KR20230015192A - 무세포 진피층 이식재의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
무세포 진피층 이식재의 제조 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 방법은 이식 환자에서 면역거부반응을 일으킬 수 있는 세포를 효과적으로 제거하여 DNA 잔류량을 최소화함으로써 안전하면서도 진피층의 3차원 구조의 손상을 최소화할 수 있어, 이식 부위에서 피부 조직 재생을 원활히 유도할 수 있다.
Description
본 발명은 무세포 진피층 이식재의 제조 방법에 관한 것이다.
피부는 인체의 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 체액의 유실 및 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적, 화학적 자극 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 피부 조직은 표피, 진피, 피하조직으로 이루어져 있으며 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 섬유아세포가 분비한 콜라겐 등의 세포외 기질(extracellular matrix)로 이루어진다.
이러한 피부 조직은 화상, 외상, 궤양, 욕창 등으로 인해 조직에 심한 결손이 발생할 수 있는데, 현재 손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 자가 이식 방법이 주로 이용되고 있다. 그러나, 자가 이식의 경우 자신의 피부조직을 추가적으로 적출하는 수술적 부담이 있어 환자의 고통이 증가하고, 환자의 건강상태가 양호하지 않은 경우에는 위험할 수 있다. 자가 이식 외의 방법으로는, 가공된 피부 이식재를 이용할 수 있으며, 인간 사체에서 기증 받은 피부 조직을 가공한 무세포 진피 동종 이식재와 돼지나 소 등의 동물 피부 조직을 채취하여 가공한 이종 이식재 등이 있다. 그러나, 이러한 피부 이식재는 자가 이식이 아닌 점에서 심각한 면역거부반응을 초래할 수 있으므로, 공여자(donor)로부터 분리된 피부 조직에서 면역거부반응을 일으키는 세포 등을 제거하는 가공 과정이 필수적으로 요구된다 (한국공개특허 10-2001-0092985). 특히, 면역반응이 문제되지 않는 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만의 수준으로 DNA를 제거하고자 할 경우, 강한 처리 조건으로 인해 원재료의 유용한 성분들, 예컨대, 3차원 지지체 구조를 제공하는 세포외 기질이나 이식 후 조직 재생 유도에 필요한 성장인자 등이 함께 손실되거나, 단백질이 변성되어 구조적 변형이 발생함으로써 기계적 물성이 저하되는 문제점이 있다.
따라서, 원재료의 성장 인자나 세포외 기질 등의 유용성 성분들과 기계적 물성은 최대한 유지하면서도 면역반응이 문제되지 않는 유의한 수준으로 DNA를 충분히 제거할 수 있는 피부 이식재의 제조 방법이 요구되는 실정이다.
일 양상은 개체로부터 분리된 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계; 상기 표피층이 제거된 피부 조직에 계면활성제 처리, 진공 처리, 동결-해동, 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 진피층의 세포를 제거하는 단계; 및 상기 세포가 제거된 피부 조직에서 DNA를 제거하는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 제조 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재를 제공한다.
일 양상은 개체로부터 분리된 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계; 상기 표피층이 제거된 피부 조직에 계면활성제 처리, 진공 처리, 동결-해동, 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 진피층의 세포를 제거하는 단계; 및 상기 세포가 제거된 피부 조직에서 DNA를 제거하는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 제조 방법을 제공한다.
용어 “무세포 진피층”은 개체로부터 분리된 피부 조직에서 이식 후 환자에서 면역반응을 일으킬 수 있는 표피나 진피 내의 세포 등이 실질적으로 제거된 상태의 피부 조직으로서, 이식 후 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성을 위한 3차원 구조의 지지체를 제공할 수 있는 무세포 진피 기질 (Acellular Dermal Matrix; ADM)을 의미할 수 있다. 상기 “실질적으로 제거된”이란 실질적으로 제거되어 “실질적으로 포함하지 않는”의 의미이며, “실질적으로”란 원재료와 비교하여 세포 등이 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 제거된 상태를 의미할 수 있다.
