BRPI0705370B1 - processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, preparação farmacêutica e seu uso como medicamento para lesões ulceradas - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, preparação farmacêutica e seu uso como medicamento para lesoes ulceradas. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, compreendendo basicamente a diluição de uma substância ativa em um veículo farmaceuticamente aceitável. a referida composição é utilizada como um medicamento de uso tópico para ser aplicado em lesões ulceradas em indivíduos normais ou em individuos portadores de diabetes mellitus.

Description

Relatório descritivo da patente de Invenção para “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO COMO MEDICAMENTO PARA LESÕES ULCERADAS”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, a qual é utilizada como um medicamento para ser aplicado em lesões ulceradas em indivíduos normais ou em indivíduos portadores de diabetes mellitus. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso da referida preparação como um medicamento de uso tópico em lesões ulceradas.

TÉCNICAS RELACIONADAS:

O diabetes é uma doença conhecida desde a antiguidade, onde era caracterizada como um distúrbio com quantidade excessiva de açúcar na urina. Dados estatísticos encontrados na literatura indicam que atualmente existem mais de 5 milhões de brasileiros portadores de diabetes, e as expectativas são de que possa existir cerca de 11 milhões de diabéticos para 2025, o que representa um aumento de 100% em relação aos números atuais. (International Diabetes Federation, 2002).

O diabetes melitus (DM) é um distúrbio no metabolismo dos carboidratos, das gorduras e proteínas, capaz de ocasionar a hiperglicemia uma vez que há insuficiência insulínica devido a uma falha das células-β do pâncreas, ou ainda resistência

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2/27 à ação deste hormônio. A glicose plasmática elevada predispõe às complicações crônicas envolvendo vários tecidos.

Uma das complicações mais freqüentes e potencialmente grave ocasionadas pelo DM é a cicatrização tecidual indolente das lesões ulcerativas as quais podem sofrer um grande processo inflamatório devido à facilidade de infecções. Aproximadamente 15% de todos os pacientes com diabetes terão, em algum momento, feridas de difícil cicatrização, a despeito de tratamento insulínico e meticuloso controle dietético.

Diferentes mecanismos patogênicos têm sido sugeridos como envolvidos no desenvolvimento das complicações dérmicas do diabetes, incluindo a microangiopatia, envelhecimento prematuro dos fibroblastos da pele, processos imune-mediados, mudanças estruturais e funcionais na membrana basal.

Entretanto, uma das lesões ulcerativas mais preocupantes refere-se às lesões ocorridas nos membros inferiores, as quais podem levar a amputação do membro. É ainda estimado que cerca de 10 a 25% dos pacientes com diabetes mellitus, em algum momento crítico da doença desenvolvam lesões nos membros inferiores.

Os fatores de risco que ocasionam o desenvolvimento das úlceras diabéticas são o controle metabólico inadequado; doença vascular periférica; neuropatia; deformações ortopédicas; infecções; traumatismos dentre outras.

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Os locais julgados como de maior risco para o aparecimento das lesões são, os dedos, os sulcos interdigitais, a região distal e a região medial dos pés.

Uma vez detectada à lesão, esta deve ser avaliada e o tratamento tópico instituído. Uma reavaliação contínua da lesão se faz necessária para que se possa melhor monitorar a eficiência das estratégias de tratamento e acompanhar a evolução do tratamento.

Para que a cicatrização seja viável, devemos levar em consideração irrigação vascular adequada no local, equilíbrio microbiano da ferida, redução da pressão das áreas adjacentes; além do controle glicêmico e distúrbios sistêmicos, que também interferem no processo de cicatrização.

Para o tratamento das lesões ulceradas, principalmente das lesões que além dos sinais locais, apresentam sinais associados de infecção (osteomielite, celulite, septicemia), os antibióticos sistêmicos são os mais indicados.

Sabe-se ainda que o diabetes ocasiona uma diminuição na expressão tecidual de fatores de crescimento, e que como tratamento o uso tópico destes fatores podem melhorar a cicatrização.

A insulina é um hormônio produzido no pâncreas pelas células-β, responsável pela regulação dos níveis de açúcar no sangue, é liberada pelo pâncreas de maneira proporcional à quantidade de glicose no sangue.

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Entretanto, quando um indivíduo é acometido pelo diabetes, a secreção da insulina pelo pâncreas não ocorre na proporção adequada para a manutenção dos níveis sanguíneos normais de glicose, este fato ocasiona um acúmulo de glicose no sangue.

A insulina se aplicada diretamente sobre a lesão, apresenta papel fundamental na cura de ferimentos, de modo a promover uma melhor cicatrização. A literatura mostra que este hormônio estimula a incorporação de [3H]thymidine em fibroblastos de pele.

