CN104684593B - 用于生产胶原蛋白膜的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产具有特定的机械性能的胶原蛋白膜的方法。特别地，本发明涉及一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括以下步骤：(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白；(iii)在含有无机酸的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的所述胶原蛋白变性；以及(iv)在含有无机酸的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；其中，所述机械刺激包括对所述含有胶原蛋白的组织周期地施加张力。

Description

用于生产胶原蛋白膜的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种生产具有特定的机械性能的胶原蛋白膜的方法。特别地，本发明涉及一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括用足够的无机盐和阴离子表面活性剂处理含胶原蛋白的组织以产生特定的机械性能。
背景技术
胶原蛋白和其衍生的产品广泛用于含胶原蛋白的可植入支架的生产中。胶原蛋白被公认为是具有低抗原性、可生物降解,并具有良好的机械、止血和细胞结合性能的材料(Sheuetal.,(2001),Biomaterials,22(13):1713-9；Pieperetal.,(2002),Biomaterials,23(15):3183-92；Chvapiletal.,(1973),IntRevConnectTissueRes.,6:1-61；Pachence(1996),J.Biomed.Mater.Res.；33(1):35-40；andLeeetal.,(2001),IntJPharm.；221(1-2):1-22)，这使得它可以用来暂时地或永久地代替或修复组织。胶原蛋白支架通常被用作基底，细胞在它的上面能够增殖和分化，并最终被正常组织所取代。
然而，公知的是当植入时，含有胶原蛋白的支架能够应激炎症和/或纤维症(fibrosis)。例如，参见Wisniewskietal.,(2000),J.AnalChem.；366(6-7)(p.611-621)。因而，含胶原蛋白的支架通常进行化学或物理处理(交联)以赋予机械强度和耐酶(胶原酶)降解的抗性。一些交联的策略已被用于含胶原蛋白的材料上。戊二醛是最广泛使用的交联剂(Sheuetal.,(2001)supra；Barbanietal.,(1995),JBiomater.Sci.Polym.Ed.；7(6):461-9)。然而，由于交联的副产品的存在和在酶降解过程中戊二醛连接的胶原肽的释放，戊二醛和其反应产物与体内细胞毒性相关联(Huang-Leeetal.,(1990),JBiomedMaterRes.,24(9):1185-201；vanLuynetal.,(1992),Biomaterials,13(14):1017-24)。
为了避免戊二醛交联的胶原蛋白在体内的细胞毒性，几种可供选择的化合物已被作为潜在的胶原蛋白交联剂进行研究(Khor(1997),Biomaterials,18(2):95-105；Sungetal.(1996),Biomaterials；17(14):1405-10)，如聚环氧，六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)和紫外线(UV)或γ射线照射。Koobetal.,(2001),JBiomedMaterRes.,56(1):31-48表明，去甲二氢愈创木酸(NDGA)能够显著提高合成的胶原蛋白纤维的机械性能。此外，还表明，在体内的6周期间，NDGA交联的胶原蛋白纤维没有引起异物反应也没有刺激免疫反应。
然而，尽管有所有的这些优点，使用交联的胶原蛋白以及天然胶原蛋白仍存在问题。因此，仍然需要一种具有以下性能的含有胶原蛋白的支架：
a)孔，以有利于组织整合和血管形成的方式相互连接；
b)生物降解性和/或生物吸收性，使得正常组织最终取代所述支架；
c)表面化学，促进细胞附着、增殖和分化；
d)强度和柔韧性；以及
e)低抗原性。
对含胶原蛋白的组织的替代具有特定需要的一个领域是鼓膜(TM)穿孔的修复。如果不加以处理，TM穿孔可导致听力损失、复发性耳漏、可能的中耳感染和后天胆脂瘤(Parekhetal.,(2009),TheLaryngoscope；119:1206-1213)。虽然大多数急性鼓膜穿孔自行愈合，大或慢性TM穿孔，尤其是慢性化脓性中耳炎，经常无法愈合且可能需要移植术(Lindemanetal.,(1987),ArchivesofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery；113:1285)。
目前，外科手术方法如鼓膜成形术被认为是对TM穿孔的最有效和可靠的治疗(Sheehyetal.,(1980),TheAnnalsofotology,rhinology,andlaryngology；89:331；Karelaetal.,(2008),EuropeanArchivesofOto-Rhino-Laryngology；265:1039-1042)。各种自体移植(autologous)和异体移植，如肌肉筋膜，软骨，软骨膜和脱细胞异体真皮(AlloDerm)已被使用，但是，它们都有自己的局限性(Levinetal.,(2009),Expertreviewofmedicaldevices；6:653-664)。例如，颞肌筋膜(temporalisfascia)，它被认为是“黄金标准”，在调整情况下与供区的发病率、附加切口、长的操作时间和材料的短缺有关(Levinetal.,(2009),supra)。迄今为止，一系列异种移植物和合成材料，包括明胶海绵()(Abbenhaus,(1978),Otolaryngology；86:ORL485)、纸贴(paperpatch)(Golzetal.,(2003),Otolaryngology--HeadandNeckSurgery；128:565)和透明质酸衍生物(Tehetal.,(2011),ExpertOpiniononBiologicalTherapy；1-14)已被作为合适的支架以支持TM的再生进行了研究。然而，作为用于不同类型的穿孔的最佳材料，很少有证据来支持这些中的任意一个。此外，由于包括血清素的残余的异种细胞组分，一些市售异种移植物例如猪小肠粘膜下层，含有异种的DNA材料且能够引起炎症反应。此外，合成材料是不可生物降解的，并且相比于正常的TM，它们的生物力学和材料特性是不同的，这可能会影响长期的听觉功能(Levinetal.,(2009),supra)。因此，一直在不断的研究更好的材料以获得改善的愈合和听力。
发明内容
本发明提供了一种生产含有胶原蛋白的组织的方法，与其他含有胶原蛋白的组织相比，当被植入时，该含有胶原蛋白的组织具有降低的炎症和/或纤维症。在一些实施方式中，含有胶原蛋白的组织是不交联的。
因此，第一方面，本发明提供了一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括以下步骤：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白；
