ES2877555T3 - Composición farmacéutica que incluye factor migratorio para guiar a las células madre pluripotenciales hacia la lesión - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la regeneración de tejidos, que comprende: un compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato de las células madre pluripotenciales como principio activo del mismo, en donde las células madre pluripotenciales son positivas para SSEA3 y positivas para CD105 y además tienen todas las siguientes propiedades: (i) actividad de telomerasa baja o ausente; (ii) capacidad para diferenciarse en células de cualquiera de las tres capas germinales; (iii) ausencia de demostración de proliferación neoplásica; y (iv) presencia de capacidad de autorrenovación.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica que incluye factor migratorio para guiar a las células madre pluripotenciales hacia la lesión
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un factor quimiotáctico que guía a las células madre pluripotenciales hacia un sitio de lesión tisular.
Antecedentes de la técnica
Recientemente, la atención se ha centrado en las células biológicas capaces de contribuir a la regeneración de los tejidos. Aunque los ejemplos conocidos de células obtenidas de adultos que tienen capacidad de diferenciación incluyen células madre mesenquimatosas (CMM) que tienen la capacidad de diferenciarse en hueso, cartílago, adipocitos, neuronas o músculo esquelético y similares (documentos que no pertenecen a patentes 1 y 2), estos consisten en grupos de células que contienen varias células, no se comprende el estado real de su capacidad para diferenciarse y ha habido fluctuaciones considerables en los efectos terapéuticos. Además, aunque se ha informado que las células iPS (documento de patente 1) son células madre pluripotenciales derivadas de adultos, además del establecimiento de células iPS que requiere un procedimiento extremadamente complejo que implica la introducción de genes específicos en células mesenquimatosas en forma de una fracción de fibroblastos cutáneos y la introducción de compuestos específicos en células somáticas, dado que las células iPS tienen un alto potencial tumorigénico, deben superarse obstáculos extremadamente altos para su aplicación clínica.
Se ha determinado a partir de la investigación de M. Dezawa, uno de los inventores de la presente invención, que las células multilinaje diferenciadoras que soportan el estrés (células Muse) que expresan el antígeno de superficie en forma de antígeno embrionario 3 específico de etapa (SSEA-3), que están presentes en las fracciones de células mesenquimatosas y pueden obtenerse sin pasar por un procedimiento de inducción, son responsables de la pluripotencia que poseen las fracciones de células mesenquimatosas y que tienen el potencial de ser aplicadas al tratamiento de enfermedades dirigido a la regeneración de tejidos (documento de patente 2, documento que no pertenece a patente 3, documento que no pertenece a patente 4). Además, se ha determinado que las células madre pluripotenciales (células Muse) están presentes en el tejido mesenquimatoso del cuerpo, se acumulan en el sitio de una lesión tisular cuando el tejido corporal ha sido dañado y es responsable de la regeneración del tejido (documento de patente 2, documento que no pertenece a patente 3). Sin embargo, no solo no se ha dilucidado el mecanismo por el cual las células Muse son guiadas al tejido dañado, sino que tampoco se ha identificado el factor quimiotáctico que guía a las células Muse al sitio dañado.
[Documentos de la técnica anterior]
[Documentos de patente]
[Documento de patente 1] Patente japonesa N.° 4183742
[Documento de patente 2] Publicación Internacional N.° 2011/007900
[Documentos no pertenecientes a patente]
[Documento no perteneciente a patente 1] Dezawa, M., et al., J. Clin. Invest., Vol. 113, pág. 1701-1710 (2004)
[Documento no perteneciente a patente 2] Dezawa, M., et al., Science, Vol. 309, pág. 314-317 (2005)
[Documento no perteneciente a patente 3] Kuroda, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 107, pág. 8639-8643 (2010)
[Documento no perteneciente a patente 4] Wakao, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, pág. 9875-9880 (2011)
US2010113774A1 desvela composiciones que comprenden agonistas de S1P2 para el tratamiento de una serie de enfermedades.
Divulgación de la invención
[Problemas a resolver por la invención]
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una aplicación médica con células madre pluripotenciales (células Muse) en el campo de la medicina regenerativa y mejorar la actividad quimiotáctica de las células Muse e identificar un factor quimiotáctico que permita que las células Muse se acumulen eficazmente en un sitio dañado junto con proporcionar una composición farmacéutica que contiene ese factor quimiotáctico.
[Medios para resolver los problemas]
Los inventores de la presente invención lograron identificar factores quimiotácticos que guían a las células Muse a un sitio dañado utilizando un análisis proteómico y descubrieron que uno de esos factores quimiotácticos en forma de esfingosina-1-fosfato (SIP) mejora la actividad quimiotáctica de las células Muse y está implicado en su acumulación en un sitio dañado, conduciendo de este modo a la consumación de la presente invención. La mejora de la actividad quimiotáctica incluye iniciar la migración de las células Muse presentes en el tejido mesenquimatoso hacia un sitio dañado.
En concreto, la presente invención es como se indica a continuación.
[1] Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la regeneración de tejidos, que comprende: un compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato de las células madre pluripotenciales como principio activo del mismo, en donde las células madre pluripotenciales son positivas para SSEA3 y positivas para CD105 y además tienen todas las siguientes propiedades:
(i) actividad de telomerasa baja o ausente;
(ii) capacidad para diferenciarse en células de cualquiera de las tres capas germinales;
(iii) ausencia de demostración de proliferación neoplásica; y
(iv) presencia de capacidad de autorrenovación.
[2] La composición farmacéutica descrita en [1] anterior, en donde el compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato es un agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato.
[3] La composición farmacéutica descrita en [2] anterior, en donde el agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato es esfingosina-1-fosfato.
[4] La composición farmacéutica descrita en [2] anterior, en donde el agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato se selecciona de entre el grupo que consiste en 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-5-(trifluorometil)piridin-2(1H)-ona, 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)pirrolidin-2,5-diona, 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-3-metilimidazolindin-2,4,5-triona, 1-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-((1-metil-1H-tetrazol-5-il)tio)etanona y (S)-1-(2-(1-bencil-2,5-dimetiMH-pirrol-3-il)-2-oxoetil-2',3-dihidroespiro[imidazolidin-4,1'-indeno]-2,5-diona.
