KR101155638B1 - 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 양막의 신규한 제조방법 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 양막(decellularized amniotic membrane)의 제조방법에 관한 것이다. 발명의 무세포 양막은 무세포화 과정 이후에도 미처리 양막과 비교하여 70-140 wt%의 성장인자(예: bFGF)를 함유하여 각막 화학화상에서 이식 후 염증세포 및 아팝토시스 세포의 수를 감소시켜 염증반응 억제와 상처 치유, 반흔 억제에 매우 효과적이다. 따라서, 본 발명의 무세포 양막을 유효성분으로 포함하는 양막 이식용 조성물은 사람 양막의 임상학적 이용 상의 어려움을 극복(예를 들어, 구입의 용이성, 대량생산의 가능)할 수 있도록 한다.

무세포 양막, 동결-해동-원심분리, bFGF, 다형핵백혈구

Description

동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 양막의 신규한 제조방법 및 이의 이용{Novel Preparation Methods for a Decellularized Amniotic Membrane Using a Freeze-Thaw-Centrifuge and Uses Thereof}

본 발명은 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 양막의 제조방법 및 이의 조성물에 관한 것이다.

양막은 태반의 가장 안쪽에 있는 얇고 반투명한 막으로, 단순 입방상피(simple cuboidal epithelium)와 두꺼운 기저막, 무혈관성의 간엽성 간질(mesenchymal stroma)로 구성되어 있으며 조직적합성항원이 표현되지 않아서 이식을 하여도 거부반응이 없는 생체막이다(Tseng SC et al., 1997; Houlihan JM et al., 1995). 양막 이식술은 1940년에 결막 결손부위의 치료에 처음으로 사용하여 그 효과를 보고하였지만(de Rotth A, 1940) 이후 주목 받지 못하다가 1995년 토끼 각막 손상 모델에서 양막을 이용한 성공적 안구 표면 재형성을 보고한 후(Kim JC et al., 1995), 지속적인 각결막 결손 및 각막 궤양(Prabhasawat P et al., 2001; Shin KS et al., 2003), 안구 화상(Meller D et al., 2000; Tamhane A et al., 2005), 공막 연화증(Jeoung JW et al., 2004), 수포각막병증(Pires RTF et al., 1999; Espana EM et al., 2003) 등 다양한 안과적 질환에서 양막 이식을 이용한 성공적인 치료들이 보고되고 있으며 실제 임상에서도 현재 활발히 사용되고 있다. 또한 안과적 질환 이외에 피부 화상(Bose B, 1979)이나 관절 질환(Vishwakarma GK et al., 1986), 이비인후과적 질환(Zahar Y et al., 1987)에서도 양막을 이용한 효과적 치료결과들이 보고된 바 있다.

하지만 사람 양막의 치료적 이용에는 일부 한계가 있다. 우선 제왕절개를 받는 건강한 산모에게서 양막을 기증 받는 것 자체가 어렵고 그 양이 한정되어있다. 또한 인체 유래 질병 전이의 위험 요소도 배제하여야 하며 사람 양막이 인체 조직이기 때문에 발생하는 종교적, 윤리적, 법적인 이용의 제한점들도 있다. 따라서 사람 양막에 비해 쉽게 많은 양을 구할 수 있고 까다로운 인체 조직 관리도 필요 없는 소양막(bovine amniotic membrane)은 사람 양막을 대신할 수 있는 하나의 대안으로 생각해볼 수 있다. 하지만 소양막을 사람의 상처 치유에 적용하기 위해서는, 특히 이식하기 위해서는, 항원성 및 병원성 제거를 위한 무세포화(decellularized) 과정이 필수적이다. 그리고, 이 무세포화 과정에 따라 어느 조직이든지 그 본래의 조직 특성에 일부 변화가 발생하는 것은 피할 수 없을 것이다.

양막에는 상피의 증식과 분화를 촉진시켜 창상 치유에 중요한 역할을 하는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 상피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 헤파토사이트 성장인자(HGF) 등의 성장 인자들이 존재한다고 보고되고 있다(Shinozaki M et al., 1995; Koizumi NJ et al., 2000). 특히, bFGF는 각막 상피세포의 상처 치유 촉진과 함께 각막의 기질세포와 내피세포에 대해서도 상처 치유 촉진, 항상성 유지에 관여하고(Hecquet C et al., 1990; Gospodarowicz D et al., 1977), 세포외 기질에서도 글라이코사미노글라이칸(GAG)과 헤파란 설페이트 등에 결합하여 존재하는 것으로 알려져 있는 성장인자이다(Vlodavsky I et al., 1987; Bashkin P et al., 1989; Vlodavsky I et al., 1991). 따라서, 세포가 모두 소실된 무세포 소양막에서도 bFGF는 세포외 기질에 남아있을 수 있는 중요 치유 인자로, 무세포 처리 방법에 따른 소양막의 특성 변화 및 그 응용가치를 알아보는데 있어 중요한 요소로 생각된다.

현재 소양막에서 무세포 처리에 따른 조직의 특성 변화와 치료 효과의 차이에 대해서는 아직 연구된 바가 거의 없다. 최근 Park 등(Park M et al., 2008)은 trypsin 과 EDTA 등을 이용하여 소양막을 무세포 처리하였고, 이렇게 화학효소적으로 처리된 무세포 소양막을 돼지 피부 화상에 적용하여 효과적인 치유 결과를 보였다고 보고하였지만 무세포 처리된 소양막 내 EGF 농도는 본래 소양막에 비해 크게 감소하였다는 결과도 함께 보여주어 소양막에 존재하는 치유 인자들의 변화와 소실을 암시하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 항원성 및 병원성 문제를 해결하기 위한 무세포 양막을 개발하고자 노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 신규한 동결-해동-원심분리 방법을 이용하여 제조된 무세포 양막이 종래의 방법(예: 화학 효소적 처리)에 의해 제조된 무세포 양막에 비해 성장인자들(예: bFGF)을 풍부하게 함유하고 각막 화학 화상에 대한 치유 효과가 더욱 우수하다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 무세포 양막(decellularized amniotic membrane)의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 무세포 양막을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체적합성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 무세포 양막(decellularized amniotic membrane)의 제조방법을 제공한다:

(a) 상기 양막을 동결하는 단계;

(b) 상기 동결된 양막을 해동하는 단계; 및

(c) 상기 해동된 양막을 원심분리 하는 단계.

본 발명자들은 항원성 및 병원성 문제를 해결하기 위한 무세포 양막을 개발하고자 노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 신규한 동결-해동-원심분리 방법을 이용하여 제조된 무세포 양막이 종래의 방법(예: 화학 효소적 처리)에 의해 제조된 무세포 양막에 비해 성장인자들(예: bFGF)을 풍부하게 함유하고 각막 화학 화상에 대한 치유 효과가 더욱 우수하다는 것을 발견하였다.

인간을 제외하고 다른 포유류(예: 소, 돼지, 양, 염소, 말, 마우스, 래트 등)로부터 유래한 양막을 인간에게 적용하기 위해, 항원성 및 병원성 제거를 위한 무세포 처리가 매우 중요하다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 무세포 양막의 제조방법은 동결-해동-원심분리를 이용한 신규한 방법으로, 종래 기술과 비교하여 매우 간편하고 효율이 우수하다.