(iii)在含有无机酸的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有无机酸的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐(align)；
其中，所述机械刺激包括对含有胶原蛋白的组织周期地(cyclically)施加张力。
应当理解的是，在第一溶液中可以使用任何无机盐，只要它能够与路易斯酸形成复合物。在一些实施方式中，所述无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸酯组成的组。在其他实施方式中，所述无机盐是氯化锂(LiCl)。
在第一溶液中可以使用任何数量的阴离子表面活性剂，在一些实施方式中，所述阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成的组。特别有用的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠(SDS)。
在一些实施方式中，所述第一溶液含有约1％(V/V)的SDS和约0.2％(V/V)的LiCl。
在一些实施方式中，在所述第二溶液中的所述无机酸含有约0.5％(V/V)的HCl，同时，在所述第三溶液中的所述无机酸含有约1％(V/V)的HCl。
本领域技术人员应当理解的是，在三个步骤的每个步骤中的孵育期将会根据如下内容进行变化：(i)含有胶原蛋白的组织的类型；(ii)无机盐/无机酸和/或阴离子表面活性剂的类型；(iii)使用的每种无机盐/无机酸和/或阴离子表面活性剂的强度(浓度)以及(iv)孵育的温度。在一些实施方式中，在步骤(i)中的孵育期至少为8小时。在其他实施方式中，在步骤(ii)中的孵育期少于60分钟，而在其他实施方式中，在步骤(iii)中的孵育期至少为20小时。
在一些实施方式中，在步骤(ii)中的孵育是在约4℃下进行的。在其他实施方式中，在步骤(ii)中的孵育至少进行12小时。
在一些实施方式中，所述第二溶液含有约0.5％(V/V)的HCl。
在一些实施方式中，步骤(iii)中的孵育进行约30分钟。在其他实施方式中，步骤(iii)中的孵育进行时伴随振荡。
在一些实施方式中，所述第三溶液含有约1％(V/V)的HCl溶液。
在一些实施方式中，步骤(iv)中的孵育进行约12小时至36小时，优选为约24小时。在其他实施方式中，步骤(iv)中的孵育进行时伴随振荡。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括在步骤(iii)和步骤(iv)之间的中和步骤，所述中和步骤包括用约0.5％(V/V)的NaOH孵育所述含有胶原蛋白的组织。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括步骤(v)，所述步骤(v)包括用丙酮孵育来自步骤(iv)的含有胶原蛋白的组织，然后干燥所述含有胶原蛋白的组织。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括在步骤(ii)和步骤(iii)之间和/或在步骤(iii)和步骤(iv)之间的将所述含有胶原蛋白的组织与甘油接触的步骤，以可视化和促进脂肪和/或血管的去除。
所述甘油可以与含有胶原蛋白的组织接触大量的时间，这将有利于脂肪和/或血管的去除。在一些实施方式中，所述接触的时间至少为10分钟。
在一些实施方式中，本发明的方法还进一步包括在步骤(ii)和步骤(iii)之间和/或在步骤(iii)和步骤(iv)之间的用于洗涤含有胶原蛋白的组织的步骤。在步骤(ii)和步骤(iii)之间使用的洗涤步骤的目的是去除变性蛋白。因此，任何能够去除变性蛋白的洗涤溶液都能够被使用。在一些实施方式中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间使用的洗涤溶液为丙酮。
在用丙酮洗涤之后，用无菌水进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
在一些实施方式中，在NaOH:NaCl溶液中进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。如果所述含有胶原蛋白的组织用NaOH:NaCl溶液洗涤，优选地，之后用无菌水进行洗涤。
在一些实施方式中，在步骤(iv)后，用所述第一溶液进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
本领域技术人员应当理解的是，所述含有胶原蛋白的组织可以是分离自哺乳动物的任意组织。但是，也应当理解的是，所述含有胶原蛋白的组织将含有致密结缔组织。在一些实施方式中，所述含有胶原蛋白的组织分离自羊，牛，猪或人。优选地，所述含有胶原蛋白的组织分离自人。
在一些实施方式中，所述含有胶原蛋白的组织是自体移植的。
第二方面，本发明提供了由第一方面的方法生产的胶原蛋白膜，其中，由该方法生产的所述膜含有大于80％(w/w)的具有编织结构和大于300MPa的模量(modulus)的I型胶原蛋白纤维或束。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白膜将具有大于400MPa的模量，且优选大于500MPa。
所述胶原蛋白膜也将具有小于85％，优选小于80％的最大负荷的延伸(extension)。
第三方面，本发明提供了一种制备用于植入到人或动物的体内或组织内的装置的方法，所述方法包括将胶原蛋白膜放置在所述装置上，其中，所述胶原蛋白膜是通过包括如下步骤的方法生产的：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白；
(iii)在含有无机酸的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有无机酸的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；
其中，所述机械刺激包括对含有胶原蛋白的组织周期地施加张力。
第四方面，本发明提供了一种用于植入到人或动物的体内或组织内的具有增强的生物相容性的装置，其中，所述装置包括胶原蛋白膜，该胶原蛋白膜是由包括以下步骤的方法生产的：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白；
(iii)在含有无机酸的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有无机酸的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；
其中，所述机械刺激包括对含有胶原蛋白的组织周期地施加张力。
一旦被生产，由本发明的方法生产的所述胶原蛋白膜可用于修复各种组织缺陷。
因此，第五方面，本发明提供了根据第一方面或第二方面的胶原蛋白膜或者根据第四方面的装置在哺乳动物中对组织缺陷的修复的应用。
第六方面，本发明提供了一种在哺乳动物受试者中治疗组织缺陷的方法，该方法包括将根据第一方面或第二方面的胶原蛋白膜或者根据第四方面的装置插入到所述组织缺陷中的步骤。
根据胶原蛋白膜的最终用途，本发明的方法能够用于生产不同厚度的胶原蛋白膜。例如，在非人类的动物的鼓膜修复中使用的膜可以是50μm的厚度，而在人类的鼓膜修复中使用的膜可以是100μm的厚度。因此，各种膜的厚度是可以设想到的。
第七方面，本发明提供了一种由第一方面的方法生产的至少为10μm的胶原蛋白膜。优选地，所述膜的厚度在约10μm和400μm之间。更优选地，厚度在50μm和200μm之间。在一些实施方式中，本发明的胶原蛋白膜的厚度为约100μm。
