BRPI1012502A2 - processo de obtenção de gel, complexos com hidroxiapatita e/ou cerâmica óssea, filmes, esponjas e microcristais ricos em fibras de colágeno tipo i puro - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de gel, complexos com hidroxiapatita e/ou cerãmica óssea, filmes, esponjas e microcristais ricos em fibras de colágeno tipo i puro. a presente invenção trata-se de um processo de descelularização de uma matriz biológica para a obtenção de produtos ricos em fibras de colágeno tipo i puro, dentre eles um gel de diferentes viscosidades empregado em terapia de lesões dérmicas. os outros produtos são derivados deste gel rico em fibras de colágeno tipo i puro, que poderá ser complexado com cerãmica óssea (co) e/ou hidroxiapatita (ha), gerando complexos que podem ser utilizados em implantes ósseos, ou então ser tratado para a obtenção de filmes, esponjas e microcristais de colágeno, com amplas aplicações terapêuticas.

Description

“PROCESSO DE OBTENÇÃO DE GEL, COMPLEXOS COM HIDROXIAPATITA E/OU CERÂMICA ÓSSEA, FILMES, ESPONJAS E MICROCRISTAIS RICOS EM FIBRAS DE COLÁGENO TIPO I PURO” Campo da Invenção A presente invenção trata-se de um processo de descelularização de uma matriz biológica para a obtenção de produtos ricos em fibras de coiágeno tipo I puro. Mais especificamente, a presente invenção relata um processo de descelularização de tendões bovinos para preparação de géis de diferentes viscosidades e ricos em fibras de coiágeno tipo I puro, que poderão ser complexados com cerâmica óssea (CO) e/ou hidroxiapatita (HA) ou tratados para a obtenção de filmes, esponjas e microcristais de coiágeno. O gel de coiágeno, com viscosidade até 10 vezes a da água, após adição de conservantes e antifúngicos, pode ser aplicado em terapias de lesões dérmicas, como por exemplo, queimaduras. O gel liofilizado, na forma de esponjas ou filmes de dimensões variadas laminados ou pulverizados, pode ser utilizado para aplicações clínicas como anti-hemorrágicos, atuando como agente de agregação plaquetária, em testes de agregação de plaquetas. Na forma de microcristais de coiágeno podem ser utilizados como embolizantes. O coiágeno obtido também pode ser empregado na formação de estruturas similares a tendões ou faixas para aplicação ortopédica ou implantes para estruturas de apoio para cicatrização. Além disso, pode ser complexado com substâncias medicamentosas para formar depósitos de liberação controlada. Fundamentos da Invenção Tendões são estruturas anatomicamente interpostas que conectam músculos e ossos e apresentam uma extensa matriz extracelular (MEC). A MEC de tendões é complexa, sendo constituída por componentes fibrilares, como as fibras colágenas e elásticas; e não fibrilares, representados pelos glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas não colagênicas. Essas moléculas interagem entre si através de ligações eletrostáticas, interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio, permitindo uma organização estrutural e funcional da matriz (Silver, F.H.; Ebrahimi, A.; Snewhill, P.B. Viscoelastic properties of self assembles type I collagen fibers: molecular basis of elastic e viscous behaviors. Connective Tissue Research, 43, 569-580, 2002 e Kjaer, M. Role of extracellular matríx in adaptation of tendon e skeletal muscle to mechanical loading. Physiological Reviews, 84, 649-698, 2004). O colágeno, o componente fibrilar mais abundante da MEC, é encontrado em várias estruturas como, tendões, nos quais a concentração de colágeno varia de 85% até 98%, pele, ligamentos e ossos (Ottani, V.; Martini, D.; Franchi, M.; Ruggeri, A.; Raspei, M. Hierarchical structures in fibrilar collagens. Micron, 33 (7-8), 587-596, 2002). Diversos tipos de colágeno já foram descritos e apresentam diferentes arranjos, 'permitindo agrupá-los de acordo com os aspectos estruturais. Em tendões, o colágeno tipo I é o componente mais abundante da MEC, mas outros tipos de colágenos também já foram descritos, como os tipos III e V (Nímni, M.E.; Harkness, R.D. Molecular structures e functions of collagen. In: Nimni, M.E. Collagen. Vol I, Biochemistry Boca raton CRC Press. 1988; Kjaer, 2004).

Além de exercer uma função mecânica do tecido, absorvendo a força de tensão inicial, as fibrilas e fibras de colágeno também estão envolvidas direta ou indiretamente em processos de adesão e diferenciação celular e como antígeno nos processos imunológicos (Linsenmayer, T.F. Collagen. In: Hay, E.D. Cell biology of extracellular matrix. New York. Plenum Press, p.5-37, 1985). Assim, o processo de descelularização descrito na presente invenção, tem a capacidade de remover tipos celulares da matéria-prima em questão, cuja presença, no produto final, possam estimular reações imunológicas e processos inflamatórios.

As células de tendões têm também um sistema de receptores que estão permanentemente ligadas às fibras que as sinalizam. A sinalização das células pelas fibras de colágeno é um importante fator para os fenômenos de remodelação tecidual e cicatrização. As fibras de colágeno obtidas e reorganizadas pelo processo descrito nesta invenção mantêm todas as propriedades físico-químicas necessárias para serem reconhecidas pelas células como originais fontes de sinais (informações biológicas para sua aceitação como biocompatíveis e para dar continuidade aos processos fisiológicos). A seguir são citados os principais documentos do estado da técnica envolvendo processos de descelularização.

