KR102016745B1 - Ｂｍｐ―７ 및 부형제를 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 BMP-7(Bone morphogenetic protein 7)과 특정 부형제를 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 성형수술이나 각막의 레이져 수술 등으로 생길 수 있는 흉터 형성을 방지하기 위한 점안액 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＢＭＰ―７ 및 부형제를 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 조성물{Compositions for reducing or inhibiting the formation of scar comprising BMP-7 and excipients}

본 발명은 BMP-7(Bone morphogenetic protein 7)과 특정 부형제를 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

흉터는 신체가 대체로 완전하고 신속한 창상(상처) 치유 반응을 개시하여 조직이 재구성 및 복구되는 자연적인 손상 치유 과정의 일부로서 형성된다. 그러나, 몇몇 경우에는 이러한 정상적인 치유 과정이 과도한 흉터 조직을 초래할 수 있다. 몇몇 종류의 수술 또는 손상에 따라, 과도한 흉터 조직 생성은 수술 및 치유의 결과에 영향을 미치는 주요 문제이다. 안구의 경우를 예로 들면, 수술 후 흉터 형성은 수술의 성과를 결정할 수 있다. 이는 특히 실명 질환인 녹내장의 경우에 그러한데, 이 경우 현재 몇몇 흉터 형성 방지 처방을 이용하여 녹내장 수술의 결과를 개선시키고 있으나, 이로 인한 심각한 합병증 때문에 임상적 용도에 제한이 되고 있다. 수술의 성과에 부정적인 영향을 미치는 과도한 흉터 조직 생성의 다른 예로는 유착 용해 수술, 혈관성형술, 척수 수술, 혈관 수술 및 심장 수술 등이 있다.

상처 치유(wound healing)는 다양한 단계를 포함한다. 이러한 상처 치유 과정 동안에 다양한 성장인자가 상처부위에서 분비된다. 이러한 성장인자들 중에서, TGF-β(transforming growth factor-β)는 섬유증(fibrosis)과 염증을 조절하는 핵심 매개자이다. TGF-β는 각막세포 증식 및 흉터 형성을 야기하는 근섬유아세포(myofibroblast)로의 전환분화(transdifferentiation)를 촉진한다. 각막에서 상처 치유 과정 동안에 형성된 흉터는 시력손실을 초래할 수 있다. 따라서, TGF-β의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 제제는 상처 치료제의 유망한 후보물질이 될 수 있다.

BMP-7(Bone morphogenetic protein 7)은 골 형성에 관여하는 물질로서, 발생시 치아와 안구의 형성에 중요한 역할을 하며, 성인의 경우에는 만들어지지 않는 것으로 알려져 있다(Dev Biol. 1999 Mar 1;207(1):176-88, Exp Cell Res. 1997 Jan 10;230(1):28-37). 또한, BMP-7이 섬유증의 진행을 막을 수 있으며, 흉터 형성을 감소시킬 수 있음이 보고되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 BMP-7을 포함하는 점안액(약제학적 조성물)에 적용할 수 있는 안전한 부형제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 콜라겐, 키토산 및 사이클로덱스트린이 세포독성을 나타내지 않으며, BMP-7과 함께 사용하는 경우 TGF-β-유도된 근섬유아세포의 형성을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) BMP-7(Bone morphogenetic protein 7)의 약제학적 유효량; 및 (b) 히알루론산, 키토산 및 사이클로덱스트린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 BMP-7을 포함하는 점안액(약제학적 조성물)에 적용할 수 있는 안전한 부형제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 콜라겐, 키토산 및 사이클로덱스트린이 세포독성을 나타내지 않으며, BMP-7과 함께 사용하는 경우 TGF-β-유도된 근섬유아세포의 형성을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

하기 실시예에서 증명된 바와 같이, BMP-7은 상처 형성 억제제로 알려진 헤파린과 동등한 정도의 흉터 형성 억제 활성을 나타낸다(도 4 참조). 또한, 하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 히알루론산, 키토산 및 사이클로덱스트란은 BMP-7의 흉터 형성 억제 활성을 방해하지 않으며(도 1 및 2 참조), 세포독성을 나타내지 않는다(도 3 참조).