A insulina de forma intensa e específica, estimula a síntese de colágeno em fibroblastos da pele, devido à proliferação dos queratinócitos possibilitando a migração dos referidos queratinócitos para a região lesionada, uma vez que os queratinócitos constituem as últimas células da epiderme a sofrer a regeneração. A insulina atua na sinalização celular por meio de cinases (especificamente PI3K e Akt) e também por meio de uma da proteína SREBP que se liga ao DNA regulando a produção de colesterol e afins

A insulina é um hormônio anabólico com poderosos efeitos metabólicos e de promoção de crescimento. Os efeitos metabólicos são observados na regulação da homeostase da glicose, predominantemente em tecidos hepático e periférico (músculo e gordura). Apresentam ainda, ação integrada no metabolismo dos carboidratos, proteínas e lípides.

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Os efeitos do crescimento e diferenciação celular ocorrem devido à modificação da atividade de uma variedade de enzimas (cinases) e sistemas de transporte protéico, levando à estimulação na síntese de RNA e DNA, estímulo à síntese e inibição da degradação de proteínas.

Atualmente, os ferimentos crônicos ou que demoram a curar causam sérios problemas nos sistemas de saúde de uma maneira geral, devido ao processo prolongado de seu tratamento, que representa maior custo econômico.

Dessa forma, buscando minimizar os problemas causados pelas desordens causadas pelo diabetes, diversos documentos relacionados na técnica revelam preparações farmacêuticas, assim como seus respectivos processos de produção e métodos para tratamento que venham a acelerar o processo de cicatrização.

O documento US2002131994 descreve uma composição química compreendendo uma substância ativa, tal como a insulina, um biopolímero, pelo menos uma erva natural, produtos vegetais, animais e solvente. A substância ativa da composição é liberada de modo transdérmico sem causar a irritação da pele.

O documento US2002119914 descreve uma composição farmacêutica utilizada para aplicação tópica na pele, couro cabeludo ou cabelo, para tratar ou prevenir pústulas causadas pela diabete, coceiras, doenças nervosas, desordens dérmicas com defectiva descamação como ictiose, psoriase, acne

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6/27 ou caspa. A referida composição compreende insulina, selecionada dentre a sintética, recombinante, humana ou animal; ou pancreatina.

Encontra-se revelado no documento WO200209639 uma composição farmacêutica para induzir ou acelerar a cura da pele, tal como de uma úlcera diabética, laceração ou incisão cirúrgica pela administração de um agente ativo e estimulador tal como a insulina, que acelera a produção e/ou ativação de proteínas cinases.

O documento EP280460 refere-se a uma composição farmacêutica tópica contendo insulina como fator de crescimento para acelerar e melhorar a qualidade curativa, um veículo para administração tópica tal como ungüento, um creme ou gel .

Um tratamento tópico para neuropatias do diabetes, por meio da administração de uma composição compreendendo insulina em diluente tópico ou um veículo para atingir a área da pele, é revelado no documento EP808170.

Já é revelado no documento WO9611705 uma formulação contendo proteínas ou polipeptideos ativos para administração transdermica especificamente para uso no tratamento do diabetes com insulina.

Uma proteção curativa efetiva para os ferimentos causados pelos diabetes são amplamente discutidos na técnica, entretanto, nota-se que as composições reveladas, são

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7/27 complexas, compreendendo diversas substâncias excipientes em sua formulação, onerando demasiadamente o tratamento.

Entretanto, nenhum documento descreve o uso de insulina regular humana associado a uma composição específica do creme para diluição, objetivando o tratamento de lesões ulceradas de diabéticos e não diabéticos, que tenham restaurado as proteínas da via de sinalização de insulina (ir, irs-1, irs-2, shc, mapk e akt) na ferida cicatricial.

No intuito de prover a técnica de formulações mais simples, menos onerosas e capazes de aceleração o processo cicatricial de forma eficiente, a presente concretização revela uma preparação farmacêutica que atenda as necessidades ainda hoje existentes na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, compreendendo basicamente a diluição da insulina humana em um veículo farmaceuticamente aceitável. A referida composição é utilizada como um medicamento para ser aplicado em lesões ulceradas em indivíduos normais ou em indivíduos portadores de diabetes mellitus. A referida preparação farmacêutica é provida de propriedades próprias que conferem ao referido medicamento a capacidade de acelerar o processo cicatricial, especificamente em indivíduos portadores de diabetes mellitus. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a uma forma de aplicação do medicamento sobre as lesões ulceradas.

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BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra graficamente a avaliação da cicatrização das lesões dos animais testados referente aos dias de tratamento.

