CN117025537A - 一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。所述小细胞肺癌类器官专用培养液由HEPES缓冲液、Antibiotic‑Antimycotic、B27、N2、Glutamax、A83‑01、EGF、bFGF、R‑spondin1、N‑cetylcysteine、SB203580、Wnt3a、Afamin、FLI‑06、Y‑27632和DMEM/F12培养基组成。所述FLI‑06在小细胞肺癌类器官专用培养液中的终浓度为2~10μM，该特定浓度的FLI‑06能够特异、有效促进小细胞肺癌类器官的体外生长。本发明提供的小细胞肺癌类器官专用培养液可实现患者来源小细胞肺癌类器官的成功构建，并可实现长期稳定培养，可为小细胞肺癌的发生发展机制研究、药物药敏检测研究等提供一个理想的模型。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。
背景技术
小细胞肺癌(SCLC)是一种起源于支气管黏膜上皮的Kuchitsky细胞的异源性神经内分泌肿瘤,是肺癌中侵袭性最强的亚型，约占肺癌的15％-20％。98％的SCLC归因于吸烟，其特点是恶性程度高、侵袭性很高、病情进展快、早期出现远处转移等。SCLC目前的治疗方式主要有手术、化疗、放疗和尚未正式批准运用到临床的免疫及靶向治疗。由于SCLC的临床特点,发现时已有远处转移,仅有约5％的SCLC患者能够早期发现并能完成手术治疗，而且手术治疗仅适用于临床分期I期(T1-2,N0)并且纵隔淋巴结未被侵犯的局限期SCLC患者。肿瘤切除后推荐辅助化疗或者放化疗联合治疗，但是大部分患者很快原位复发或远处转移，5年生存率仅为10％。药物辅助治疗存在方案多样化，药物效率不高，易产生耐药，试药程序复杂等问题。
类器官(Organoid)是一种利用成体干细胞，在体外培养出的3D细胞培养物，与对应的人体器官具有高度相似的组织学特征，能重现器官的部分生理功能。利用患者离体肿瘤组织构建类器官能模拟肿瘤组织的发生过程及生理病理状态，因此，可作为研究小细胞肺癌的病理生物学特性以及用于(个性化)药物筛选的先进工具，在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。
目前，已有肺癌类器官培养技术，然而，主要是针对非小细胞肺癌类器官培养，对于恶性程度高、侵袭性强、神经内分泌型的小细胞肺癌类器官培养较少见。鉴于此，有必要开发一种专用于构建小细胞肺癌类器官培养的培养液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
一种小细胞肺癌类器官专用培养液，每10mL所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：HEPES缓冲液，pH＝7.2～7.4，终浓度为8～10mM；Antibiotic-Antimycotic，终浓度为50～100μg/mL；B27，终浓度为1～2％v/v；N2，终浓度为1～2％v/v；Glutamax，1～2％v/v；A83-01，终浓度为0.1～0.5μM；EGF，终浓度为10～20ng/mL；bFGF，终浓度为10～20ng/mL；R-spondin1，终浓度为50～100ng/mL；N-cetylcysteine，终浓度为0.5～2mM；SB203580，终浓度为0.5～2μM；Wnt3a，终浓度为50～100ng/mL；Afamin，终浓度为50～100ng/mL；FLI-06，终浓度为2～10μM；Y-27632，终浓度为8～10μM；用DMEM/F12培养基补足至10mL。
优选的，每10mL上述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：HEPES缓冲液，pH＝7.2～7.4，终浓度为10mM；Antibiotic-Antimycotic，终浓度为100μg/mL；B27，终浓度为1％v/v；N2，终浓度为1％v/v；Glutamax，终浓度为1％v/v；A83-01，终浓度为0.5μM；EGF，终浓度为20ng/mL；bFGF，终浓度为20ng/mL；R-spondin1，终浓度为100ng/mL；N-cetylcysteine，终浓度为1mM；SB203580，终浓度为1μM；Wnt3a，终浓度为100ng/mL；Afamin，终浓度为100ng/mL；FLI-06，终浓度为10μM；Y-27632，终浓度为10μM；用DMEM/F12培养基补足至10mL。
上述一种小细胞肺癌类器官专用培养液在小细胞肺癌类器官培养中的应用。
一种利用上述小细胞肺癌类器官专用培养液培养小细胞肺癌类器官的方法，包括以下步骤：
1)获得小细胞肺癌肿瘤组织，机械及酶解消化小细胞肺癌肿瘤组织，细胞筛网过滤后离心，收集细胞沉淀用小细胞肺癌类器官专用培养液重悬，得到小细胞肺癌细胞重悬液；
2)将小细胞肺癌细胞重悬液与基质胶混合后滴胶接种于24孔板中，待胶滴全凝固后加入小细胞肺癌类器官专用培养液，培养获得小细胞肺癌类器官；培养时2天换液一次，培养7天后传代。
一种由上述方法培养获得的小细胞肺癌类器官。