[5] La composición farmacéutica descrita en [1] a [4] en lo que antecede, en donde la activación de la migración es una guía a un sitio dañado en el cuerpo.
[6] La composición farmacéutica descrita en [1] a [5] en lo que antecede, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD117 y negativas para CD146.
[7] La composición farmacéutica descrita en [1] a [6] en lo que antecede, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD117, negativas para CD146, negativas para NG2, negativas para CD34, negativas para vWF y negativas para CD271.
[8] La composición farmacéutica descrita en [1] a [7] en lo que antecede, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD34, negativas par aCD117, negativas para CD146, negativas para CD271, negativas para NG2, negativas para vWF, negativas para Sox10, negativas para Snail, negativas para Slug, negativas para Tyrp1 y negativas para Dct.
También se analiza en el presente documento;
Una composición farmacéutica para activar la migración de células madre pluripotenciales, que comprende: como principio activo de la misma, un compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato.
La composición farmacéutica, en donde el compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato es un inhibidor de la esfingosina-1-fosfato liasa, en donde el inhibidor de la esfingosina-1-fosfato liasa se selecciona de entre el grupo que consiste en (E)-1-(4-((1R, 2S, 3R)-1,2,3,4-tetrahidroxibutil)-1H-imidazol-2 -il)etanona oxima, (1R, 2S, 3R)-1-(2-isoxazol-3-il)-1H-imidazol-4-il)butano-1,2,3,4-tetraol y 1-(5-((1R, 2S, 3R)-1,2,3,4-tetrahidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona.
[Efectos de la invención]
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un factor quimiotáctico que mejora la actividad quimiotáctica de las células Muse y guía a las células Muse al sitio de una lesión durante la regeneración de tejidos por las células Muse.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 es un gráfico que indica los resultados de la medición de los niveles de expresión de varios tipos de receptores de esfingosina-1-fosfato (S1PR) en células Muse como valores relativos basados en los niveles de expresión en fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) usando PCR en tiempo real (PCR cuantitativa).
[Figura 2] La figura 2 es un dibujo que muestra esquemáticamente una cámara de Boyden utilizada para medir la migración de las células Muse y la migración celular inducida por un factor quimiotáctico. La cámara de Boyden tiene un inserto que tiene un diámetro de microporo de 8 pm en el interior. Se añade un caldo de cultivo que contiene células Muse o células que no son Muse encima del inserto, se añade un caldo de cultivo que contiene factor quimiotáctico debajo del inserto y se cuenta el número de células que han pasado a través del inserto
después de 18 horas.
[Figura 3] La figura 3 es un gráfico que indica una evaluación relativa del número de células migradas medidas usando una cámara de Boyden. En el gráfico, las diferentes concentraciones de factor quimiotáctico se representan en el eje horizontal y los valores relativos se representan en el eje vertical según un valor de 1 para el número de células Muse que fueron inducidas a migrar por el factor quimiotáctico (0 nM).
[Figura 4] La figura 4 es un dibujo conceptual de un aparato de análisis de la cinética celular básica (EZ-TAXIScan) utilizado para medir la migración de las células Muse. El aparato contiene dos hendiduras, las células y el factor quimiotáctico se añaden respectivamente a cada hendidura y la manera en que las células se orientan hacia el factor quimiotáctico en la placa se indica con flechas.
[Figura 5] La figura 5 representa fotografías que muestran la migración celular medida usando un aparato de análisis de cinética celular básica. Las células Muse migran siguiendo el gradiente de concentración de un factor quimiotáctico para pasar por debajo de una estructura denominada terraza que tiene una longitud de 250 mm y una profundidad de 8 pm. La fotografía de la izquierda muestra la cinética celular en el caso de la adición de esfingosina-1-fosfato (SIP) a una concentración de 2 pM, mientras que la fotografía de la derecha muestra la cinética celular en el caso de no añadir S1P.
[Figura 6] La figura 6 indica los resultados del análisis de la migración de células Muse inducida por S1P usando un aparato de análisis de cinética celular básica. El gráfico de la izquierda indica los resultados de la medición en tiempo real de la forma en que las células Muse migran linealmente hacia S1P. El gráfico de la derecha indica los resultados de la medición en tiempo real de la forma en que las células Muse se dispersan aleatoriamente en ausencia de S1P.
[Figura 7] La figura 7 es un dibujo para explicar el procedimiento de una prueba de migración de células Muse en ratones utilizando un factor quimiotáctico. Los ratones consistían en ratones SCID inmunodeficientes (de 7 semanas de edad) que no rechazan las células humanas. Se trasplantó un hidrogel biodegradable impregnado con una solución S1P en el lomo de los ratones y, después de administrar células Muse humanas positivas para GFP en la vena de la cola, se recogió tejido de las proximidades del sitio de trasplante de hidrogel para verificar si las células Muse se habían acumulado en el sitio o no.
[Figura 8] La figura 8 representa dibujos que muestran la acumulación de células Muse humanas positivas para GFP que se acumularon en el hidrogel en el caso de hacer que la concentración de la solución de S1P sea de 500 nM o 1000 nM. Se usó anticuerpo anti-GFP (Alexa 568) para teñir el GFP. Estos resultados indican que las células Muse se acumulan dependiendo de la concentración de la solución de S1P.
[Figura 9] La figura 9 muestra los resultados de evaluar el número de células Muse que se acumularon en hidrogel como el número de células por milímetro cuadrado (1 mm2). Similar a los resultados que se muestran en la figura 8, las células Muse se acumularon dependiendo de la concentración de la solución de S1P.
Modo para llevar a cabo la invención
La presente invención se refiere a una composición que comprende un factor quimiotáctico que guía a las células madre pluripotenciales a un sitio dañado y a su utilización. A continuación se proporciona una explicación detallada de la presente invención.