A Figura 2A mostra a lesão no dia 0 de tratamento com veiculo/STZ.

A Figura 2B mostra a lesão no 4° dia de tratamento com veiculo/STZ.

A Figura 2C mostra a lesão no 9° dia de tratamento com veiculo/STZ.

A Figura 2D mostra a lesão no dia 0 de tratamento com Ins/STZ.

A Figura 2E mostra a lesão no 4° dia de tratamento com Ins/STZ.

A Figura 2F mostra a lesão no 9° dia de tratamento com Ins/STZ.

A Figura 2G mostra a lesão no dia 0 de tratamento com a preparação farmacêutica da presente concretização.

A Figura 2H mostra a lesão no 4° dia de tratamento com a preparação farmacêutica da presente concretização.

A Figura 2I mostra a lesão no 9° dia de tratamento com a preparação farmacêutica da presente concretização.

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A Figura 3 mostra os fragmentos da pele com coloração para imunohistoquímica de fragmentos da pele para animais diabéticos tratados com o veículo (veículo/STZ).

A Figura 4 mostra os fragmentos da pele com coloração para imunohistoquímica de fragmentos da pele para animais diabéticos tratados com o insulina (Ins/STZ).

A Figura 5A mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IR.

A Figura 5B mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IRS-1.

A Figura 5C mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IRS-2.

A Figura 5D mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-SHC.

A Figura 5E mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-Akt.

A Figura 5F mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti- ERK-1.

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A Figura 5G mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti- ERK-2.

A Figura 6A mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IR.

A Figura 6B mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IRS-1.

A Figura 6C mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-IRS-2.

A Figura 6D mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-SHC.

A Figura 6E mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-Akt.

A Figura 6F mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-ERK-1.

A Figura 6G mostra o resultado da lâmina de imunoperoxidase realizada em fragmentos da pele de animais diabéticos utilizando anticorpo anti-ERK-2.

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DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, a qual é utilizada como um medicamento para ser aplicado em lesões ulceradas em indivíduos normais ou em indivíduos portadores de diabetes mellitus.

A referida preparação farmacêutica é provida de propriedades próprias que conferem ao referido medicamento a capacidade de acelerar o processo cicatricial, especificamente em indivíduos portadores de diabetes mellitus.

O processo de obtenção da preparação farmacêutica ora revelado na presente concretização, compreende basicamente a diluição de um agente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável, que possa contemplar um medicamento de uso tópico.

Para a presente concretização, o agente ativo utilizado foi o hormônio insulina, o qual pode ser selecionado dentre a insulina humana, bovina, suína, novos análogos de insulina, tais como a lispro e aspart, ou ainda qualquer outro tipo de insulina animal. Preferencialmente, para a presente concretização foi utilizada a insulina regular humana.

O veículo farmacêutico ora utilizado é selecionado dentre as composições químicas utilizadas para produzir bases cremosas ou loções cremosas, preferencialmente bases auto-emulsionantes.

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Para a presente concretização, a composição química selecionada para ser utilizada como veículo farmacêutico compreende a combinação de:

I- cerca de 5 a 8% de álcool cetoestearilico

2- cerca de 1 a 3% de Vaselina líquida;

3- Cerca de 3 a 6% de Cetiol 868 (estearato de octila);

4- Cerca de 0,05% de Propilparabeno;

5- Cerca de 1,5 a 3% de Natrozol (hidroxietil celulose) (gel);

6- Cerca de 3 a 6% de Propilenoglicol

7- Cerca de 0,15% de Metilparabeno;

- Cerca de 0,1% de EDTA (conservante);

9- Cerca de 0,2% de Imidazolidinilureia ; e10cerca de 4 a 6% de paramul (mistura de álcool cetoestearílico (70%) e seu derivado etoxilado (30%))

II- Água destilada qsp

O álcool cetoestearilico utilizado na presente concretização estava sob a forma de Lannete N. A água é adicionada para completar o volume final desejado. Para a presente concretização o volume desejado era de cerca de 100 grs.

Adicionalmente, a referida composição química é utilizada para produção de um creme hidrossolúvel, não-iônico,

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13/27 não oleoso, lavável e provido de propriedades umectantes, no qual podem ser incorporados vitaminas, hormônios, óleos, fitoterápicos, Hidroquinona e diversos outros princípios ativos medicamentosos.