보다 상세하게는, 본 발명의 방법은 다음의 동결-해동-원심분리하는 단계를 포함한다: (pre-a) 태반에서 분리된 양막을 증류수에서 24시간 동안 함침하는 단계; (a) 상술한 분리된 양막을 -196℃ 액화질소에서 15분 동안 동결하는 단계; (b) 상술한 동결된 양막을 37℃ 수욕조에서 30분 동안 해빙하는 단계; (c) 상술한 (a) 및 (b) 단계를 3회에 걸쳐서 반복적으로 실시하는 단계; 및 (d) 상술한 해동된 양막을 원심분리하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 양막은 인간, 돼지, 양, 염소, 말, 알파카(alpaca), 마우스, 래트 또는 소의 양막이고, 보다 바람직하게는 인간 또는 소의 양막이며, 가장 바람직하게는 소의 양막이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (pre-a) 단계를 추가적으로 포함한다. 즉, 상술한 본 발명의 (pre-a) 단계는 분리된 양막을 증류수에서 함침하여 무세포화 과정을 보다 더 용이하게 유발시키는 단계이다. 바람직하게는, 상술한 (pre-a) 단계는 12-48시간, 보다 바람직하게는 18-36시간, 보다 더 바람직하게는 20-28시간, 가장 바람직하게는 24시간 동안 실시한다. 또한, 본 발명의 (pre-a) 단계는 상온에서 실시하는 것이 바람직하며, (pre-a) 단계 후에 즉시 다음의 (a) 단계를 실시하는 것이 바람직하다.

상술한 본 발명의 (a) 단계는 당업계에서 통상적으로 실시되는 적합한 냉각 과정을 통해 실시할 수 있으며, 동결이 일어날 수 있는 온도 이하(예: -80℃ 이하)라면 어느 온도나 가능하다. 예를 들어, 태반을 액체질소를 이용하여 급속-동결(flash-frozen)시킬 수 있다. 선택적으로, 태반을 이소프로파놀/건조 얼음 수조에서 실시하거나, 또는 다른 냉각제(coolants)를 이용하여 급속-동결시킬 수 있다. 상업적으로 유용한 빠른(quick) 동결 과정이 이용될 수도 있다. 또한, 태반을 냉동고에 저장하여 급속-동결보다 더 느리게 저장 온도로 평형화시킬 수도 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 동결 단계는 액체질소를 이용한 급속-동결이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 양막의 동결 단계 (a)는 -80℃ ~ -200℃, 보다 바람직하게는 -150℃ ~ -200℃, 보다 더 바람직하게는 -180 ℃ ~ -200℃, 가장 바람직하게는 -196℃(액체질소 이용)에서 실시한다. 또한, 본 발명의 양막 동결 단계는 상술한 온도에서 5분-30분, 보다 바람직하게는 10-20분, 가장 바람직하게는 15분 동안 실시한다.

상술한 본 발명의 (b) 단계의 해동 과정은 간편하고 용이하게 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 동결된 양막의 해동은 20-45℃, 보다 바람직하게는 25-42℃, 보다 더 바람직하게는 35-39℃, 가장 바람직하게는 37℃에서 실시한다. 본 발명의 동결된 양막의 해동 단계는 상술한 온도에서 수욕조, 배양기, 혼성화 챔버(hybrid chamber) 등 온도 조절이 가능한 기기에서 실시할 수 있으며, 가장 바람직하게는 수욕조에서 실시한다.

본 발명에서, 상술한 (a) 및 (b) 단계는 반복적으로 실시한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)는 2-8회, 보다 바람직하게는 2-5회, 보다 더 바람직하게는 2-4회, 가장 바람직하게는 3회 반복 실시한다.

상술한 본 발명의 (d) 단계의 원심분리 과정은 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 원심분리는 5,000-20,000 rpm, 보다 바람직하게는 10,000-15,000 rpm, 보다 더 바람직하게는 12,000-14,000 rpm, 가장 바람직하게는 13,000 rpm에서 실시한다. 또한, 본 발명의 원심분리는 상술한 속도(rpm)에서 1-10분, 보다 바람직하게는 2-8분, 보다 더 바람직하게는 3-7분, 가장 바람직하게는 5분 동안 실시한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상술한 양막의 동결 단계((a) 단계) 전에 양막의 분리 및 살균/소독 과정을 추가적으로 포함한다. 보다 상세하게는, 태반을 포함한 무균 플라스틱 백을 얼음 가방(ice bucket) 속에서 실험실로 운반한 후 조직 배양의 경우처럼 무균 조건에서 실시한다. 무균작업대(lamellar-flow hood)에서 태반을 평형염액(balanced salt saline) 또는 생리식염수(physiological saline)로 여러 번 린스하여 과량의 혈액 덩어리(clot)를 제거한다. 상술한 평형염액은 Alcon Inc.(6201 Sounth Freeway, Fort Worth, Tex., 76101, USA)로부터 구입할 수 있다. 또한, 린스 과정은 살균/소독 및 저장을 위해 항생제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 효과적인 항생 조성물은 페니실린, 스트렙토마이신, 네오마이신, 폴리믹신, 젠타마이신 또는 암포테리신 B를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이식을 위해 사용되는 경우 필요에 따라 다른 물질이 양막에 처리될 수 있다. 이식 분야 또는 다른 치료법에서 상처 치료를 보조하기 위해, 양막에 처리될 수 있는 물질은 치료제, 호르몬, 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 살균/소독을 위해 70% 알코올(예: 에탄올), 소듐 하이포클로라이드, 방사선(예: 감마선) 조사 또는 자외선 조사를 실시할 수 있다.

한편, 태반에서 분리된 양막은 동결 아래의 온도에서 적합한 배양배지에 저장할 수 있다. 예를 들어, 양막은 DEME(Dubecco Modified Eagle's Medium) 및 50%(v/v) 글라이세롤에 저장할 수 있다. 저장 배지는 양막에 영양분을 제공하고 전해질 평형을 유지시켜 주며, 글라이세롤은 양막의 수화 상태를 유지시키는 기능을 한다. 당업계에 잘 알려진 이용될 수 있는 저장 배지로 DEME, Liebowitz 배지, MEM 또는 NCTC 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 양막은 소듐 하이포클로라이드에 저장할 수 있다. 이렇게 태반에서 분리된 양막은 4℃에서 6 주까지 무균 상태로 저장할 수 있다.

본 발명에 따르면, 감마선(25 kGy)이 조사된 태반을 생리식염수로 3-10회, 보다 바람직하게는 4-7회, 가장 바람직하게는 5회에 걸쳐서 반복 린스하여 실험에 사용하였으며, 태반을 저장하기 위해서는 0.025% 소듐 하이포클로라이드를 이용하였고 제조된 소양막을 100% 글라이세롤에서 24시간 동안 냉장보관 하였다(참조: 연구방법).