1. Células madre pluripotenciales (células Muse)
La existencia de las células madre pluripotenciales que son guiadas al sitio dañado por el factor quimiotáctico de la presente invención fue descubierta por M. Dezawa, uno de los solicitantes de la presente invención, y las células se denominaron "células que soportan estrés diferenciadoras de múltiples linajes (Muse)". Las células Muse pueden obtenerse de aspirados de médula ósea o tejido cutáneo, tal como tejido conjuntivo dérmico, y están presentes esporádicamente en el tejido conjuntivo de varios órganos. Además, estas células tienen propiedades tanto de células madre pluripotenciales como de células madre mesenquimatosas y se identifican como doble positivas para cada uno de los marcadores de superficie celular del "antígeno embrionario 3 específico de etapa (SSEA-3)" y "CD105". Por tanto, las células Muse o las poblaciones de células que contienen células Muse se pueden aislar del tejido corporal utilizando estos marcadores de antígeno como indicadores. Los detalles relacionados con los métodos utilizados para aislar e identificar las células Muse, así como sus características se desvelan en la publicación internacional n.° WO 2011/007900. Además, como han indicado Wakao, et al. (2011, citados anteriormente), en el caso de utilizar un cultivo celular obtenido mediante el cultivo de células mesenquimatosas presentes en la médula ósea, la piel y similares y utilizando las células como la población madre de células Muse, se sabe que todas las células positivas para SSEA-3 son positivas para CD105. Por tanto, en la composición farmacéutica de la presente invención, en el caso de aislar células Muse de tejido mesenquimatoso biológico o células mesenquimatosas cultivadas, las células Muse se pueden purificar y usar simplemente usando SSEA-3 como marcador de antígeno. Adicionalmente, en la presente descripción, las células madre pluripotenciales (células Muse) que se han aislado de tejido mesenquimatoso biológico o células mesenquimatosas cultivadas mediante el uso de SSEA-3 como marcador de antígeno, o una población celular que contiene células Muse, pueden describirse simplemente como "células positivas para SSEA-3". Además, en la presente descripción, "células no Muse" se refiere a células que están contenidas en el tejido mesenquimatoso biológico o células mesenquimatosas cultivadas y que no son "células positivas para SSEA-3".
Simplemente hablando, las células Muse o las poblaciones de células que contienen células Muse pueden aislarse de tejido biológico (tal como tejido mesenquimatoso) usando un anticuerpo contra el marcador de superficie celular SSEA3 solo o usando tanto un anticuerpo contra SSEA-3 como un anticuerpo contra CD105. En este caso, "tejido biológico" se refiere al tejido biológico de un mamífero. En la presente invención, aunque un embrión en una etapa de desarrollo anterior a un óvulo fertilizado o una etapa de blástula no se incluye en el tejido biológico, está incluido un embrión en una etapa de desarrollo dentro o después del feto o la etapa de blástula, incluida la blástula. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero sin limitación, primates, tales como seres humanos o monos, roedores, tales como ratones, ratas, conejos o cobayas, así como gatos, perros, ovejas, cerdos, vacas, caballos, burros, cabras y hurones. Las células Muse utilizadas en la preparación celular de la presente invención se distinguen claramente de las células madre embrionarias (ME) y las células germinales embrionarias (GE) en que se derivan de tejido biológico. Además, "tejido mesenquimatoso" se refiere a tejido óseo, membrana sinovial, grasa, sangre, médula ósea, músculo esquelético, dermis, ligamentos, tendones, pulpa, umbilical y similares, así como a tejido conjuntivo presente en varios órganos. Por ejemplo, las células Muse se pueden obtener de la médula ósea y la piel. Por ejemplo, preferentemente se utilizan células Muse que se han aislado de tejido mesenquimatoso recogido del cuerpo vivo. Además, las células Muse también pueden aislarse de células mesenquimatosas cultivadas usando los medios de aislamiento mencionados anteriormente.
Como se ha descrito anteriormente, aunque las células Muse o las poblaciones de células que contienen células Muse pueden aislarse del tejido biológico utilizando su propiedad de ser positivas para SSEA-3 o dobles positivas para SSEA y CD105, se sabe que la piel humana adulta contiene varios tipos de células madre y células precursoras. Sin embargo, las células Muse no son las mismas que estas células. Los ejemplos de tales células madre y células precursoras incluyen células precursoras derivadas de la piel (PDP), células madre de la cresta neural (CMCN), melanoblastos (MB), células perivasculares (CP), células precursoras endoteliales (PE) y células madre derivadas de tejido adiposo (CMDA). Las células Muse pueden aislarse de estas células utilizando la "no expresión" de un marcador único como indicador de estas células. Más específicamente, Las células Muse se pueden aislar utilizando la no expresión de al menos uno de los 11 marcadores, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 marcadores, seleccionados de entre el grupo que consiste en CD34 (marcador para PE y CMDA), CD117 (c-kit) (marcador para MB), CD146 (marcador para PC y CMDA), CD271 (NGFR) (marcador CMCN), NG2 (marcador para CP), factor vWF (factor von Willebrand) (marcador para PE), Sox10 (marcador para CMCN), Snail (marcador para PDP), Slug (marcador para PDP), Tyrp1 (marcador para MB) y Dct (marcador para MB). Por ejemplo, aunque no se limita a ello, las células Muse se pueden aislar utilizando la ausencia de expresión de CD117 y CD146 como indicador, se pueden aislar usando la ausencia de expresión de CD117, CD146, NG2, CD34, vWF y CD271 como indicador, y se pueden aislar utilizando la ausencia de expresión de los 11 marcadores mencionados anteriormente como indicador.
Además, las células Muse que tienen las características mencionadas anteriormente utilizadas en la preparación celular de la presente invención pueden tener al menos una propiedad seleccionada de entre el grupo que consiste en:
(i) actividad de telomerasa baja o ausente;
(ii) capacidad para diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales;
(iii) ausencia de demostración de proliferación neoplásica; y,
(iv) capacidad de autorrenovación.
