CN101355974A - 具有可调整性质的人造生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料的制备方法，其通过对压缩胶原凝胶施加多循环拉伸载荷以使胶原原纤维融合入压缩凝胶。通过本发明的方法可以得到具有改良的材料性质的生物材料。例如，通过本发明方法制得的生物材料可以作为组织等效植入物用于修复和/或替换个体内受损组织。

Description

具有可调整性质的人造生物材料
技术领域
本发明涉及用于修复和/或替换个体中受损组织的人造生物材料和组织等效植入物的制造方法，以及由该方法生产的生物材料和植入物。
背景技术
多数连接组织的机械性质(也就是功能性质)取决于纤维蛋白胶原及其三维结构。因为现代西方人中多数慢性的，与年龄有关的运动外科和外伤损伤都跟这些连接组织有关，胶原功能的损坏据说代表影响生活质量和灵活性的重要临床因素。因此，组织工程学和再生药物的主要新发展中的大部分都集中在胶原结构的重建或诱导再生(R.A.Brown，in Future Strategiesfor Tissue and Organ Replacement(Eds：J.M.Polak，L.L.Hench，P.Kemp)，WorldScientific Publishing，Singapore(2002)48；R.A.Brown et al Wound Rep.Reg.(1997)5212)。限制治疗进展的关键因素是对细胞如何调节胶原原纤维结构和特定的原纤维直径缺乏了解。
原纤维结构(就任何纤维材料而言)对胶原结构的材料性质是重要的。目前，甚至连简单的、部分功能(复制)组织的重组的所有治疗方法都使用细胞活性去改造胶原结构(M.Eastwood et al，Cel. Motil. Cytoskel.1998 40 13；D.Huang，et al Ann.Biomed.Eng.1993 21 289)。这限制了移植组织在体内修复期间和在体外生长期间的组织工程。这种缺乏了解也限制了疾病的新的治疗方法或病人体内失败的修复过程的发展。例子是关节炎、神经-肌肉损伤/退化、肌-键受损和老化、创伤后的低再生能力或组织坏死或外科切除(比如肿瘤手术)。
组织工程学的一个重要问题仍是在不使用细胞的情况下，不能控制或影响组织材料的性质以产生特定式样的胶原原纤维结构。
发明内容
本发明人发现，对压缩胶原凝胶施加多循环拉伸载荷会使胶原原纤维融合入压缩凝胶。该融合在不涉及细胞的情况下导致材料性质的改进。
本发明的一个方面是提供一种生产生物材料的方法，包含：
(i)塑性压缩胶原凝胶，
(ii)对压缩凝胶施加单轴拉伸载荷，
(iii)移除所述的载荷，和；
(iv)重复步骤(ii)和(iii)以产生所述的生物材料。
重复循环载荷增加压缩凝胶中胶原原纤维的融合，以产生具有改进的材料强度(也就是增加的断裂应力、断裂应变和/或弹性系数)的生物材料。得到的生物材料例如可以用来生产组织等效植入物。
凝胶中原纤维的融合的增加可以导致原纤维直径的增加或原纤维网状物的数量、尺寸和/或交叉吻合的紧密性的增加。
用于本发明的胶原凝胶包含胶原原纤维基质，所述胶原原纤维在隙间液体周围形成连续的网状物。制备胶原凝胶的方法在本领域中是已知的。比如，先将三螺旋胶原单体溶解在稀酸中，然后诱导其聚合(聚集)成原纤维(比如在37°中性pH下)。当原纤维聚合时，会发生相变且所述的原纤维固体网状物“支撑”剩下的大约相同体积和形状的隙间液体-也就是说它成胶化。从可溶单体到固体聚合物的相转移是凝胶的特性。这里描述的胶原凝胶不同于通过预聚合的原纤维或其他不溶胶原原纤维的聚合体形成的“海绵”，也不同于通过变性的胶原比如明胶制得的凝胶。
胶原原纤维可以是任何天然原纤维形成的胶原类型，包括胶原类型I、II、III、V、VI、VII、IX和XI以及它们(比如I、III、V或II、IX、XI等)的组合。优选地，所述胶原原纤维是胶原类型I、II或III。比如，原纤维可以是胶原类型I原纤维。
隙间液体通常是水溶液，虽然其他有机溶液可以被用于某些无生命的应用中。比如，所述液体可以是有溶质的水，所述溶质比如是溶于其中的盐和蛋白质。在一些实施例中，所述隙间液体是适于细胞生长和增殖的细胞培养介质。
在一些实施例中，胶原凝胶可以是非细胞的和不含活细胞的。在其他实施例中，凝胶可以包含活细胞，其可以，比如，使制得的生物材料具有组织功能性，且提供用于替换或促进内源性组织修复的结构。比如，凝胶可以包含一种或多种肌细胞从而提供有收缩性的结构，脉管和/或神经细胞从而提供传导元件，代谢活性的分泌细胞，比如肝细胞、激素合成细胞、脂肪细胞、胰岛细胞或肾上腺皮质细胞从而提供分泌结构，干细胞，比如成熟组织源性(比如骨髓)或胚胎干细胞、真皮成纤维细胞、皮肤角质形成细胞、(和两者的结合层)，许旺细胞(Schwann cell)或其他用于神经植入物的神经胶质细胞，用于脉管结构的平滑肌细胞和内皮细胞，用于膀胱/尿道结构的尿路和平滑肌细胞，及用于骨和腱结构的骨细胞、软骨细胞和腱细胞。在一些实施例中，种入凝胶内的细胞可以包含纤维原细胞。