한편, 양막은 상피의 증식과 분화를 촉진하는 성장인자 외에도 기저막의 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 1, 라미닌 5, 파이브로넥틴을 포함하여 상피 세포의 이주 및 세포외 기질 유착을 촉진하며, α1-항트립신, 인터-α-트립신 억제제, α1-항키모트립신, α2-마크로글로불린, α2-항플라스민 등과 같은 단백분해효소 억제물질들도 창상 치유를 촉진한다. 또한, 양막은 형질전환 성장인자-β(TGF-β) 전달체계의 하향조절을 통해서 섬유아세포의 증식 및 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화를 억제시켜서 반흔 형성을 억제하는 기능도 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막은 안구 질환 또는 상처 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 안구 질환 또는 상처는 화학적 화상으로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “화학적 화상(chemical burn)”은 생체 조직이 강산 또는 강염기 같은 부식성 물질에 노출될 때 일어나는 광범위한 조직 손상을 의미한다. 화학적 화상은 표준 화상 분류에 따라 구분할 수 있으며, 부식성 물질로는 산, 염기, 산화제, 용매, 환원제 및 알킬 화물 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 화학적 화상은 미란성 독가스(예: 발포제, 루이사이트) 또는 두드러기발생제(예: 포스젠 옥심) 같은 화학 무기에 의해 유발될 수 있다. 화학적 화상에 의한 증상은 피부의 가려움, 탈색 또는 다크닝, 화끈거리는 느낌(burning sensations), 호흡 곤란, 각혈, 조직 괴사 및 죽음을 포함한다. 통상적으로, 화학적 화상의 소스는 실버 나이트레이트(AgNO₃), 염산, 양잿물(NaOH) 또는 석회(CaO)를 포함한다. 또한, 화학적 화상은 피부 및 눈을 포함하는 신체 표면과의 직접적 접촉, 호흡 및 섭취를 통해 일어날 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 안구 질환 또는 상처는 손상된 안구 표면, 눈의 질환, 지속성 상피 결손, 지속성 결막 궤양, 주변주 각막 궤양, 허혈성 각막염, 염증성 각막염, 신경영양인자성 각막염, 윤부염, 무홍채증, 수포각막병증, 스티븐스-존슨 증후군, 안반흔성유천포창, 쇼그렌 증후군, 익상편 또는 가상익상편, 다발성내분비선 부전, 병소(lesion)의 절제, 결막 종양의 절제, 줄기세포 이식수술, 결막 염증, 급성 염증, 화학적 및 열적 화상의 급성 상태(state), 각막기질 융해 질환, 류마티스성 각막병증, 바이러스 결막염 또는 박테리아 궤양에 의해 특징되는 질환, 질병 또는 상태를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 눈의 질환은 각막 부종, 각막 혼탁, 반흔, 표면 염증, 안내 염증, 각막 신혈관신생(corneal neovascular disorder) 또는 안구 건조증을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 무세포 양막은 미처리 양막과 비교하여 70-140 wt%, 보다 바람직하게는 80-135 wt%, 보다 더 바람직하게는 90-130 wt%, 가장 바람직하게는 100-120 wt%의 성장인자를 함유하고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 무세포 양막에 함유된 성장인자는 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 케라티노사이트 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 헤파토사이트 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor)-α(TGF-α), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), TSP-1(Thrombospondin-1), 색소상피유래인자(Pigment epithelium-derived factor, PEDF) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 따라 제조된 무세포 양막을 제공한다.

본 발명의 무세포 양막은 상술한 본 발명의 제조방법에 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 무세포 양막은 세포치료제, 생체 기저막 또는 콘텍트렌즈에 이용될 수 있다.

본 발명에서, 상술한 세포는 유전자 치료법으로 변형된(pre-engineered) 세 포, 망막색소 상피세포, 상피줄기세포, 윤부줄기세포, 윤부상피세포, 구강점막 상피세포 및 코점막 상피세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상술한 콘텍트 렌즈용 무세포 양막은 치료용 콘텍트 렌즈, 굴절용 콘텍트 렌즈, 인공수정체 또는 각막용 렌즈 인레이(corneal lens inlay, 각막 이식)에 이용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 무세포 양막은 다양한 약물에 대한 약물전달시스템(drug delivery system: DDS)로 이용될 수 있다. 예컨대, 무세포 양막을 항생제 또는 항염증제가 포함된 용액에 함침시켜 상기 약물을 무세포 양막에 내입시키고 이어 상기 무세포 양막을 치료 부위에 도포하면 상기 약물이 치료 부위로 서서히 방출(sustained release)되어 상기 부위를 치료할 수 있다. 이러한 측면에서, 무세포 양막은 약물에 대한 서방성 DDS로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 무세포 양막을 포함하는 생체적합성 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 무세포 양막을 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 양막 이식, 안구 질환 치료 또는 상처 치료, 콘택트렌즈, 세포 배양 또는 이식용 조직, 또는 생체기저막으로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 무세포 양막의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 무세포 양막의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 국소 부위에서 각막 외과 수술(예: 양막 이식술), 상처 치료 또는 피부 이식에 이용될 수 있으며, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 영향 받을 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 각막세포에 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 각막상피세포에 이용될 수 있다(참조: 연구방법 및 도 3).

각막은 홍채, 동공 및 전방을 둘러싸고 있는 눈의 투명한 앞쪽 부위로, 각막 상피, 보우만층(Bowman's layer), 각막간질, 데스메막(Descemet' membrane) 및 각막 내피로 구성된다. 각막은 축소된 역상을 망막 위로 굴절시킨다. 각막 손상을 치료하기 위해서 각막 외과 수술 또는 각막 교정술을 이용할 수 있다.

임상학적 조직 이식을 위해, 사람의 양막을 이용하는 것이 가장 바람직하지만, 사람의 양막의 이용은 다음과 같은 제한점이 있다: (a) 산모로부터 양막 기증의 어려움, (b) 적은 양, (c) 인체-유래 질병 전이의 위험성 및 (d) 종교적, 윤리적, 도덕적 난점. 이러한 제한점을 극복할 수 있고 사람의 양막을 대신할 수 있는 대안으로서 다른 동물의 양막의 이용이 시급하게 요구된다. 하지만, 다른 동물의 양막을 이용하는 경우, 항원성 및 병원성 제거를 위한 무세포화 과정이 요구되는데, 이러한 과정을 통해서 조직 본래의 특성에 변화가 일어날 가능성이 높다.

본 발명의 방법에 따르면, 본 발명은 간편한 제조 방법(동결-해동-원심분리 방법)을 통해 보다 더 효율적이고 안정적인 무세포 양막을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명은 항원성 및 병원성이 낮거나 또는 제거된 형태의 무세포 양막을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 이식 후 다형핵백혈구의 수를 미처리 양막과 유사한 수준으로 유지한다(참조: 표 2). 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 이식 후 염증세포 또는 아팝토시스 세포를 미처리 양막과 유사한 수준으로 유지한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법에 따라 양막 이식술을 실시한 경우, 각막 실질에 침윤된 다형핵백혈구의 수가 대조군 소양막 이식 패치 군과 통계적으로 유의한 차이가 없었으며(참조: 표 2), TUNEL염색을 통해 확인한 바와 같이, 아팝토시스(세포 자멸사) 세포의 수 역시 대조군 소양막 이식 패치 군과 통계적으로 유의한 차이가 없었다(참조: 도 2).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 이식 후 각막 두께 및 각막 혼탁을 미처리 양막과 유사한 수준으로 유지한다(참조: 표 3 및 도 3).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 동결-해동-원심분리를 이용하여 무세포 양막의 신규한 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 무세포 양막은 무세포화 과정 이후에도 미처리 양막과 비교하 여 70-140 wt%의 성장인자(예: bFGF)를 함유한다.