본 명세서에서 사용된 용어, "흉터"는 손상되었던 피부가 치유된 흔적을 의미한다. 수술 또는 외상으로 인하여 진피의 깊은 층까지 손상을 입었을 때, 피부의 긴장도를 유지하는 진피층의 콜라겐이 과다하게 증식하여 상처가 치유된 후에도 얇아진 피부를 밀고 나와 흉터로 남게 된다. 이런 흉터를 일반 흉터라 한다. 일반 흉터는 창상이 치유된 결과이나, 이 과정이 비정상적으로 일어나 비대 흉터(비후성반흔, hypertrophic scar)나 켈로이드가 생길 수 있다.

본 발명의 조성물에는 상처 치유시 흉터의 형성을 감소 또는 억제할 수 있는 약제학적 유효량의 BMP-7이 포함된다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 상처는 안구에서 발생된 상처이다. 하나의 특정예에서 상기 안구에서 생긴 상처는 각막 또는 공막과 같은 안구의 표면에 생긴 상처이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 흉터 형성 억제 활성을 나타내는 범위 내에서, 인간 BMP-7 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함할 수 있다. 예를 들어, BMP-7의 흉터 형성 억제 활성 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 BMP-7의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 BMP-7 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 인간 BMP-7은 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 히알루론산, 키토산 및 사이클로덱스트린의 범위에는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 유도체 역시 포함된다. 본 명세서에서 용어, "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용 가능한, 실질적으로 비독성인 유기산 및 무기산을 이용하는 당업계에 잘 알려진 통상의 방법으로 제조된다. 상기 산은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산; 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기산을 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜 암모니움 염; 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염; 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염; 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성할 수도 있다.

상기 히알루론산의 약제학적으로 허용되는 염의 예로는, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염 등을 들 수 있다.

상기 히알루론산 유도체의 예로는 히알루론산 에스테르, 히알루론산의 아미드, 히알루론산의 탈아세틸화물 및 탈카르복실화 된 히알루론산 등을 들 수 있다.

상기 키토산 유도체의 예로는, 아세틸화, 알킬화 또는 술폰화된 키토산 등을 들 수 있으며, 이는 Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166에 상세히 기재되어 있다.