상기 무세포 진피층 이식재의 제조 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
우선, 상기 방법은 도 1에 도시된 바와 같이, 개체로부터 분리된 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계;를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 개체는 인간, 소, 돼지. 기니피그, 및 개로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 포유 동물일 수 있다. 구체적으로, 상기 개체로부터 분리된 피부조직은 인간 사체로부터 분리된 동종 피부일 수 있다. 기증된 시신의 조직을 신체에서 분리하여 운반할 때, 저산소증에 의한 조직 손상, 자가 분해 효소에 의한 분해, 단백질 분해 효소에 의한 세포외 간질의 손상 등의 위험이 있다. 또한, 운반용액의 삼투압에 따라 물리적인 손상을 입을 수도 있다. 그 뿐 아니라 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 의한 오염 위험이 항상 존재한다. 따라서, 조직의 운반에 이용되는 용액에는 저산소증에 의한 분해, 자가분해효소에 의한 분해, 단백질 분해효소에 의한 분해를 막을 수 있는 물질을 첨가될 수 있고, 미생물의 오염을 막을 수 있는 항생제와 항균제가 첨가될 수 있다. 삼투압에 의한 조직의 손상을 막기 위해서는 적절한 완충용액을 포함할 수 있다. 조직 운반 용액의 삼투압은 혈장의 삼투압인 260 ~ 320 mOsm/kg 정도의 삼투압을 갖는 것일 수 있다. 동물세포 배양 등에 많이 이용되는 상업적인 배지의 경우 삼투압이 260 ~ 320 mOsm/kg 정도로 혈장의 삼투압과 비슷한 수준을 가지므로, 상업적인 배지를 기본 용액으로 이용하고 거기에 여러 가지 역할을 하는 성분을 첨가하여 이용할 수 있다. 세균이나 곰팡이의 오염을 막기 위해 페니실린, 스트렙토마이신, 가나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신, 반코마이신 등과 같은 항생제를 단독 또는 조합으로 첨가하여, 암포테리신-비, 니스타틴, 폴리믹신 등과 같은 항균제를 단독 또는 조합으로 첨가할 수 있다. 또 여러 가지 분해효소에 의한 조직의 손상을 막기 위해 효소억제제를 첨가할 수 있다. 효소억제제로는 엔-에틸말레이미드(NEM), 불화 페닐메틸술포닐(PMSF), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸르)-N,N,N,N'-테트라아세트산(EGTA) 등과 같은 킬레이트화물질, 루펩틴, 아포프로티닌 등과 같은 단백질 분해효소 억제제 등을 이용할 수 있다.
상기 표피층을 제거하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 표피층을 제거하는 단계는 단백질 분해 효소, 이온 용액, 또는 이들의 조합을 처리하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것일 수 있다. 단백질 분해 효소를 사용하는 경우 사용 농도가 낮거나 처리 시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으킬 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등일 수 있다. 1.0 units/㎖ 농도의 디스파아제로 37 ℃에서 60∼120분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 또는 200㎍/㎖ 농도의 터몰리신을 37 ℃에서 30분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 이온 용액을 사용하는 경우 이온 강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 분리 정도가 달라질 수 있다. 상기 이온 용액은 염화나트륨 용액, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 1M 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 1M 이상의 염화나트륨 용액에서는 세균이나 곰팡이 등이 증식할 수 없기 때문에 미생물의 오염 위험을 낮출 수 있다. 또는 20 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하여 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. EDTA를 이용하면 EDTA가 단백질분해효소 억제제의 역할을 하기 때문에 단백질 분해 효소에 의한 조직의 손상을 줄일 수 있다. 따라서, 1M의 염화나트륨 용액에 1∼10 mM의 EDTA를 첨가하여 처리하면 미생물의 오염이나 효소에 의한 조직 손상을 최소화하며 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.
이후, 상기 방법은 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 표피층이 제거된 피부 조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 진피층의 세포를 제거하는 단계는 계면활성제 처리, 진공 처리, 동결-해동, 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 진피층의 세포를 제거하는 단계일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 진피층의 세포를 제거하는 단계는 도 2에 도시된 바와 같이, 계면활성제를 처리한 후 진공 처리를 수행하는 것일 수 있으며, 반대로 진공 처리를 먼저 수행한 후 계면활성제를 처리하는 것일 수 있다. 상기 진공 처리는 진피층이 놓인 물리적 환경을 진공 상태로 유지하여 진피층의 세포막 등에 물리적 힘을 가함으로써 후속 공정을 용이하게 하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 진공 처리는 1 내지 950 mTorr 압력 조건을 20분 내지 6시간 동안 가하는 것일 수 있다. 다시 말해, 상기 진공 처리는 진공 챔버 내에 상기 진피층을 위치시키고 진공 챔버 내부의 가스의 압력을 1 내지 950 mTorr로 유지시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 압력 조건은 1 내지 950 mTorr, 1 내지 900 mTorr, 1 내지 800 mTorr, 1 내지 500 mTorr, 1 내지 300 mTorr, 1 내지 100 mTorr, 1 내지 50 mTorr, 3 내지 950 mTorr, 3 내지 900 mTorr, 3 내지 800 mTorr, 3 내지 500 mTorr, 3 내지 300 mTorr, 3 내지 100 mTorr, 3 내지 50 mTorr, 5 내지 950 mTorr, 5 내지 900 mTorr, 5 내지 800 mTorr, 5 내지 500 mTorr, 5 내지 300 mTorr, 5 내지 100 mTorr, 또는 5 내지 50 mTorr일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 진공 처리 시간은 20분 내지 6시간, 20분 내지 5시간, 20분 내지 4시간, 20분 내지 3시간, 20분 내지 2시간, 1시간 내지 6시간, 1시간 내지 5시간, 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 3시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 6시간, 2시간 내지 5시간, 2시간 내지 4시간, 또는 2시간 내지 3시간일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 상기 압력이 너무 높거나 처리시간이 너무 길면 원재료의 3차원 지지체 구조가 변형되어 기계적 물성이 저하될 수 있고, 상기 압력이 너무 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 세포막에 미치는 물리적 영향이 부족하여 세포 제거 효과가 낮을 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 진피층의 세포를 제거하는 단계는 도 3에 도시된 바와 같이, 계면활성제를 처리한 후 동결-해동을 수행하는 것일 수 있으며, 반대로 동결-해동을 먼저 수행한 후 계면활성제를 처리하는 것일 수 있다. 