Chen e colaboradores (Chen, R.N.; Ho, H.O.; Tsai, Y.T.; Sheu ,M.T. Process development of an acellular dermal matrix (ADM) for biomedical applications. Biomaterials, 25, 2679-86, 2004) descrevem o emprego de pele de porco para a obtenção de uma matriz acelular, porém, desvantajosamente, o tratamento enzimático é feito junto com o tratamento com as substâncias tensoativas. Na presente invenção a ação de tensoativos no material antes e separadamente da ação enzimática faz com que as fibras de colágeno estejam limpas e suficientemente separadas para serem atingidas pela etapa enzimática subsequente. O propósito deste tratamento é liberar as fibras de colágeno não só das células, mas também de produtos não colagênicos solúveis nas soluções de tensotivos, e.g lípides. Nos tendões as fibras estão supra-organizadas e com alta ordem molecular, mais compactas formando um corpo quiral, além disso, a concentração de colágeno é a mais alta encontrada chegando entre 85 a 98% do tendão, diferencial em relação à utilização de pele de animais. O documento W0200240630-A2 de 15/11/2000 trata de um processo de descelularização de uma matriz biológica, inclusive de tendões, cuja etapa inicial de lise celular, d es vantajosamente, é realizada a 4°C preferencialmente. Já na presente invenção esta etapa é feita preferencialmente a -10°C para que os cristais de gelo formados sejam suficientemente grandes permitindo que ocorra, além da lise celular, a dissociação dos feixes de fibras e tornando assim as etapas seguintes mais eficientes. O documento W02006099332 de 11/03/05 descreve um processo simples de descelularização empregando a etapa de lise celular a 4°C e utiliza depois uma solução contendo Triton X-100 e hidróxido de amônio. O processo da presente invenção, como já descrito anteriormente, emprega preferencialmente uma temperatura de congelamento de -10°C, que provoca a lise das células e a separação dos feixes de fibras. Além disso, hidróxido de amônio é muito reativo, tóxico e drástico quando comparado com lauril sulfato de sódio, utilizado na presente invenção com a mesma finalidade da combinação de Triton X-100 e hidróxido de amônio descrito no pedido citado acima. O lauril sulfato de sódio saponifica os lipídeos e solubiliza as proteínas não colagênicas de forma mais eficaz e consequentemente dissocia as fibras facilitando o tratamento nas próximas etapas. O pedido de patente americano US20080095662 de 26/10/07 revela um método de descelularização de válvula aórtica porcina para subsequente produção de biopróteses. Após a limpeza do material este é tratado com uma solução de ácido deoxicólico ou de ácidos biliares e em seguida tratados com álcool 40% para retirada de remanescentes celulares da estrutura de colágeno. Primeiramente, a presente invenção, vantajosamente, utiliza como matéria-prima tendões bovinos, cuja composição e arranjo estrutural diferem da válvula aórtica. O tecido cardíaco, ao contrário dos tendões, apresenta muitos proteoglicanos que estão ligados fortemente ao colágeno, tal fato é extremamente desvantajoso para o processo de descelularização, tornando-o caro e com baixos rendimentos. Outro ponto relevante quanto à matéria-prima utilizada é o predomínio e maior condensação de colágeno presentes nos tendões, característica não encontrada em válvula aórtica. Além disso, o uso de ácido deoxicólico ou de ácidos biliares é pouco efetivo no processo de descelularização, já que estes são responsáveis apenas por emulsionarem o material, não digeríndo-o, diferentemente dos tratamentos descritos na presente invenção que degradam lipídeos e proteínas não colagênicas, obtendo assim fibras de colágeno tipo I puro.

Diante das informações disponíveis no estado da técnica o processo de descelularização descrito na presente invenção permite a obtenção de fibras de colágeno tipo I a partir de uma sequência de etapas dispostas de tal maneira que proporcionam um máximo rendimento. Partindo de um tipo de matéria-prima composta por fibras extremamente organizadas e complexas, com a mais alta concentração de colágeno, de 85 a 98% do tendão. Devido a esta organização e complexidade é necessário um tratamento rigoroso para liberar as fibras de colágeno de forma eficiente, gerando um produto de qualidade. Portanto, o uso de um tensoativo aniônico (lauril sulfato de sódio) logo no início do processo tem a finalidade de saponificar lipídeos, solubilizar proteínas não colagênicas e dissociar as fibras de colágeno tornando efetivas as próximas etapas. Outro diferencial do processo é o uso do tensoativo não iônico (Triton X-100) e tripsina depois e separadamente da etapa de tratamento com o tensoativo aniônico. O Triton X-100 continua o processo de solubilização de lipídeos e de degradação das membranas celulares iniciado pelo lauril sulfato de sódio, sem prejudicar a ação enzimática da tripsina, que age essencialmente em proteínas não colagênicas. Assim é essencial seu uso separado e logo após o lauril sulfato de sódio para provocar a disjunção de algumas partes estruturais presentes ainda no material e completar o processo iniciado pelo tensoativo aniônico, tornando o processo de descelularização mais eficiente.