第八方面，本发明提供了一种修复鼓膜穿孔的方法，该方法包括将根据第一方面或第二方面的胶原蛋白膜或者根据第四方面的装置插入至或邻近于所述鼓膜穿孔的步骤。
在一些实施方式中，所述第一方面或第二方面的方法具有限制性条件：没有发生含有胶原蛋白的组织的交联。在一些实施方式中，第一方面或第二方面的方法具有限制性条件：在本发明的方法中没有使用戊二醛。
附图说明
图1显示的是与其他的膜相比，由本发明的方法生产的胶原蛋白膜的表面形态(TympacolTM指的是本文中的ACS)。扫描电子显微镜显示了三个膜的表面形态(板A-C；×500，D；×200)。TympacolTM(图1中指的是ACS)拥有两个不同的表面，以致密的胶原蛋白束为特征的光滑的表面(板(Panel)A)，和以疏松的胶原蛋白纤维的多孔表面为特征的粗糙的表面(板B)。纸贴(膜)表面是不平坦的，具有少量的小孔(板C)。显示大小不等的大量的孔(板D)。比例尺：500μm。
图2显示的是由本发明的方法生产的胶原蛋白膜的扫描电子显微镜(SEM)图像(X100)。
图3显示的是市售生物支架(“Bio-gideTM”，LuitpoldPharmaceuticals,Inc,Shirley,NY,USA)的扫描电子显微镜(SEM)图像(X200)。
图4显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均最大负荷的条形图。
图5显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的最大负荷的平均延伸的条形图。
图6显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均负荷率(meanloadatyield)的条形图。
图7显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均延伸率(meanextensionatyield)的条形图。
图8显示的是与其他市售的膜相比，移植由本发明的方法生产的胶原蛋白膜28天后愈合的鼓膜(TM)的显微照片。在28天，用TympacolTM治疗的TM(ACS(板B&板D))具有正常的三片层结构，由在CT层中的致密有序的胶原蛋白束组成。用纸贴治疗的TM(板E，板H)和用治疗的TM(辉瑞，皮尔斯，比利时)(板F，板I)在愈合区域变厚且在中间层具有疏松杂乱的胶原蛋白纤维。在对照组中的TM(板G，板J)仍然较厚且具有非典型结构和不规则的胶原蛋白纤维区域。在14天，与正常的TM(板K)相比，所有的TM均显著变厚。28天时，与正常的TM(板L)相比，在ACS组中的TM厚度显示无显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。箭头指示的是残余的支架。H&E和马松三色染色法(Massontrichromestaining)。比例尺：50μm。
图9显示的是移植后听力恢复的听觉脑干反应评估。听力恢复被定义为紧接穿孔后(修复前)和移植后在特定时间点(修复后)之间的听觉阈限的差别。数值表示平均值±平均标准误差(SEM)(n＝5)。使用多重线性回归分析在每组中进行移植后的听力恢复。当在不同处理之间进行比较时，观察到恢复一段时间的所有大鼠的听觉阈值和显著的差异(p<0.01)。与那些用纸贴、和自发愈合(对照)处理的大鼠的听力相比，用ACS处理的大鼠听力恢复的明显更快。组之间的统计显著性是：ACS和自发愈合(p<0.01)；ACS和纸贴(p<0.01)；ACS和(p<0.01)。
图10显示的是移植后在不同时间点鼓膜穿孔的愈合。
通过阅读附图和随后的实施方式的具体说明，本领域普通技术人员将会理解本发明的进一步的特征、优点和细节，这种说明仅仅为本发明的示例性描述。
具体实施方式
一般来讲，本发明的实施方式涉及特别适合用于可植入的医疗装置的胶原蛋白膜、覆盖物、涂层和/或支架，及其在动物或人类患者中制造和使用的方法。患者可以是人或其他动物，如灵长类动物、马、牛、羊、犬、或猫科动物。可以提供胶原蛋白膜、涂层、覆盖物和/或支架作为组织接触表面，其可封装可植入的装置的所有或部分，从而提供降低的免疫原性应答和/或植入的装置在体内的长期功能。
本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方式，而不是旨在限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。可以进一步理解的是，在本说明书中使用的术语“包括”和/或“包含”，指定所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或它们的组的存在或附加。如本文所使用的，术语“和/或”包括相关所列项目的一种或多种的任意和所有组合。如本文所用的，短语诸如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如本文所用的，短语诸如“在约X和Y之间”表示“在约X和约Y之间”。如本文所用的，短语诸如“从约X到Y”表示“从约X到约Y”。
本文所用的术语“约”是指跟随术语10％以上或以下的数值的偏差。例如，提及到约70％的乙醇，包括在63％和77％之间的范围，即，70％的值的10％以下或以上。这包括64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％和77％的乙醇。
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有本领域普通技术人员常规理解的相同的含义。将进一步理解的是，术语，诸如在常用的词典中定义的术语，应解释为具有与在说明书和相关技术的上下文中相一致的含义，除非有明确定义，不应以理想化或过于正式的观念进行解释。为了简洁和/或清楚，公知的功能或结构可能没有详细地描述。
应该理解的是，当一个元件涉及状态“在…上(on)”、“附着(attached)”至、“连接(connected)”至、与…“偶联(coupled)”、“接触(contacting)”等，另一元件，它可以直接在…上、附着至、连接至、与…偶联或接触其他元件或者中间元件也可以存在。相反，当一个元件涉及状态例如，“直接在…上”、“直接附着”至、“直接连接”至、与…“直接偶联”或“直接接触”另一元件时，不存在中间元件。本领域技术人员也将理解的是，涉及一种结构或特征与另一特征设置为“相邻的”，可以具有重叠或位于相邻特征之下的部分。
应该理解的是，尽管在本文中使用术语第一、第二等来描述各种元件、组分、区域、层和/或部分，但是这些元件、组分、区域、层和/或部分不应该限于这些术语。这些术语仅用于从一种元件、组分、区域、层或部分中区分另一种元件、组分、区域、层或部分。因此，下面讨论的第一元件、组分、区域、层或部分可以被称为第二元件、组分、区域、层或部分，而不脱离本发明的教导。除非特别指明，操作(或步骤)的顺序不限于提交的权利要求或附图中的顺序。
术语“可植入的”是指可以插入、嵌入、移植或以其他方式急性或慢性附着或放置在患者上或患者内的“含有胶原蛋白的组织”、“胶原蛋白膜”、“装置”或“支架”。术语“含有胶原蛋白的组织”是指可以从含有胶原蛋白的哺乳动物身体中分离出来的皮肤、肌肉等。术语“含有胶原蛋白的组织”还包括“合成”生产的组织，其中的胶原蛋白或含有胶原蛋白的材料已在体外组装或制造。
术语“胶原蛋白膜”在这方面应理解为主要基于胶原蛋白的膜。“膜”通常包括如本文所述的组分。
术语“慢性”是指“含有胶原蛋白的组织”、“胶原蛋白膜”、“装置”或“支架”被设定为保持移植至少2个月，典型地至少6个月，且在一些实施方式中，1年或多年以上，同时保留操作用于其预期的功能。术语“涂层”或“覆盖物”指的是在膜、装置或支架的目标表面上的材料。该涂层可以是能够抑制底层膜、装置或支架的细胞和组织结垢的多孔涂层。该涂层不能促进组织生长。该涂层可以是抵抗组织结垢和生物降解的薄的或厚的膜、泡沫或其他屏障。术语“支架”指的是在其中的细胞、组织、血管等可以生长、繁殖和扩充的多孔材料和/或结构。