상기 사이클로덱스트린 유도체의 예로는, 히드록시프로필 사이클로덱스트린, 카르복시메틸사이클로덱스트린, 술포부틸사이클로덱스트린, 아미노사이클로덱스트린, 디메틸사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 포스페이트, 히드록시에틸사이클로덱스트린, 아세틸-사이클로덱스트린, 에틸사이클로덱스트린, 트리메틸사이클로덱스트린, 카르복시에틸사이클로덱스트린, 글루코실사이클로덱스트린, 6-O-α-말토실사이클로덱스트린, 부틸-사이클로덱스트린, 술페이트사이클로덱스트린, N,N-디에틸아미노에틸사이클로덱스트린, tert-부틸실릴사이클로덱스트린, 실릴[(6-O-tert-부틸디메틸)-2,3,-디-O-아세틸)-사이클로덱스트린, 숙시닐-(2-히드록시프로필)-사이클로덱스트린, 숙시닐-사이클로덱스트린, 술포프로필-사이클로덱스트린 및 폴리사이클로덱스트린 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 BMP-7을 약제학적 유효량으로 포함한다. 본 명세서에서 용어, "약제학적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 상처 치유시 형성되는 흉터 형성의 예방, 감소 또는 억제를 유도하는 양을 포함한다. 유효 용량 수준은 상처의 종류, 발생부위 및 중증도, 환자의 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 부형제 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 안정화제, 계면활성제, 유화제, 현탁제, 보존제, pH 조절제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 안내 투여, 유리체내 투여, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적(상처) 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0000001-1 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 점안액이다. 본 발명의 점안액은 약제학적으로 혀용되는 완충제, 보존제(보존성 보조제 포함), 삼투성-조절제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 연화제(emollients), pH-조절제, 완화제 및/또는 윤활제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 활성성분으로서 BMP-7 및 부형제로서 히알루론산, 키토산 및/또는 사이클로덱스트린을 포함하는 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ii) 본 발명의 조성물은 성형수술이나 각막의 레이져 수술 등으로 생길 수 있는 흉터 형성을 방지하기 위한 점안액 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 TGF-β-유도된 HaCaT 세포에 대한 BMP-7과 부형제의 효과를 보여준다. 세포에 TGF-β(5 ng/㎖), 및 BMP-7(200 ng/㎖), BMP-7과 히알루론산(0.3% v/w), BMP-7과 키토산(0.5% v/w) 또는 BMP-7과 사이클로덱스트린(0.5% v/w)을 각각 처리하고, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 상청액과 추출물을 제조하고, α-SMA 및 피브로넥틴 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. [A] 부형제 병용에 따른 BMP-7의 효과를 확인하기 위하여 세포내 또는 세포외 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현을 HaCaT 세포에서 관찰하였다. [B] 피브로넥틴 단백질을 ELISA로 정량화 하였다. [C] BMP-7 또는 BMP-7과 부형제 병용의 콜라겐 타입 1 mRNA의 전사에 미치는 효과를 확인하였다.
도 2는 HaCaT 세포에서의 부형제와의 병용에 따른 BMP-7의 효과를 보여주는 면역형광 테스트 결과이다. α-SMA(red), 피브로넥틴(green).
도 3은 BMP-7과 부형제의 병용이 세포 생존율에 미치는 영향을 보여준다.
도 4는 HaCaT 세포에서 BMP-7과 TGF-β 억제제의 효과를 비교한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

세포 배양

10% 소태아혈청(Cell gro) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Cell gro)이 함유된 DMEM(Dulbeco`s Modified Eagle`s Medium, Cell gro)에서 HaCaT 세포를 0.5% CO₂와 37℃의 조건에서 배양하였다.

면역블랏 분석

세포 및 상청액을 모으고 프로테아제 억제제(Sigma)를 함유하는 RIPA 버퍼(Sigma)로 용해하였다. 브래드포드 분석 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 용해물을 1.5 ㎖ eppendorf 튜브로 옮기고, 5X SDS 샘플 버퍼(Invitrogen)로 변성시킨 다음 100℃에서 5분간 끓였다. 단백질 20 ㎍을 4-12% SDS-PAGE 겔(KOMA)에 로딩하고, NC 또는 PVDF 막(Bio-Rad, Invitrogen)으로 옮겼다. 옮긴 후, 0.1% 트윈 20이 함유된 Tris-HCl 버퍼 식염수(TBST) 및 5% 탈지유를 함유하는 블락킹 용액에서 막을 1시간 동안 인큐베이션 하였다. TSBT로 3번 세척한 다음 막을 1차 항체 용액으로 옮기고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 항-마우스 α-SMA(Sigma) 및 항-인간 피브로넥틴 항체(Santa Cruz biotechnology)를 1차 항체로 사용하고, 5% 소혈청 알부민(BSA)이 함유된 TBST로 희석하였다. 막을 TBST로 5분 동안 세 번 세척하고, 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG를 2차 항체로 사용하였으며, 5% 탈지유를 함유하는 TBST로 희석하였다. 막을 TBST로 5분 동안 세 번 세척하고, ECL 시스템(Santa Cruz biotechnology)을 사용하여 면역복합체를 시각화 하였다.