细胞可以以任何排列形式间隙地分布在凝胶内。比如，细胞可以均匀地分布在整个凝胶中，或分布在凝胶内规定的带、区域或层。优选在压缩前将细胞种入凝胶中，比如先将它们和液体胶原混合，比如在每ml中至少有1×105个细胞的细胞密度下，然后根据已知的技术让胶原凝固成凝胶。优选在合适的温度、pH、离子强度和剪力的条件下种入胶原基质，以使其在凝胶形成前保持生命力。细胞在凝胶中可以被孵化24小时或更少、12小时或更少、6小时或更少、3小时或更少、或1小时或更少，优选压缩前孵化0到2小时。
如本发明所描述的塑性压缩胶原凝胶，使凝胶原纤维紧密接近并促进原纤维融合。
凝胶的塑性压缩包括使凝胶变形以减小其体积，这样，即使在移除压缩原因后，凝胶能保持或基本上保持它的新体积。胶原凝胶的塑性压缩减小胶原原纤维之间的距离，且增加相邻原纤维之间的接触点数量。塑性压缩是一个快速的细胞独立过程，其是凝胶经受物理处理，比如使隙间液体从凝胶中排出的外力或压力的结果。塑性压缩与细胞驱动收缩的慢过程不同，细胞驱动收缩是通过凝胶中细胞生长的固有动作而发生的，也就是说塑性压缩是非细胞介导的，且不是通过凝胶中培养的细胞动作而发生的。
凝胶的压缩，比如通过挤压，可以引起凝胶的一种或多种尺寸减少至少5倍，至少10倍或至少20倍。一种或多种尺寸可以被减少500倍或更少、300倍或更少、200倍或更少、150倍或更少、或100倍或更少。在优选的实施例中，通过压缩来减小凝胶的厚度。
比如，通过塑性压缩，凝胶的体积可以被减少50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多、或99.9％或更多。
发生塑性压缩的时间要比发生细胞驱动收缩所需的时间短，且可以根据使用的压缩方法和条件来改变。比如，压缩可以发生在少于12小时内、少于6小时内、少于3小时内、少于1小时内、少于30分钟内或少于10分钟内。在一些优选实施例中，凝胶可以被压缩2分钟或更少，或1分钟或更少。
凝胶的塑性压缩可以跟间隙液体从凝胶中的损失或去除有关联。比如，通过塑性压缩从凝胶中损失或去除的液体量可以是凝胶原始液体量的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％、或至少99.9％。
可以通过任何简便的方法或方法的结合来塑性压缩凝胶。用于胶原凝胶塑性压缩的合适技术和规约被记载在PCT/GB2005/002631中。在一些优选实施例中，可以对凝胶施加机械力，比如压缩力。为了达到所需的压缩作用而作用于凝胶的压缩力的量取决于特定的环境，且本领域技术人员可以容易地确定压缩力的量。比如，合适的压缩力可以是0.1到10N，比如1N。优选地，凝胶在经受压缩力时是无限制的。可以使用任何在凝胶上作用压缩力的适当方法。比如，可以通过一种或多种以下方式：对凝胶施加静态载荷(比如静重)，通过水力、凸轮或让凝胶通过滚筒的方法来施加载荷。
在一些实施例中，流体压力水化膨胀可以被用于压缩胶原凝胶。
在一些实施例中，在循环载荷前，压缩凝胶的原纤维可以是无序的，且处于随机网络排列，并在任何一维上都没有对准。循环载荷通过增加交叉吻合的数量、尺寸和紧密性来增加原纤维网络的强度，所述循环载荷可以被用来生产基本同向性的生物材料。
在其他实施例中，在循环载荷前，压缩的凝胶原纤维可以部分地或全部地对准。比如，原纤维可以在一个维度内对准或取向(比如对准或平行层、或在每个层中随机定向的原纤维平面)或，更优选地，在两个维度中对准(也就是对准或平行层，或在每个层中对准或平行的原纤维平面)。
利用任何简便的技术使胶原原纤维对准。许多合适的技术在本领域中已经公知。比如，夹住凝胶的端部，并在夹住的端部之间施加单轴应变(seefor example M. Eastwood et al，Cel.Motil. Cytoskel.(1998)40 13；Mudera etal(ibid)2000；and Marenzana et al Exp.Cell.Res.(In press))；凝胶可以受到剪切力并成角度胶化(Elstow&Bard.J.Biol.Chem.1976)；或者胶原原纤维可以在超强磁场下胶化(Kotani H，et al(2000)J.App.Phys 87 6191-3，Torbet J et al Biochem J.(1984)219：1057，Guido S et al J.Cell.Sci.105：317(1993))。