Para aumentar a eficiência do processo de descelularização o material ainda é tratado com outra enzima, a α-amilase, que digere polissacarídeos e glicoproteínas não colagênicas, facilitando a obtenção de um produto final incapaz de estimular reações imunológicas e inflamatórias.

Outro diferencial do processo aqui descrito está na utilização de técnicas de caracterização que são realizadas no final de cada uma das etapas importantes do processo para obtenção dos produtos descritos nesta invenção. Todas as técnicas são baseadas em princípios físico-químicos bem estabelecidos, como propriedades ópticas anisotrópicas e reação com moléculas planares catiônicas e aniônicas. No material em processamento e/ou na etapa final do processo são empregadas técnicas topoquímicas para detectar a presença de remanescentes celulares (fibroblastos principalmente) e assim verificar a eficiência do tratamento de desceiularização e a necessidade de repetição de alguma etapa. Tanto o gel, como o gel complexado com CO e/ou com HA e os cristais de colágeno também passam por esta caracterização e quantificação. O mesmo é feito para a caracterização da morfologia e cristalinidade da CO ou HA. Assim todos os produtos obtidos pela invenção aqui descrita apresentam a qualidade garantida pelas técnicas empregadas ao longo do processo.

Breve Descrição da Invenção A presente invenção trata-se de um processo para a obtenção de produtos ricos em fibras de colágeno tipo I puro que compreende as seguintes etapas: (a) Pré-tratamento: (a1) Congelamento; (a2) Tratamento mecânico; (a3) Lavagem; (a4) Filtração; (b) Desceiularização: (b1) Tratamento com solução tensoativa aniônica; (b2) Filtração; (b3) Lavagem; (b4) Tratamento com enzimas e tensoativo não-iônico; (b5) Lavagem; (b6) Filtração; (b7) Tratamento com solução de a-amilase; (c) Extração: (c1) Tratamento com enzimas e ácidos; (c2) Filtração; (d) Reconstituição das fibras: (d1) Precipitação; (d2) Diálise e Formação de gel; (d2a) Complexação com CO e/ou HA e secagem; (d2b) Tratamento com radiação gama; (d2c) Liofilização. A matéria-prima utilizada é tendão bovino, preferencialmente tendões calcâneos ou flexores. O pré-tratamento compreende o congelamento (a1) da matéria-prima úmida a uma temperatura variando entre 0 e -10°C, preferencialmente -10°C, por 24 a 72 horas, preferencíalmente 48 horas. O material é submetido ao tratamento mecânico (a2) em homogeneizador ou moinho de bolas até a separação nítida das fibras. Em seguida, ocorre a lavagem (a3) com água deionizada por preferencialmente 1 hora com agitação branda e filtração (a4) em filtro de náilon de 1 mm2. O tratamento com tensoativo (b1) selecionado do grupo dos tensoativos aniônicos, preferencialmente lauril sulfato de sódio a uma concentração de 0,05 a 0,1%, preferencialmente 0,1% e um quelante, preferencialmente o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a uma concentração de 0,5 a 1%, preferencialmente 0,5%, é feito com agitação suave, durante 12 a 48 horas, preferencialmente 12 horas. Se necessário esta etapa pode ser repetida, preferencialmente, por mais 12 horas, após refrigeração overnight do material.

Após este tratamento o material passa por uma filtração simples (b2) em filtro de náilon e por uma lavagem (b3) com água deionizada até a completa remoção do tensoativo. O tratamento enzimático (b4) é realizado com uma enzima selecionada do grupo das proteases, preferencialmente tripsina, a uma concentração preferencial de 1%, um tensoativo selecionado do grupo dos tensoativos não iônicos, preferencialmente polioxietileno octil fenil éter, a uma concentração preferencial de 0,1%, e um antibiótico, preferencialmente gentamicina, a uma concentração preferencial de 11 pg/ml, com agitação branda, a preferencialmente 25°C, por 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas. O material depois passa por uma lavagem (b5) com água deionizada e por uma filtração simples (b6) em filtro de náilon. O tratamento com solução de α-amilase (b7), com uma concentração final na solução de preferencialmente 1,5%, é feito com agitação branda, temperatura preferencial de 25°C e durante 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas. Se necessário, este tratamento (b7) pode ser repetido, preferencialmente por mais 12 horas, apôs refrigeração ovemight do material.