胶原蛋白束由胶原蛋白纤维组成。胶原蛋白纤维由缠绕以形成右旋三股螺旋的三种多肽链组成。每种胶原蛋白多肽链被命名为α链且富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。有许多不同α链和这些α链与对应的不同类型的胶原蛋白的不同组合。在一些实施方式中，本发明的胶原蛋白膜包括I型胶原蛋白。I型胶原蛋白由两个α1链和一个α2链组成。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白纤维或纤维束是从分离自源(source)的致密结缔组织提供的。在这里使用的术语“致密结缔组织”是指主要含有在所有哺乳动物的肌腱、韧带和真皮中发现的I型胶原蛋白纤维或纤维束的基质。致密结缔组织与“疏松结缔组织”明显不同。疏松结缔组织的特征在于松散排列的纤维和丰富的细胞，并且存在于，例如，覆盖身体表面和线条内脏的上皮细胞的下方。
致密结缔组织可以是规则的或不规则的。规则致密结缔组织在肌腱和韧带中被发现，并在不同的组织之间提供紧密连接。在规则致密结缔组织中的胶原蛋白纤维以平行的方式被捆绑。不规则致密结缔组织具有不像在规则致密结缔组织中平行捆绑排列的纤维，并包括皮肤的大部分真皮层。本发明的胶原蛋白膜可以由规则致密结缔组织或不规则致密结缔组织，或两者的组合组成。
胶原蛋白“微纤维”，“原纤维”，“纤维”和“天然纤维”指的是在腱中发现的天然存在的结构。微纤维的直径是约3.5nm至50nm。原纤维的直径是约50nm至50μm。天然纤维的直径为约50μm以上。“合成纤维”指的是已形成和/或化学制造或物理制造或从它的天然存在的状态被改变的任何纤维状材料。例如，从消化腱形成的原纤维的压纺纤维(extrudedfibre)是合成纤维，但从哺乳动物新形成的腱纤维是天然纤维。当然，合成的胶原蛋白纤维能够包括非胶原成分，如羟基磷灰石或促进组织生长的药物。例如，该组合物能够含有生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤生长因子β、骨形态发生蛋白、血小板源性生长因子和胰岛素类生长因子；趋化因子如纤维连接蛋白和透明质酸；以及细胞外基质分子如聚集蛋白聚糖、二聚糖和核心蛋白多糖。当然，合成的胶原蛋白纤维能够包括非胶原组分，如微粒、羟基磷灰石和其他矿物相，或促进组织生长的药物。例如，该组合物能够含有碳纳米管、锌纳米线、纳米晶体金刚石或其它纳米级颗粒；较大的晶体和非晶体颗粒如磷酸钙、硫酸钙、磷灰石矿物质。例如，该组合物能够含有治疗剂如二膦酸盐，抗炎类固醇，生长因子如碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤生长因子β、骨形态发生蛋白、血小板源性生长因子和胰岛素类生长因子；趋化因子如纤维连接蛋白和透明质酸；以及细胞外基质分子如聚集蛋白聚糖、二聚糖和核心蛋白多糖。
本文所用的术语“源”是指含有任何哺乳动物中的致密结缔组织的任何胶原蛋白组织。在一些实施方式中，含有致密结缔组织的组织是腱。腱是在哺乳动物中连接肌肉至骨骼的组织。
在一些实施方式中，所述含有胶原蛋白的组织可以分离自任何哺乳动物，包括，但不限于羊、牛、猪或人。在其他实施方式中，所述含有胶原蛋白的组织分离自人。
在一些实施方式中，所述含有胶原蛋白的组织是“自体移植的”，即分离自需要治疗的受试者的身体。
在一些实施方式中，本发明提供了一种含有大于80％的I型胶原蛋白的胶原蛋白膜。在其他实施方式中，所述胶原蛋白膜含有至少85％的I型胶原蛋白。在其他实施方式中，所述胶原蛋白膜含有大于90％的I型胶原蛋白。
所述胶原蛋白纤维或所述胶原蛋白膜的纤维束形成编织结构。本文所用的术语“编织结构”是指一种包括纤维或纤维束的第一组和第二组的结构，其中在第一组中的纤维或纤维束主要在第一方向上延伸，且在第二组中的纤维或纤维束主要在第二方向上延伸，其中所述第一方向和第二方向是彼此不同的，而且在第一组中的纤维或纤维束插入或与在所述第二组中的纤维或纤维束相编织。在方向上的差值可以是约90°。
本文所用的术语“最大拉伸负荷强度”指的是所述胶原蛋白膜可以承受的最大拉伸负荷。在负荷V延伸曲线上，这是通过在曲线上的最大负荷来表示。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白膜具有大于20N的最大拉伸负荷强度。在一些实施方式中，本发明的所述胶原蛋白膜具有大于25N，40N，60N，80N，100N，120N或140N的最大拉伸负荷强度。
此外，可以认为所述胶原蛋白膜的实施方式的编织结构提供了在生物支架的最大负荷上的减小的延伸，同时提供了在模量上的增加。
本文所用的术语“模量”指杨氏模量且被确定为应力(stress)与应变(strain)之间的比例。这提供了胶原蛋白膜的刚度的测量。
在一些实施方式中，胶原蛋白膜具有大于100MPa的模量。在其他实施方式中，所述胶原蛋白膜具有大于200MPa，300MPa，400MPa，或者500MPa的模量。
本文所用的术语“在最大负荷上的延伸”是指参考在空载条件下的所述胶原蛋白膜的原始长度，在最大拉伸负荷强度下的所述胶原蛋白膜的延伸。这是对比哪个具有更大的最大延伸。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白膜具有小于原始长度85％的在最大负荷上的延伸。
装置的实施例能够从通过本发明的实施方式设想的所述胶原蛋白膜、胶原蛋白涂层和/或支架中获益，包括但不限于，可植入的支架，包括心脏的、动脉的、神经的(脑)、泌尿的和其它的支架，可植入的发电机(IPGs)，心脏起搏器，除颤器，心律转变器(cardioverters)，刺激剂和/或用于脑的引线系统，中枢神经系统(CNS)或外周神经系统，心脏的或其他生物的系统，心脏置换瓣膜，可植入的传感器包括葡萄糖传感器、心脏传感器、身份或跟踪传感器(例如，射频识别)，检测或测量O2、pH值、温度、离子等的传感器，骨科植入物，包括组织植入物，诸如用于下巴、面颊、下颚骨和鼻子的面部植入物，可植入的皮下或经皮进入端口，引流管如咽鼓管引流管，导管如尿导管，呼吸辅助管等。
所述胶原蛋白膜、支架或纤维的覆盖物能够被设定为大体上包装目标可植入的装置，或者可以仅覆盖其一部分。
所述胶原蛋白膜、支架或覆盖物能够为结合在一起的或以任何合适的方式在设备上的纤维或原纤维的三维阵列，该合适的方式包括经压缩或挤压通过它们的天然亲和力粘附在一起，通过使用粘性涂层或粘合剂，如凝胶状涂层，或者通过其他方式连接纤维以形成所述阵列。
在本文中所描述的方法中使用的术语“同时发生的机械刺激”指的是在所述含有胶原蛋白的组织的化学处理过程中拉伸胶原蛋白膜的过程。所述膜可以经历静态的和/或周期的拉伸。因此，在一些实施方式中，同时发生的机械刺激可以包括：
(i)预设时间内所述膜的拉伸；
(ii)预设时间内所述膜的松弛；以及
(iii)重复步骤(i)和步骤(ii)n次，其中，n是大于或等于1的整数。
如果机械刺激是通过拉伸所述膜实现的，优选地，所述膜沿其长轴被拉伸。
在一些实施方式中，同时发生的机械刺激包括对含有胶原蛋白的组织周期地施加张力，其中，所述张力的周期性包括约10秒至约20秒的拉伸期，和约10秒的松弛期，以及由此产生的应变是大约10％，并且继续进行机械刺激直到所述含有胶原蛋白的组织内的胶原蛋白束如本文所述被对齐。