상기 동결-해동은 진피층 내의 수분이 동결-해동하는 과정에서 팽창-수축에 의해 진피층의 세포막 등에 물리적 힘을 가함으로써 후속 공정을 용이하게 하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 동결-해동은 -80 ℃에서 1 내지 2시간, 실온 (15-30 ℃)에서 완전히 해동될 때까지 방치하는 것일 수 있으며, 예를 들어, -80 ℃에서 2시간 가량 동결하고, 실온 (15-30 ℃)에서 1시간 가량 해동시키는 과정을 1 cycle로 하여 1 내지 10회 동결-해동 cycle을 반복 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 동결-해동은 1 내지 10회, 1 내지 9회, 1 내지 8회, 1 내지 7회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 1 내지 4회, 2 내지 10회, 2 내지 9회, 2 내지 8회, 2 내지 7회, 2 내지 6회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 반복 수행되는 것일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 반복 횟수가 너무 많으면 단백질의 변성이 일어나 진피층 조직이 구조적으로 심각하게 손상되거나, bFGF, EGF, VEGF, PDGF, TGF-beta, HGF, IGF 등 성장인자들이 지나치게 손실될 수 있으며, 반복 횟수가 너무 적으면 세포에 물리적 힘을 제공하는 작용이 충분치 않아 후속하는 공정을 수행하여도 DNA 잔류량을 10% 미만으로 제거하기 어려울 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐도데실설페이트(Sodium Dodecyl Sulphate; SDS), N-라우로일사르코신 (N-lauroyl sarcosine; NLS), 데옥시콜릭산 (Deoxycholic acid; DA), 소디움 콜레이트 (sodium cholate), 트리톤 x-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 노니데트 피-10(NP-10), 및 노니데트 피-40(NP-40)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 계면활성제가 소듐도데실설페이트 (SDS)인 경우, 실온(15-30 ℃)에서 0.001 내지 5.0 %(w/v)의 농도로 30분 내지 120분간 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 SDS의 농도는 0.001 내지 5.0 %(w/v), 0.001 내지 4.0 %(w/v), 0.001 내지 4.0 %(w/v), 0.001 내지 3.0 %(w/v), 0.001 내지 2.0 %(w/v), 0.001 내지 1.0 %(w/v), 0.001 내지 0.7 %(w/v), 0.001 내지 0.5 %(w/v), 0.001 내지 0.3 %(w/v), 0.001 내지 0.1 %(w/v), 0.01 내지 5.0 %(w/v), 0.01 내지 4.0 %(w/v), 0.01 내지 4.0 %(w/v), 0.01 내지 3.0 %(w/v), 0.01 내지 2.0 %(w/v), 0.01 내지 1.0 %(w/v), 0.01 내지 0.7 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.3 %(w/v), 0.01 내지 0.1 %(w/v), 0.05 내지 5.0 %(w/v), 0.05 내지 4.0 %(w/v), 0.05 내지 4.0 %(w/v), 0.05 내지 3.0 %(w/v), 0.05 내지 2.0 %(w/v), 0.05 내지 1.0 %(w/v), 0.05 내지 0.7 %(w/v), 0.05 내지 0.5 %(w/v), 0.05 내지 0.3 %(w/v), 또는 0.05 내지 0.1 %(w/v)일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 SDS의 처리 시간은 30분 내지 120분, 30분 내지 100분, 30분 내지 80분, 또는 30분 내지 60분일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 SDS의 농도가 너무 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만을 만족하기 어려울 수 있으며, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 진피층 조직이 손상되거나 bFGF 함량 등이 지나치게 손실될 수 있다.
상기 계면활성제가 N-라우로일사르코신 (NLS)인 경우, 실온에서 0.001 내지 5.0 %(w/v)의 농도로 30분 내지 120분간 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 NLS의 농도는 0.001 내지 5.0 %(w/v), 0.001 내지 4.0 %(w/v), 0.001 내지 4.0 %(w/v), 0.001 내지 3.0 %(w/v), 0.001 내지 2.0 %(w/v), 0.001 내지 1.0 %(w/v), 0.001 내지 0.7 %(w/v), 0.001 내지 0.5 %(w/v), 0.001 내지 0.3 %(w/v), 0.001 내지 0.1 %(w/v), 0.01 내지 5.0 %(w/v), 0.01 내지 4.0 %(w/v), 0.01 내지 4.0 %(w/v), 0.01 내지 3.0 %(w/v), 0.01 내지 2.0 %(w/v), 0.01 내지 1.0 %(w/v), 0.01 내지 0.7 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.3 %(w/v), 0.01 내지 0.1 %(w/v), 0.05 내지 5.0 %(w/v), 0.05 내지 4.0 %(w/v), 0.05 내지 4.0 %(w/v), 0.05 내지 3.0 %(w/v), 0.05 내지 2.0 %(w/v), 0.05 내지 1.0 %(w/v), 0.05 내지 0.7 %(w/v), 0.05 내지 0.5 %(w/v), 0.05 내지 0.3 %(w/v), 또는 0.05 내지 0.1 %(w/v)일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 NLS의 처리 시간은 30분 내지 120분, 30분 내지 100분, 30분 내지 80분, 또는 30분 내지 60분일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 SDS의 농도가 너무 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만을 만족하기 어려울 수 있으며, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 진피층 조직이 손상되거나 bFGF 함량 등이 지나치게 손실될 수 있다. 상기 범위를 벗어나 NLS의 농도가 너무 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만을 만족하기 어려울 수 있으며, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 진피층 조직이 손상되거나 bFGF 함량 등이 지나치게 손실될 수 있다.