Para uma modalidade preferida da presente concretização, a composição química utilizada como veículo farmaceuticamente aceitável compreende:

1- cerca de 7% de álcool cetoestearilico

2- cerca de 1% de Vaselina líquida;

3- Cerca de 5% de Cetiol 868 (estearato de octila);

4- Cerca de 0,05% de Propilparabeno;

5- Cerca de 1,5% de Natrozol (hidroxietil celulose) (gel);

6- Cerca de 5% de Propilenoglicol

7- Cerca de 0,15% de Metilparabeno;

- Cerca de 0,1% de EDTA (conservante);

9- Cerca de 0,2% de Imidazolidinilureia ; e

10- cerca de 5% de paramul (mistura de álcool cetoestearílico (70%) e seu derivado etoxilado (30%))

11- Água destilada qsp

Entretanto, a presente invenção não está limitada ao uso da referida composição química como veículo

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14/27 farmacêutico, podendo ainda ser utilizado como veículo, outras composições químicas providas das mesmas características que a composição química ora utilizada, capazes de constituir um medicamente de uso tópico.

O processo de obtenção da preparação farmacêutica ora revelada pela presente concretização compreende a preparação do veiculo farmacêuticamente aceitável em relação ao ingrediente ativo, a insulina, em uma proporção de 2:1.

Em uma modalidade preferida do processo da presente concretização, utilizou-se cerca de 100 gramas do veículo para cerca de 50 unidades de insulina. A mistura foi acondicionada em recipientes adequados, tais como, tubos ou bisnaga estéril.

A preparação farmacêutica da presente invenção deve ser preferencialmente preparada cerca de 2 dias antes do inicio do tratamento.

A insulina é adicionada à composição química sob constante homogeneização e sob uma temperatura que varia em cerca de 2 a 8 °C. Após a adição da composição química à insulina, a mistura deve ser armazenada sob a mesma variação de temperatura, ou seja, cerca de 2 a 8 °C. Em uma modalidade preferida da presente concretização, cerca de 100 mg da composição química foi adicionada a cerca de 50 IU de insulina.

De modo a garantir uma melhor eficiência do produto obtido pela referida mistura, os frascos de insulina a

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15/27 serem utilizados na presente concretização devem preferencialmente ser abertos na hora de uso, uma vez que a após a abertura do frasco, a insulina tem as suas propriedades físicoquímicas preservadas durante um período de cerca de 30 dias.

O produto da mistura, ou seja, a preparação farmacêutica obtida consiste em uma substância pastosa, de aspecto cremoso, coloração branca, consistente, com odor característico e com capacidade de adesão à derme. No intuito de harmonizarmos os termos ora utilizados chamaremos a referida substância pastosa obtida de Pasta de Insulina. Entretanto, outras denominações, tais como Creme de Insulina também podem ser usualmente aplicadas a referida substância.

A preparação farmacêutica ora obtida pode ser armazenada para uso posterior até cerca de 30 dias sem que haja comprometimento das suas propriedades químicas e físicas, as quais conferem a eficiência do produto.

Adicionalmente, um outro objetivo da presente concretização, consiste no uso da referida preparação farmacêutica como um medicamento de aplicação tópica sobre as lesões ulceradas de indivíduos normais ou em indivíduos portadores de diabetes mellitus.

O método de administração do referido medicamento consiste em pelo menos uma aplicação diária de cerca de 1 a 1,5 g/cm² do medicamento sobre as lesões ulceradas, seguido da oclusão da lesão com um apósito estéril. A troca do curativo deve ser preferencialmente realizada a cada 24 hs.

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Caso ocorra um aumento do exsudato, deve-se proceder uma substituição do curativo. A substituição do curativo, consiste na troca do curativo secundário, ou seja, o apósito estéril (gaze estéril) a gaze que está em contato com o leito da lesão não é retirado.

A preparação farmacêutica obtida pela combinação da insulina com uma composição química específica, capaz de constituir um medicamento de uso tópico para o tratamento de lesões ulcerativas, especificamente para o tratamento de indivíduos acometidos pelo diabetes, vem prover a técnica de mais uma opção para o tratamento das lesões ulceraticas, especificamente as causadas pelo diabetes, de modo a acelerar o processo cicatricial, com a vantagem de ser obtida por meio de um processo mais simples, sem complexidade quanto a sua realização e quanto às substâncias ora envolvidas, sendo então, menos dispendioso e conseqüentemente, promovendo a obtenção de uma preparação farmacêutica para ser utilizada como um medicamente muito menos oneroso

A eficiência da preparação farmacêutica ora utilizada como um medicamento para ser aplicado a lesões ulceradas, foi comprovada por meio de testes laboratoriais, nos quais foram investigados os efeitos da preparação farmacêutica, em lesões de ratos diabéticos e ratos não-diabéticos, acompanhando a velocidade de cicatrização.