本发明还涉及本发明的胶原蛋白膜或支架用于在体外或在体内生物活性化合物、药物、生长因子、蛋白质、肽、核酸、有机或无机分子等的递送的应用。本发明的含有胶原蛋白的组织或支架能够装载生物活性化合物等，然后该装载的支架可以被植入或与人或动物的身体、组织、细胞等接触。然后允许该化合物从支架释放到身体、组织、细胞内等。所述胶原蛋白膜或支架能够设置在可生物降解的或不可降解的支撑结构或基质上。
本发明中使用的所述胶原蛋白能够是合成的或源自任何合适的动物物种。所述胶原蛋白能够来自于脊椎动物或无脊椎动物(例如海星，海胆，海绵等)。在一些实施方式中，所述胶原蛋白为鱼、鲨鱼、鳐(skate)或魟(ray)胶原蛋白。在另一种实施方式中，所述胶原蛋白为人、马、牛、羊、猪、犬或猫胶原蛋白。在一种示例性的实施方式中，所述胶原蛋白为牛胶原蛋白。
本发明的含有胶原蛋白的组织或支架是在体温下在体外和体内都能保持稳定至少4周的。
在本文中使用术语“修复”或其在语法上的等同术语以覆盖在哺乳动物优选人的组织缺陷的修复。“修复”是指足以至少部分地填充组织缺陷部位的空隙或结构不连续性的新组织的形成。然而，修复并不意味着或需要完全愈合或治疗的过程，这是在恢复组织缺陷至其缺陷前的生理上/结构上/机械状态上100％有效的。
术语“组织缺陷”或“组织缺陷部位”是指上皮细胞、结缔组织或肌肉组织的破坏。组织缺陷导致组织处在非理想的水平或非理想的状态中。例如，组织缺陷可以是腱的部分厚度或全厚度的撕裂或归因于心肌梗塞的局部细胞死亡的结果。组织缺陷能够假设为“空隙”的结构，这应理解为表示三维缺陷，例如，在上皮细胞、结缔组织或肌肉组织的结构的完整性中的间隙、空腔、空穴或其它实质的破坏。在某些实施方式中，所述组织缺陷不能内源性或自发性修复。组织缺陷能够是事故、疾病和/或手术操作的结果。例如，软骨缺陷可以是关节创伤如撕裂的半月板组织替换进入关节的结果。组织缺陷也可以是退化性疾病如骨关节炎的结果。
通常地，本发明的所述胶原蛋白膜将被植入在组织缺陷的部位并通过本领域技术人员所公知的任意常规方法固定在对的位置，例如，缝合、缝合锚钉、骨固定装置和骨或可生物降解的聚合物螺丝。
在本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用将其全部内容包括所有附图和表格并入本发明，以达到它们不与本说明书的明确教导相矛盾的程度。
以下是举例说明用于实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有的百分比都以重量计，所有的溶剂混合物比例均为体积比。
实施例1用于制备胶原蛋白膜的方法
仔细地分离来自猪内部器官衬里的胶原蛋白部分，并放入含有约70％的乙醇的溶液中，并使其在室温下短暂地孵育。然后将所述含有胶原蛋白的组织在工作表面的上面拉伸至多脂肪的面朝上，并尽可能多的除去脂肪组织和血管。
为了使脂肪组织可见，在含有胶原蛋白的组织上涂布甘油约10分钟。在该点的胶原蛋白是透明的，但脂肪组织是白色的。在解剖显微镜下我们使用镊子从所述胶原蛋白分离白色的脂肪组织。
当完成时，将所述含有胶原蛋白的组织小心地转移至密封的容器中，并在含有约1％(V/V)的SDS和0.2％(V/V)的LiCl的溶液中孵育，以变性非胶原蛋白类蛋白质。所述孵育为在4℃下放置过夜。
然后在100％丙酮中将所述含有胶原蛋白的组织小心地洗涤两次，以除去变性的非胶原蛋白类蛋白质。然后在200ml容器中将所述组织在100RPM下离心以缓慢降速来自所述含有胶原蛋白的组织的残留溶液、非胶原蛋白类蛋白质和核酸。
小心地除去所述含有胶原蛋白的组织，并在膜SteripureTM水中再洗涤3次。
有时，在所述含有胶原蛋白的组织在100RPM下离心90分钟后，在含有NaOH：NaCl的溶液中洗涤所述组织。
然后将所述含有胶原蛋白的组织浸入0.5％(V/V)HCl中并放置在振荡器中振荡30分钟以变性所述胶原蛋白。我们发现，为了避免损坏由此产生的组织的机械结构，HCl的浓度和孵育时间是非常重要的。
然后除去所述含有胶原蛋白的组织，并在SteripureTM水中再洗涤3次。
然后用0.5％(V/V)的NaOH中和所述含有胶原蛋白的组织。在此阶段，可以进行对由此产生的含有胶原蛋白的组织的力学性能的初步测试。
然后使用不锈钢框架的机械力(压缩和拉伸)操作所述含有胶原蛋白的组织。一旦所述含有胶原蛋白的组织被拉伸到合适的大小、厚度等，所述组织在原位变性，即在所述框架内，在含有1％(V/V)HCl的溶液中浸渍。通常情况下，将所述组织在100RPM下振荡孵育22-25小时，直至胶原蛋白纤维束已经对齐。
然后用水洗涤所述含有胶原蛋白的组织并用1％(V/V)的SDS和0.2％(V/V)的LiCl的混合物进行漂洗。
根据最终用途，在所述含有胶原蛋白的组织上重新涂布甘油10分钟以使任何残留的脂肪组织可见。如上所述，在解剖显微镜下使用手术钳从所述胶原蛋白分离剩余的白色脂肪组织。在此阶段中，任何额外的胶原蛋白束也被除去，以控制所述含有胶原蛋白的组织的厚度。
最后，仍然在框架内被拉伸的同时，用丙酮处理所述含有胶原蛋白的组织并进行空气干燥，以使对齐的胶原蛋白束固定。然后拉伸、压缩和/或卷起所述含有胶原蛋白的组织，以形成光滑的表面。然后检查成品胶原蛋白膜组织，并使用激光切割机切割成一定的尺寸。
用扫描电镜表征与其他类型的膜相比的胶原蛋白膜的表面形态。简单地说，用5nm厚的铂对组织样品进行溅射镀膜(SEM涂层单元，E1020，日立科学系统有限公司，日本)，并在低电压(20千伏)下用扫描电子显微镜(S260，莱卡，剑桥，英国)观察两面。
图1显示的是由本发明的方法生产的胶原蛋白膜与其他的膜相比的表面形态(TympacolTM指的是本文中的ACS)。扫描电子显微镜显示了三个支架的表面形态(板A-C；×500，D；×200)。TympacolTM(图1中指的是ACS)拥有两个不同的表面，以致密的胶原蛋白束为特征的光滑的表面(板A)，和以疏松的胶原蛋白纤维的多孔表面为特征的粗糙的表面(板B)。纸贴(膜)表面是不平坦的，具有少量的小孔(板C)。显示不同尺寸的大量的孔(板D)。比例尺：500μm。
图2显示的是由上述方法生产的胶原蛋白膜的扫描电子显微镜(SEM)图像(X100)。
图3显示的是由路特普制药有限公司(雪莱，纽约、美国)(LuitpoldPharmaceuticals,Inc,Shirley)市售的可用的生物支架(“Bio-gideTM”)的扫描电子显微镜(SEM)图像(X200)。由此可以看出，在TympacolTM中的胶原蛋白束排列比Bio-gideTM均匀。
图4显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均最大负荷的条形图。
图5显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的最大负荷的平均延伸的条形图。
图6显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均负荷率的条形图。
图7显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gideTM比较的平均延伸率的条形图。
结论
我们发现，与处理含有胶原蛋白的组织的传统的碱-酸的方法相比，上述方法具有如下优点：
1)用含有1％的SDS和0.2％的LiCl的溶液进行的孵育能够变性并去除公知的与其他可植入的膜引起炎症反应的非胶原蛋白蛋白质和核酸。
2)甘氨酸涂层能够从含有胶原蛋白的组织分离脂肪组织，如果不除去脂肪组织，会引起组织的灵活性的问题。
3)使用HCl并且连同孵育时间使我们能够生产具有合适的机械性能的膜，而无需使用交联剂如戊二醛。
4)当被固定至框架时施加于胶原蛋白膜的机械力使我们能够重新排列对于特殊结构的形成必需的胶原蛋白束和纤维。