상기 계면활성제가 데옥시콜릭산 (DA)인 경우, 실온에서 0.001 내지 10.0 %(w/v)의 농도로 2시간 내지 20시간 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 DA의 농도는 0.001 내지 10.0 %(w/v), 0.001 내지 9.0 %(w/v), 0.001 내지 8.0 %(w/v), 0.001 내지 7.0 %(w/v), 0.001 내지 6.0 %(w/v), 0.001 내지 5.0 %(w/v), 0.001 내지 4.0 %(w/v), 0.001 내지 3.0 %(w/v), 0.001 내지 2.0 %(w/v), 0.001 내지 1.0 %(w/v), 0.01 내지 10.0 %(w/v), 0.01 내지 9.0 %(w/v), 0.01 내지 8.0 %(w/v), 0.01 내지 7.0 %(w/v), 0.01 내지 6.0 %(w/v), 0.01 내지 5.0 %(w/v), 0.01 내지 4.0 %(w/v), 0.01 내지 3.0 %(w/v), 0.01 내지 2.0 %(w/v), 0.01 내지 1.0 %(w/v), 0.05 내지 10.0 %(w/v), 0.05 내지 9.0 %(w/v), 0.05 내지 8.0 %(w/v), 0.05 내지 7.0 %(w/v), 0.05 내지 6.0 %(w/v), 0.05 내지 5.0 %(w/v), 0.05 내지 4.0 %(w/v), 0.05 내지 3.0 %(w/v), 0.05 내지 2.0 %(w/v), 0.05 내지 1.0 %(w/v), 0.1 내지 10.0 %(w/v), 0.1 내지 9.0 %(w/v), 0.1 내지 8.0 %(w/v), 0.1 내지 7.0 %(w/v), 0.1 내지 6.0 %(w/v), 0.1 내지 5.0 %(w/v), 0.1 내지 4.0 %(w/v), 0.1 내지 3.0 %(w/v), 0.1 내지 2.0 %(w/v), 또는 0.1 내지 1.0 %(w/v)일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 DA의 처리 시간은 2시간 내지 20시간, 2시간 내지 18시간, 2시간 내지 12시간, 2시간 내지 6시간, 6시간 내지 20시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 20시간, 또는 12시간 내지 18시간일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 DA의 농도가 너무 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만을 만족하기 어려울 수 있으며, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 단백질 변성이 일어나 진피층의 기계적 강도가 지나치게 약해질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 DNA 제거하는 단계는 실온에서 DNase를 1 내지 100 U/mL의 농도로 2시간 내지 20시간 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 DNase의 농도는 1 내지 100 U/mL, 1 내지 90 U/mL, 1 내지 80 U/mL, 1 내지 70 U/mL, 1 내지 60 U/mL, 1 내지 50 U/mL, 5 내지 80 U/mL, 5 내지 70 U/mL, 5 내지 60 U/mL, 5 내지 50 U/mL, 10 내지 80 U/mL, 10 내지 70 U/mL, 10 내지 60 U/mL, 또는 10 내지 50 U/mL일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 DNase의 처리 시간은 2시간 내지 20시간, 2시간 내지 18시간, 2시간 내지 12시간, 2시간 내지 6시간, 6시간 내지 20시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 20시간, 또는 12시간 내지 18시간일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 DNase의 농도가 너무 낮거나 처리 시간이 너무 짧으면 탈세포화의 기준인 DNA 잔류량 10% 미만을 만족하기 어려울 수 있으며, 처리 농도가 50 U/mL을 초과할 경우 공정의 경제성이 떨어질 수 있다.