Adicionalmente, por meio dos referidos testes laboratoriais, também foi possível investigar por meio da técnica

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17/27 da imunohistoquímica a distribuição do IR(receptor de insulina), IRS-1(substrato 1 do receptor de insulina), IRS-2(substrato 2 do receptor de insulina), SHC, Akt e MAPK, em tecido cicatricial na pele de ratos diabéticos e não diabéticos, os quais receberam o tratamento com medicamento obtido pela preparação farmacêutica ora objeto da presente concretização.

Para comprovar a eficiência da preparação farmacêutica por meio da investigação dos efeitos da preparação farmacêutica, acompanhando a velocidade de cicatrização, foram utilizados aproximadamente 40 ratos machos, da linhagem Wistar-Hannover, pesando aproximadamente 160-250g.

Os animais foram inicialmente divididos em dois grupos e mantidos em jejum alimentar prévio não hídrico, de aproximadamente 12 a 14h. Após o término do período de jejum, um primeiro grupo de ratos (Grupo A) composto por cerca de 30 animais foi submetido a injeções intravenosas (caudal) de estreptozotocina, em dose única de 60mg/kg de peso corporal e um segundo grupo de ratos (Grupo B) composto por cerca de 30 animais, o qual foi utilizado com o grupo controle, foi submetido a injeções intravenosas (caudal) de solução tampão citrato em dose única de 60mg/kg de peso corporal.

Após a inoculação de estreptozotocina ao Grupo A e solução tampão citrato ao Grupo B (grupo controle), os animais permaneceram por cerca de 2h de jejum. Após o referido período, os animais voltaram a sua dieta normal e permaneceram sob observação pelo menos durante 4 dias. Após o quarto dia de

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18/27 observação, foi realizada a glicemia capilar (caudal). Os animais com glicemia acima de 250mg/dl foram selecionados para os testes. Os animais foram divididos em grupo tratado ou diabético.

Aos animais selecionados, no 4° dia de observação, estes foram submetidos a um procedimento cirúrgico, no qual consistiu em inicialmente se anestesiar os ratos com uma dose de cerca de 0,2mL/100mg de peso corporal do animal de uma mistura de cerca de 10mg de cloridrato de Cetamina e de cerca de 0,07mg de diazepam. Esta mistura foi administrada na proporção de 10mg de cloridrato de cetamina para 0,07 mg de diazepam. Uma vez que os animais estivessem devidamente anestesiados, o procedimento cirúrgico para ocasionar as lesões seria realizado.

Uma lesão foi realizada por meio de um método para biópsia, tal como um punch de cerca de 2mm em cada animal preferencialmente na região dorsal. Cada lesão foi tratada com a “Pasta de insulina” pelo menos 2 (duas) vezes ao dia e ocluida com o auxílio de micropore ou filme transparente.

Ao término do procedimento cirúrgico os animais foram acomodados em leitos individuais, tais como gaiolas, em ambiente com temperatura controlada, com cerca de 22 °C em ciclo de 12 horas luz e 12 horas de escuro, recebendo água e ração.

Amostras do tecido lesionado foram retiradas dos animais para serem submetidas à biópsia, ou seja, para passarem pelo processo da imuno-histoquímica.

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Amostras de sangue dos animais foram coletadas e submetidas a análises para determinação da glicose plasmática. A referida determinação foi realizada por meio do método enzimático colorimétrico de glicose oxidase.

A Tabela 1 mostra os resultados expressos em mg/dl para os animais controles e dos animais diabéticos (STZ), incluindo os níveis séricos da insulina, níveis glicêmicos e o peso corporal.

TABELA 1. Características dos animais

	N° Animais	Peso (g)	N° Animais	Insulina	N° Animais	Glicemia
Estreptozotocina	15	98 + 4*	15	6 + 2*	30	498 + 9*
Controle	15	141 +4	15	29 + 4	10	98 + 2

Os resultados são expressos em média ± erro padrão da média, e a significância expressa em * P<0,005.

Os níveis plasmáticos de glicose e insulina foram dosados em amostras coletadas de animais que permaneceram em jejum entre 12 a 14h.

Os animais tratados com estreptozotocina, após 4 dias da injeção da droga, apresentaram peso corporal significativamente menor do que o daqueles do grupo controle (Estreptozotocina: 98 ±_4 g vs Controle 141 + 4 g p< 0,001), acompanhada de uma redução significativa nos níveis de insulina sérica (Estreptozocina: 6 + 2 μΠ /ml vs Controle 29 + 4 μΠ /ml, p< 0,0001), como também houve um aumento nos níveis glicêmicos dos ratos que receberam o tratamento com estreptozotocina em relação ao controle (STZ 498+ 9 mg/dl vs 98 + 2 mg/dl ).