ELISA

96-웰 플레이트를 100 ㎕ 항-인간 피브로넥틴(1% BSA가 함유된 PBS로 1/100로 희석, Santa Cruz biotechnology)으로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 1% BSA가 함유된 PBS 200 ㎕로 상온에서 두 시간 동안 플레이트를 블락하였다. 인간 혈장 피브로넥틴(Millipore) 및 모은 상청액을 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 플레이트를 PBST로 다섯 번 세척하였다. 1차 항체(래빗 항-피브로넥틴 항체, abcam)를 상온에서 두 시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 PBST로 다섯 번 세척하였다. 항-래빗 HRP-결합된 이차 항체(Santa Cruz biotechnology)를 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 PBST로 다섯 번 세척하였다. 효소 기질(TMB, Invitrogen)을 상온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 2M H₂SO₄ 50 ㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Biotek)를 사용하여 기록하였다.

RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction)

TRizol(Invitrogen Life Technologies)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 전체 세포 RNA를 얻었다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:

1. 콜라겐 I: TCG GCG AGA GCA TGA CCG ATG GAT(정방향, 서열목록 제1서열), GAC GCT GTA GGT GAA GCG GCT GTT(역방향, 서열목록 제2서열);

2. GAPDH: GCC AAA GGG TCA TCA TCT C(정방향, 서열목록 제3서열), GTA GAG GCA GGG ATG ATG TT(역방향, 서열목록 제4서열).

원-스텝 RT-PCR 프리믹스 키트(45℃에서 30분, 94℃에서 5분, Invitrogen)를 사용하여 First-strand cDNA를 합성하였다. 전체 500 ng RNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 94℃에서 30초간의 변성 후, 50℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 30사이클 진행하였다. 최종 연장을 72℃에서 5분 동안 수행하였다. 결과물은 3% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

공초점 현미경

0.3 × 10⁵ 세포 밀도의 세포를 12-웰 조직배양 플레이트의 폴리-L-라이신(Sigma)이 코팅된 커버슬립에서 배양하였다. 세포들을 PBS로 세척하고, 4% 포름알데히드를 사용하여 상온에서 15분 동안 고정하였다. 세포들을 PBS로 5분 동안 세 번 세척하고, 100% ice-cold 메탄올을 사용하여 -20℃에서 10분 동안 세포들을 투과성으로 만들었다(permeabilize). 플레이트를 PBS로 5분 동안 세척하고, 블락킹 버퍼(5% BSA in PBS)로 상온에서 1시간 동안 블락하였다. 1차 항체(항- 마우스 α-SMA(Sigma); 항-인간 피브로넥틴(Santa Cruz biotechnology))를 4℃에서 하룻밤 동안 세포에 처리하였다. 세포들을 PBS로 5분 동안 세 번 세척하였다. 2차 항체(염소 항-마우스 IgG-FITC, 염소 항-마우스 IgG-TR(Santa Cruz biotechnology))를 항체 희석 버퍼(1% BSA in PBS)로 희석하고, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. PBS로 세척 후, 커버슬립을 DAPI와 함께 인큐베이션 하였다. 세포들을 공초점 레이져 스캐닝 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 이미지들을 프로그램을 사용하여 캡쳐하였다.

세포 생존율 측정

최종 부피 100 ㎕/웰 배지를 갖는 96-웰 마이크로 플레이트에서 HaCaT 세포(2.5 x 10⁴, 1.25 x 10⁴, 6.2 x 10³, 3.1 x 10³ 또는 1.6 x 10³)를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배지를 무-혈청 DMEM 배지로 6시간 동안 교체하고, 각 물질(200 ng/㎖ BMP-7(서열목록 제5서열)과 0.3% v/w 히알루론산(Sigma-Aldrich), 0.5% v/w 키토산(Sigma-Aldrich) 또는 0.5% v/w 사이클로덱스트린(Sigma-Aldrich)의 조합)과 함께 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 생존율 측정 키트(its Bio) 시약을 웰 당 10 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 1분 동안 흔든 후, 샘플들의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Bioek)로 450 nm에서 측정하였다.