Para o tratamento enzimático com ácidos (c1) são utilizados uma enzima selecionada do grupo das proteases, preferencialmente pepsina, sendo 1mg da enzima para cada 1g de material, uma solução de ácido acético, com uma concentração de 5% e ácido clorídrico, sendo 1 mL para cada 500 ml_ de solução, com agitação suave, por 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas. Se necessário esta etapa (c1) pode ser repetida por, preferencialmente, mais 24 horas, sob refrigeração, com ou sem agitação suave. Em seguida o material obtido é filtrado em uma sucessão decrescente de filtros que variam de 500 a 300 pm e se necessário, pode ocorrer a repetição desta etapa. A precipitação (d1) do filtrado obtido na etapa (c2) é realizada em cloreto de sódio PA, a uma concentração final de 10%, por 5 a 7 dias, preferencialmente 7 dias, sob refrigeração. A diálise (d2) do material deve ser realizada sob refrigeração, por 5 a 7 dias, preferencialmente 7 dias, para a obtenção de um gel de colágeno tipo I puro, que pode ser empregado em terapias de lesões dérmicas, como queimaduras. O gel viscoso obtido na etapa (d2) pode ser complexado (d2a) com CO e/ou HA, a uma proporção de 50% a 70%. O complexo formado inicia a sua secagem e tratamento térmico em refrigerador por 24 a 48 horas, preferencialmente 48 horas. Em seguida os complexos são levados à estufa para secagem em três ciclos de temperatura: temperatura controlável e preferencial de 37°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas, depois a temperatura controlável e preferencial de 50°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas e a temperatura controlável e preferencial de 65°C, durante 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas. Os complexos de colágeno tipo I puro e CO e/ou HA que possuem aplicação na área de implantes ósseos. O gel viscoso obtido na etapa (d2) pode passar por um tratamento com radiação gama (d2b), com dose de 25 KGY, para a obtenção de microcristais de colágeno tipo I puro empregados como embolizantes. O gel viscoso obtido na etapa (d2) após passar pelo processo de liofilização (d2c) pode gerar também filmes ou esponjas de colágeno tipo I puro empregados como agentes de agregação plaquetária em aplicações clínicas.

Breve Descrição da Figura O processo e a estrutura da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma, poderão ser melhor entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e às seguintes descrições: A Figura 1 mostra um espectro de FT-IR de fibras de colágeno. Quando o eixo da fibra estiver orientado sucessivamente paralelo ao plano do polarizador temos LD=, e perpendicular temos LD+, sendo LD a sigla para Dicroísmo Linear.

Breve Descrição dos Anexos O Anexo 1 mostra uma imagem da birrefringência de feixes de colágeno do corte histológico de tendão de boi.

No Anexo 2 é mostrado o aspecto da birrefringência das finas fibras de colágeno que constituem a malha dos géis. Aumento 40x2. O Anexo 3 mostra imagens de birrefringência das fibrilas de colágeno que compõem o gel. São representadas quatro imagens (A, B, C e D) cujo brilho da birrefringência depende da orientação das fibrilas com relação aos planos de polarização dos polarizadores. O Anexo 4 mostra a micrografia de um fragmento de cerâmica óssea. Na imagem as setas finas e longas indicam os osteoplastos, as setas pequenas e finas indicam os prolongamentos dos osteoplastos e a seta longa e grossa aponta para uma área da imagem que corresponde exatamente a um grupo de osteoplastos em outro plano de foco, deles e sobre eles são visto os prolongamentos acima citados. Escala 20 pm.

No Anexo 5 está representada a imagem em microscopia de polarização do gel complexado com cerâmica óssea. As setas indicam as cores de interferência da birrefringência e estas são proporcionais às espessuras do material percorridas pelas frentes de onda (diferenças de caminho óptico). Os aspectos de grânulos de cor rosa com várias intensidades, indicadas pelas setas finas e longas, são cerâmicas ósseas (cor rosa avermelhada de terceira a quarta ordem de retardos ópticos), as zonas brancas e verdes clara são cores de primeira ordem devidas as fibras de colágeno, indicadas no anexo pelas setas grossas e longas e a faixa escura irregular corresponde ao gel fibrilar. Escala 20 pm.

No Anexo 6 estão representadas imagens de um campo de cultura celular de osteoblasto sobre o complexo de gel de colágeno com CO. Em A tem-se um foco superficial com os núcleos de osteoblastos que penetraram da superfície para o nível inferior, em B são vistos inúmeros núcleos de fibroblastos que proliferaram aderidos à superfície do complexo e em C, nível de foco um pouco mais dirigido para áreas inferiores, novamente são vistos fibroblastos crescidos abundantemente, cobrindo e penetrando o complexo. Escala 20 pm. O Anexo 7 representa a mesma área e o mesmo campo microscópico do Anexo 6, porém documentando agora a birrefringência do colágeno.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção trata-se de um processo de descelularização de tendões bovinos para a obtenção de géis constituídos de colágeno tipo I e de diferentes viscosidades, que poderão ser complexados com CO e/ou HA ou tratados para a obtenção de filmes, esponjas ou microcristais de colágeno. As características e propriedades do gel são cruciais para a sua aplicação prática nos diferentes casos recomendados, tais como transparência, viscosidade, homogeneidade e ordem das moléculas, determinadas e estudadas por suas anisotropias ópticas. O material de interesse para utilização no processo de descelularização pode ser qualquer tendão bovino, mais preferencialmente o tendão calcâneo e/ou flexores. Tendões provenientes de bois são muito complexos em questões de interações e orientações das fibras, como ilustrado no Anexo 1, onde o brilho observado tem origem na ordem nanométrica molecular e na variabilidade da direção das fibras ao longo eixo do tendão. As fibras não são paralelas ao eixo de tendão. A matéria-prima deverá ser dissecada, cortada e lavada com solução de hipoclorito de sódio de 1 a 5% antes do início do processo descrito na presente invenção.