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Os níveis de glicose plasmática foram acompanhados em pelo menos 3(três) momentos após o tratamento das lesões, a saber: 1 hora após o tratamento, 3 horas após o tratamento e 6 horas após o tratamento. Para tal, 3(três) grupos foram analisados. Grupo I, animais tratados somente com o veículo (veículo/STZ); Grupo II, animais tratados com preparação farmacêutica ora desenvolvida (insulina/STZ) e o Grupo III, animais não diabéticos (controle/insulina). A Tabela 2 mostra os resultados obtidos das análises para os níveis de glicose plasmática. Observa-se que os referidos níveis de glicose plasmática não apresentaram variação significativa, mantendo-se entre 465 e 528 mg/dl.

TABELA 2. Níveis glicêmicos

	N° Animais	Controle Insulina	N° Animais	Veículo STZ	N° Animais	Insulina STZ
Glicemia
(mg/dl)
1h	10	98,3 ± 2,1	15	465 ± 26	15	492± 26
3h	10	98,1 ± 2,9	15	502 ± 18	15	523 ± 20
6h	10	99,7 ±1,6	15	528 ± 24	15	481 ± 30

Os resultados são expressos em média ± erro padrão da média.

Pelos resultados obtidos para o procedimento de dosagem da glicemia, foi possível comprovar que não houve risco de hipoglicemia e não ocorreu melhora do controle metabólico.

O acompanhamento do processo de cicatrização das lesões foi realizado por meio da realização de medidas

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21/27 periódicas com auxílio de um instrumento específico, tal como um paquímetro, durante aproximadamente 9 dias e realização de exames citológicos, por decalque (“imprint”) da área lesionada pelo menos a cada dois dias, assim como, por meio de imagens digitais realizadas por câmeras digitais.

A Figura 1 mostra graficamente o resultado do efeito da preparação farmacêutica ora desenvolvida pela presente concretização, a pasta de insulina, no processo de cicatrização das lesões da região dorsal dos ratos. A referida Figura mostra a avaliação da cicatrização das lesões dos animais não diabéticos (1 -Controle/insulina), diabéticos (2 - Veículo/STZ) e (3 - Insulina /STZ) e que receberam o tratamento com o veículo ou com a preparação farmacêutica respectivametne. Os valores são expressos em média ± erro padrão média, e a significância expressa em *<0,05.

O resultado visual do efeito da preparação farmacêutica ora desenvolvida pela presente concretização é observado por meio do conjunto de Figuras que compõem a Figura 2. O referido conjunto mostra as imagens comparativas das lesões ulcerativas nos diferentes grupos de animais sob análise.

Observa-se uma redução significativa nos dias do processo de cicatrização das lesões que receberam a pasta enriquecida com insulina em relação aos animais diabéticos que receberam somente o veículo (Insulina/STZ 9,24 ± 0,6 vs veículo/STZ (15,5 ± 0,5 vs controle/ insulina 9.79 ± 0,4)

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Os tecidos lesionados tratados com a “Pasta de Insulina”, preparação farmacêutica ora objeto da presente concretização, foram ainda submetidos à técnica da imunohistoquímica para a investigação da distribuição do receptor de insulina, IRS-1, IRS-2, SHC, MAPK e Akt.

A preparação do tecido para a imunohistoquímica compreende:

Animais machos da espécie Wistar-Hannover submetidos a uma dieta regular e água a vontade (“ad libitum ”), foram anestesiados com fenobarbital (50 mg/Kg), por via intraperitoneal.

Após a perda dos reflexos pedioso e corneano, os animais foram submetidos à toracotomia mediana com posterior canulação trans-cardíaca da aorta torácica. Os animais foram então perfundidos com cerca de 80mL de solução fisiológica heparinizada (0,01% volume/volume), seguido da perfusão de cerca de 80 mL de paraformaldeído preferencialmente a 4%, o qual estava previamente dissolvido em água destilada pré-aquecida e solução tampão fosfato 0,2 M, pH 7,4. Ambas as perfusões foram feitas com bomba de infusão, numa velocidade fixa de cerca de 4,0 mL/min.

Uma amostra do tecido foi retirada por meio da seleção da área da lesão e retirada com auxílio de um instrumento cortante, tal como tesoura, em seguida, foi transferida para um recipiente contendo paraformaldeído a cerca de 4%. A amostra do tecido permaneceu embebida na solução de paraformaldeido por

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23/27 cerca de 12 horas. Após este período de 12 horas, inicia-se o processo de fixação, no qual a referida amostra do tecido foi processada com álcool em diferentes concentrações (70%,80%,95% e 100%), xilol, e xilol/parafina.