(c) 본 발명의 무세포 양막은 안구 질환 또는 상처 치료에 매우 효과적이다.

(d) 본 발명의 무세포 양막은 이식 후에 염증세포 및 아팝토시스 세포의 수가 정상 수준으로 유지됨에 따라 염증반응 등의 부작용을 최소화할 수 있다.

(e) 본 발명의 무세포 양막을 유효성분으로 포함하는 양막 이식용 조성물은 사람 양막의 임상학적 이용 상의 어려움을 극복(예를 들어, 구입의 용이성, 대량생산의 가능)할 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

연구대상 및 방법

1. 소양막 준비

모든 소양막은 건강한 국내 홀스타인 종(Korean Holstein) 소의 태반에서 분리하여 생리식염수로 다섯 번 세척 후 0.025% 소듐 하이포클로라이드에 보관되어 사용되었다. 무세포 처리를 하지 않은 대조군 소양막은 25 kGy의 감마선 조사만 을 시행하여 소독처리 하였다. 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 소양막은 25 kGy 감마선 조사된 소양막을 증류수로 24시간 처리한 다음, -196℃ 액화질소에서 15분 동결 후 37℃ 수욕조에서 30분 해빙하는 과정을 3회 시행하고 원심분리(13000 rpm, 5분)를 시행하여 만들었다. 처리된 모든 소양막은 100% 글라이세롤에 24시간 냉장보관 하였다. 화학 효소적 방법을 이용한 무세포 소양막(Amnisite BA^TM, Bioland, Cheonan, Korea)은 70% 에탄올과 0.05% 소듐 하이포클로라이드로 처리하여 소독한 후 0.25% 트립신(pH 7.4), 0.02% EDTA 및 0.9% NaCl의 혼합 용액에 60분간 처리하여 세포를 제거한 다음 25 kGy의 감마선을 조사하여 만들었다.

2. 무세포 소양막의 생체외 평가

세 가지 소양막 조직에 대하여 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색과 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)에 대한 면역조직화학염색을 시행하였고, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 소양막 조직의 bFGF에 대한 정량 검사를 시행하였다.

(1) H&E 염색과 bFGF에 대한 면역조직화학염색

세 가지 소양막 조직을 4% 파라포름알데하이드로 고정하여 절편으로 제작한 후 H&E 염색을 시행하여 광학현미경 관찰하였다.

면역조직화학 염색은 벡터 ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 이용하였다. 탈 파라핀 과정을 거친 세가지 소양막 조직 절편은 내재성 퍼록시다제 활성을 제거하기 위해 60% 메탄올에 녹인 3% H₂O₂에 30분 간 반응시킨 다음 인산완충용액(PBS)으로 세척하였으며 10% 정상 호스 혈청으로 1시간 반응시켜 주변부의 비-특이적 반응을 억제하였다. 일차 항체 anti-bFGF(Santa Cruz, CA, USA)를 200배 희석하여 처리한 뒤 1시간 동안 반응시키고 바이오틴 처리된 2차 항체에 10분, 스트렙타비딘-바이오틴 복합체 용액(Zymed Lacoraoties, Inc., CA, USA)에 10분간 반응시켰다. 마지막으로 3,3-다이아미노베지(DAKO A/S, Glostrup, Denmark)으로 발색시키고 헤마톡실린으로 대조 염색을 시행한 후 세 가지 소양막의 발현 정도를 비교 관찰하였다.

(2) bFGF에 대한 ELISA 정량검사

먼저 조직을 액체질소에서 동결시켜 조직분쇄기로 갈은 후 인상 완충용액 2ml를 첨가하여 15,000 rpm 에서 1분간 초음파분산기를 이용하여 균질화한 다음, 13, 000rpm 에서 15분간 원심분리하여 수용성 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 브랫포드 마이크로-어세이를 이용하였고, bFGF의 양막 조직 내 농도는 상품화된 ELISA 키트(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 정량적으로 측정하였다.

3. 각막 화학 화상에 대한 무세포 소양막의 치유 효과

(1) 각막 알칼리 화상 모델 및 일시적 양막이식술

2-3kg 사이 무게의 흰 토끼(female New Zealand white rabbit, 다윤, Korea) 15마리 30안을 대상으로 12.5 mg/Kg의 틸레타민(Tiletamine)과 졸라제팜(Zolazepam) 혼합마취제(Zoletil, VirbacLab, France), 및 12.5 mg/kg의 자일라진(Xylazine; Rompun, BayerKorea, Korea)를 근육 내 주사하여 마취시킨 뒤 0.5% 포비돈 요오드(povidone iodine)로 실험 시야 전 범위를 소독하였다. 직경 6mm 크기의 원형 여과지를 1 N NaOH 용액에 침적시킨 다음 이를 각막 중앙에 25초간 올려놓은 후 제거하고 생리식염수 50 ml로 세척하여 각막 알칼리 화상을 양안에 만들었다. 대조군 소양막(1군)과 동결-해동-원심분리를 이용하여 무세포 처리된 소양막(2군), 화학 효소적 방법으로 무세포 처리된 소양막(3군)을 상피층이 아래로 가도록 하여 각 군 당 10안씩 각막 전체가 덮히도록 안구표면에 위치시키고 8-0 비크릴(vicryl) 봉합사(TG140-8, Johnson&Johnson, NJ, USA)를 이용하여 결막에 봉합하여 일시적 양막이식술을 시행하였다. 시술 후 모든 군에서 4-0 나일론 봉합사(NB434, AILEE Co, Korea)로 눈꺼풀 봉합술을 시행하였다. 수술 후 2주간 레보플록사신(Levofloxacin; Cravit, Santen, Japan) 점안액을 하루 3회, 덱사메타손-네오마이신-폴리믹신 B(Maxitrol, Alcon, Belgium) 안연고를 하루 2회 점안 하였다.

(2) 각막 내 염증세포 침윤 및 아팝토시스(Apoptosis) 평가

소양막 이식 후 3일에 각 군 당 2마리씩 토끼의 귀 정맥에 과용량의 페노바 르비탈(Phenobarbital)을 주입하여 희생시키고, 화상부위가 중심에 오도록 지름 9 mm 트레핀(Barron radial vacuum trephine, Katena products, Inc., NJ, USA)를 이용하여 각 군당 4안씩 각막을 적출하였다. 모든 조직의 채취 과정은 대한의학회의 지침을 준수하는 중앙대학교 동물윤리 심의위원회 승인을 받은 후 안과 및 시각 연구용 동물 이용에 대한 ARVO 성명(ARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)의 지침에 따라 시행되었다. 적출한 각막에서 염증세포 침윤을 보기 위해 H&E 염색 후 광학현미경을 이용하여 400배의 배율로 관찰하였고, 아팝토시스를 평가하기 위해 TUNEL(Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated d-Uridine 5” triphosphate Nick End Labeling) 염색을 하여 400배로 관찰하였다. 그리고 두 염색에서 각막 간질에 침윤된 다형핵백혈구 수와 각막 간질 내에 있는 TUNEL 염색 양성 세포 수를 연속한 5개의 400배 현미경시야에서 각각 측정하였다.