5)对在含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束的方向的宏观和微观检验显示了使组织在植入研究中更有用的胶原蛋白束结构取向。
实施例2与其它膜相比的胶原蛋白膜的表征
与市售的膜相比较，在临床试验中使用由实施例1中的方法生产的TympocolTM的40μm厚的样品。市售的产品包括：
1)纸贴，获自卷烟纸(TallyHo,澳大利亚帝国烟草(ImperialTobaccoAustralia)，澳大利亚)，大约为20μm厚，白色且不透明；
2)(可吸收的明胶海绵，法玛西亚普强公司(Pharmacia&UpjohnInc)，纽约，美国)，是一种高度吸收的、非弹性的约4mm厚且具有在30-700μm之间变化的孔径大小的海绵(Rohanizadehetal.,(2008),J.MaterialsScience；19:1173-1182)。
雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠，体重250-300克，根据机构动物伦理批准被用于临床试验。在此之前的研究中，用S5模型耳显微镜(蔡司(Zeiss)，德国)对所有动物进行检查以确保它们是没有中耳病。动物被随机分为四个支架修复组，即TympocolTM组(n＝30)，纸贴组(n＝30)， 组(n＝30)和对照组(自愈)(n＝30)。此外，10只大鼠(n＝10)的组被分配作为正常对照组(没有任何穿孔或支架)。
所有的外科手术过程在肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和美托咪定(0.5mg/kg)的全身麻醉下进行。使用3.0mm耳窥器除去来自外耳道的碎片且外耳道为用聚维酮碘溶液准备好的。经外耳道的方法(transcanalapproach)在鼓膜紧张部后半部(intheposteriorhalfoftheparstensa)使用无菌23号针进行双侧鼓膜(TM)穿孔，测得直径约为1.8mm。然后将四种不同的材料修剪成片(直径为2.4mm)，用1×磷酸盐缓冲盐水溶液(pH值为7.4)(英骏(Invitrogen)，中国上海)漂洗，并使用嵌体鼓膜修补术移植至右边的TM穿孔上。左耳作为没有移植材料放置在穿孔的TM上的内部对照。所有大鼠给予皮下注射丁丙诺啡(0.02-0.08mg/kg)用于术后镇痛。
不同治疗组的TM愈合通过耳镜检查、扫描电子显微镜(SEM)、组织学和透射电子显微镜(TEM)进行评价，而听力功能通过听性脑干反应(ABR)进行分析。在各组中，在术后第3、5、7、9、14和28天随机选择相同的五只大鼠(n＝5)用于耳镜和ABR评估。在五只大鼠的这些亚组中，三只用于组织学评价，另外两个分别用于SEM和TEM。
耳镜观察
为了研究TM愈合建立了TM穿孔的急性大鼠模型。在用于耳镜观察的每个时间点从每个组中随机选取5只大鼠，耳镜观察为在全身麻醉下使用数字视频耳镜(MedRX,Largo,FL)。两名独立的观察者就穿孔闭合、感染、鼓膜的相关性(myringosclerosis)、肉芽组织和增厚观察TM。每个TM穿孔被分级为完全闭合或未闭合。只有已完全闭合的TM被认为是愈合。使用Aurisview软件(澳大利亚耳科学研究所(EarScienceInstituteAustralia),苏比亚克(Subiaco)，澳大利亚)记录数字图像。
用SEM评价TM在通过支架修复后的愈合过程。简言之，将大鼠TM试样在4℃用2.5％戊二醛固定过夜，在乙醇溶液中脱水，随后通过临界点干燥(HCP-2，日立，东京，日本)。最后，将样品涂覆5nm厚的铂，在SEM下观察TM的内侧表面。
外科手术的所有大鼠均存活且无术后并发症。通过耳镜观察TM的外侧面以评价在每个时间点移植的效果。在任何大鼠中均没有观察到感染或反常的迹象。
在对照组中，穿孔后TM变厚且不透明，具有突出的临近穿孔边缘可见的微血管。通过14天，TM变得越来越透明且多数穿孔已经完全闭合。28天时，所有的穿孔完全愈合，尽管在穿孔部位观察到类似于乳白色环的可见的疤痕。TympocolTM的半透明度允许直接观察TM的愈合。在整个愈合过程中，TympocolTM保持了它的结构稳定性并很好的粘附至TM剩余部分。与对照组相比，TM和微血管的乳浊化是较不明显的。在早至移植后的第7天穿孔已愈合，其中，愈合的TM表现正常。与此相反，纸贴和是不透明的，从而使得在愈合期间难以检查中耳。此外，这些材料趋于容易从愈合的TM脱离。特别是，随着时间的推移，大部分萎缩且其多孔结构丢失。在28天，在纸贴组和组中的TM出现愈合，但有一些疤痕。
以下牺牲个别时间点，通过使用耳显微镜观察获得的TM的内表面证实了穿孔的闭合。在TympocolTM组中的TM愈合明显比其他组更快(图10)。60％(3/5)的TympocolTM治疗的耳完全愈合，但在对照组中没有耳痊愈(0/5)(p<0.05)。9天后，在TympocolTM组和纸贴组中的所有五只大鼠中，TM完全愈合，与对照组相比，这是显著不同的(2/5)(p<0.05)。在14天，在对照组中除了一个TM，所有的耳完全愈合(4/5)。手术后28天，所有的TM已经完全愈合。
组织学评价
以下的牺牲，两个外耳在骨软骨交界处被分离，且TM连同骨环从鼓泡被除去。获得的样品在10％的中性福尔马林缓冲液中固定24小时，接着在10％的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)(pH值为7.4)中脱钙两个星期至三个星期。脱钙的TM在一系列分级醇中脱水，包埋在固体石蜡中并横向切片为4μm的厚度。使用苏木精和伊红(H&E)染色对所有的部分进行评价。进行马森(Masson)三色染色以检查胶原蛋白纤维的形态。使用艾普瑞尔扫描系统XT自动滑动扫描仪(AperioScanScopeXTautomatedslidescanner)(艾普瑞尔科技有限公司，Vista系统，CA；40x/0.75平面复消色差镜头(PlanApoobjective))对所有染色切片进行数字化扫描。图像保存为TIFF格式用于进行组织学评价。使用艾普瑞尔显示软件(AperioImageScopeViewersoftware)测量14天和28天的愈合的TM部分的TM厚度。
对TM愈合的组织学和四种支架的效果的检查超过了28天。与其他组相比，在对照组中的TM愈合相对较慢。在第一周中，穿孔保持显露(patent)，虽然在TM的上皮和结缔组织(CT)层中观察到增生。在第5天，看到角蛋白骨刺，且在第9天穿孔开始闭合且伴随有在3个TM层中明显变厚。在28天，愈合的TM变薄而在先前的穿孔部位变厚并伴随残留。发现具有松散堆积的胶原蛋白纤维的CT层是杂乱无章的(图8)。
在TympocolTM治疗组中，在早期阶段，上皮增生和血管增殖是明显的。在CT层中类似于成纤维细胞的浸润细胞是大量的，且在移植的周围有偶尔的淋巴细胞。在28天，愈合的TM具有三片层结构表现正常(图8)。
与此相反，在纸贴周围观察到很多的炎症细胞(主要是淋巴细胞)和明显的渗出液。虽然TM穿孔最终痊愈，TM变厚且伴有新合成的纤维的混乱(图8)。同样地，诱导炎症细胞在植入部位的浸润。不像其他的材料，在CT层中发现明显的成纤维细胞增殖及红细胞填充的血管。28天后，愈合的TM仍然变厚且在CT层中伴有非典型混乱的胶原蛋白纤维(图8)。
TM横切片用于定量治疗后TM厚度的变化(图8)。在14天，与正常的TM(p<0.05)相比，除了SFS处理的TM，所有组的TM大体上都变厚，其中，SFS处理的TM具有与正常TM相似厚度的(14.13±4.04μm)(p>0.05)。在28天，在对照组、纸贴组和组中发现TM厚度上有统计学上的显著差异(p<0.05)。然而，在TympocolTM组(8.55±4.25μm)与正常TM之间没有看到TM厚度上有统计学上的显著差异(p>0.05)。