Em seguida ao processamento das amostras de tecido, estas foram adicionadas a blocos de parafina, os quais foram seccionados em cortes de 5 pm e fixados em lâminas de microscopia previamente sinalizadas.

As referidas lâminas permaneceram em repouso por cerca de 24 horas para completa fixação dos cortes, em seguida as referidas lâminas foram desparafinizadas com xilol, rehidratadas com as diferentes concentrações de álcool e lavadas pelo menos 3(três) vezes com solução de PBS 0,1M, pH 7,4.

Em seqüência, foi iniciada a reação de imunoperoxidase para se investigar a expressão das proteínas. Para a reação de imunoperoxidase, após a desparafinização e rehidratação os cortes foram tratados com Triton X-100 por cerca de 10 min e novamente lavados pelo menos 3(três) vezes com a solução de PBS 0,1M, pH 7,4. Em seguida, foram submetidos a um tratamento com H2O2 a 1% em solução de PBS 0,1M, pH 7,4, por cerca de 30 min, protegidos da luz, de modo a promover o bloqueio da peroxidase endógena.

A seguir, é realizado o bloqueio com leite desnatado 5%, diluídos em solução de PBS 0,1 M, pH 7,4 por cerca de uma hora. Os cortes foram incubados com o anticorpo

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24/27 primário específico para cada situação, diluídos em leite desnatado 1% e solução de PBS 0,1 M, pH 7,4, durante 12 horas (“overnight”), a preferencialmente 4°C. Em seguida o procedimento de lavagem foi repetido e um anticorpo secundário associado à peroxidase, diluídos em 1/500 em leite desnatado 1% e PBS 0,1M, pH 7,4, foi adicionado. Em seqüência, os cortes foram incubados aproximadamente 2 horas à temperatura preferencial de 25 °C.

Os cortes foram então novamente lavados e incubados com a solução reveladora contendo DAB (diaminobenzidina), H2O2 e PBS 0,1 M, pH 7,4, durante aproximadamente 3 min. A reação foi bloqueada colocando as lâminas em água deionizada e o tecido foi contra-corado com hematoxilina de Harris. Os cortes foram então desidratados nas diferentes concentrações de álcoois e xilol e as lâminas serão montadas com Entellan®, para análise através de microscopia óptica.

Os resultados das lâminas ora analisadas entre os diferentes grupos foram submetidas a uma análise estatística, a qual utilizou o teste “one way-ANOVA”, com nível de significância de 5% (p<0,05), sendo os resultados expressos como média ± erro padrão da média (X ± E.P.M.).

A Figura 3 mostra os fragmentos da pele para imunohistoquímica, contendo elementos celulares da epiderme, derme, folículo piloso e estruturas glandulares, observa-se que no

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25/27 fragmento sem insulina (grupo veículo/STZ) uma extensa área dérmica desnuda e reação inflamatória mais exuberante em relação ao grupo tratado com insulina (Ins/STZ). O grupo tratado com a insulina (Ins/STZ) é mostrado na Figura 4, na qual observa-se uma reepitelização completa e reação inflamatória discreta.

Pela matéria ora revelada na presente concretização, a insulina tópica acelera o processo de cicatrização em lesões de pele dos animais diabéticos, em comparação com lesões que receberam somente o veículo. Por esta razão a insulina promove o crescimento celular sinalizado, por meio de diferentes eventos bioquímicos que direcionam na restauração da integridade funcional da pele.

O estudo das lâminas submetidas ao processo de imunoperoxidase, o qual consiste na expressão e/ou ativação das proteínas IR, IRS-1, IRS-2, SHC, Akt e MAPK, mostra que referidas proteínas, que estavam reduzidas na ferida dos animais diabéticos, apresentaram restauração completa no tecido cicatricial dos animais diabéticos que foram tratados com o medicamento compreendendo a preparação farmacêutica ora objeto da presente concretização.

As Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F e 5G, mostram uma visão panorâmica das lâminas de analise da imunoperoxidase. Tais laminas mostram a presença de antígeno

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26/27 nas células da epiderme, folículo piloso e nos fibroblastos da derme para as lesões ulceradas dos animais do Grupo Controle.

As Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F e 6G, mostram uma visão panorâmica das lâminas de analise da imunoperoxidase. Tais laminas mostram a presença de antígeno nas células da epiderme, folículo piloso e nos fibroblastos da derme para as lesões ulceradas dos animais do tratados com a preparação farmacêutica ora desenvolvida pela presente concretização.

A ativação da capacidade cinase do receptor de insulina resulta na fosforilação em tirosina de uma família de proteínas que são substratos do receptor de insulina (IRS) e são responsáveis pela formação de um complexo de multisubunidades de sinalização.