(3) 각막 상피 치유 효과 평가

실험 후 각막 상피가 완전히 치유될 때까지 매일 플루오레신 형광 염색을 이용하여 Digital photo slit lamp(450D, Canon Co, Japan; SL-D7 Topcon slit lamp, Topcon Co, Japan)로 각막상피결손을 확인하고 촬영하였으며 각막상피결손이 모두 치유되는데 걸린 시간을 기록하여 비교 평가하였다.

(4) 각막 혼탁 및 각막 부종 평가

술 후 1주, 2주, 4주에 각막 중심부 혼탁을 Fantes 등급(Fantes FE et al., 1990)에 따라 0점(완전히 투명한 각막), 0.5점(경사진 간접조명에서 관찰되는 희미한 혼탁), 1점(0.5점보다 심하지만 홍채의 세밀한 관찰이 가능한 정도의 혼탁), 2점(홍채의 세밀한 관찰에 약간 지장이 있는 정도의 혼탁), 3점(홍채와 수정체의 관찰에 상당한 제약이 되는 정도의 혼탁), 4점(완전한 혼탁)으로 평가하였고, 각막 부종은 초음파각막두께측정기(Advent pachymeter^TM, Mentor O&O Inc. USA)를 이용하여 중심 각막 두께를 측정하여 평가하였다.

3. 통계 분석

세 군에서 각막상피 치유 시간과 각막 혼탁, 각막 두께, 각막 내 염증세포수, TUNEL 양성 세포의 수는 Mann-Whitney 검정(SPSS ver.12.0)을 이용하여 비교 분석 하였으며 p 값이 0.05 이하면 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.

실험 결과

1. 무세포 소양막의 생체외 평가

(1) H&E 염색과 bFGF 면역조직화학염색

H&E 염색 결과 동결-해동-원심분리 무세포 처리를 한 소양막은 간질에서 일부 핵 조각들이 관찰되기는 하였지만 세포는 모두 사라졌으며 그 두께는 대조군 소양막의 두께와 비슷하게 유지되고 있었다. 화학 효소적 무세포 처리된 소양막에 서도 세포는 전혀 관찰되지 않았지만 그 두께는 대조군 소양막에 비해 1/2 정도로 얇아져 있음을 관찰할 수 있었다. bFGF 면역조직화학염색 결과 대조군 소양막에서 상피 세포와 기저막, 일부 간질 세포에서 bFGF가 염색되어 있는 것을 확인할 수 있었고 동결-해동-원심분리 무세포 소양막에서도 기질 내에 불규칙하게 퍼진 선형 양상으로 bFGF가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 화학 효소적 무세포 소양막에서는 전혀 bFGF의 발현을 관찰할 수 없었다(도 1).

(2) bFGF 에 대한 ELISA 정량검사

bFGF 농도는 대조군 소양막에서 1.77 pg/mg, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막에서 2.03 pg/mg으로 측정되었고 화학 효소적 무세포 처리된 소양막에서는 수용성 단백질 농도 자체가 너무 적어서(대조군 소양막; 19.35 ㎍/ml, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막; 41.82 ㎍/ml, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막; 8.89 ㎍/ml), bFGF 농도가 유의하게 검출되지 않았다(표 1).

다양한 소양막 제조물에서 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 측정

	신선한 BAM	FTC BAM	CE BAM
단백질 농도(㎍/ml)	19.35	41.82	8.89
bFGF 레벨(pg/㎍)	1.77	2.03	측정 불가*

BAM(bovine amniotic membrane) = 소양막; FTC(freeze-thaw-centrifuge-decellularized) BAM = 동결-해동-원심분리 무세포 소양막; CE(chemical enzyme-decellularized) BAM = 화학 효소적 무세포 소양막.

^*bFGF의 신뢰할만한 측정치를 얻을 수 없었는데, 이는 CE BAM에 추출할만한 수용성 단백질의 양이 극히 낮기 때문이다.

2. 각막 화학 화상에 대한 무세포 소양막의 치유 효과

(1) 각막 H&E 염색과 TUNEL 면역조직화학염색

소양막 이식 3일에 H&E 염색된 각막 조직을 관찰한 결과 세 군 모두 각막 상피가 거의 치유되어 자라 들어온 것을 확인할 수 있었다. 연속된 다섯 개의 고배율시야(X 400)에서 각막 실질에 침윤된 다형핵백혈구의 수는 대조군 소양막 이식군에서 평균 12 ± 2.16개, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에서 평균 15 ± 2.94개, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서는 평균 29.75 ± 4.43개로 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서 다른 두 군에 비해 유의하게 많은 것으로 나타났으며(p < 0.05), 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군 간에는 유의한 차이가 없었다(p = 0.20)(표 2).

알칼리 화상(alkali burn) 후 3일 째 각 소양막 패치 군의 각막 실질에서 PMN 침윤 및 TUNEL 양성 세포의 비교

	신선한 군	FTC 군	CE 군
침윤된 PMNs/5HPFs	12.00 ± 2.16	15.00 ± 2.94	29.75 ± 4.43†‡
TUNEL 양성 세포/5HPFs	4.25 ± 1.50	5.75 ± 1.71	9.50 ± 1.29†‡

PMNs(Polymorphonuclear leukocytes) = 다형핵백혈구; TUNEL(terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated d-Uridine 5'-triphosphate Nick End Labeling) = 말단 데옥시리보뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 d-우리딘 5'-트리포스페이트 닉 말단 표지; HPF(high power field) = 400 X 고배율시야; 신선한 군 = 신선한 소양막 패치 군; FTC 군 = 동결-해동-원심분리 무세포 소양막 패치 군; CE 군 = 화학 효소적 무세포 소양막 패치 군.

^†신선한 군 및 CE 군 간의 p < 0.05 비교(Mann-Whitney 검정).

^‡FTC 군 및 CE 군 간의 p < 0.05 비교(Mann-Whitney 검정).

TUNEL 염색된 각막 조직에서도 연속된 5개 고배율시야(X 400)에서 각막 실질내 아팝토시스 세포의 수를 관찰하였는데, 대조군 소양막 이식군에서 평균 4.25 ± 1.50개, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에서 평균 5.75 ± 1.71개, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서는 평균 9.50 ± 1.29개로 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서 다른 두 군에 비해 유의하게 많은 것으로 나타났으며(p < 0.05), 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군 간에는 유의한 차이가 없었다(p = 0.34)(도 2).

(2) 각막 상피 치유 시간

각막의 평균 상피 치유 시간은 대조군 소양막 이식군에서 3.00±0.63일, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군 3.17±0.41일, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군 3.33±0.52일 이었으며 세 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(표 3).