En un aspecto de la presente invención, las células Muse utilizadas en la preparación celular de la presente invención tienen todas las propiedades mencionadas anteriormente. En este caso, con respecto a lo citado anteriormente (i), "actividad de telomerasa baja o ausente" se refiere a que la actividad de la telomerasa es baja o no se puede detectar en el caso de haber detectado actividad de la telomerasa usando, por ejemplo, el kit de detección de telomerasa Trapeze XL (Millipore Corp.). Actividad de telomerasa "baja" se refiere a tener una actividad de la telomerasa aproximadamente igual a la de los fibroblastos humanos, por ejemplo, o tener una actividad de la telomerasa que es 1/5 o menos y, preferentemente, 1/10 o menos en comparación con las células Hela. Con respecto a lo citado anteriormente (ii), las células Muse tienen la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) in vitro e in vivo, y al inducir la diferenciación mediante cultivo in vitro, por ejemplo, pueden diferenciarse en hepatocitos, neurocitos, células de músculo esquelético, células de músculo liso, osteocitos, adipocitos y similares. Además, las células Muse también pueden demostrar la capacidad para diferenciarse en las tres capas germinales en el caso de trasplante in vivo en testículos, por ejemplo. Asimismo, las células Muse también tienen la capacidad de migrar, injertarse y diferenciarse en un órgano dañado (tal como el corazón, la piel, la médula espinal, el hígado o el músculo) al ser trasplantado al cuerpo mediante inyección intravenosa. Con respecto a lo citado anteriormente (iii), aunque las células Muse proliferan a una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1,3 días en un cultivo en suspensión, también tienen la propiedad de interrumpir la proliferación durante aproximadamente 10 días y, en el caso de haber sido trasplantadas en testículos, tienen la propiedad de no volverse malignas durante al menos seis meses. Además, con respecto a lo citado anteriormente (iv), las células Muse tienen la capacidad de autorrenovación (autorreplicación). En este caso, "autorrenovación" se refiere al cultivo de células contenidas en una masa celular similar a un cuerpo embrioide obtenida mediante el cultivo en suspensión de células Muse individuales y permitiéndoles reformar una masa celular similar a un cuerpo embrioide. La autorrenovación puede realizarse durante un ciclo o repetirse durante una pluralidad de ciclos.2
2. Identificación de proteínas expresadas específicamente en células Muse
Aunque anteriormente se sabía que las células Muse convergen en sitios dañados cuando se administran a un adulto, mientras que las células que no son Muse no lo hacen, se desconoce el factor quimiotáctico que guía a las células Muse a un sitio dañado. Por lo tanto, en el caso de hipotetizar la existencia de un factor quimiotáctico que guía a las células Muse a un sitio dañado, mediante la identificación de una proteína (particularmente un receptor) que se expresa específicamente en las células Muse pero no se expresa en células que no son Muse, se cree que existe una alta posibilidad de que el ligando correspondiente y similares sean un factor quimiotáctico.
En general, se sabe que el análisis proteómico es útil como técnica para identificar factores desconocidos. Este análisis es una técnica analítica para la realización de investigaciones con el fin de determinar la correlación entre una proteína extraída de células o tejidos y un gen que la codifica mediante el análisis de las propiedades bioquímicas y fisicoquímicas de dicha proteína y utilizando información genética determinada a partir de un análisis del genoma y determinar además las funciones de los productos de traducción de todos los genes mientras se utiliza la información de la secuencia del genoma.
En un análisis proteómico, un ejemplo de una técnica que se utiliza con frecuencia en la actualidad es la huella de masa de péptidos (PMF). En la PMF, después de aislar una proteína por electroforesis bidimensional y similares y digerir esa proteína en péptidos con una enzima digestiva como la tripsina, el espectro de masas de la mezcla de péptidos (huella de masa de péptidos) se adquiere utilizando un espectrómetro de masas y buscando en una base de datos del genoma para este espectro y el espectro de masas teórico calculado a partir de una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de bases de ADN, esa proteína y el gen que codifica esa proteína pueden identificarse.
De acuerdo con la presente invención, puede usarse un análisis proteómico desarrollado por un grupo dirigido por el profesor Toshiaki Isobe de la Universidad Metropolitana de Tokio con el propósito de identificar receptores para factores quimiotácticos de células Muse. Más específicamente, las proteínas (mezclas) se extraen de dos grupos de células que se van a comparar (grupo de células Muse y grupo de células no Muse) y estas mezclas se aíslan mediante electroforesis en función de las diferencias de peso molecular. Las proteínas aisladas se distinguen como bandas respectivas en un gel. Después, cada banda se corta del gel y su masa se mide mediante análisis LC-MS. Asimismo, las proteínas se buscan automáticamente y se seleccionan de una base de datos utilizando estos valores de masa, lo que hace posible identificar proteínas que difieren entre los dos grupos de células (véase, por ejemplo, Taoka, M., et al., "Protein Analysis Model - The Definitive Version!", Isobe, T. y Takahashi N., ed., pág. 92-100, Yodosha Co., Ltd., 2004). Adicionalmente, aunque no existen limitaciones en la base de datos antes mencionada, se puede utilizar una base de datos de proteínas previamente desvelada públicamente en forma de "Swiss Prot". Los inventores de la presente invención identificaron proteínas expresadas específicamente en células Muse comparándolas con células que no son Muse usando el análisis proteómico mencionado anteriormente (datos no mostrados). Como se describirá posteriormente, entre estas proteínas identificadas, se determinó que el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato (que puede abreviarse como "SIPR2"), por ejemplo, era una proteína que se expresa específicamente en las células Muse pero no se expresa en células que no son Muse (Ejemplo 2).
3. Identificación y confirmación del factor quimiotáctico
Los factores quimiotácticos de las células Muse pueden identificarse seleccionando proteínas expresadas específicamente en células Muse identificadas de la manera descrita anteriormente que pueden servir como receptores de factores quimiotácticos y luego examinando si los ligandos de estos receptores pueden ser factores quimiotácticos o no. En general, aunque no existen limitaciones particulares sobre el método utilizado para medir la migración celular, se pueden usar métodos tales como el método de la cámara de Boyden o la tecnología de análisis de cinética celular en sistemas experimentales in vitro. Simplemente hablando, el método de la cámara de Boyden es un método que es eficaz para cuantificar la actividad quimiotáctica y consiste en proporcionar un inserto como un compartimento separado en una cámara de Boyden e instalar un filtro con una gran cantidad de microporos de tamaño uniforme (por ejemplo, aproximadamente 8 pm) en la parte inferior de este inserto. Al añadir un caldo de cultivo que contiene células sobre el filtro y añadir un caldo de cultivo que contiene un factor quimiotáctico debajo del inserto, las células migran hacia abajo pasando a través del filtro a lo largo del gradiente de concentración del factor quimiotáctico generado en los microporos del filtro y esta migración se usa para cuantificar la actividad quimiotáctica (Figura 2) (véase, por ejemplo, Boyden, S., J. Exp. Med., Vol. 115, págs. 453-466 (1962)). De esta manera, el grado de quimiotaxis se puede medir cuantitativamente contando el número de células que pasan a través del filtro. En la presente invención, después de añadir una sustancia candidata de un factor quimiotáctico debajo de un inserto y añadir células Muse encima del inserto, se cuenta el número de células Muse que migraron a través del inserto, por lo que es posible evaluar si la sustancia candidata añadida es capaz de actuar como factor quimiotáctico.