Ainda pode-se observar um aumento na expressão das proteínas SHC e ERK 1 e 2 na pele em cicatrização dos animais que foram tratados com o medicamento compreendendo a preparação farmacêutica ora objeto da presente concretização, quando comparado com o grupo controle. Os resultados mostram que a insulina tem um papel direto na regulação do crescimento e diferenciação celulares, acelerando o processo cicatricial, por meio da restauração das proteínas IR, IRS-1, IRS-2, SHC, Akt e MAPK, da via de sinalização deste hormônio.

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O uso da insulina tópica acelera o processo de cicatrização em lesões de pele dos animais diabéticos, em comparação com as lesões dos animais do grupo controle. Logo, insulina promove crescimento celular sinalizado, por meio de 5 diferentes eventos bioquímicos que direcionam na restauração da integridade funcional da pele desses animais.

A aplicação do medicamento compreendendo a preparação farmacêutica ora objeto da presente concretização não alterou a elevada glicemia dos animais submetidos aos testes. Este 10 fato, comprova a sua ação local e direta na cicatrização das lesões.

Enquanto concretizações particulares da presente invenção tenham sido aqui descritas, a presente patente de invenção não deve ser considerada limitada a tais descrições. Deve ser aparente que mudanças e modificações podem ser 15 incorporadas e concretizadas como parte da presente invenção e ainda assim estando dentro do escopo das reivindicações a seguir:

Claims (13)

1. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica, caracterizada por compreender basicamente a diluição de um agente ativo, sendo que o agente ativo é a insulina em um veículo farmaceuticamente aceitável, o qual compreende uma composição química provida da combinação de:

- 5 a 8% de álcool cetoestearilico;

- 1 a 3% de Vaselina líquida;

- 3 a 6% de estearato de octila (Cetiol 868);

- 0,05% de Propilparabeno;

- 1,5 a 3% de hidroxietil celulose (gel) (Natrozol);

- 3 a 6% de Propilenoglicol

- 0,15% de Metilparabeno;

- 0,1% de EDTA (conservante);

- 0,2% de Imidazolidinilureia ;

- 4 a 6% de uma mistura de álcool cetoestearílico (70%) e seu derivado etoxilado (30%) (paramul); e

- Água destilada qsp;

Sendo que a preparação compreende 0,5IU de insulina por grama da preparação final.

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3. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a insulina ser selecionado dentre a insulina humana, bovina, suína, lispro, aspart, ou ainda qualquer outro tipo de insulina animal.

4. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a insulina ser preferencialmente, a insulina regular humana.

5. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição química compreender preferencialmente:

- 7% de álcool cetoestearilico

- 1% de Vaselina líquida;

- 5% de estearato de octila (Cetiol 868);

- 0,05% de Propilparabeno;

- 1,5% de hidroxietil celulose (gel) (Natrozol);

- 5% de Propilenoglicol

- 0,15% de Metilparabeno;

- 0,5% de EDTA (conservante);

- 0,2% de Imidazolidinilureia ;

- 5% de uma mistura de álcool cetoestearílico (70%) e seu derivado etoxilado (30%) (paramul); e

- Água destilada qsp.

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6. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por adicionalmente, a referida composição química ser utilizada para produção de um creme hidrossolúvel, não-iônico, não oleoso, lavável e provido de propriedades umectantes, no qual podem ser incorporados vitaminas, hormônios, óleos, fitoterápicos, Hidroquinona e diversos outros princípios ativos medicamentosos.

7. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o álcool cetoestearilico estar preferencialmente sob a forma de Lannete N.

8. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender o veículo farmaceuticamente aceitável e a insulina, na proporção de 2:1.

9. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por preferencialmente compreender cerca de 100 gramas do veículo para cerca de 50 unidades de insulina.

10. Processo de obtenção de uma preparação farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 e 9, caracterizado por a preparação farmacêutica ser preferencialmente preparada cerca de 2 dias antes do início do tratamento.

11. Preparação farmacêutica obtida conforme o processo reivindicado nas reivindicações de 1 a 10 caracterizada

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4/4 por compreender preferencialmente cerca de 100 mg da composição química adicionada a cerca de 50 IU de insulina e acelerar o processo cicatricial, especificamente em indivíduos portadores de diabetes mellitus.

12. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por consistir em uma substância pastosa, de aspecto cremoso, coloração branca, consistente, com odor característico e com capacidade de adesão à derme.

13. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por poder ser armazenada para uso posterior até cerca de 30 dias sem que haja comprometimento das suas propriedades químicas e físicas.