透射电子显微镜(TEM)
用TEM研究修复后28天的愈合TM的微观结构。简要地说，剥离之后，将获得的TM样品的穿孔部位在2.5％的戊二醛中固定并在4℃下储存过夜。将组织标本进行洗涤，后固定(1％锇酸)，脱水和包埋以用于透射观察。切割薄的横切片并用TEM(TECNAI10，飞利浦公司，荷兰)在80KV下进行观察。
进行TEM观察以研究手术后28天的愈合TM的超微结构。在TympocolTM治疗和自发愈合的TM中，与正常TM相比，CT层适度增厚且成纤维细胞积累是明显的。在TympocolTM组中，TM的三个层易于识别且CT层是致密的具有良好导向的胶原蛋白束。然而，在纸贴组和组中，胶原蛋白纤维在纤维层中松散、不规则地排列，具有明显的可见的水肿。
用SEM观察TM的内侧面以评价支架附着、与支架的细胞整合和穿孔闭合。在整个愈合过程中TympocolTM表现出稳定附着至穿孔边缘，从而保持它们的支架功能。TM上皮细胞横跨伤口边缘迁移并粘附至第5天的TympocolTM的内表面。第9天，TympocolTM组的TM已愈合且新膜的内表面是光滑的。与此相反，纸贴组表现出从TM表面的早期局部分离，但它的支架功能部分丢失。在纸贴组中，在穿孔部位渗出物形成和炎症细胞浸润是明显的。表明了其海绵结构的早期解体。随着收缩和吸收的进行，大多数溶解，导致其支持功能的丧失。在14天，在纸贴组和组中的愈合的TM表现出一些疤痕。在对照组中没有支架植入，在第9天未愈合的TM的轧制穿孔边缘是可见的。在14天时TM最终愈合，但有明显的疤痕。
听性脑干反应(ABR)
为了评价移植后大鼠的听力，在一个隔音房间内使用日本光电Neuropack-μ测量系统(MEB-9100，日本光电，日本)进行ABR。如前所述，在测试前将大鼠麻醉。将铂皮下针电极插入到头皮顶点(活性电极)、两个乳突(参比电极)和鼻尖上(接地电极)。通过插入式耳机呈现0.1ms持续时间的测试刺激(点击)。从90-至0分贝声压级(SPL)以10分贝递减，动物呈现刺激强度级数。在每个系列的刺激中超过10ms的分析周期平均共有512个应答。阈值定义为引起典型的波形III或波形IV形态的可重现的ABR波形的最低强度。在所有大鼠的右耳TM穿孔前和穿孔后以及在对来自每组的五只动物鼓膜成形术后的每个时间点测量点击刺激的听觉阈值。正常的耳和TM穿孔且没有材料的耳作为对照组。
听力阈值在测量穿孔前(p>0.05)以及穿孔后(p>0.05)的所有治疗组中是类似的。正常大鼠的平均听觉阈值是15.0分贝，在穿孔后显著上升到29.5分贝，表明TM穿孔引起显著的听力损失(p<0.01)。对于所有治疗后的组，使用ABR的听力评价证明听力恢复(图9)。听力恢复定义为穿孔后(修复前)立即的听觉阈值和移植后(修复后)特定时间点的听觉阈值之间的差。随着时间的推移，所有大鼠的听觉阈值恢复，且当比较不同的治疗方法时，观察到显著的差异(p<0.01)。最明显的是，与用纸贴(p<0.01)、 (p<0.01)和自发愈合(p<0.01)治疗相比，用TympocolTM治疗的动物的听力恢复得明显更快。
统计分析
通过耳镜观察确定的愈合率(Healingrates)使用卡方(χ2)检验进行比较。对于ABR和TM厚度的统计分析使用单向方差分析(ANOVA)进行评价，而随着时间的推移，每组中的听力恢复使用多元线性回归分析进行。所有分析均使用统计软件R(版本2.11.1，包元)执行。统计显著性定义为p<0.05。
结论
这项研究表明：与两种常用的支架(纸贴和)和在大鼠模型中自发愈合相比，本发明的胶原蛋白膜(TympocolTM)明显缩短了穿孔闭合时间，并促进了TM伤口愈合。在TympocolTM组中的愈合的TM显示致密的胶原蛋白纤维的再生的改进的形态，迅速返回到正常的TM厚度，以及与其他组相比的在更早阶段的完全的听力恢复。由于用于TM穿孔的手术治疗的目标是实现穿孔的完全闭合和听力的恢复，这些结果表明TympocolTM是有效的，且将成为一种理想的支架以恢复TM愈合和听力。
支架的生物相容性是要考虑的一个重要因素，因为应用生物材料后的炎性反应可以导致在手术中的失败。另外，已知胶原蛋白引起极小的炎性和抗原反应(Pachence,(1996),J.biomed.Mat.Res.；33:35-40)。在这项研究中，TympocolTM加快并改善TM愈合，部分归因于在植入部位的极小的炎症反应。
在这项研究中，我们发现，与其他组相比，TympocolTM实现明显更快的听力恢复。我们假定这些改善是由愈合的TM的胶原蛋白纤维的改善的组织和早期重塑引起的，以实现与正常的TM可媲美的厚度。
在手术过程中，发现TympocolTM很容易操作，因为它不像纸贴一样易碎，也不像一样庞大和富有弹性。此外，TympocolTM的透明度允许TM的直接观察，而纸贴和的不透明性阻碍了TM愈合的直接可见性。从临床观点来看，与纸贴和相比，这些特点使得TympocolTM更加有利。

Claims (43)

1.一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括以下步骤：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白，所述无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸酯组成的组，所述阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成的组；
(iii)在含有HCl的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的所述胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有HCl的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；其中，所述机械刺激包括对所述含有胶原蛋白的组织周期地的施加张力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乙醇溶液含有大于70％的乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无机盐为氯化锂(LiCl)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠(SDS)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一溶液含有1％(V/V)的SDS和0.2％(V/V)的LiCl。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中的所述孵育是在4℃下进行的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中的所述孵育至少进行12小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二溶液含有0.5％(V/V)的HCl。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iii)中的所述孵育进行30分钟。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iii)中的所述孵育进行时伴随振荡。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第三溶液含有1％(V/V)的HCl溶液。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iv)中的所述孵育进行12小时至36小时。