Por otro lado, la tecnología de análisis de cinética celular se refiere a un sistema que permite la medición de la actividad quimiotáctica dependiente del gradiente de concentración de las células en la dirección horizontal mediante la formación de un gradiente de concentración de factor quimiotáctico constante en un sustrato de vidrio utilizando un chip de oblea de silicio fabricado con la última tecnología de microfabricación. La directividad (como el grado en que las células Muse avanzan hacia el lado de alta concentración de un factor quimiotáctico en una determinada dirección) se puede cuantificar analizando las imágenes obtenidas con este sistema en tiempo real. Como se describirá posteriormente con detalle, en el caso de utilizar esfingosina-1-fosfato (S1P) como sustancia candidata única, se
observó que las células Muse demostraban una notable actividad quimiotáctica en sistemas experimentales que empleaban el método de cámara de Boyden y la tecnología de análisis de cinética celular (Ejemplo 2).
Además, en sistemas experimentales in vivo, los factores quimiotácticos se pueden identificar mediante el uso de un sistema en el que los ratones, por ejemplo, se utilizan para el modelo experimental. Más específicamente, se trasplanta un gel (tal como un hidrogel) impregnado con un factor quimiotáctico en el tejido de ratones inmunodeficientes que no rechazan las células humanas y, posteriormente, se administran células Muse humanas marcadas con GFP en una vena de la cola, el factor quimiotáctico puede identificarse observando histoquímicamente si las células Muse pueden acumularse en el gel trasplantado que contiene el factor quimiotáctico. Como se indica en el Ejemplo 2 que se describirá posteriormente, se determinó que las células Muse positivas para GFP se acumulaban dependiendo de la concentración de S1P.
4. Utilización del factor quimiotáctico
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende como principio activo de la misma un factor quimiotáctico que mejora la actividad quimiotáctica de las células Muse y guía las células Muse hacia un sitio dañado. Un "factor quimiotáctico" utilizado en la composición farmacéutica de la presente invención se refiere a, por ejemplo, una sustancia que hace que las células migren hacia ese factor quimiotáctico como resultado de la unión a un receptor expresado en la superficie de las células Muse y que activa un sistema de transducción de señales implicado en la migración celular mediante esa unión. Además, cuando se utiliza en la presente invención, la expresión "sitio dañado" se refiere a un sitio específico en varios órganos o tejidos del cuerpo cuya función se ha perdido debido a la degeneración o eliminación con varios tipos de células y tejidos causados por un traumatismo, inflamación, enfermedad, isquemia, necrosis, tumorigénesis o envejecimiento y similares. De acuerdo con la presente invención, para permitir que las células Muse se acumulen en un sitio dañado, se puede usar un factor quimiotáctico como composición farmacéutica obtenida incorporando un vehículo y/o diluyente farmacológicamente aceptable, o se puede usar el factor quimiotáctico solo. En este caso, no existen limitaciones particulares sobre el factor quimiotáctico contenido en la composición farmacéutica de la presente invención siempre que sea una sustancia que tenga la capacidad de guiar las células Muse a un sitio dañado (ejemplos de las cuales incluyen proteínas, péptidos, lípidos y compuestos químicos). Más preferentemente, el factor quimiotáctico es un agonista de esfingosina-1-fosfato (SIP), un derivado de esfingosina-1-fosfato o un receptor de esfingosina-1-fosfato. En este caso, "esfingosina-1-fosfato (S1P)" se refiere a un producto metabólico de un esfingolípido que compone la membrana celular que tiene la fórmula indicada a continuación.
[Fórmula química 1]
Se sabe que la S1P es una sustancia fisiológicamente activa que induce migración al ser liberada después de ser escindida de la membrana celular por ciertos tipos de enzimas y luego unirse a un receptor acoplado a proteína G expresado en la membrana celular. Además, se sabe que un receptor acoplado a proteína G en forma de receptor de S1P es un receptor para SIP, y previamente se ha determinado que existen cinco tipos, que consiste en S1PR1 a S1PR5. En este caso, cuando se realizó una investigación de la expresión del receptor de S1P en células Muse y células no Muse, aunque se determinó que S1PR1 se expresaba en ambas células, los inventores de la presente invención determinaron que SP1R2 se expresaba en células Muse (datos no mostrados).
De acuerdo con la presente invención, el factor quimiotáctico utilizado en la composición farmacéutica de la presente invención no se limita a SIP, sino que también puede ser un derivado de S1P del mismo, siempre que sea una sustancia que potencie la actividad quimiotáctica de las células Muse. Aunque no existen limitaciones particulares al respecto, los ejemplos de derivados de S1P incluyen esfingosilcolina, galactosilesfingosina (psicosina), glucosilesfingosina (glucopsicosina), sulfogalactosilesfingosina (lisosulfatida), N,N-dimetilesfingosina-1-fosfato, N,N,N-trimetilesfingosina-1-fosfato, ceramida-1-fosfato, dihidroesfinogisina-1-fosfato, fitoesfingosina-1-fosfato, deshidrofitoesfingosina-1-fosfato y sus sales. Además, de acuerdo con la presente invención, se puede usar un agonista de S1PR2 para el factor quimiotáctico usado en la composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos de tales agonistas incluyen un agonista que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 2]
que representa 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-5-(trifluorometil)piridin-2(1H -ona (consulte, por ejemplo, Park, S.W., et al., J. Am. Soc. Nephrol., Vol. 23, págs. 266-280 (2012)), un agonista que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 3]
que representa 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)pirrolidin-2,5-diona, un agonista que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 4]
que representa 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-3-metilimidazolindin-2,4,5-triona, un agonista que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 5]
que representa 1-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-((1-metil-1H-tetrazol-5-il)tio)etanona y un agonista que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 6]
que representa (S)-1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil-2',3'-dihidroespiro [imidazolidina-4,1'-indeno]-2,5-diona.