载荷循环期间施加的张力可以使原纤维充分对准。作为选择，张力可以在循环载荷(步骤ii)前作为单独步骤作用于凝胶。比如，在循环载荷前将静态单轴张力作用于凝胶，其可以使得压缩凝胶受到5-50％单轴应变，优选10-30％或20-25％单轴应变，这样可以使胶原原纤维和种子细胞(如果存在)向着主应变方向成平行取向排列。单个定位张力的载荷速度可以比循环载荷的速度快。在一些实施例中，单个定位张力的载荷速度足够高以促使凝胶塑性形变。
可以在凝胶塑性压缩之前或之后施加张力，但优选在塑性压缩之前施加。或者，可以在塑性压缩期间施加张力，比如在塑性压缩过程的起始阶段或在经过部分压缩过程后(比如20到60％压缩过程)，然后所述张力回到塑性压缩态，这样由拉伸应变引起的原纤维排列被固定在凝胶中，得到对准的紧密的复合材料。
胶原原纤维塑性压缩和任选地排列或定向之后，胶原凝胶可以受到多次循环拉伸载荷。该循环载荷引起凝胶中的胶原原纤维相对于彼此移动，并使相邻原纤维的表面电荷基序对齐，从而使原纤维融合。胶原凝胶中相邻原纤维的融合会导致形成凝胶直径增加的原纤维。载荷方向(也就是载荷矢量)可以确定凝胶中的哪些原纤维直径增加，因为与载荷轴平行的原纤维增加的直径要比与载荷轴垂直的原纤维增加的直径多。在凝胶原纤维被预先对准的实施方式中，载荷方向优选与原纤维排列方向相对应。
每个循环张力包含载荷阶段和空载阶段，在载荷阶段中单轴拉伸载荷被施加于压缩凝胶，在空载阶段中拉伸载荷被移除。
每个载荷循环的载荷阶段可以包含变速载荷期，和任意的应力松弛期。在变速载荷期，施加于凝胶的载荷逐渐地增加到预先确定的值。在应力松弛期，施加于凝胶的载荷则可以维持在预先确定的值。
施加于凝胶的载荷优选以一定速度增加，这样使得引起的形变是粘弹性的且临时性的(也就是非塑性形变)。比如，该载荷可以在1分钟或更长、5分钟或更长、10分钟或更长、15分钟或更长、或30分钟或更长的时期内增加或增速。合适的载荷速度包括10％应变/分钟或更少、5％应变/分钟或更少、4％应变/分钟或更少、3％应变/分钟或更少、2％应变/分钟或更少、1％应变/分钟或更少。
上述的对凝胶施加拉伸载荷的方法是本领域公知的(see for example，M.Eastwood et al，Cell.Motil.Cytoskel.(1998)40 13)。在一些优选实施例中，可以夹住胶原凝胶的端部，并在夹住的端部之间施加单轴载荷。
其他合适的方法包括磁拉力、渗透作用、压缩、流体水化膨胀和流体剪切。当对颗粒、泡囊、小球或粉末形式的胶原凝胶施加拉伸载荷时，流体剪切特别的有用。
流体流动也对压缩胶原凝胶施加载荷时有用，比如包含压缩胶原凝胶的管状结构，所述管状结构环绕膨胀核成螺旋形或卷形。膨胀核可以包含一种在水合时膨胀或溶胀的组分，例如凝胶形成剂，具有大量膨胀压力的带电物质，如透明质酸、淀粉、葡聚糖、壳聚糖和糖胺多糖，所述糖胺多糖如软骨素硫酸盐、角蛋白硫酸盐和肝素。水合所述的核(比如通过润湿)使其膨胀，从而对周围胶原施加拉伸载荷。当溶胀核材料分解或扩散开后，移除或驱散载荷，留下一个被压缩胶原层环绕的中心通道。循环载荷可以被施加在上面描述的结构上以促进纵向原纤维融合或者，做为选择，通过施加搏动流体流过中心通道的方法促进周围原纤维融合。
循环载荷的合适拉伸载荷可以使凝胶受到至少5％、10％、15％或20％应力，及达到30％、40％或50％应力。通常地，合适的拉伸载荷可以使凝胶受到20％应力。在一些实施例中，可以使用低于凝胶断裂应变的5％的拉伸载荷。
在一些实施例中，当拉伸载荷达到预先确定值后，在载荷循环的空载阶段中可以逐渐减少或移除拉伸载荷。在其他实施例中，载荷循环的载荷阶段可以进一步包含应力松弛期，在该松弛期预先确定值的载荷被连续地作用于凝胶，其持续的时期为10秒或更多、30秒或更多、1分钟或更多、5分钟或更多、10分钟或更多、15分钟或更多、或30分钟或更多。
载荷阶段之后，可以将拉伸载荷从载荷循环的空载阶段中的凝胶移除。载荷循环的空载阶段可以包含变速空载期，在变速空载期，逐渐地移除作用于凝胶的拉伸载荷。
拉伸载荷优选以一定速度减少，所述速度足以使凝胶回到它的初始形状，并且该速度在载荷期间可以根据材料密度和刚性来改变。比如，载荷可以在1分钟或更多、5分钟或更长、10分钟或更长、或15分钟或更长的时期内减少或减速。合适的空载速度包含10％应力/分钟或更少、5％应力/分钟或更少、4％应力/分钟或更少、3％应力/分钟或更少、2％应力/分钟或更少、1％应力/分钟或更少。
可选地，在移除或减少拉伸载荷后，空载阶段也可以包含松弛期，在松弛期所述凝胶被维持在空载或处在减少的载荷下。例如，凝胶可以被维持在松弛状态(比如空载或基本上空载)下10秒或更长、30秒或更长、1分钟或更长、5分钟或更长、10分钟或更长、15分钟或更长、或30分钟或更长。