알칼리 화상 후 각 소양막 패치 군에서 각막 상피 치유 시간, 각막 혼탁 및 중심 각막 두께의 비교

	신선한 군	FTC 군	CE 군
각막 상피 치유 시간(days)	3.00 ± 0.63	3.17 ± 0.41	3.33 ± 0.52
각막 혼탁 점수* 1주 차 2주 차 4주 차	3.67 ± 0.52 3.00 ± 0.63 2.00 ± 0.63	3.67 ± 0.52 3.16 ± 0.41 2.17 ± 0.41	4.00 ± 0.00 3.50 ± 0.55 3.00 ± 0.63†‡
중심 각막 두께(㎛) 1주 차 2주 차 4주 차	761.8 ± 58.2 732.5 ± 50.5 633.7 ± 42.7	773.3 ± 29.7 750.7 ± 28.6 637.2 ± 28.2	799.2 ± 67.1 780.8 ± 66.7 712.0 ± 66.3†‡

신선한 군 = 신선한 소양막 패치 군; FTC 군 = 동결-해동-원심분리 무세포 소양막 패치 군; CE 군 = 화학 효소적 무세포 소양막 패치 군.

^*Fantes 등급(Fantes FE et al., 1990)

^†신선한 군 및 CE 군 간의 p < 0.05 비교(Mann-Whitney 검정).

^‡FTC 군 및 CE 군 간의 p < 0.05 비교(Mann-Whitney 검정).

(3) 각막 혼탁 및 각막 부종

Fantes 등급(Fantes FE et al., 1990)에 따른 중심 각막의 평균 혼탁 정도는 화상 후 1주와 2주에는 세 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 하지만 4주에는 대조군 소양막 이식군에서 2.00 ± 0.63점, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에서 2.17 ± 0.41점, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서 3.00 ± 0.63점으로 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군이 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에 비해 통계적으로 유의하게 각막 혼탁이 심하였다(p < 0.05). 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다(p = 0.70)(도 3).

중심 각막 두께도 화상 후 1주와 2주에는 세 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았지만 4주에는 대조군 소양막 이식군에서 633.7 ± 42.7 ㎛, 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에서 637.2 ± 28.2 ㎛, 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군에서 712.0 ± 66.3 ㎛로 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식 군이 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군에 비해 유의하게 중심 각막이 두꺼웠으며(p<0.05), 대조군 소양막 이식군과 동결-해동-원심분리 무세포 처리된 소양막 이식군 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다(p = 0.82)(도 3).

고 찰

양막에는 상피의 증식과 분화를 촉진시키는 bFGF, EGF, KGF, HGF 등의 여러 성장 인자들(Shinozaki M et al., 1995; Koizumi NJ et al., 2000) 이외에도 기저막의 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 1, 라미닌 5, 파이브로넥틴이 상피 세포의 이주 및 세포외 기질 유착을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Grueterich M et al., 2003). 또한, 양막에 존재하는 α1-항트립신, 인터-α-트립신 억제제, α1-항키모트립신, α2-마크로글로불린, α2-항플라스민 등과 같은 단백분해효소 억제물질들도 창상 치유를 촉진하고(Na BK et al., 1999), 형질전환 성장인자-β(TGF-β) 전달체계의 하향조절을 통해서 섬유아세포의 증식 및 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화를 억제시켜서 반흔 형성을 억제하는 작용도 나타내는 것으로 보고되고 있다(Buultmann S et al., 1999; Li DQ et al., 1999; Tseng SC et al., 1998).

소양막도 사람 양막과 같이 단층의 입방상피세포와 기저막, 기질로 구성되어 있으며 두께는 약 15 ㎛이며, 사람 양막의 면적이 약 1600 cm²인데 비해 소양막은 그 4-5배인 약 6000~7500 cm²의 면적을 가진다(Rao TV et al., 1981). 소양막이 사람 양막에서와 같은 치료적 효능이 있는지에 대하여는 1981년 토끼 피부 화상에서 소양막이 사람 양막과 유사한 상처 치유 효과를 나타낸다는 보고가 있었지만(Rao TV et al., 1981), 그 이후 별다른 연구 결과 없이 주목 받지 못하였다. 아마도 소양막을 사람에게 적용하기 위해서 항원성 및 병원성 제거를 위한 무세포 처리가 선행되어야 하는데 이에 대한 과정이 해결되지 않고 있었던 것이 한 원인으로 생각된다. 그러나 최근 Park 등(Park M et al., 2008)이 소양막을 trypsin 과 EDTA 등을 이용하여 무세포 처리를 한 후 돼지 피부 화상의 상처 치유에 적용하였고 무세포 처리하지 않은 소양막 및 사람 양막과 유사한 상피 치유 촉진 효과를 보고하면서 무세포 처리된 소양막의 치료적 이용 가능성을 보고하였다. 또한, 안과적으로 개의 각막 상처 치유에도 이러한 무세포 소양막이 우수한 치료적 효과를 보였다는 연구 결과 발표도 있었다(Kim JY et al., 2009). 본 연구에서도 토끼 각막 화학 화상에서 화학 효소적 무세포 처리된 소양막과 동결-해동-원심분리를 이용하여 무세포 처리된 소양막, 대조군 소양막 모두가 평균 각막 상피 치유 시간에 차이를 보이지 않는 비슷한 상처 치유 효과를 나타내었다. 그러나 화학 효소적 무세포 처리된 소양막을 대조군 소양막과 비교해보았을 때 양막 기질의 두께가 얇아지고 bFGF는 소실되어 관찰되지 않았다. 이는 대조군 소양막 않았다.화학 효소적 무세포 처리된 소양막이 콜라겐 IV형의 농도에는 차이가 없었지만 EGF의 농도는 약 반으로 줄었다는 Park 등(Park M et al., 2008)의 결과와 연관지어 보면, 화학 효소적 무세포 처리 후 양막 기질의 주 성분인 collage type IV의 농도에는 변함없이 양막이 얇아졌다는 것은 양막 기질 내 많은 수용성 성분들이 소실된 것으로 생각해볼 수 있으며, 실제로 본 연구에서 bFGF의 뚜렷한 소실은 확인되었다. 그리고 화학 효소적 처리에 의한 무세포 소양막에서 bFGF가 검출되지 않고 염색도 되지 않은데 비해 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 소양막에서는 bFGF가 충분히 검출되고 관찰되는 것은 동결-해동-원심분리 무세포 처리과정이 세포만 소실시키고 세포외 기질에 존재하던 bFGF는 보존할 수 있었기 때문으로 생각된다. 본 연구에서 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 소양막에서 대조군 소양막 보다 bFGF 농도가 오히려 더 높게 검출되기도 하였는데, 이는 손상 받거나 죽은 세포에서 bFGF가 더 많이 분비된다는 기존의 보고(Mignatti P et al., 1991)에 비추어보았을 때 설명될 수 있다. 본 연구에서 직접 확인해보진 못하였지만 bFGF 이외의 KGF, HGF 같은 다른 성장 인자들과 단백분해효소 억제물질들도 무세포 처리과정에 따라 양막내 존재 량에 변화가 있을 것으로 생각되며 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 처리과정이 화학 효소적 처리보다는 양막의 주요 성분들을 좀 더 잔존시킬 수 있을 것으로 사료된다.