실험결과

부형제와의 병용에 따른 BMP-7의 효과 확인

부형제와의 병용에 따른 BMP-7의 효과를 확인하기 위하여 세포내 또는 세포외 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현을 HaCaT 세포에서 관찰하였다. 그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현은 TGF-β 유도에 의하여 상향 조절되었으나(lane 2), BMP-7의 처리에 의하여 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현이 상당히 감소하였다(lane 4). 또한, BMP-7과 부형제의 병용 처리에 의하여 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현이 감소하였다(lane 5, 6 및 7).

피브로넥틴 단백질을 ELISA로 정량화 하였다. 그 결과, 도 1의 B에 나타난 바와 같이 BMP-7과 부형제의 병용처리에 의하여 피브로넥틴의 수준이 감소하였다.

BMP-7 및 BMP-7과 부형제와의 조합의 콜라겐 타입 1 mRNA의 전사에 대한 효과를 확인하였다. RT-PCR 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이 TGF-β에 의하여 콜라겐 전사체의 수준이 상향조절 되었으나, BMP-7 또는 BMP-7과 부형제의 병용 처리에 의하여 전사체의 수준이 감소하였다. 이러한 결과는 BMP-7과 부형제의 병용이 HaCaT 세포의 섬유증(fibrosis)을 억제할 수 있음을 나타낸다.

면역형광법 실험 결과

HaCaT 세포의α-SMA 및 피브로넥틴의 발현을 면역형광법 및 공초점 현미경을 사용하여 확인하였다. 확인 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 TGF-β에 의해서 α-SMA(red) 또는 피브로넥틴(green)이 HaCaT 세포에서 발현되었으나, BMP-7 또는 BMP-7과 부형제의 병용 처리에 의하여 상기 두 단백질의 발현이 감소하였다.

BMP-7과 부형제의 병용이 세포 생존율에 미치는 영향 확인

점안액으로의 적용 가능성을 확인하기 위하여, BMP-7 및/또는 부형제의 세포독성 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, BMP-7과 부형제는 대조군과 비교하여 세포 생존율에 유의성 있는 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 히알루론산, 키토산 및 사이클로덱스트란이 세포에 독성을 나타내지 않아 부형제로서 BMP-7과 함께 안전하게 사용할 수 있음을 나타낸다.

BMP-7과 TGF-β 억제제와의 비교

세포에 TGF-β(5 ng/㎖) 단독, BMP-7(200 ng/㎖) 단독, TGF-β와 BMP-7, TGF-β와 헤파린(100 ㎍/㎖), 또는 TGF-β와 TGF-β 억제제((+) Control of p38 억제제(50 μM))를 처리하고, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 추출물을 제조하고, 피브로넥틴의 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 또한, 피브로넥틴 단백질을 ELISA로 정량화 하였다. 즉, BMP-7과 헤파린의 효과를 비교하기 위하여, 세포(HaCaT)외 피브로넥틴의 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 TGF-β에 의하여 피브로넥틴의 발현이 유도되었으나, BMP-7은 TGF-β-유도된 피브로넥틴의 발현을 헤파린만큼 효과적으로 억제하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> EYEGENE Inc. <120> Compositions for reducing or inhibiting the formation of scar comprising BMP-7 and excipients <130> PN130057 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for collagen I <400> 1 tcggcgagag catgaccgat ggat 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for collagen I <400> 2 gacgctgtag gtgaagcggc tgtt 24 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for GAPDH <400> 3 gccaaagggt catcatctc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 4 gtagaggcag ggatgatgtt 20 <210> 5 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(139) <223> BMP-7 <400> 5 Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser 35 40 45 Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu 50 55 60 Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro 65 70 75 80 Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly 85 90 95 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser 100 105 110 Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr 115 120 125 Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu 130 135

Claims (3)

1. (a) BMP-7(Bone morphogenetic protein 7)의 약제학적 유효량; 및
   (b) 히알루론산을 포함하는 안구 표면의 흉터 형성의 감소 또는 억제용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 흉터는 안구 표면의 상처 치유과정에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 점안액인 것을 특징으로 하는 조성물.

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