在移除或减少压缩凝胶的拉伸载荷和可选的松弛期后，可以在下一个载荷循环的载荷阶段逐步地增加载荷。
在一些优选的实施例中，合适的载荷循环可以包括5分钟内变速载荷达到预先确定的值，如20％，例如在4％/分钟的稳定速度下，20％应力的应力松弛维持5分钟，然后是5分钟内变速空载，例如在4％/分钟的稳定速度下达到空载状态，在下一个循环载荷前维持所述空载状态5分钟。
载荷循环(也就是步骤(ii)和(iii))可以重复2次或更多次、10次或更多次、50次或更多次、100次或更多次、或200次或更多次。
所述载荷和空载阶段可以以一定的速度重复，所述速度可以是每小时0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些优选实施例中，载荷循环可以以每小时少于10次循环的速度重复。
可以认为，本领域技术人员可以根据任何给定的时间的胶原凝胶的刚性和所需精密生物材料的性质来改变载荷循环的数量、循环的速度和每个循环的参数(比如，载荷的数量、载荷的速度、和载荷、空载阶段的长度)。
在一些实施例中，例如，载荷和空载的参数可以在整个载荷循环中保持恒定。在其他实施例中，在载荷循环期间可以简便地改变载荷和空载的参数。
例如，在载荷循环期间改变循环率，如增加或减少循环率；特别是当压缩凝胶的刚性增加时增加速度。同样地，作用于凝胶的应力可以逐渐地增加。例如，在一些实施例中，初始载荷循环可以在低速度高应力下进行(比如，20-30％，3-30次循环/小时)，随后是持续更长时间的高速度低应力的循环(比如，5％应力，50-100次循环/小时)。
压缩凝胶也可以经受平缓的循环、慢压缩或流体剪切以改进或修饰表面性质。
在细胞实施例中，优选地，在这里描述的整个方法中将压缩凝胶维持在生理环境下(如温度、pH、水合和离子强度)以保持细胞存活。为了减少与干燥有关的细胞死亡和/或损害，凝胶可以在水溶液中被压缩和经受循环载荷，比如在培养基中，如DMEM，Ham’s或Eagle’s培养基或生理缓冲液，所述生理缓冲液比如是适当温度下的Ringer’s或PBS，所述温度比如是5℃到37℃。
在非生命的或非细胞的实施例中，压缩凝胶不需要保存在生理环境下，且可以使用任何塑性压缩和循环载荷的方法及任何与框架基质相容的溶剂，包括那些改变凝胶流体的离子性质的溶剂，所述方法如渗透方法。
通过改变胶原凝胶中单个成分的比率(比如是％V/V)、压缩参数以及载荷循环的数量和参数来调整本发明方法制得的生物材料的性质，以用于特定的用途或应用。例如，通过改变胶原比例来改变生物材料的强度，通过改变循环载荷来改变胶原原纤维的直径，通过改变细胞比例来改变生物材料的细胞活性，和/或通过改变微通道的存在与否或数量来改变生物材料的灌注性质。
经过此处描述的循环载荷改进了原纤维直径和机械性质的压缩胶原可以用作生物材料，比如适合用于制造组织等效植入物的仿生材料和人造生物材料。
通过本方法得到的生物材料可以是任何便利形式，例如，可以是片、环、螺旋管、毛细管、条带、块、管、颗粒、或卷形物。
在一些实施例中，本方法制得的生物材料可以在无需额外加工的情况下用作组织等效植入物，所述组织等效植入物用于修复或替换受损组织。
在其他实施例中，可以进行生物材料的额外加工来生产用于修复或替换受损组织的组织等效植入物。例如，可以铸模和/或塑造生物材料以生产组织等效植入物。生物材料可以被模制成预先确定的形状和/或可以经受进一步的塑性压缩。塑性压缩可以是对称的或不对成的。
生物材料可以铸模和/或塑造成任何便利的植入物形式，例如，小片、块、管、带、条带、环、螺旋管、毛细管、卷形物、片或线。组织等效植入物的最终形状取决于其将被使用的特定环境。在一些实施例中，组织等效植入物可以具有适于进一步成形的易弯形式。
本方法制得的生物材料片或条带可以卷起来或折叠以形成多层结构，比如卷形物。
所述的卷形或折叠形的多层结构可以被直接用作组织等效植入物，或根据需要被进一步的切割、成形或模铸。在一些实施例中，可以进一步塑性压缩所述结构以使所述层粘在一起，以达到所需的尺寸规格、增加细胞密度或改进其他性质。对此，PCT/GB2005/002631中有更详细的记载。所述塑性压缩允许3-维的组织等效植入物快速安装，比如可以是外科医生从生物材料的一个或多个平坦2-维层开始进行简便地操作。本发明允许快速给予该组织等效物可调基质结构和机械性质(纳米/微米级)，且基本上不损害其含有的细胞。
组织等效植入物是一种植入人体以修复或替换内源性组织的材料，所述内源性组织比如是受损的或有病的。被组织等效植入物修复或替换的有病组织的例子包括神经、腱、软管、皮肤、骨、泌尿生殖器官、肝、心肺组织、肾、眼组织、血管、肠和腺。
有病或受损的组织比如可以由关节炎、神经肌肉受损/退化、肌肉-腱受损和老化、创伤后的低再生能力、组织坏死或外科切除(如肿瘤手术)所产生。