Produtos ricos em fibras de colágeno tipo I puro compreendem géis, complexos, filmes, esponjas e microcristais, É objeto da presente invenção um processo para obtenção dos produtos descritos acima que compreende as seguintes etapas: (a) Pré-tratamento: (a1) Congelamento; (a2) Tratamento mecânico; (a3) Lavagem; (a4) Filtração; (b) Descelularização: (b1) Tratamento com solução tensoativa aniônica; (b2) Filtração; (b3) Lavagem; (b4) Tratamento com enzimas e tensoativo não-iônico; (b5) Lavagem; (b6) Filtração; (b7) Tratamento com solução de a-amilase; (c) Extração: (c1) Tratamento com enzimas e ácidos; (c2) Filtração; (d) Reconstituição das fibras: (d1) Precipitação; (d2) Diálise e Formação de gel; (d2a) Complexação com CO e/ou HA e secagem; (d2b) Tratamento com radiação gama; (d2c) Liofilização; A primeira etapa (a) de pré-tratamento é iniciada pela etapa (a1) de congelamento do material de interesse. Os tendões são colocados úmidos para o congelamento, que é feito de 0 a -10°C, preferencialmente a -10°C, e devido a não homogeneidade da matéria prima o tempo pode variar de 24 a 72 horas, preferencialmente 48 horas. Em seguida o material é colocado em um homogeneizador ou preferencialmente em um moinho de bolas para o tratamento mecânico (a2) até que se detecte a separação das fibras. A etapa de lavagem (a3) é feita com água deionizada, por preferencialmente 1 hora, com agitação, para que ocorra a lise das células por hipertonicidade. Todo o material é filtrado em um filtro de náilon de 1mm2 (a4).

Após o pré-tratamento inicia-se a etapa de descelularização (b) propriamente dita com o tratamento do material obtido na etapa (a4) utilizando uma solução de tensoativo aniônico, preferencialmente lauril sulfato de sódio, a uma concentração de 0,05 a 0,1%, preferencialmente 0,1% e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) de 0,5 a 1%, preferencialmente 0,5%, com agitação branda, em agitador planetário, durante 12 a 48 horas, preferencialmente 12 horas (b1). O EDTA age como quelante dos íons cálcio e inibe algumas enzimas, principalmente aquelas que degradam o colágeno. Caso a dissociação das fibras e a solubilização de lipídeos e proteínas não colagênicas não tenha sido satisfatório, fato observado após análise empregando técnicas topoquímicas, como a reação com soluções de Azul de Toluidina (AT), verificando a presença de remanescentes celulares e/ou por microscopia de polarização para detectar a birrefringência das fibras de colágeno e sua análise, o material é deixado sob refrigeração overnight e a etapa de tratamento (b1) repetida por mais 12 horas. Após o tratamento o material passa por uma filtração simples em filtro de náilon (b2). O filtrado obtido na etapa (b2) é lavado (b3) com água deionizada até a completa remoção do tensoativo, evitando agitação. Após esta etapa o material pode ser armazenado por até 24 horas sob refrigeração. A próxima etapa do processo de descelularização é o tratamento enzimático (b4), onde o material é colocado em contato com uma protease, preferencialmente tripsina, a uma concentração preferencial de 1%, um tensoativo não iônico, preferencialmente polioxietileno octil fenil éter (Triton X-100), a uma concentração preferencial de 0,1%, e com um antibiótico, preferencialmente gentamicina, a uma concentração preferencial de 11 pg/ml. O processo segue com agitação branda, em temperatura controlável e preferencial de 25°C, por 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas, até que as fibras fiquem hidratadas e bem separadas. Em seguida as fibras são submetidas à lavagem (b5) com água deionizada e filtração simples (b6) em filtro de náilon.

Para a remoção dos radicais glicídios e proteoglicanos as fibras são submetidas ao tratamento com uma solução de α-amilase (b7). É utilizada uma concentração final na solução de preferencialmente 1,5% e a etapa é realizada em agitador planetário, com temperatura preferencial de 25°C, durante 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas. O tratamento pode ser repetido caso o material apresente características adequadas baseando-se no exame visual, onde a matéria prima aparece esbranquiçada e com aumento de volume, ou no exame pelo tato, revelando que as fibras se separam com facilidade. O exame microscópico no material com reação pelo Azul de Toluidina, deve revelar ausência de células ou de seus remanescentes e na microscopia de polarização, deve-se detectar fibras íntegras com sinais de separação. O material é deixado sob refrigeração overnight e a etapa de tratamento (b7) repetida por mais 12 horas.

As moléculas de colágeno de natureza nanométrica são automontadas por mecanismos de auto-reconhecimento para formar fibras e feixes de fibras. Para isolá-las e remover as partes teloméricas, que podem estimular reações imunológicas e inflamatórias, é necessária a etapa de extração (c). O tratamento com soluções de ácido acético (5%), ácido clorídrico (para cada 500 ml_ de solução de material são adicionados 1 ml_ de HCI PA) e uma protease, preferencialmente pepsina (1mg de pepsina para cada 1g de matéria-prima), é feito com agitação não intensa, para facilitar a dissolução, por 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.

Os fragmentos de tendões limpos e com as fibras já relativamente separadas, quando imersos na solução extrativa da etapa (c1) passam a demonstrar intumescimento e transparência na camada superficial de aproximadamente 1 a 2 mm. Em direção às camadas internas dos fragmentos a aparência é esbranquiçada a branca no interior dos fragmentos. Isto é devido à dispersão da luz pelo não intumescimento e falta de solubilização de fibras. Assim, mais de duas extrações serão necessárias, sob refrigeração por mais 24 horas, com ou sem agitação suave, para se obter um ponto ideal de extração. Esta condição é fundamentada no estilo de criação do gado, no gado que caminha há um aumento das ligações cruzadas entra as cadeias protéicas do colágeno, há também a influência da idade do animal e seu peso. Portanto, é necessário adaptação em detalhes extrativos para obtenção de melhores resultados.