이후, 상기 방법은 세포와 DNA가 제거된 진피층을 보관용액에 침지하여 전자선(E-beam)을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 보관용액은 멸균수, 생리식염수, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 당업계에서 사용되는 공지의 보관용액이라면 어떤 것이든 이용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 전자선의 조사 선량은 5 내지 35 kGy일 수 있다. 예를 들어, 상기 전자선의 조사 선량은 5 내지 35 kGy, 5 내지 25 kGy, 5 내지 15 kGy, 10 내지 35 kGy, 10 내지 25 kGy, 10 내지 15 kGy, 15 내지 35 kGy, 또는 15 내지 25 kGy 일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재를 제공한다. 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재는 이식 환자에서 면역거부반응을 일으키지 않아 안전하고, 콜라겐 등의 손실이나 구조적 변형을 최소화할 수 있어 결손 조직 부위에 이식 후 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성 등을 원활히 유도할 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 이식 환자에서 면역거부반응을 일으킬 수 있는 세포를 효과적으로 제거하여 DNA 잔류량을 최소화함으로써 안전하면서도 진피층의 3차원 구조의 손상을 최소화할 수 있어, 이식 부위에서 피부 조직 재생을 원활히 유도할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 제조 방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 제조 방법에서 진피층의 세포를 제거하는 단계를 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 제조 방법에서 진피층의 세포를 제거하는 단계를 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 제조 방법에서 진피층의 세포를 제거하는 단계를 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 제조 방법에서 진피층의 세포를 제거하는 단계를 예시적으로 나타낸 순서도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 12. 물리적 환경 조절(진공처리) 및 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
(a) 표피층 제거 단계: 조직은행에서 입수한 시체의 피부를 냉동상태가 유지 될 수 있도록 운반하였다. 운반된 피부 조직을 꺼내어 진피층이 아래로 가도록 하여 적당한 크기로 절단하였다. 피부조직을 세척한 뒤, 1M NaCl + 10mM EDTA가 포함된 멸균 증류수를 처리하였다. 핀셋을 이용하여 표피층을 가볍게 잡은 다음, 진피층으로부터 벗겨내 표피층을 제거하고, 세척하여 남아있는 이온 용액을 제거하였다.
(b) 진피층 세포 제거 단계: 그런 다음, 40㎖의 둘베코의 인산완충용액(Dullbecco's phosphate buffered saline, Sigma Chem. Co., USA)을 가하고, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켰다. 이어, 상기 인산 완충용액을 제거하고, 0.1%(w/v)의 소듐도데실설페이트(SDS), 0.1%(w/v)의 N-라우로일사르코신 (NLS), 또는 1.0-3.0%(w/v)의 데옥시콜릭산 (DA)이 첨가된 둘베코의 인산완충용액 40㎖을 다시 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 120분간 서서히 진탕시켰다. 그런 다음, 완충용액을 제거하고, 시료를 진공 처리 장치로 이동시켜 5-900 mTorr 조건으로 2시간 가압한 후, 다시 40㎖의 둘베코의 인산완충용액을 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켜 세척하였다.
(c) 진피층 DNA 제거 단계: 이어, 5-50 U/mL 농도의 DNase (Benzonase®) 용액 40mL을 가하여 12시간 동안 DNA를 제거 과정을 진행하고 1mM EDTA와 gentamicin을 포함하는 멸균 증류수로 효소를 정지하였다.
(d) 보관용액 침지 및 전자선 멸균 단계: 다시, 완충용액을 제거하고, 보관용액인 둘베코의 인산 완충용액 40㎖에 침지하여 포장재에 실링하고 5-35kGy 범위로 전자빔 멸균을 진행하였다.
실시예 13 내지 15. 물리적 환경 조절(동결-해동) 및 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
(a) 표피층 제거 단계: 조직은행에서 입수한 시체의 피부를 냉동상태가 유지 될 수 있도록 운반하였다. 운반된 피부 조직을 꺼내어 진피층이 아래로 가도록 하여 적당한 크기로 절단하였다. 피부조직을 세척한 뒤, 1M NaCl + 10mM EDTA가 포함된 멸균 증류수를 처리하였다. 핀셋을 이용하여 표피층을 가볍게 잡은 다음, 진피층으로부터 벗겨내 표피층을 제거하고, 세척하여 남아있는 이온 용액을 제거하였다.
(b) 진피층 세포 제거 단계: 그런 다음, 40㎖의 둘베코의 인산완충용액(Dullbecco's phosphate buffered saline, Sigma Chem. Co., USA)을 가하고, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켰다. 이어, 전기 인산 완충용액을 제거하고, 2.0%(w/v)의 데옥시콜릭산 (DA)이 첨가된 둘베코의 인산완충용액 40㎖을 다시 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 120분간 서서히 진탕시켰다. 그런 다음, 완충용액을 제거하고, 시료를 -80°C에서 2시간 동결하고 상온에서 완전히 녹을 때까지 약 1시간 가량 해동시키는 과정을 1 cycle로 하여 2-4회 동결-해동 cycle을 실시한 후, 다시 40㎖의 둘베코의 인산완충용액을 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켜 세척하였다.
(c) 진피층 DNA 제거 단계: 이어, 5-50 U/mL 농도의 DNase (Benzonase®) 용액 40mL을 가하여 12시간 동안 DNA를 제거 과정을 진행하고 1mM EDTA와 gentamicin을 포함하는 멸균 증류수로 효소를 정지하였다.
(d) 보관용액 침지 및 전자선 멸균 단계: 다시, 완충용액을 제거하고, 보관용액인 둘베코의 인산 완충용액 40㎖에 침지하여 포장재에 실링하고 5-35kGy 범위로 전자빔 멸균을 진행하였다.