如上描述的产生之后，组织等效植入物被迅速植入到个体、或储存或经受进一步的处理以调节胶原的精细性质，比如刚性、弹性系数等。
为了减少和/或预防细胞死亡或损坏，包含活细胞的植入物或生物材料在使用前被储存在可以维持生命力但不支持细胞生长的环境中。例如，植入物或生物材料被储存在低温，如0℃到5℃之间，优选4℃。在一些实施例中，塑性压缩和循环载荷后生物材料不经过干燥或脱水，比如加热、冻干、气流或真空干燥，因为脱水会杀死细胞和破坏生物材料的结构。
本发明的另外一个方面是提供一种由本发明所述方法制得的生物材料。
优选，所述生物材料具有相对于通过其他方法制得的胶原凝胶或胶原基生物材料更改良的性质。例如，生物材料的原纤维直径增加，材料强度增加，孔径减小，原纤维交叉点的数量增加和原纤维交叉点的稳定性增加。
本发明的另外一个方面是提供一种组织等效植入物，所述植入物包含本发明所述方法制得的生物材料，或由本发明所述方法制得的生物材料组成。
本发明的另外一个方面是提供一种治疗个体内受损组织的方法，其包含：
在所述的受损组织处安装一个这里描述的组织等效植入物，以修复和/或替换所述组织。
可以通过任何便利的技术来安装植入物。例如，可以缝合或粘合在适当的位置。
由这里描述的生物材料制成的植入物将采用缝合术，且甚至在肌肉载荷的情况下也能通过外科手术缝合到身体部位。
本发明的相关方面提供了一种用于治疗个体内受损组织的方法的组织等效植入物，以及该组织等效植入物在制备治疗受损组织的药物中的应用。
个体内受损组织比如可以由关节炎、神经肌肉损伤或退化、，肌肉-腱受损和老化、创伤后的低再生能力、组织坏死或手术切除(如肿瘤手术)所产生。
本方法可以在不依赖细胞的情况下控制和操纵基于胶原的生物材料的组织、结构和原纤维几何形状。本方法制得的生物材料可以用作天然组织的定义模型(比如用于研究、教学、临床诊断、毒性试验)，或作为标准物质或人体模型，例如在光学/光谱显微镜、X射线和核磁共振成像监测系统的标定中。
本方法可以控制和操纵孔径，从而也可以控制和操纵生物材料的超滤性质。因此由本发明方法制得的生物材料可以例如用作具有可调性质的过滤器或用在控制药物释放的系统中。
本领域的技术人员在阅读本发明公开的内容后可以容易地得到本发明的各种其他方面和实施方式。说明书中提到的所有资料都以引用方式全部合并于此。
本发明包含这里描述的特征的每个结合和亚结合形式。
本发明的特定方面和实施形式将通过举例和参考以下记载的附图和表格的方式来说明。
附图说明
图1显示频率图，表示增加循环次数对经过处理的材料中胶原原纤维直径分布形式的影响。通过该处理范围其平均粒径增加了将近2倍，且存在于初始凝胶中的最小原纤维种类(15至40nm直径)已经完全消失。
图2显示一盒子和原纤维直径分布的晶须图。盒子表示四分位数间距(25th到75th百分点)，中间的线表示平均值。误差条表示尺寸的总范围。
图3显示平均原纤维直径随着载荷循环数量的增加而增加的线条图，表明是逐步地增加且SD在平均值周围。
图4显示循环载荷之后胶原凝胶的平均断裂强度增加。*＝P＜0.001
图5显示循环载荷后胶原凝胶的应力/应变关系，表明载荷样品的断裂应力和刚性大幅提高(增加梯度)。
图6显示经过144次循环载荷的胶原凝胶的平均断裂强度，空载对照的胶原凝胶平均断裂强度和在静态张力下孵化跟144次循环所需时间一样长的时间的胶原凝胶的平均断裂强度。如同144次循环序列，孵化所述的“仅孵化”对照48小时，但是没有循环载荷，以测试自发的与时间有关的稳定性(如果有的话)，所述稳定性可能以自发的交联的形式发生于胶原中。该对照中没有观察到强度的增加，因此也没有交联的增加，显示需要循环载荷。
图7显示机械介导胶原原纤维吻合的可能机制。首先，通过压缩[i]使稀疏的原纤维(由自发单体聚集成凝胶而形成)紧密接触。该步骤提供了许多原纤维侧面接触的点，但是相邻原纤维[ii]在对齐的“表面电荷”(这里指如EM水平中的原纤维带型)中接触点很少。但是，循环单轴拉伸应变的施加使对齐的相邻原纤维数量增加[iii]。彼此接触且对齐的原纤维形成稳定的吻合，导致接合[iv]和较厚原纤维数量[v]逐步聚集。重要的是，原纤维直径以离散原纤维直径倍数的方式增加。超微结构分析显示原纤维融合的所有阶段都能在1)哑铃形2)三叶草形3)丧失(随着多次循环逐渐地减少)小原纤维(20-30nm)的较大圆形截面这三类横截面中找到。在纵剖面中发现单独原纤维2、3、或4通过单带方式并入到大原纤维中的例子。
图8显示粘附在用于循环载荷的2个聚乙烯筛孔浮选杆所附的胶原凝胶。
表1说明循环载荷对压缩胶原凝胶的机械性质的影响。144次循环后，断裂应力增加了4.5倍。