Após esta etapa de tratamento (c1) tudo é filtrado (c2) em uma sucessão decrescente de filtros que variam de 500 a 300 pm. O material retido é novamente submetido ao tratamento anterior e às etapas sucessivas de filtragem, até que se obtenha um material suficientemente viscoso e transparente. A etapa de reconstituição das fibras (d) é iniciada com a precipitação (d1) do filtrado obtido na etapa (c2) em cloreto de sódio PA, a uma concentração final de 10%. Depois é deixado sob refrigeração por 5 a 7 dias, preferencialmente 7 dias, até que seja perceptível os sinais de auto-montagem das fibras e máxima agregação, para que se mantenha as informações de cristalinidade do colágeno. Além disso, as fibras reconstituídas devem ser submetidas à prova de ausência de núcleos celulares empregando a técnica de Azul de Toluidina.

Após a etapa de precipitação (d1), descrita acima, as fibras são submetidas à etapa de diálise (d2). Os tubos de diálise são preparados com membranas de celulose com “cut-off" de peso molecular entre 11.500 a 15.800 Da. Estes tubos contendo o material da etapa (d1) são mergulhados em água deionizada, por 5 a 7 dias, preferencialmente 7 dias, sob refrigeração até que o material fique transparente. Nestas condições os sais e pequenos peptídeos fluem do tubo para a água e pelo poder oncótico do colágeno há entrada de água, assim, as fibras de colágeno reconstituídas serão gradativamente hidratadas e gradativamente forma-se um gel. Este é constituído de finas fibras de colágeno, de diâmetro homogêneo, birrefringentes e com alta ordem molecular, como pode ser observado no Anexo 2, características essenciais para garantir a próxima etapa de complexação com CO e/ou HA. As finas fibrilas de colágeno do gel obtido nesta etapa, que se entrecruzam formando uma malha que garante as propriedades topográficas e biomecânicas do produto, podem ser visualizadas também no Anexo 3. O gel viscoso obtido na etapa (d2) pode ser complexado com HA e/ou CO (d2a), para isso o gel é misturado vagarosamente com o pó de HA e/ou CO, a uma proporção de gel complexada com CO e/ou HA de 50% a 70%, e em seguida distribuído em recipientes de teflon. O complexo formado inicia a sua secagem e tratamento térmico em refrigerador por 24 a 48 horas, preferencialmente 48 horas.

Após este período é feita a secagem dos complexos em estufa, com três ciclos de temperatura: temperatura controlável e preferencial de 37°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas, depois a temperatura controlável e preferencial de 50°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas e a temperatura controlável e preferencial de 65°C, durante 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas. O pó de cerâmica óssea empregado nesta etapa é constituído por fragmentos de superfície propositadamente irregular, como pode ser observado no Anexo 4, para aumentar a superfície de contacto com as fibrilas do gel durante a complexação e também garantir, pelas mesmas razões, maior superfície de contato com fibroblastos durante seu emprego nos processos de remodelação do reparo ósseo. A imagem representada no Anexo 4 mostra o brilho típico da birrefringência negativa de cristais de cerâmica óssea contra o fundo escuro dos polarizadores cruzados. A imagem é o resultado de foco estendido profundo de sete imagens em diferentes focos consecutivos e coerentes obtidas por análise de imagens. A birrefringência informa sobre as características de ordem molecular e cristalinidade, sendo a última característica essencial no reconhecimento pelas células do organismo sede, no caso de um implante, por exemplo.

Os fragmentos de cerâmica devem conter os elementos estruturais do osso de onde provêm. Assim, no Anexo 4 são vistos osteoplastos, estes são as lacunas ocupadas pelos osteócitos (células ósseas) antes do tratamento para obtenção da CO, e que no presente anexo encontram-se vazias (após complexação serão preenchidas por gel). Também podem ser observados os prolongamentos dos osteoplastos, que in vivo estariam preenchidos pelos prolongamentos celulares dos osteócitos. Observe-se que a imagem mostra uma grande quantidade desses prolongamentos, na realidade eles denunciam a presença de osteoplastos que não estão aparentes por estarem em diferentes planos de focalização.

Nos complexos a estrutura finamente fibrilar do gel obtido na etapa (d2) envolve os grânulos de cerâmica óssea, neles penetrando, característica esta identificada pelas cores de birrefringência indicadas no Anexo 5 pelas setas.