화학 효소적 무세포 소양막 이식군에서도 상피 치유 촉진 효과는 나타났고 상피 치유 시간도 무세포 처리 방법에 따른 유의한 차이는 없었는데, 이는 소양막의 기저막과 기질 자체 만으로도 상당한 상피 치유효과를 나타내는 것으로 생각해볼 수 있다. 또한 기저막의 콜라겐 IV 농도가 화학효소적 처리 후에도 변함이 없다는 사실이 이를 뒷받침 한다. 하지만, 무세포 처리 방법에 따른 소양막내 각종 성분 차이는 각막 화학 화상의 초기 치유 과정에서 침윤된 염증 세포 와 자멸 세포의 수에서 차이를 가져온 것으로 생각된다. 화상 후 3일에 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 군에서 염증세포와 자멸세포의 수가 대조군 소양막 이식 군이나 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 소양막 이식군에 비해 유의하게 많았는데, 이는 돼지 피부 화상모델에서도 화학 효소적 무세포 소양막 이식군이 대조군 소양막 이식군에 비해 3일 째 염증반응이 심했다는 Park 등(Park M et al., 2008)의 결과와도 일치한다. 토끼 각막 화학 화상에서 양막에 의한 각막부종 및 각막혼탁의 호전은 화상 후 약 3주부터 유의하게 나타나며, 화상 후 약 8주가 지나면 각막 두께는 거의 정상화된다고 보고되고 있다(Park DW et al., 2002; Kim JS et al., 2000). 본 연구에서 각막 화학 화상 후 4주 까지 각막 부종과 혼탁에 대한 평가 결과, 화상 후 4주에 각막 부종과 각막 혼탁 모두 화학 효소적 무세포 처리된 소양막 이식군이 다른 소양막 군에 비해 호전 정도와 유의한 차이가 났는데, 이 점도 역시 화학 효소적 처리된 무세포 소양막 내 각막 내피세포 회복 및 유지에 관여하는 bFGF 와 기타 여러 양막 내 성장인자들의 소실이 관여되고, 양막의 반흔 억제 작용의 주요 기전인 TGF-β 전달체계의 하향 조절 능력 또한 감소한 것으로 짐작해볼 수 있다. 하지만 무세포 소양막 간의 이런 차이가 나타나는 정확한 원인 및 기전에 대해서는 좀더 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결 론

소양막은 사람 양막에 비해 쉽게 구할 수 있고 크기가 커서 대량 생산도 가능하다. 또한 인체 조직에 관련된 여러 제한에서 벗어나 있어 편리한 사용도 가능하기 때문에 양막의 사용을 보편화시킬 수 있다. 그러나 그 선행 요건으로, 소양막의 항원성 및 병원성 제거를 위한 무세포화 처리 과정이 필요하다. 본 연구에서 동결-해동-원심분리를 이용한 새로운 무세포 소양막은 기존의 화학 효소적 무세포 소양막에 비해 소양막 특성을 잘 유지하면서 상처 치유 및 반흔 억제에도 본래의 소양막과 유사한 우수한 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 비록 bFGF 외의 다양한 양막 성분들에 대한 추가적인 연구와, 일부 남아있는 세포 핵 조각들에 대한 DNA 정량 검사, 바이러스 전염성 검사 같은 항원성 및 병원성에 대한 더 많은 연구가 필요하긴 하지만, 우수한 치료적 효과를 나타내는 새로운 무세포 소양막은 향후 다양한 분야에서 치료에 이용될 수 있을 것으로 기대해볼 수 있다.

참조문헌

Bashkin P, Doctrow S, Klagsbrun M, Svahn CM, Folkman J, Vlodavsky I (1989) Basic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules. Biochemistry 28: 1737-43.

Bose B (1979) Burn wound dressing with human amniotic membrane. Ann R Coll Surg Engl. 61(6): 444-7.

Buultmann S, You L, Spandau U (1999) Amniotic membrane down-regulate chemokine expression in human keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci 40: S3044.

de Rotth A (1940) Plastic repair of conjunctival defects with fetal membrane. Arch Ophthalmol 23: 522-5.

Espana EM, Crueterich M, Sandoval H, Solomon A, Alfonso E, Karp CL, Fantes F, Tseng SC (2003) Amniotic membrane transplantation for bullous keratopathy in eyes with poor visual potential. J Cataract Refract Surg 29: 279-84.

Fantes FE, Hanna KD, Waring III GO, Pouliquen Y, Thompson KP, Savoldelli M (1990) Wound healing after excimer laser keratomileusis(photorefractive keratectomy) in monkeys. Arch Ophthalmol 108: 665-75.

Gospodarowicz D, Mescher AL, Brown KD, Birdwell CR (1977) The role of fibroblastic growth factor and epidermal growth factor in the proliferative response of corneal and lens epithelium. Exp Eye Res 25: 631-49.

Grueterich M, Espana EM, Tseng SC (2003) Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche. Surv Ophthalmol 48: 631-46.

Hecquet C, Morisset S, Lorans G, Plouet J, Adolphe M (1990) Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on the proliferation of rabbit corneal cells. Curr Eye Res 9: 429-33.

Houlihan JM, Biro PA, Harper HM, Jenkinson HJ, Holmes CH (1995) J Immunol 154(11): 5665-74.

Jeoung JW, Yoon YM, Lee JL, Wee WR, Lee JH, Kim MK (2004) The effect of amniotic membrane transplantation on the treatment of necrotizing scleritis after pterygium excision. J Korean Ophthalmol Soc 45: 1981-8.

Kim JC, Tseng SC (1995) Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea 14: 473-84.

Kim JS, Kim JC, Na BK, Jeong JM, Song CY (2000) Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn. Exp Eye Res 70(3):329-37.

Kim JY, Choi YM, Jeong SW, Williams DL (2009) Effect of bovine freeze-dried amniotic membrane (Amnisite-BA) on uncomplicated canine corneal erosion. Vet Ophthalmol 12(1): 36-42.

Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ, Fullwood NJ, Quantock AJ, Kinoshita S (2000) Growth factor and mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. 20(3): 173-7.

Li DQ, Lee SB, Tseng SC (1999) Differential expression and regulation of TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-betaRI, TGF-betaRII and TGF-betaRIII in cultured human corneal, limbal, and conjunctival fibroblasts. Curr Eye Res 19:154-61.

Meller D, Pires RT, Mack RJ, Figueiredo F, Heiligenhaus A, Park WC, Prabhasawat P, John T, McLeod SD, Steuhl KP, Tseng SC (2000) Amniotic membrane transplantation for acute chemical or thermal burns. Ophthalmology 107:980-9.

Mignatti, P., Rifkin, D.B (1991) Release of basic fibroblast growth factor, an angiogenic factor devoid of secretory signal sequence: a trivial phenomenon or a novel secretion mechanism? J Cell Biochem 47: 201207.

Na BK, Hwang JH, Kim JC, Shin EJ, Kim JS, Jeong JM, Song CY (1999) Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent for recalcitrant keratitis. Placenta 20:453-66.

Park DW, Yoo KW, Park WC (2002) The Effects of amniotic membrane ointment on corneal alkali burn in rabbits. J Korean Ophthalmol Soc 43(9):1758-66.

Park M, Kim S, Kim IS, Son D (2008) Healing of a porcine burn wound dressed with human and bovine amniotic membranes. Wound Repair Regen 16(4): 520-8.

Pires RT, Tseng SC, Prabhasawat P, Puangsricharern V, Maskin SL, Kim JC, Tan DT (1999) Amniotic membrane transplantation for symptomatic bullous keratopathy. Arch Ophthalmol 117: 1291-7.