上述一种小细胞肺癌类器官在筛选预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
本发明提供的一种小细胞肺癌类器官专用培养液中，HEPES可调节培养基PH值；B27是细胞生长所需营养因子，可促进细胞存活和生长；N2可促进类器官的生长活性；Glutamax可提高类器官活性，改善生长状况；EGF、bFGF可促进细胞生长、增殖、分化，从而促进类器官生长；R-spondin 1(Wnt信号通路激活剂)可促进肿瘤干细胞的自我更新；N-cetylcysteine具有抗氧化作用；Wnt3a可以促进肿瘤干细胞生长、增殖、分化和抑制凋亡的效果；Afamin可与Wnt3a结合形成复合体，提高Wnt3a的稳定性，维持其较高活性，两者联用可以更适用于类器官的长期培养；SB203580可抑制肿瘤干细胞凋亡与衰老；Y-27632具有抑制干细胞凋亡及分化的作用；特别添加FLI-06，其可以靶向抑制Notch信号通路，进而促进小细胞肺癌的增殖，发挥与Delta样配体3(DLL3)类似的作用(在小细胞肺癌中，DLL3可通过抑制Notch信号通路激活P13K/Akt通路，参与Wnt信号通路的激活，促进小细胞肺癌的发展)，有助于小细胞肺癌类器官的构建。
附图说明
图1为实施例6中患者来源小细胞肺癌原发灶样本类器官连续培养跟踪第7天的形态。
图2为实施例6中患者来源小细胞肺癌原发灶样本类器官第1、2、3次传代培养的形态。
图3为实施例10中患者来源小细胞肺癌原发灶样本类器官连续培养跟踪第7天的形态。
图4为实施例11中小细胞肺癌类器官活性检测结果统计。横坐标为所采用的小细胞肺癌类器官专用培养液的来源。
图5为实施例12中利用所构建小细胞肺癌类器官进行小分子药物(E2A1)敏感性测试。A，不同浓度E2A1，不同反应时间，小细胞肺癌类器官形态变化图。B，检测小细胞肺癌类器官与不同浓度E2A1反应96h的存活率。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
下述实施例中，所涉及的试验材料如下：
HEPES缓冲液，pH＝7.2～7.4，购于赛默飞世尔科技公司，货号H1095。Antibiotic-Antimycotic，购于赛默飞世尔科技公司，货号15240062。B27，购于赛默飞世尔科技公司，货号2301953。N2，购于赛默飞世尔科技公司，货号17502048。Glutamax，购于赛默飞世尔科技公司，货号35050061。A83-01，购于MCE，货号HY-10432。EGF，购于novoprotein，货号C029。bFGF，购于novoprotein，货号C779。R-spondin1购于novoprotein，货号GMP-CX83。N-cetylcysteine购于Sigma，货号A9165。SB203580，购于MCE，货号HY-10256。Wnt3a，购于novoprotein，货号C18K。Afamin，购于novoprotein，货号CW88。FLI-06，购于AbMole，货号M2703。Y-27632，购于MCE，货号HY-10071。DMEM/F12培养基，购于赛默飞世尔科技公司，货号2428670。
实施例1
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官专用培养液，每10mL小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：HEPES缓冲液，终浓度为10mM；Antibiotic-Antimycotic，终浓度为100μg/mL；B27，终浓度为1％(体积分数)；N2，终浓度为1％(体积分数)；Glutamax，终浓度为1％(体积分数)；A83-01，终浓度为0.5μM；EGF，终浓度为20ng/mL；bFGF，终浓度为20ng/mL；R-spondin1，终浓度为100ng/mL；N-cetylcysteine，终浓度为1mM；SB203580，终浓度为1μM；Wnt3a，终浓度为100ng/mL；Afamin，终浓度为100ng/mL；FLI-06，终浓度为10μM；Y-27632，终浓度为10μM；用DMEM/F12培养基补足至10mL。
实施例2
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其原料组成与实施例1基本相同，不同之处在于：小细胞肺癌类器官专用培养液中FLI-06终浓度为5μM。
实施例3
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其原料组成与实施例1基本相同，不同之处在于：小细胞肺癌类器官专用培养液中FLI-06终浓度为2μM。
实施例4
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其原料组成与实施例1基本相同，不同之处在于：小细胞肺癌类器官专用培养液中FLI-06终浓度为1μM。
实施例5
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其原料组成与实施例1基本相同，不同之处在于：小细胞肺癌类器官专用培养液中不含FLI-06。
实施例6