表2表示凝胶中的胶原原纤维的取向分布。原纤维分成以下几类：(i)横截面(也就是与施加的主应变平行)，(ii)斜截面(也就是成一个角度)和(iii)纵截面(也就是垂直于应变)。
具体实施方式
非细胞胶原凝胶的形成
通过I型胶原的pH滴定法来制备非细胞胶原凝胶。为了制备胶原凝胶，将0.3ml的10X Eagles MEM溶液(Gibco，Paisley，UK)和0.3ml的Dulbeccos改良的eagles培养基(Gibco)加入到2.4ml的鼠尾I型胶原中(在醋酸中，蛋白浓度＝2.14mg/ml，First Link，Birmingham，UK)。用5M NaOH中和该溶液直到观察到颜色改变为止(由黄色变为卷云粉红)(Prajapati等人.2000 Wound Rep.Regen.8 227-238；Prajapati et al.2000 Wound Rep.Regen.8 239-247)。在室温下将胶原凝胶插入井(22mm×33mm×10mm)中30分钟。
塑性压缩
插入之后，用修改后的标准塑性压缩方法将胶原凝胶压缩93％，所述修改是由Brown等人在(2005)Adv.Funct.Mater.15，1762-70中所作的。将胶原凝胶放在2张尼龙筛(35mm×70mm)之间，其下层放在不锈钢筛上，再将不锈钢筛放在单层Whatman I级滤纸上。然后将125g的砝码放在凝胶顶部5分钟。随后将压缩凝胶切成三个7mm×33mm的纵向条带。
机械装载：循环载荷的施加
使用氰基丙烯酸盐粘合剂胶将胶原凝胶的三个部分粘到2个聚乙烯筛孔浮选杆上，然后又将聚乙烯筛孔浮选杆粘到不锈钢金属丝A形架上(图8)。然后将胶原凝胶浸在Earls平衡盐溶液中(EBSS)(Gibco)，再放入到含有5％CO2的润湿孵化器中。一个A形杆被粘到固定点上，另外一个被粘到力传感器上，所述的力传感器能够监测力和载荷(Eastwood et al.1996J.Cell Physiol.166：33-42；Brown et al.(1996)J.Cell Physiol.169：439-447)。计算机控制的微步电动机可以使外源的载荷作用在非细胞胶原凝胶上。
建立培养物(t-CFM)
压缩胶原凝胶在两个浮选杆之间被铸型，然后再被粘到不锈钢金属丝A型架上(图8)。这些A型架允许胶原凝胶和t-CFM系统之间有一个连接器。一个A型架被固定，另一个被粘到力传感器上，所述力传感器监测力和载荷(Eastwood et al.1998 Cell Motility Cytoskel.49：13-21)。通过‘Labview’程序放大、数字化和处理模拟输出信号(National Instruments，Berkshire，UK)。计算机控制的微步电动机能将外源载荷作用于培养物，所述微步电动机作用于平行于胶原凝胶栓系轴的平面。
循环载荷方式
可以使用各种循环载荷方式，每个循环持续20分钟(也就是3/3600Hz)。每个循环由4个相等的阶段组成(每个持续5分钟)。阶段1是20％应力的线性应用(33mm结构的总位移是6.6mm)；阶段2是维持20％应力；阶段3是释放应力；阶段4是维持0％应力。每个循环期间，对胶原凝胶使用同样的应力。控制方式是使用一次循环。其他的方式是：4小时(12次循环)、8小时(24次循环)、16小时(48次循环)、24小时(72次循环)和48小时(144次循环)。处理后直接分析胶原凝胶的原纤维直径(电子显微镜)或准静态拉伸机械性能。
透射电子显微镜法
使用常规TEM测量循环载荷胶原凝胶中改变的胶原凝胶直径。在0.1M的磷酸缓冲盐液(PBS)中冲洗3D胶原凝胶，并在4℃下使其在含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液中固定1小时，然后用PBS冲洗两次，并用含1％四氧化饿的0.1M二甲砷酸盐缓冲液第二次固定，在室温下固定1小时。然后通过增加丙酮级数使样品脱水，用丙酮∶环氧树脂CY212树脂(1∶1)渗透过夜，当新鲜树脂完全替换时通过两个变化来结束渗透，每个变化至少持续3小时，并在60℃下聚合18小时。使用金刚砖刀从平衡块上切下超薄切片(80-100mm)，用2％的乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色(10分钟)，并在Phillips CM12电子显微镜下观察(Agar Scientific Ltd.，Essex，UK)。
图像分析
用于TEM程序的样品取自固定凝胶的“对准”区，并沿着凝胶的横断面切开。每个截面拍摄10张随机照片，并用OpenlabTM version 3.1.5图像分析软件(
Figure A20068005064000181