Como já mencionado anteriormente as fibras de colágeno obtidas e reorganizadas pelo processo descrito nesta invenção mantêm todas as propriedades físico-químicas necessárias para seu reconhecimento pelas células como originais fontes de sinais, característica essencial para o fenômeno de remodelação tecidual e reparo. O Anexo 6 ilustra bem este processo, no qual o complexo do gel com CO é reconhecido pelas células osteoblásticas, que nele se aderem, penetram e proliferam aderidas. No Anexo 7 a imagem da birrefringência correspondente à cultura celular referida no Anexo 6 é devida à ordem molecular e cristalinidade do complexo em questão. Os núcleos são vistos dentro da estrutura fibrilar do complexo. O gel de colágeno obtido na etapa (d2), após passar pelos processos de caracterização utilizando microscopia eletrônica, podem ser tratados com radiação gama, dose de 25 KGY, para a obtenção de microcristais de colágeno (d2b). Deste tratamento resulta uma massa cristalina de colágeno, com eliminação de água, que deve ser desprezada. Este fenômeno gera uma maior polimerização das microfibras de colágeno por formação de ligações cruzadas. A massa cristalina fragmenta-se ao contato mecânico, reduzindo-se a microcristais de tamanhos micrométricos, esta micrometragem será determinada pelas indicações de uso. O gel de colágeno obtido na etapa (d2) pode ser colocado em recipientes com volumes variáveis e relacionados ao tipo de produto e dimensão desejados, filme (volume menor de gel) ou esponja (volume maior de gel), e levado ao aparelho liofilizador para a remoção de água, onde deve permanecer até que seu peso permaneça constante (d2c).

Existem técnicas de caracterização propostas para examinar e diagnosticar as propriedades/características do produto final e mesmo do material nas etapas da produção. Estes procedimentos baseiam-se em propriedades ópticas anisotrópicas e reação com moléculas planares catiônicas e aniônicas, como as de Azul de Toluidina. Também são feitos experimentos com cultura de células, como osteoblasto e fibroblastos sobre as fibras de colágeno reconstituídas, obtidas pelo processo descrito nesta invenção, para atestar não só a biocompatibilidade como também a diferenciação celular desejada induzida pelas novas fibras.

Exemplo 1: Reação com Azul de Toluidina Para verificar o efeito do tratamento de descelularização são utilizadas técnicas capazes de detectar a presença de remanescentes celulares (fibroblastos principalmente) no material em processamento e/ou na etapa final do processo. São empregadas técnicas topoquímicas, como a reação com soluções de Azul de Toluidina (AT) a 0,025%, aproximadamente 10'3M em solução tampão Macllvaine pH 4. A molécula de AT, planar e dotada de propriedades óticas anisotrópicas, liga-se eletrostaticamente, no pH apontado, aos radicais fosfato de ácidos nucléicos DNA ou RNA), revelando assim a presença de núcleos celulares ou fragmentos de células. Esta mesma molécula de AT pode também se ligar aos radicais carboxilados ou sulfatados de proteoglicanos que não tenham sido removidos pelo tratamento adequado, mais um indicativo utilizado para verificar a eficiência do processo de descelularização.

Exemplo 2: Birrefrinqência As moléculas de colágeno são birrefringentes exibindo birrefringência intrínseca ou cristalina. O estudo da presença desta propriedade óptica não-linear é essencial no exame do material finalizado e/ou em algumas etapas importantes do processo, para detectar se o produto exibe as propriedades de ordem molecular e de cristal líquido, qualidades necessárias e exigidas para que o produto final preencha as finalidades necessárias. A detecção da birrefringência do colágeno, para identificar e caracterizar o estado de agregação ordenada, é feita utilizando microscopia de luz polarizada, como verificado no Anexo 3. O brilho da birrefringência depende da orientação das fibrilas com relação aos planos de polarização dos polarizadores, assim, rotacionando a platina (mesa) do microscópio as várias camadas de fibrilas do gel brilham sucessivamente. O brilho máximo só ocorre quando o longo eixo de cada fibrila está a 45 graus dos planos de polarização, enquanto as fibrilas que têm seus ângulos fora dos 45 graus escurecem. Desta forma é possível relacionar o brilho com a estrutura 3D do gel e concluir que uma massa de gel está constituída por fibrilas que se emaranham mantendo sua orientação molecular e cristalinidade, verificadas pela birrefringência.

Exemplo 3: Microespectrofotometria de Infravermelho, Fast-Fourier de Infravermelho ÍFT-IR) No final do processo de descelularização aqui descrito é feito a microespectrofotometria de infravermelho para detectar e medir o dicroísmo linear em fibras de colágeno. No Anexo 1 estão indicadas as orientações dos eixos da fibras com respeito ao plano de polarização da luz infravermelha, indicando que o material colagênico tem uma alta orientação dos radicais dos aminoácidos ao longo eixo da fibras. Além disso, a FT-IR é indicada para detectar a presença de tipos de moléculas indesejáveis no produto final e para caracterizar a presença de colágeno devido sua alta sensibilidade e assim é possível obter a proporcionalidade de colágeno no produto final (45 a 50% de colágeno).

Claims (46)