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其是采用实施例1的小细胞肺癌类器官专用培养液，包括以下步骤：
S1：收集临床小细胞肺癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本，转移到4℃预冷的组织保护液中，置于冰浴中进行运输和保存，24h内运至实验室处理。其中，所述组织保护液为在DMEM/F12培养基中添加终浓度100μg/mLAntibiotic-Antimycotic、终浓度10μMY-27632、终浓度10mM HEPES和终浓度10μM FLI-06；
S2：在超净工作台上将肿瘤组织样本取出，置于无菌平皿中，用0.1M PBS(pH 7.4)冲洗3次；用无菌刀片将冲洗好的肿瘤组织样本切成约1～2mm3大小；根据每1g组织量加入1mL胶原酶II(1mg/mL)，充分混匀后37℃酶解消化30min，得到细胞悬液，100μm细胞滤网过滤，滤液4℃、200g离心5min，去除上清液，收集细胞沉淀，按每20万个小细胞肺癌细胞重悬于12μL小细胞肺癌类器官专用培养液，得到小细胞肺癌细胞重悬液；
S3：将小细胞肺癌细胞重悬液与基质胶按照1：4的质量比混合后滴胶接种于24孔板中，每个胶滴为50μL，接种完成后37℃静置至胶滴全凝固；另取小细胞肺癌类器官专用培养液在37℃预热，在每个胶滴上加入500μL预热后的小细胞肺癌类器官专用培养液，然后在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，期间每2天更换一次新鲜的小细胞肺癌类器官专用培养液。如图1所示，本实施例利用小细胞肺癌患者少量肿瘤组织即可产生大量小细胞肺癌类器官团，培养第7天的原代小细胞肺癌类器官团直径约50～100μm，达到传代标准。
本实施例还提供了一种小细胞肺癌类器官的传代方法，其是采用实施例1的小细胞肺癌类器官专用培养液，包括以下步骤：
S1：将前述培养第7天的原代小细胞肺癌类器官培养产物置于显微镜下观察，选择含有直径>50μm类器官团达到80％的培养孔，吸取其中的悬液部分，加入1mLTrypLEExpress消化酶，充分混匀后室温消化3min，而后加入1mLDMEM/F12培养基终止消化，4℃、300g离心5min，去除上清液，收集细胞沉淀加入100μL小细胞肺癌类器官专用培养液重悬，得到小细胞肺癌类器官细胞沉淀重悬液；
S2：将小细胞肺癌类器官细胞沉淀重悬液与基质胶按照1：4的质量比混合后滴胶接种于24孔板中，每个胶滴为50μL，接种完成后37℃静置至胶滴全凝固；另取小细胞肺癌类器官专用培养液在37℃预热，在每个胶滴上加入500μL预热后的小细胞肺癌类器官专用培养液，然后在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，期间每2天更换一次新鲜的小细胞肺癌类器官专用培养液；
S3：每次传代培养的培养周期为7天，获得相应代小细胞肺癌类器官。如图2所示，本实施例所培养的小细胞肺癌类器官经过3次传代(P1、P2、P3)仍可成功形成，且传代后状态与传代前接近。
实施例7
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其步骤与实施例6基本相同，不同之处在于：所采用的小细胞肺癌类器官专用培养液为实施例2的小细胞肺癌类器官专用培养液。
实施例8
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其步骤与实施例6基本相同，不同之处在于：所采用的小细胞肺癌类器官专用培养液为实施例3的小细胞肺癌类器官专用培养液。
实施例9
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其步骤与实施例6基本相同，不同之处在于：所采用的小细胞肺癌类器官专用培养液为实施例4的小细胞肺癌类器官专用培养液。
实施例10
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其步骤与实施例6基本相同，不同之处在于：所采用的小细胞肺癌类器官专用培养液为实施例5的小细胞肺癌类器官专用培养液。如图3所示，本实施例显微镜下多数细胞以单细胞形态存在，仅获得少量小细胞肺癌类器官细胞球，培养第7天的原代小细胞肺癌类器官细胞球大小仅20～40μm。
实施例11
分别对实施例6～10采用3D细胞活力检测试剂(CellTiter-3DCellViabilityAssay)进行类器官细胞活性检测，测定样本均为培养第7天的原代小细胞肺癌类器官培养产物。
CellTiter-3D CellViabilityAssay是通过对活细胞新陈代谢的指标ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质快速检测方法，检测到的发光信号与存在的ATP量成正比，而ATP量直接与培养物中的细胞数量成正比。如图4所示，随着FLI-06的浓度增加，检测到的发光信号(Luminescence)增强，说明小细胞肺癌类器官的活性也随之增加。
综合本实施例与实施例10，表明FLI-06有助于小细胞肺癌类器官的成功构建，其浓度影响小细胞肺癌类器官的活性。
实施例12