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤(iv)中的所述孵育进行24小时。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iv)中的所述孵育进行时伴随振荡。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括在步骤(iii)和步骤(iv)之间的中和步骤，该中和步骤包括用0.5％(V/V)的NaOH孵育所述含有胶原蛋白的组织。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括步骤(v)，该步骤(v)包括用丙酮孵育来自步骤(iv)的所述含有胶原蛋白的组织，然后干燥所述含有胶原蛋白的组织。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间和/或在步骤(iii)和步骤(iv)之间，将所述含有胶原蛋白的组织与甘油接触，以可视化和促进脂肪和/或血管的去除。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，将所述甘油与所述含有胶原蛋白的组织接触至少10分钟。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间和/或在步骤(iii)和步骤(iv)之间，洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间使用的洗涤剂为丙酮以去除变性蛋白。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，在用丙酮洗涤之后，用无菌水进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，在含有NaOH和NaCl的溶液中进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iv)后，用无菌水洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，在用所述无菌水洗涤之后，用所述第一溶液进一步洗涤所述含有胶原蛋白的组织。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有胶原蛋白的组织含有致密结缔组织。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有胶原蛋白的组织分离自羊、牛、猪或人。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有胶原蛋白的组织分离自人。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有胶原蛋白的组织是自体移植的。
30.根据权利要求1-29中任意一项所述的方法生产的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织含有大于80％(w/w)的具有编织结构以及大于300MPa的模量的I型胶原蛋白纤维或束。
31.根据权利要求30所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织具有大于400MPa的模量。
32.根据权利要求30所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织具有大于500MPa的模量。
33.根据权利要求30所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织具有小于85％的最大负荷的延伸。
34.根据权利要求33所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织具有小于80％的最大负荷的延伸。
35.根据权利要求33所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织含有大于85％(w/w)的I型胶原蛋白。
36.根据权利要求33所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织含有大于90％(w/w)的I型胶原蛋白。
37.根据权利要求33所述的含有胶原蛋白的组织，其中，所述组织含有大于80％的具有编织结构的I型胶原蛋白纤维或束，且具有小于80％的最大负荷的延伸。
38.一种制备用于植入到动物的体内的装置的方法，所述方法包括将含有胶原蛋白的组织放置在所述装置上，其中，所述胶原蛋白支架是通过包括如下步骤的方法生产的：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白，所述无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸酯组成的组，所述阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成的组；
(iii)在含有HCl的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的所述胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有HCl的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；其中，所述机械刺激包括对所述含有胶原蛋白的组织周期地施加张力。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述动物为人。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中，所述装置用于植入到动物的组织内。
41.一种用于植入到动物的体内的具有增强的生物相容性的装置，其中，所述装置包括胶原蛋白支架，该胶原蛋白支架是由包括以下步骤的方法生产的：
(i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
(ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤(i)的所述含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白，所述无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸酯组成的组，所述阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成的组；
(iii)在含有HCl的第二溶液中孵育在步骤(ii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，直至在所述材料中的所述胶原蛋白变性；以及
(iv)在含有HCl的第三溶液中孵育在步骤(iii)中产生的所述含有胶原蛋白的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束对齐；其中，机械刺激包括对所述含有胶原蛋白的组织周期地施加张力。
42.根据权利要求41所述的装置，其中，所述动物为人。
43.根据权利要求41或42所述的装置，其中，所述装置用于植入到动物的组织内。
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