1. Processo para a obtenção de produtos ricos em fibras de colágeno tipo I puro caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) Pré-tratamento: (a1) Congelamento; (a2) Tratamento mecânico; (a3) Lavagem; (a4) Filtração; (b) Desceiularização: (b1) Tratamento com solução tensoativa aniônica; (b2) Filtração; (b3) Lavagem; (b4) Tratamento com enzimas e tensoativo não-iônico; (b5) Lavagem; (b6) Filtração; (b7) Tratamento com solução de a-amilase; (c) Extração: (c1) Tratamento com enzimas e ácidos; (c2) Filtração; (d) Reconstituição das fibras: (d1) Precipitação; (d2) Diálise e Formação de gel; (d2a) Complexação com CO e/ou HA e secagem; (d2b) Tratamento com radiação gama; (d2c) Liofilização.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela matéria-prima ser tendão bovino, preferencialmente tendões calcâneos ou flexores.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de pré-tratamento compreender o congelamento (a1) da matéria-prima úmida a uma temperatura variando entre 0 e -10°C, preferencialmente -10°C, por 24 a 72 horas, preferencialmente 48 horas.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de pré-tratamento compreender o tratamento mecânico (a2) em homogeneizador ou moinho de bolas até a separação nítida das fibras.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de pré-tratamento compreender a lavagem (a3) com água deionizada por preferencialmente 1 hora com agitação branda.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de pré-tratamento compreender a filtração (a4) em filtro de náilon de 1 mm2.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender o tratamento com tensoativo (b1) selecionado do grupo dos tensoativos aniônicos e um quelante, com agitação suave, durante 12 a 48 horas, preferencialmente 12 horas.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender preferencialmente lauril sulfato de sódio a uma concentração de 0,05 a 0,1%, preferenciaimente 0,1%.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender preferencialmente o quelante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a uma concentração de 0,5 a 1%, preferencialmente 0,5%.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender, se necessário, a repetição da etapa de tratamento (b1) por, preferencialmente, mais 12 horas, após refrigeração overnight do material.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender a filtração simples (b2) do material em filtro de náilon.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender a lavagem (b3) com água deionizada até a completa remoção do tensoativo.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender o tratamento enzimático (b4) com uma enzima selecionada do grupo das proteases, um tensoativo selecionado do grupo dos tensoativos não iônicos e um antibiótico, com agitação branda, a preferencíalmente 25°C, por 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender preferencialmente tripsina, a uma concentração preferencial de 1%.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender preferencialmente o tensoativo não iônico polioxietileno octil fenil éter, a uma concentração preferencial de 0,1%.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender preferencialmente o antibiótico gentamicina, a uma concentração preferencial de 11 pg/ml.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender a lavagem (b5) do material com água deionizada.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender a filtração simples (b6) do material em filtro de náilon.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de descelularização compreender o tratamento com solução de a-amilase (b7) com uma concentração final na solução de preferencialmente 1,5%, com agitação branda, temperatura preferencial de 25°C, durante 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender, se necessário, a repetição da etapa de tratamento (b7) por, preferencialmente, mais 12 horas, após refrigeração ovemight do material.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de extração compreender o tratamento enzimático com ácidos (c1), com agitação suave, por 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender uma enzima selecionada do grupo das proteases, preferencialmente pepsina, sendo 1mg da enzima para cada 1g de material.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender uma solução de ácido acético, com uma concentração de 5%.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender o uso de ácido clorídrico, sendo 1 ml_ para cada 500 mL de solução.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender, se necessário, a repetição da etapa de tratamento (c1) por, preferencialmente, mais 24 horas, sob refrigeração, com ou sem agitação suave.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de extração compreender a filtração (c2) em uma sucessão decrescente de filtros que variam de 500 a 300 pm.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por compreender, se necessário, a repetição da etapa de filtração (c2) em uma sucessão decrescente de filtros que variam de 500 a 300 pm.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de reconstituição das fibras compreender a precipitação (d1) do filtrado obtido na etapa (c2) em cloreto de sódio PA, a uma concentração final de 10%.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pela precipitação durar 5 a 7 dias, preferencialmente 7 dias, sob refrigeração.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de reconstituição das fibras compreender a diálise do material (d2), sob refrigeração, por 5 a 7 dias, preferenciaímente 7 dias.

31. Gel de colágeno tipo I puro caracterizado por ser obtido de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 30.

32. Uso do gel de colágeno tipo I puro caracterizado por ser empregado em terapias de lesões dérmicas, como queimaduras.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de complexação (d2a) do gel viscoso obtido na etapa (d2) com CO e/ou HA, sob refrigeração por 24 a 48 horas, preferencialmente 48 horas.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela proporção de gel complexada com CO e/ou HA ser de 50% a 70%.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela etapa de complexação compreender a secagem dos complexos em estufa, com três ciclos de temperatura.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo primeiro ciclo ser a temperatura controlável e preferencial de 37°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo segundo ciclo ser a temperatura controlável e preferencial de 50°C, durante 12 a 36 horas, preferencialmente 24 horas.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo primeiro ciclo ser a temperatura controlável e preferencial de 65°C, durante 12 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.

39. Complexos de colágeno tipo I puro e CO e/ou HA caracterizadas por serem obtidos de acordo com o descrito nas reivindicações de 1 a 30 e de 33 a 38.

40. Uso dos complexos de colágeno tipo I puro e CO e/ou HA caracterizados por serem empregados como implantes ósseos.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de tratamento com radiação gama (d2b) do gel viscoso obtido na etapa (d2) com dose de 25 KGY.

42. Microcristais de colágeno tipo I puro caracterizados por serem obtidos de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 30 e 41.

43. Uso dos microcristais de colágeno tipo I puro caracterizado por serem empregados como embolizantes.

44. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de liofiiização (d2c) do gel viscoso obtido na etapa (d2).

45. Filmes ou esponjas de colágeno tipo l puro caracterizado por serem obtidas de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 30 e 44.

46. Uso dos filmes e esponjas de colágeno tipo I puro caracterizado por serem empregados como agentes de agregação plaquetária em aplicações clínicas.