本实施例提供了一种小细胞肺癌类器官药敏测试方法，其是采用实施例6培养第7天的原代小细胞肺癌类器官培养产物及实施例1的小细胞肺癌类器官专用培养液，步骤如下：
S1：将原代小细胞肺癌类器官培养产物置于显微镜下观察，选择含有直径>50μm类器官团达到80％的培养孔，吸取其中的悬液部分，加入1mL TrypLE Express消化酶，充分混匀后室温消化3min，而后加入1mL DMEM/F12培养基终止消化，4℃、300g离心5min，去除上清液，收集细胞沉淀加入100μL小细胞肺癌类器官专用培养液重悬，得到小细胞肺癌类器官细胞沉淀重悬液，计数；
S2：向小细胞肺癌类器官细胞沉淀重悬液中补充5％基质胶，混合均匀后铺板于96孔低粘附培养板中，确保每孔有50个以上的小细胞肺癌类器官细胞团，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养至直径>50μm类器官团达到80％，加入待测试药物白僵菌素E2A1(0.4μM、0.8μM、1.6μM、3.2μM)，每48h加药一次，加药96h后，采用3D细胞活性检测试剂(CellTiter-3D CellViabilityAssay)进行类器官细胞活力检测并计算IC50。
如图5所示，0.4μM、0.8μM白僵菌素E2A1处理48h后即可观察到少部分的类器官细胞团裂解及体积缩小；1.6μM、3.2μM白僵菌素E2A1处理48h后可观测到大部分类器官细胞团出现三维结构崩塌、裂解等形态特征；白僵菌素E2A1对小细胞肺癌类器官具有浓度依赖性的杀伤效果，半抑制浓度为0.2039μM。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其特征在于：每10mL所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：HEPES缓冲液，pH=7.2~7.4，终浓度为8~10 mM；Antibiotic-Antimycotic，终浓度为50~100 μg/mL；B27，终浓度为1~2% v/v；N2，终浓度为1~2% v/v；Glutamax，1~2% v/v；A83-01，终浓度为0.1~0.5 μM；EGF，终浓度为10~20 ng/mL；bFGF，终浓度为10~20 ng/mL；R-spondin1，终浓度为50~100 ng/mL；N-cetylcysteine，终浓度为0.5~2mM；SB203580，终浓度为0.5~2 μM；Wnt3a，终浓度为50~100 ng/mL；Afamin，终浓度为50~100ng/mL；FLI-06，终浓度为2~10 μM；Y-27632，终浓度为8~10 μM；用DMEM/F12培养基补足至10mL。
2.根据权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液，其特征在于：每10mL所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：HEPES缓冲液，pH=7.2~7.4，终浓度为10 mM；Antibiotic-Antimycotic，终浓度为100 μg/mL；B27，终浓度为1% v/v；N2，终浓度为1% v/v；Glutamax，终浓度为1% v/v；A83-01，终浓度为0.5 μM；EGF，终浓度为20 ng/mL；bFGF，终浓度为20 ng/mL；R-spondin1，终浓度为100 ng/mL；N-cetylcysteine，终浓度为1 mM；SB203580，终浓度为1 μM；Wnt3a，终浓度为100 ng/mL；Afamin，终浓度为100 ng/mL；FLI-06，终浓度为10 μM；Y-27632，终浓度为10 μM；用DMEM/F12培养基补足至10 mL。
3.如权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液在小细胞肺癌类器官培养中的应用。
4.一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）获得小细胞肺癌组织，机械及酶解消化小细胞肺癌组织，细胞筛网过滤后离心，收集细胞沉淀用权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液重悬，得到小细胞肺癌细胞重悬液；
2）将小细胞肺癌细胞重悬液与基质胶混合后滴胶接种于24孔板中，待胶滴全凝固后加入权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液，培养获得小细胞肺癌类器官。
5.根据权利要求4所述的小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于：步骤2）中培养时2天换液一次，培养7天后传代。
6.一种由权利要求4所述的培养方法获得的小细胞肺癌类器官。
7.如权利要求6所述的小细胞肺癌类器官在筛选预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
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