Además, aunque la S1P se desfosforila en el cuerpo mediante la esfingosina-1-fosfato liasa presente en el retículo endoplásmico, lo que hace que se descomponga en trans-2-hexadecenal y fosfato de etanolamina, se sabe que esta reacción de desfosforilación normalmente se encuentra en un estado de equilibrio con una reacción que añade ácido fosfórico al trans-2-hexadecenal. Por lo tanto, una sustancia que inhibe la S1P liasa, que es responsable de la desfosforilación, también se puede usar en la composición farmacéutica de la presente invención para mejorar la concentración de S1P. Los ejemplos de estas sustancias que inhiben la S1P liasa incluyen una sustancia que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 7]
que representa (E)-1-(4-((1R, 2S, 3R) -1,2,3,4-tetrahidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona oxima (véase, por ejemplo, Bagdanoff, J. T., et al., J. Med. Chem., Vol. 53, págs. 8650-8662 (2010)), una sustancia que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 8]
Estructura:
que representa (1R, 2S, 3R)-1-(2-isoxazol-3-il)-1H-imidazol-4-il)butano-1,2,3,4-tetraol (Bagdanoff, et al., ibid), y una sustancia que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula química 9]
que representa 1-(5-((1R, 2S, 3R)-1,2,3,4-tetrahidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona (véase, por ejemplo, Cayman Chemical Item Number 13222, Cayman Chemical Co., Michigan, EE.UU.).
En el caso de utilizar la composición farmacéutica que comprende un factor quimiotáctico de la presente invención para el tratamiento con el fin de regenerar tejidos, no existen limitaciones particulares en la vía de administración y se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con el propósito del tratamiento. Por ejemplo, aunque la composición farmacéutica de la presente invención puede ser cualquiera de una preparación inyectable, preparación oral, supositorio o inhalador y similares, en el caso de tener como objetivo acumular células Muse en un sitio dañado, es más preferible administrar el factor quimiotáctico de la composición farmacéutica de la presente invención directamente en el sitio dañado. Por otro lado, en el caso de modificar la composición farmacéutica de la presente invención para administrarla a un sitio dañado, la administración de la composición farmacéutica no se limita a la inyección directa en el sitio dañado, sino que la composición farmacéutica también se puede administrar por vía intravenosa. Además, la composición farmacéutica también puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, mediante administración intravenosa con el fin de iniciar la migración de las células Muse presentes en el tejido mesenquimatoso del cuerpo. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para estas formas de administración se pueden producir usando métodos de preparación conocidos.
En el caso de la preparación de una preparación inyectable, se puede producir una preparación inyectable local usando métodos ordinarios añadiendo un ajustador de pH, tampón, estabilizante, agente de tonicidad o anestésico local y similares al factor quimiotáctico. Los ejemplos de ajustadores del pH y tampones incluyen citrato sódico, acetato sódico y fosfato sódico. Los ejemplos de estabilizantes incluyen pirosulfito sódico, EDTA (edetato sódico), ácido tioglicólico y ácido tioláctico. Los ejemplos de anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína y clorhidrato de lidocaína. Los ejemplos de agentes de tonicidad incluyen cloruro sódico y glucosa.
Además, en el caso de inyectar directamente la composición farmacéutica o el factor quimiotáctico de la presente invención en un sitio dañado, se puede usar una hoja en la que la composición farmacéutica o el factor quimiotáctico de la presente invención esté contenido en un vehículo tal como un hidrogel biodegradable que contenga ingredientes de las preparaciones inyectables mencionadas anteriormente. Los ejemplos de hidrogel biodegradable que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, geles que contienen colágeno, fibronectina, gelatina o agarosa como componente principal del mismo. Asimismo, además de inyectarse directamente en un sitio dañado, la composición farmacéutica o el factor quimiotáctico de la presente invención puede recubrirse sobre el diámetro interno de una endoprótesis vascular usada con el propósito de vasodilatación cuando se ha producido un infarto y similares. Además, también se puede incorporar un componente (tal como un factor de crecimiento o una citocina) que mejore la viabilidad de las células Muse acumuladas con el fin de apoyar la regeneración de tejidos de las células Muse.
La concentración de factor quimiotáctico contenida en la composición farmacéutica de la presente invención puede ajustarse adecuadamente de acuerdo con el grado de lesión en el sitio dañado y el tipo de factor quimiotáctico. Aunque no existen limitaciones particulares al respecto, la concentración efectiva del factor quimiotáctico para guiar las células Muse es, por ejemplo, 1 nM a 100 pM. Además, en el caso de inyectar o administrar factor quimiotáctico en forma de composición farmacéutica, la cantidad inyectada o la cantidad administrada de la composición farmacéutica, la forma de administración, el número de administraciones y el intervalo de administración y similares se pueden seleccionar de forma adecuada teniendo en cuenta la concentración de factor quimiotáctico o el grado de lesión como se ha descrito previamente.
Aunque lo siguiente proporciona una explicación más detallada de la presente invención a través de ejemplos de la misma, la presente invención no está limitada en forma alguna a estos ejemplos.
[Ejemplos]
Ejemplo 1: Selección de sustancias candidatas al factor quimiotáctico mediante análisis proteómico
Se utilizó un método de análisis proteómico desarrollado por un grupo dirigido por el profesor Isobe de la Universidad Metropolitana de Tokio (véase Taoka, et al. (2004), ibid) se usó para seleccionar sustancias candidatas de factores quimiotácticos que guían a las células Muse a un sitio dañado. Este método es un método para identificar un gran
número de proteínas contenidas en una muestra mediante el análisis de una mezcla de péptidos compleja obtenida al digerir una mezcla de proteínas con proteasa, y también se denomina "método de escopeta". Un sistema automatizado para realizar este método está compuesto por un sistema LC integrado que combina una LC de intercambio iónico, separación de LC de fase inversa y sistema de desalinización, un espectrómetro de masas híbrido y un sistema de análisis de datos. El sistema de LC integrado se caracteriza en particular por la combinación de dos tipos de LC que tienen diferentes modos de separación (modo de intercambio iónico y modo de fase inversa), y dado que la resolución del sistema general se obtiene como el producto de la resolución de cada método de separación, se puede separar un número extremadamente grande de proteínas o péptidos. Después, una muestra biológica se separa a alta resolución en función de la masa y, mediante el uso de MS que proporciona datos de masa, se pueden identificar proteínas o péptidos buscando posteriormente en una base de datos que contenga información de secuencia. Por ejemplo, se pueden identificar de 2.000 a 3.000 tipos de péptidos derivados de aproximadamente 1.000 tipos de proteínas adquiriendo aproximadamente 10.000 a 15.000 espectros de MS/MS en una sola ronda de análisis a partir de una mezcla extremadamente compleja de péptidos obtenidos al digerir una célula cruda o un extracto de tejido con tripsina. En el presente ejemplo, el uso del sistema automatizado desarrollado por Isobe et al. como se ha descrito anteriormente, hizo posible identificar proteínas expresadas específicamente en células Muse en comparación con células no Muse.