비교예 1 내지 2. 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 1 내지 12의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 계면활성제와 DNase 처리 조건을 하기 표 1에서와 같은 조건(DA 2, 10 %(w/v), DNase 50, 70 U/mL)으로 변경하고, 진공처리 과정을 생략한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 내지 12와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 3 내지 4. 물리적 환경 조절(진공처리)을 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 1 내지 12의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 진공 처리 조건을 하기 표 1에서와 같은 조건(진공처리 3, 950 mTorr)으로 변경하고, 계면활성제 처리 및 DNase 처리 과정을 생략한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 내지 12와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 5. 물리적 환경 조절(동결-해동)을 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 13 내지 15의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 동결-해동 조건을 하기 표 1에서와 같은 조건(동결-해동 10회)으로 변경하고, 계면활성제 처리 및 DNase 처리 과정을 생략한 것을 제외하고는, 상기 실시예 13 내지 15와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 6 내지 7. 물리적 환경 조절(초음파) 및 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 1 내지 12의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 하기 표 1에서와 같은 조건(DA 2 %(w/v), DNase 50 U/mL, 초음파 (40kHz에서 1분, 40kHz에서 10분))으로 계면활성제, DNase 처리 조건을 변경하고 진공 처리 대신 초음파 처리를 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 내지 12와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 8 내지 11. 물리적 환경 조절(진공처리) 및 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 1 내지 12의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 계면활성제, DNase, 진공 처리 조건을 하기 표 1에서와 같은 조건(SDS 1%(w/v), NLS 1%(w/v), DA 0.01, 5 %(w/v), DNase 50 U/mL, 진공처리 5 mTorr)으로 변경한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1 내지 12와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 12 내지 13. 물리적 환경 조절(동결/해동) 및 화학적 세포 제거를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조
실시예 13 내지 15의 진피층 세포 제거 단계 및 DNA 제거 단계에서, 계면활성제, DNase, 동결-용해 처리 조건을 하기 표 1에서와 같은 조건(DA 2 %(w/v), DNase 50 U/mL, 동결-해동 1, 5 회)으로 변경한 것을 제외하고는, 상기 실시예 13 내지 15와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
실험예 1: 세포 제거 방법에 따른 효과 확인
1.1.
세포 제거 방법에 따른 DNA 제거 효율 확인
공여자로부터 분리된 피부의 진피층에 포함된 세포와 DNA는 이식 환자에서 면역 거부반응을 일으킬 수 있는 바, 실시예의 세포 제거 방법이 DNA를 잔류량을 최소화할 수 있는 지 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층의 DNA 잔류량을 비교 평가하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층 시료 20-25 mg을 Qiagen DNA Mini kit 내의 ALP Buffer 180 ul와 Protease K Buffer 20 ul로 Lysis한 뒤 kit를 이용하여 하기 식 1에 따라 정량하였다.
[식 1]
DNA 제거는 원재료 대비 10% 미만의 수준으로 제거되어야 이식 후 면역반응이 문제되지 않으므로, DNA 잔류량이 10% 미만인 경우를 DNA가 유의하게 제거된 것으로 평가하였으며, 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
1.2.
세포 제거 방법에 따른 bFGF 함량 유지 효과 확인
이식 후 면역반응이 문제되지 않도록 DNA를 원재료 대비 90% 이상으로 제거하고자 할 경우, 이식 후 조직 재생에 필요한 성장인자도 함께 손실될 수 있는 바, 실시예의 세포 제거 방법이 진피층의 조직 재생에 유용한 인자들을 효과적으로 유지할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층을 이용하여 대표적인 성장인자 중 하나인 bFGF(basic fibroblast growth factor; bFGF) 함량을 비교 평가하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층 시료를 잘게 자른 뒤 10 mg 당 100 ul 의 Tissue extraction Buffer 를 첨가한 뒤, 4 ℃ 에서 homogenizer를 사용하여 1 시간 동안 추출하였다. 추출 후 4 
에서 12000rpm으로 20 분간 원심분리한 뒤, 상층액을 회수하여 bFGF ELISA kit 을 이용하여 UV 450 nm 에서 정량하였다.
bFGF 함량이 원재료 대비 15 % 미만일 경우 이식 후 조직 재생을 원활히 유도하기 어려울 수 있으므로, bFGF 함량이 15 % 이상인 경우를 bFGF가 유의하게 유지된 것으로 평가하였으며, 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
1.3.
세포 제거 방법에 따른 콜라겐 함량 유지 효과 확인
이식 후 면역반응이 문제되지 않도록 DNA를 원재료 대비 90% 이상으로 제거하고자 할 경우, 이식 후 골격 제공에 필요한 세포외 기질도 함께 손실될 수 있는 바, 실시예의 세포 제거 방법이 진피층의 세포외 기질을 효과적으로 유지할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층의 콜라겐 함량을 비교 평가하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층 시료를 일정량 취한 후 PICO tag 방법을 이용하여 PITC labeling을 실시하였다. PITC labeling된 시료를 400 ul의 buffer에 녹인 후 그 중 10 ul을 취하여 HPLC에 로딩하였다. 아미노산 정량 값 중 Hydroxyproline 값을 이용하여 하기 식 2에 따라 콜라겐을 정량하였다.
[식 2]
콜라겐 함량이 원재료 대비 65 % 미만일 경우 조직 재생에 유리한 콜라겐이 부족하여 이식 후 생물학적인 조직 재생 환경의 제공이나 조직 재생에 필요한 골격 제공이 어려울 수 있으므로, 콜라겐 함량이 65% 이상인 경우를 콜라겐이 유의하게 유지된 것으로 평가하였으며, 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
1.4.