，Coventry，UK)测量所有被横切的胶原凝胶的直径。只有当圆形横截面的Y和X方向相等时，也就是胶原原纤维是正圆且没有从某个角度被切掉，也没有两个或多个原纤维重叠，该测量方法才有效。
统计学
所有的实验结果都用Graphpad PrismTM第4版软件(Graphpad PrismSoftware，San Diego，USA)进行分析。用Dunnetts多重比较后-测试法(multiple comparisons post-test)对所有组进行单向方差分析。
机械强度测试
设计拔出试验(Pull-out experiment)来测试循环载荷胶原凝胶的断裂强度。首先，凝胶被循环地载荷或留作对照，然后使用t-CFM将稳定的单个变速载荷作用于凝胶直到它断裂。然后从应力/应变曲线算出平均的断裂力和其它参数。
结论
本发明所述方法的塑性压缩(PC)步骤可以有效地促进胶原原纤维紧密接近，并互相接触，从而促使原纤维吻合。图7显示了引起(滑动)融合的载荷的假定机制。
在1到144次载荷循环之后，通过PC材料横剖面(也就是垂直于载荷轴)的电子透射显微照片来测量平均胶原原纤维直径。由显微照片(图1)中原纤维聚集和横截面直径增加判断，发现增加压缩胶原薄片的循环载荷导致逐渐增加纤维间的接触和侧面融合。可以看到原纤维-原纤维交互作用的形式范围随着循环数量的增加而变的更加普通。所述增加包括了原纤维对称横截面直径的简单增加、圆形横截面的增加、“哑铃”和“三叶草”形状的增加、所述“哑铃”和“三叶草”形状在横截面中有2个或3个部分成阶层的原纤维。在该过程的最早阶段可以发现许多紧密相邻的原纤维通过细桥连接，所述细桥是电子密集的线材料。
直接测量确定胶原原纤维直径随着载荷循环数量的增加而清楚的增加。通过随机TEM区域(每个样品10个区域)的图像分析来测量每次处理的3个重复胶原样品的原纤维中值粒径。原纤维的中值粒径在1次循环时是29±4.6nm，在144次循环后(P＜0.001)大幅增加(＞2倍)到70±10nm(图2和图3)。除12-循环方式之外，所有测试组的原纤维中值直径都比对照组显著增加。原纤维直径的总范围也随着循环的增加而清楚的增加。所述增加通过减少中值频率来表现。然而，当循环增加时，25th和75th百分数范围之间没有区别。
此外，通过一系列清楚的步骤来进行的原纤维直径的增加可以被视为通过六个处理组的3个步骤。在1次和1 2次循环(组1)、24次和48次循环(组2)及96次和144次循环(组3)之间没有明显的区别。但是，跟组1相比，组2和组3都逐渐地明显增加(图2)。在随后的载荷循环中，15-40nm直径的原纤维完全消失。
原纤维直径的增加主要是由对称的、圆形横截面的原纤维所引起，而不是由增加多叶片结构(这里不将其计为单个原纤维)的数目所引起。这表明改造原纤维横截面形状在相当大的程度上可以作为吻合过程的一部分。该结果与相邻原纤维之间的连接“股”的出现是一致的，再一次表明表面改造和胶原迁移(图7)。
根据断裂应力监测循环载荷结构的机械性质、断裂应变和弹性系数(图4到图6)。图4显示机械强度的增加，当增加载荷循环的数量时可以观察到机械强度增加。144次循环的胶原载荷的断裂应力是1次循环的4.5倍(P＜0.001)。虽然48次载荷循环可以增加平均断裂应力，但是其没有达到统计显著性。类似地，48次循环系数提高了23％，144次循环系数提高了56％，同时，断裂应变提高到133±35％，增加了2倍。
将一系列样品放在静态的20％载荷下孵化48小时(和144次循环的时期相同，但是没有循环)。该处理没有增加材料的断裂应力(图6)，事实上其跟1次循环的对照样品是相同的。因此，机械强度的增加不单独地与孵化时间关联，但是跟载荷循环的数量紧密相关，结果是胶原原纤维的直径增加。
对原纤维材料性质的一般理解显示增加原纤维直径将增加整个材料的强度。通过在载荷的结尾进行准静态拉伸实验和断裂强度、断裂应变和弹性系数的参数来监测循环载荷结构的机械性质。图5显示在循环载荷后，凝胶的代表性应变-应力行为。表1概括了获得的数据。
以上实验结果显示胶原凝胶的循环载荷导致胶原原纤维的融合，这通过原纤维直径的增加及拉伸性质的相应增加来表现。直径的分阶段增加跟离散的小直径原纤维的逐渐增加是一致的。因为使用了无细胞系统，控制原纤维直径(从而控制得到的组织材料性质)被证明是主要的生物化学过程。其说明组织在体内的性质是由局部的细胞产生的应变及外部载荷的结合控制的。
  循环次数   断裂应力(MPa)   系数(MPa)   应变(比)
  1   0.17±0.03   0.24±0.06   0.71±0.24
  48   0.26±0.07   0.31±0.07   0.90±0.24
  144   0.76±0.50   0.54±0.27   1.33±0.35
表1