Ejemplo 2: Identificación de factores quimiotácticos
(1) Preparación de células Muse humanas
La preparación de células Muse humanas se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la publicación internacional n.° WO 2011/007900. Más específicamente, se cultivaron células mesenquimatosas adhesivas a partir de aspirado de médula ósea humana seguido de permitir que las células proliferaran e introducir lentivirus-GFP en las células. Una población celular que contenía células Muse marcadas con GFP o células Muse se separó mediante FACS como células dobles positivas para GFP y SSEA-3. Además, las células no Muse constituían un grupo de células positivas para GFP de las células mesenquimatosas mencionadas anteriormente que es negativo para SSEA-3, y estas células se utilizaron como control. Posteriormente, las células se ajustaron a las concentraciones prescritas usando solución salina fisiológica tamponada con fosfato o caldo de cultivo y luego se usaron en el método de cámara de Boyden y la tecnología de análisis de cinética celular que se describe a continuación. Adicionalmente, en el caso de utilizar células obtenidas mediante el cultivo de células mesenquimatosas, tales como las células mesenquimatosas de la médula ósea, como población madre de células Muse, se ha determinado que todas las células positivas para SSEA-3 son células positivas para CD105 como se informa en Wakao, et al. (2011, ibid).
Se sugirió que uno de los candidatos a factor quimiotáctico obtenido en el Ejemplo 1 mencionado anteriormente en forma de receptor 2 de esfingosina-1-fosfato (S1PR2) tenía la posibilidad de expresarse específicamente en células Muse. Por lo tanto, cuando se intentó investigar la expresión del receptor para S1P en células Muse y células no Muse mediante análisis proteómico, se determinó que S1PR2 solo se expresaba en células Muse (datos no mostrados). Además, S1PR1 se expresó tanto en células Muse como en células no Muse (datos no mostrados). Asimismo, dado que se sabe que S1PR tiene cinco tipos que consisten en S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 y S1PR5 en función de las diferencias en los sitios de expresión, las secuencias de aminoácidos y las secuencias de bases de los mismos, se realizó una comparación de la presencia o ausencia de su expresión y las diferencias en los niveles de expresión de las mismas en células Muse mediante PCR en tiempo real (PCR cuantitativa) (Figura 1). En vista de los resultados anteriores, se sugirió que S1PR2 se expresaba específicamente en células Muse. Por lo tanto, se confirmó que la S1P que se une a S1PR2 es uno de los factores quimiotácticos específicos de las células Muse utilizando los sistemas experimentales que se describen a continuación.
(2) Método de la cámara de Boyden
El método de la cámara de Boyden se utilizó para medir cuantitativamente la migración de las células Muse inducida por el factor quimiotáctico. Se usó el kit de ensayo de migración celular de quimiotaxis QCM (ensayo de migración celular colorimétrica QCM de 24 pocillos), disponible en el mercado en Millipore Corp. para la cámara de Boyden. Esta cámara de Boyden contiene un inserto que tiene un filtro en la parte inferior de la misma que tiene microporos uniformes de 8 |jm en su interior. El caldo de cultivo que contiene células Muse o células que no son mus se añade encima del filtro en el inserto, se añade caldo de cultivo que contiene un factor quimiotáctico debajo del inserto y se cuenta el número de células que han pasado a través de los microporos del filtro después de incubar durante 18 horas (véase la Figura 2). El uso de este método hace posible identificar factores quimiotácticos para las células Muse probando cada uno de los factores quimiotácticos candidatos obtenidos en el Ejemplo 1.
Más específicamente, se sembraron en placas células Muse o células no Muse a una concentración de 1 x 105 células/pocillo en el filtro y un caldo de cultivo que contenía una concentración prescrita de S1P (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1.000 nM o 5.000 nM) debajo del inserto. Después de incubar las células durante 18 horas, se contó el número de células que pasaron a través de los microporos del filtro. Los resultados se muestran en la figura 3. En el gráfico, las diferentes concentraciones de S1P se representan en el eje horizontal, mientras que los valores relativos del número de células para cada concentración basados en un valor de 1 para el número de células Muse que migraron a una concentración de S1P de 0 jm se representan en el eje vertical. Como está claro a partir de la figura 3, en el
sistema en el que se añadieron las células Muse, dado que el número de células que migraron aumentó dependiendo de la concentración de SIP, se sugirió que S1P funciona como un factor quimiotáctico con respecto a las células Muse. Por otro lado, dado que las células que no son Muse no demostraron actividad quimiotáctica con respecto a S1P en ninguna concentración, se sugirió que S1P es un factor quimiotáctico específico para las células Muse.
(3) Tecnología de análisis de cinética celular (tecnología TAXIScan)
La tecnología de análisis de cinética celular es una tecnología para analizar la actividad quimiotáctica celular desarrollada por ECI Inc. (véase Nitta, et al., Journal of Immunological Methods, 320, 155-163 (2007)). En un aparato que utiliza este método analítico, se usa un sistema que permite la medición de la actividad quimiotáctica de células dependientes del gradiente de concentración en dirección horizontal formando un gradiente de concentración constante de un factor quimiotáctico usando un chip de oblea de silicio fabricado usando tecnología de microfabricación más reciente (Figura 4). La directividad (tal como el grado en que las células Muse avanzan hacia el lado de alta concentración de un factor quimiotáctico en una determinada dirección) se puede cuantificar analizando los resultados obtenidos con este sistema en forma de imágenes (figura 5).