Prabhasawat P, Tesavibul N, Komolsuradej W (2001) Single and multilayer amniotic membrane transplantation for persistent corneal epithelial defect with and without stromal thinning and perforation. Br J Ophthalmol 85:1455-63.

Rao TV, Chandrasekharam V (1981) Use of dry human and bovine amnion as a biological dressing. Arch Surg 116: 8916.

Schweigerer L, Ferrara N, Haaparanta T, Neufeld G, Gospodarowicz D (1988) Basic fibroblast growth factor: expression in cultured cells derived from corneal endothelium and lens epithelium. Exp Eye Res46:71-80.

Shin KS, Chung IY, Seo SW (2003) The effect of amniotic membrane transplantation for corneal ulcer and ocular surface diseases. J Korean Ophthalmol Soc 44:1305-10.

Shinozaki M, Shoda A, Shimazaki J (1995) Detection of basic fibroblast growth factor from amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 36:131-8.

Tamhane A. Vajpayee RB, Biswas NR, Pandey RM, Sharma N, Titiyal JS, Tandon R (2005) Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology 112:1963-9.

Tseng SC, Li DQ, Ma X (1998) Down regulation of TGF-b1, b2, b3, and TGF-b receptor II expression in human corneal fibroblasts by amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 39:S428.

Tseng SC, Prabhasawat P, Lee SH (1997) Amniotic membrane transplantation for conjunctival surface reconstruction. Am J Ophthalmol 124(6):765-74.

Vishwakarma GK, Khare AK (1986) Amniotic arthroplasty for tuberculosis of the hip. A preliminary clinical study. J Bone Joint Surg Br 68(1):68-74.

Vlodavsky I, Folkman J, Sullivan R, Fridman R, Ishai-Michaeli R, Sasse J, Klagsbrun M (1987) Endothelial cell-derived basic fibroblast growth factor: synthesis and deposition into subendothelial extracellular matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 2292-6.

Vlodavsky I, Fuks Z, Ishai-Michaeli R, Bashkin P, Levi E, Korner G, Bar-Shavit R, Klagsbrun M (1991) Extracellular matrix-resident basic fibroblast growth factor: implication for the control of angiogenesis. J. Cell. Biochem. 45: 167-76.

Zahar Y, Talmi YP, Finkelstein Y, Shvili Y, Sadov R, Laurian N (1987) Use of human amniotic membrane in otolaryngologic practice. Laryngoscope 97: 978-980.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 신선한 소양막(F-BAM; A, D), 동결-해동-원심분리 무세포 소양막(FTC-BAM; B, E) 및 화학 효소적 무세포 소양막(CE-BAM; C, F)의 헤마콕실린-에오신 염색(A, B, C) 및 bFGF 면역조직화학염색(D, E, F) 결과이다(원배율: X 200). 어떤 핵 단편이 FTC-BAM에서 보여질 지라도, 세포가 FTC-BAM 및 CE-BAM 모두에서 부재하였다. FTC-BAM의 두께는 F-BAM의 두께와 유사하였지만, CE-BAM의 두께는 F-BAM의 약 1/2의 두께 정도로 얇았다. 면역조직화학염색을 통해, bFGF가 F-BAM의 상피, 기저막 및 기질세포에서 강하게 발현하는 것을 확인하였다. FTC-BAM의 경우, bFGF가 기질에서 불규칙한 선형 또는 둥글게 뭉친(conglomerated) 형태로 발현되었다. 하지만, 본 발명자들은 CE-BAM에서 bFGF의 발현을 발견할 수 없었다.

도 2는 알칼리 화상 후 3일 째에 토끼 각막의 헤마톡실린-에오신 염색(A, B, C) 및 면역조직화학염색(D, E, F) 결과이다(원배율: X 200). 신선한 소양막 패치 군(A, D) 및 동결-해동-원심분리 무세포 소양막 패치 군(B, E)보다 화학 효소적 무세포 소양막 패치 군(C, F)의 각막 간질에서 염증성 세포 및 아팝토시스 세포(검은 화살표)들이 더 많이 존재한다.

도 3은 알칼리 화상 후 1주 차(A, D, G), 2주 차(B, E, H) 및 4주 차(C, F, I)에 각막 혼탁을 나타내는 사진이다. 화학 효소적 무세포 소양막 패치 군(G, H, I)을 제외한 모든 군에서 각막 혼탁이 개선되었으며, 신선한 소양막 패치 군(A, B, C) 및 동결-해동-원심분리 무세포 소양막 패치 군(D, E, F)보다 화학 효소적 무세포 소양막 패치 군(G, H, I)의 혼탁 정도가 더욱 뚜렷하였다.

Claims (20)

1. 다음의 단계를 포함하는 화학적 효소 처리를 하지 않는 무세포 양막(decellularized amniotic membrane)의 제조방법:

   (a) 상기 양막을 동결하는 단계;

   (b) 상기 동결된 양막을 해동하는 단계; 및

   (c) 상기 해동된 양막을 원심분리 하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 양막은 인간, 돼지, 양, 염소, 말, 알파카(alpaca), 마우스, 래트 또는 소의 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 양막은 소의 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 양막은 동결 전 증류수에 12-48시간 동안 보관하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 양막의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 동결된 양막의 해동은 20-45℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)는 2-8회 반복 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 원심분리는 5000-20000 rpm에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 원심분리는 3-10분 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 무세포 양막은 안구 질환 또는 상처 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 안구 질환 또는 상처는 화학적 화상으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 안구 질환 또는 상처는 손상된 안구 표면, 눈의 질환, 지속성 상피 결손, 지속성 결막 궤양, 주변주 각막 궤양, 허혈성 각막염, 염증성 각막염, 신경영양인자성 각막염, 윤부염, 무홍채증, 수포각막병증, 스티븐스-존슨 증후군, 안반흔성유천포창, 쇼그렌 증후군, 익상편 또는 가상익상편, 다발성내분비선 부전, 병소(lesion)의 절제, 결막 종양의 절제, 줄기세포 이식수술, 결막 염증, 급성 염증, 화학적 및 열적 화상의 급성 상태(state), 각막기질 융해 질환, 류마티스성 각막병증, 바이러스 결막염 또는 박테리아 궤양에 의해 특징되는 질환, 질병 또는 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 눈의 질환은 각막 부종, 각막 혼탁, 반흔, 표면 염증, 안내 염증, 각막 신혈관신생(corneal neovascular disorder) 또는 안구 건조증 인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 무세포 양막은 미처리 양막이 함유하는 성장인자의 100-120 wt%의 성장인자를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 성장인자는 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 케라티노사이트 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 헤파토사이트 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor)-α(TGF-α), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), TSP-1(Thrombospondin-1), 색소상피유래인자(Pigment epithelium-derived factor, PEDF) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 (pre-a) 단계인 양막을 증류수에 함침시키는 전처리 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 상기 무세포 양막은 세포치료제, 생체 기저막 또는 콘텍트렌즈에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 무세포 양막.
19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 무세포 양막을 포함하는 생체적합성 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물은 양막 이식, 안구 질환 치료 또는 상처 치료, 콘택트렌즈, 세포 배양 또는 이식용 조직, 또는 생체기저막으로 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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