세포 제거 방법에 따른 기계적 강도 유지 효과 확인
이식 후 면역반응이 문제되지 않도록 DNA를 원재료 대비 90 % 이상으로 제거하고자 할 경우, 콜라겐 구조가 손상되어 기계적 물성이 저하될 수 있는 바, 실시예의 세포 제거 방법이 진피층의 기계적 물성을 효과적으로 유지할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층의 인장 강도를 비교 평가하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 15와 비교예 1 내지 13에서 제조된 무세포 진피층 시료를 10×50 mm 길이가 되도록 컷팅하여 준비하였다. 만능시험기 (universal test machine; UTM)의 그립 사이의 거리를 30mm로 위치한 뒤, 시료를 장비에 고정하여 crosshead speed 50 mm/min 속도로 인장하여, 파단점에 도달하는 힘 값으로 계산된 수치를 이용하여 인장강도를 확인하였다.
인장 강도가 원재료 대비 50 % 미만일 경우 이식 부위 조직에서 요구되는 기계적 물성을 충분히 제공하기 어려워, 이식 후 결손 조직을 대체할 수 있는 조직으로 분화되고 재생되기 어려울수 있으므로, 인장강도가 50 % 이상인 경우를 기계적 강도가 유의하게 유지된 것으로 평가하였으며, 그 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
| Detergent (%(w/v)) |
Benzonase (U/mL) |
물리적 환경 조절 (Cycle횟수, mTorr, or kHz) |
DNA잔류량 (ng/mg) | bFGF량 (pg/mg) |
Collagen량 (중량%) |
인장강도 (Mpa) | |
| 원재료 | - | - | - | 1140.94 | 123.69 | 100 | 28.69 |
| 비교예1 | DA 2% |
50 | - | 196.10 | 37.49 | 72.91 | 25.07 |
| 비교예2 | DA 10% |
70 |
- | 1.20 | 5.31 | 60.73 | 12.63 |
| 비교예3 | - | - | 진공처리 950 mTorr | 985.46 | 36.55 | 73.86 | 27.21 |
| 비교예4 | - | - | 진공처리 3 mTorr | 976.05 | 36.23 | 73.48 | 14.08 |
| 비교예5 | - | - | 동결-해동10 회 | 940.31 | 4.14 | 62.49 | 7.59 |
| 비교예6 | DA 2% | 50 | 초음파 40kHz에서 1분 | 202.72 | 28.10 | 71.76 | 26.64 |
| 비교예7 | DA 2% | 50 | 초음파 40kHz에서 10분 | 85.33 | 3.09 | 61.25 | 10.59 |
| 실시예1 | SDS 0.1% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 98.13 | 25.50 | 72.90 | 26.55 |
| 비교예8 | SDS 1% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 84.33 | 13.14 | 65.91 | 23.48 |
| 실시예2 | NLS 0.1% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 63.89 | 21.40 | 67.24 | 19.10 |
| 비교예9 | NLS 1% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 34.69 | 10.92 | 59.90 | 21.79 |
| 비교예10 | DA 0.01% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 563.41 | 49.85 | 78.63 | 17.99 |
| 실시예3 | DA 1% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 29.82 | 46.41 | 78.12 | 23.52 |
| 실시예4 | DA 2% | 5 | 진공처리 5 mTorr | 41.85 | 42.13 | 75.94 | 22.93 |
| 실시예5 | DA 2% | 10 | 진공처리 5 mTorr | 28.32 | 44.64 | 76.88 | 22.31 |
| 실시예6 | DA 2% | 30 | 진공처리 5 mTorr | 14.05 | 41.34 | 74.53 | 22.18 |
| 실시예7 | DA 2% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 7.16 | 38.69 | 73.86 | 21.06 |
| 실시예8 | DA 3% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 5.57 | 22.50 | 68.38 | 19.88 |
| 비교예11 | DA 5% | 50 | 진공처리 5 mTorr | 1.49 | 10.84 | 62.41 | 17.62 |
| 실시예9 | DA 2% | 50 | 진공처리100 mTorr | 11.57 | 39.55 | 74.73 | 15.04 |
| 실시예10 | DA 2% | 50 | 진공처리250 mTorr | 35.83 | 37.31 | 72.79 | 22.86 |
| 실시예11 | DA 2% | 50 | 진공처리500 mTorr | 48.31 | 38.84 | 73.07 | 23.03 |
| 실시예12 | DA 2% | 50 | 진공처리 900 mTorr | 92.26 | 39.17 | 74.12 | 23.95 |
| 비교예12 | DA 2% | 50 | 동결-해동 1회 | 166.99 | 36.92 | 72.60 | 24.52 |
| 실시예13 | DA 2% | 50 | 동결-해동 2회 | 98.39 | 33.69 | 70.97 | 23.11 |
| 실시예14 | DA 2% | 50 | 동결-해동 3회 | 69.20 | 30.77 | 68.69 | 20.43 |
| 실시예15 | DA 2% | 50 | 동결-해동 4회 | 40.96 | 22.58 | 67.10 | 18.07 |
| 비교예13 | DA 2% | 50 | 동결-해동 5회 | 41.85 | 18.30 | 66.64 | 15.15 |
그 결과, 상기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 화학적 세포 제거만을 수행한 비교예 1 및 2의 경우, 저농도 계면활성제로는 DNA를 90 % 이상 수준으로 제거할 수 없어 세포 제거 효과가 미미하였고, 면역반응이 문제되지 않도록 DNA를 90% 이상 수준으로 제거하고자 계면활성제를 고농도로 처리한 경우에는 대표적인 성장인자인 bFGF 함량과 콜라겐 함량이 현저하게 감소되고, 단백질 변성에 의해 콜라겐 구조 등이 심각하게 손상되어 기계적 강도가 현저하게 약화되는 것으로 나타났다.