Más específicamente, se añadieron células Muse a una de las hendiduras que tenían un diámetro de aproximadamente 1 mm en una cámara sobre el chip a una densidad arbitraria, mientras que el factor quimiotáctico en forma de S1P se añadió desde la otra hendidura. La fotografía de lapso de tiempo se inició después de la adición de las células y S1P y se realizaron observaciones durante aproximadamente 14 horas. La actividad quimiotáctica celular se evaluó midiendo la distancia que cada una de las células migró en la dirección de la longitud sobre una terraza provista en el chip de oblea de silicio que tiene una estructura que mide 1200 pm de anchura, 250 pm de longitud y aproximadamente 8 pm de profundidad. Adicionalmente, se utilizó como control un sistema al que no se añadió S1P. El gráfico en el lado izquierdo de la figura 6 muestra los resultados de observar la actividad quimiotáctica de las células Muse (A a N) en tiempo real en el caso de haber añadido S1P a una concentración de 2 pM. El gráfico en el lado derecho de la figura 6 muestra los resultados de observar el movimiento de las células Muse en el caso de no haber añadido S1P. En el sistema en el que se añadió S1P, se determinó que las células Muse (A a N) pasaban linealmente a través de la terraza mientras seguían el gradiente de concentración de S1P. Además, aunque algunas células no pudieron pasar a través de la terraza, se piensa que esto se debe principalmente a la presencia de columnas proporcionadas en la terraza que han obstruido la migración de células (lado derecho de la figura 6). Por otro lado, en el sistema en el que no se añadió S1P, se observó que las células Muse (a a j) solo se extendían de forma aleatoria (lado izquierdo de la figura 6). Sobre la base de los resultados anteriores, se sugirió firmemente que S1P era un factor quimiotáctico específico para las células Muse de la misma manera que en el caso de haber evaluado la actividad quimiotáctica utilizando una cámara de Boyden.
Además, la actividad quimiotáctica de las células Muse se observó en tiempo real de la misma manera que se ha descrito anteriormente usando un agonista de S1PR2 en forma de 1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3 -il)-2-oxoetil)-5-(trifluorometil)piridin-2(1H)-ona en lugar de S1P (datos no mostrados). En un sistema en el que se añadió este agonista (2 pM), se observó un estado en el que las células Muse pasaban linealmente a través de la terraza mientras seguían el gradiente de concentración del agonista. Sobre la base de los resultados anteriores, se confirmó que este agonista demostraba actividad quimiotáctica con respecto a las células Muse.
(4) Acumulación de células Muse por factor quimiotáctico in vivo
Si las células Muse se acumulan o no por un factor quimiotáctico en el cuerpo se determinó de la manera descrita a continuación usando ratones para el modelo experimental (véase la figura 7). Los ratones utilizados fueron ratones SCID inmunodeficientes que no rechazan células humanas (machos, 7 semanas de edad) compradas a Japan SLC, Inc. o Charles River Laboratories Japan, Inc. Se utilizó S1P para el factor quimiotáctico. Se trasplantó hidrogel biodegradable (MedGel™) que medía 0,5 cm x 0,5 cm impregnado preliminarmente con una solución de S1P (500 nM o 1.000 nM) a un sitio arbitrario en el lomo de los ratones. Posteriormente, se inyectaron células Muse humanas marcadas con GFP preparadas en el Ejemplo 1 en la vena de la cola de los ratones. Dos días después, el tejido en las proximidades del hidrogel se eliminó del sitio trasplantado, el marcador de GFP se detectó usando el anticuerpo de GFP y el número de células Muse positivas para GFP se contó con un microscopio de barrido láser.
Más específicamente, el hidrogel eliminado se tiñó de acuerdo con las técnicas histoquímicas usadas habitualmente utilizadas utilizando anticuerpo anti-GFP para GFP (Alexa 568, adquirido de Invitrogen). Las imágenes teñidas se muestran en la figura 8. Las porciones indicadas por flechas indican células Muse positivas para GFP. Cuando se hace una comparación entre el caso de una concentración de S1P de 500 nM (lado izquierdo de la figura 8) y el caso de una concentración de S1P de 1.000 nM (lado derecho de la figura 8), se puede ver que el número de células Muse aumenta dependiendo de la concentración de S1P. En los dibujos, las imágenes del lado superior derecho aumentadas son imágenes aumentadas de las porciones enmarcadas en el centro. Además, los resultados del recuento del número de células basándose en cada una de las imágenes resultantes se muestran en la figura 9. Sobre la base de estos resultados también, se determinó que las células Muse se acumulaban dependiendo de la concentración de S1P.
Aplicabilidad industrial
La composición farmacéutica de la presente invención es capaz de proporcionar una nueva aplicación médica utilizada con el propósito de la regeneración de tejidos eficaz en medicina regenerativa utilizando células Muse al permitir que las células Muse se acumulen en un sitio dañado.
Claims (8)
1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la regeneración de tejidos, que comprende: un compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato de las células madre pluripotenciales como principio activo del mismo, en donde las células madre pluripotenciales son positivas para SSEA3 y positivas para CD105 y además tienen todas las siguientes propiedades:
(i) actividad de telomerasa baja o ausente;
(ii) capacidad para diferenciarse en células de cualquiera de las tres capas germinales;
(iii) ausencia de demostración de proliferación neoplásica; y
(iv) presencia de capacidad de autorrenovación.
2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto que activa el receptor 2 de esfingosina-1-fosfato es un agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato.
3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato es esfingosina-1-fosfato.
4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor 2 de esfingosina-1-fosfato se selecciona del grupo que consiste en
1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-5-(trifluorometil)piridin-2(1H)-ona,
1-(2-(l-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)pirrolidin-2,5-diona,
1-(2-(l-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil)-3-metilimidazolindin-2,4,5-triona,
1-(l-bencil-2,5-dimetiMH-pirrol-3-il)-2-((1-metiMH-tetrazol-5-il)tio)etanona y
(S)-1-(2-(1-bencil-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-il)-2-oxoetil-2',3'-dihidroespiro[imidazolidin-4,1'-indeno]-2,5-diona.
5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el compuesto guía las células madre pluripotenciales hacia un sitio dañado en el cuerpo.
6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD117 y negativas para CD146.
7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD117, negativas para CD146, negativas para NG2, negativas para CD34, negativas para vWF y negativas para CD271.
8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las células madre pluripotenciales son negativas para CD34, negativas par aCD117, negativas para CD146, negativas para CD271, negativas para NG2, negativas para vWF, negativas para Sox10, negativas para Snail, negativas para Slug, negativas para Tyrp1 y negativas para Dct.
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