一次循环(对照)  12次循环  48次循环  72次循环  144次循环
纵截面 20  20  15  17  17
横截面 28  28  34  33  39
斜截面 52  52  51  50  44
表2
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Claims (32)

1.制备生物材料的方法，包含：
(i)塑性压缩胶原凝胶，
(ii)对压缩凝胶施加单轴拉伸载荷，
(iii)从压缩凝胶移除所述的载荷，和；
(iv)重复步骤(ii)和(iii)以生产所述的生物材料。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述生物材料相对于压缩凝胶具有增加的材料强度，或改变的流动性和溶质渗透性质。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述生物材料相对于压缩凝胶具有增加的原纤维直径。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述生物材料用于制造组织等效植入物。
5.前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(ii)包括将作用于凝胶的载荷逐步增加到预先确定的单轴拉伸载荷。
6.权利要求5的方法，其特征在于所述预先确定的单轴拉伸载荷使压缩凝胶受到5-40％的应变。
7.权利要求6的方法，其特征在于作用于凝胶的载荷以少于10％应变/分钟的速度逐步增加。
8.权利要求6或7的方法，其特征在于预先确定的载荷维持至少1分钟。
9.前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(iii)包括逐步将载荷从凝胶移除。
10.权利要求9的方法，其特征在于载荷以少于10％应变/分钟的速度被逐步移除。
11.前述任一项权利要求的方法，其特征在于移除载荷后，压缩凝胶维持空载至少1分钟。
12.前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(ii)和(iii)被重复10次或更多次。
13.前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(ii)和(iii)每小时被重复10次或更少次。
14.权利要求1至13任一项的方法，其特征在于凝胶被浸在水溶液中。
15.权利要求14的方法，其特征在于液体是培养基。
16.前述任一项权利要求的方法，其特征在于凝胶包含活细胞。
17.权利要求16的方法，其特征在于活细胞选自以下细胞所组成的组：肌细胞、肝细胞、肾脏细胞、心脏细胞、肺细胞、肠细胞、支气管细胞、眼细胞、生殖细胞、脉管细胞、神经细胞、分泌细胞、干细胞、成纤维细胞、许旺细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、膀胱上皮细胞、骨细胞、软骨细胞和腱细胞。
18.前述任一项权利要求的方法，其特征在于塑性压缩包括所述凝胶体积减少至少50％。
19.前述任一项权利要求的方法，其特征在于通过对凝胶作用压缩力来塑性压缩凝胶。
20.前述任一项权利要求的方法，其特征在于通过对凝胶作用单轴张力使胶原凝胶的原纤维对准。
21.权利要求20的方法，其特征在于在塑性压缩前施加单轴张力。
22.前述任一项权利要求的方法，其特征在于其包括将所述生物材料植入到人体内或动物体内以修复或替换受损组织。
23.权利要求1至21任一项的方法，其特征在于其包括使生物材料模铸或成形以制造组织等效植入物。
24.权利要求23的方法，其特征在于其包括折叠或卷起所述生物材料以制造植入物。
25.权利要求23或24的方法，其特征在于所述生物材料受到进一步的塑性压缩以制造植入物。
26.权利要求1至21任一项方法制造的生物材料。
27.权利要求26的生物材料在制造过滤装置、药物释放装置、模型组织或试验台中的应用。
28.组织等效植入物，其包含权利要求26的生物材料，或由权利要求26的生物材料组成。
29.治疗个体内受损组织的方法，包括：
在受损组织处安装权利要求28的组织等效植入物以修复和/或替换所述组织。
30.权利要求28的组织等效植入物用于治疗个体内的受损组织的方法中。
31.利用权利要求28的组织等效植入物在制造治疗受损组织的药物中的应用。
32.权利要求29的方法，权利要求30的植入物或权利要求31的应用，其特征在于受损组织由关节炎、神经肌肉受损/退化、肌肉-腱受损和老化、创伤后的低再生能力、组织坏死或手术摘除所产生。
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