℃／分で −40℃まで ＋15℃／分で −25℃まで −２℃／分で −40℃まで及び −３℃／分で −100℃まで の凍結プログラムが用いられる請求項１〜７のいずれか
    １項の保存する方法。
  9. 【請求項９】更に、凍結されたシートを解凍するステッ
    プを含む請求項１〜８のいずれか１項の保存する方法。
  10. 【請求項１０】保存された細胞内組織を有する分化する
    ことができ、代謝する能力を有し、細胞分裂能を有し、
    階層化された上皮細胞を含む凍結保存、解凍、培養され
    たコンフルエント状のシートで構成された、請求項１〜
    ９の方法によって得られる傷口修復組織。
  11. 【請求項１１】更に、上記シートの表面と接触するよう
    に配置され、上記表面から取り外し易くなっている裏打
    ちを含んでいる請求項10の修復組織。
  12. 【請求項１２】細胞がケラチノサイトである請求項10の
    修復組織。
  13. 【請求項１３】解凍された場合に、傷口修復組織として
    役立ち、保存されている細胞内構造を示し、細胞分裂能
    があり、代謝能力を有する上皮細胞を含む、請求項１〜
    ９の方法で得ることができる凍結、培養、階層化された
    上皮細胞シート。
  14. 【請求項１４】請求項１−９の方法で得ることができる
    凍結培養された上皮細胞シート。
  15. 【請求項１５】上皮細胞がケラチノサイトである請求項
    14の凍結培養された上皮細胞シート。
  16. 【請求項１６】更に、上記シートの表面に接触するよう
    に配置された裏打ちを含んでいる請求項14又は15の凍結
    培養された上皮細胞シート。
  17. 【請求項１７】裏打ちが、該シートの表面からの取外し
    に適した素材で構成された請求項16の凍結培養された上
    皮細胞シート。
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