또한, 물리적 환경 조절만을 수행한 비교예 3 내지 5의 경우, 물리적 환경 조절 단독으로는 강한 물리적 자극 조건에서도 DNA를 90 % 이상 수준으로 제거할 수 없어 세포 제거 효과가 미미하였고, 강한 물리적 자극에 의해 단백질 변성이 일어나 기계적 강도가 현저하게 약화되는 것으로 나타났다.
또한, 물리적 환경 조절(초음파 처리)과 화학적 세포 제거를 모두 수행한 비교예 6 및 7의 경우에도, 초음파를 약하게 처리한 조건에서는 DNA를 90 % 이상 수준으로 제거할 수 없어 세포 제거 효과가 미미하였고, 면역반응이 문제되지 않도록 DNA를 90% 이상 수준으로 제거하고자 초음파를 강하게 처리한 경우, bFGF 함량과 콜라겐 함량이 현저하게 감소되고, 단백질 변성에 의해 콜라겐 구조 등이 손상되어 기계적 강도가 현저하게 약화되는 것으로 나타났다. 즉, 초음파 처리는 분자 구조에 진동을 일으키는 방법으로서, 유의한 수준으로 DNA를 제거하기 위해 초음파를 강하게 처리할 경우 재료에 열이 발생되어 단백질 변성이 유발할 수 있음을 확인하였다.
그러나, 진공처리 또는 동결-해동 방법으로 물리적 환경을 조절하고 화학적 세포 제거를 수행한 실시예 1 내지 15의 경우, DNA를 90 % 이상 수준으로 제거할 수 있어 면역 반응이 문제되지 않으면서도 성장인자 함량과 콜라겐 함량을 유의한 수준으로 유지할 수 있고, 구조적 손상도 최소화할 수 있어 기계적 강도를 유의한 수준으로 유지할 수 있는 것으로 나타났다. 특히, 진공처리 방법의 경우, 대기압 조건인 비교예 1의 경우 세포 제거 효과가 미미하였으며, 5 mTorr 미만의 압력 조건인 비교예 4의 경우 콜라겐 구조가 손상되어 기계적 물성이 현저하게 저하되는 것을 확인하였다. 또한, 동결-해동 방법의 경우, 동결-해동을 1회 실시한 비교예 12의 경우 세포 제거 효과는 미미하였으며, 동결-해동을 5회 이상 실시한 비교예 13과 비교예 5의 경우 동결-해동의 반복으로 단백질 변성이 일어나 기계적 물성이 감소하고 bFGF의 함량과 콜라겐 함량이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 세포 제거 단계에서 진공처리 또는 동결-해동 방법으로 진피층의 물리적 환경을 조절하고 화학적 세포 제거 과정을 수행하는 실시예의 제조 방법은 DNA 제거 효율을 높일 수 있어 안전성이 향상된 피부 이식재를 제조할 수 있으며, 콜라겐 등의 손실이나 구조적 변형을 최소화할 수 있어 결손 조직 부위에 이식 후 피부 조직 재생을 원활히 유도할 수 있음을 의미한다.
Claims (11)
- 개체로부터 분리된 피부 조직에서 표피층을 제거하는 단계;
상기 표피층이 제거된 피부 조직에 계면활성제 처리, 진공 처리, 동결-해동, 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 진피층의 세포를 제거하는 단계; 및
상기 세포가 제거된 피부 조직에서 DNA를 제거하는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 제조 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 진공 처리는 1 내지 950 mTorr 압력 조건을 가하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동결-해동은 1 내지 10회 수행하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐도데실설페이트(Sodium Dodecyl Sulphate; SDS), N-라우로일사르코신 (N-lauroyl sarcosine; NLS), 데옥시콜릭산 (Deoxycholic acid; DA), 소디움 콜레이트 (sodium cholate), 트리톤 x-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 노니데트 피-10(NP-10), 및 노니데트 피-40(NP-40)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 소듐도데실설페이트의 농도는 0.001 내지 5.0 %(w/v)인 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 N-라우로일사르코신의 농도는 0.001 내지 5.0 %(w/v)인 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 데옥시콜릭산의 농도는 0.001 내지 10.0 %(w/v)인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 DNA를 제거하는 단계는 DNase를 1 내지 100 U/mL의 농도로 처리하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 인간, 소, 돼지. 기니피그, 및 개로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 포유 동물인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표피층을 제거하는 단계는 단백질 분해 효소, 이온 용액, 또는 이들의 조합을 처리하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재.
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