KR20150125673A

KR20150125673A - 다능성 줄기세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 포함하는 의약조성물

Info

Publication number: KR20150125673A
Application number: KR1020157025190A
Authority: KR
Inventors: 마리 데자와; 요시노리 후지요시; 마사노리 요시다
Original assignee: 가부시키가이샤 클리오; 도호쿠 다이가쿠; 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2015-11-09
Also published as: KR102180319B1; JPWO2014133170A1; JP2018111734A; US20160354393A1; ES2877555T3; AU2014221659A1; AU2014221659B2; EP2962698A4; CN105188754B; US20160008340A1; WO2014133170A1; CA2903415A1; EP2962698A1; SG11201506845XA; CN105188754A; US10034889B2; CA2903415C; US20170304326A1; EP2962698B1; SG10201710901RA

Abstract

본 발명은 새로운 의료용도로서 유용한 다능성 줄기세포(Muse세포)를 손상부위로 유도하는 유주인자를 동정하는 동시에, Muse세포를 이용한 재생의료에 있어서, 조직 재생을 촉진하기 위한 유주인자를 포함하는 의약조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 비Muse세포와 비교하여 Muse세포에 특이적으로 발현하고 있는 수용체를 특정하고, 그 수용체에 대한 리간드가 유주인자로서 작용할 수 있는 것을 확인하였다. 본 발명에서는, 스핑고신-1-인산(S1P)이 유주인자인 것을 동정하고, 따라서 본 발명은 S1P를 유효성분으로서 포함하는 다능성 줄기세포를 손상부위로 유도하기 위한 의약조성물에 관한 것이다.

Description

다능성 줄기세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 포함하는 의약조성물{Pharmaceutical Composition Including Migratory Factor for Guiding Pluripotent Stem Cells to Injury}

본 발명은 다능성 줄기세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 포함하는 의약조성물에 관한 것이다.

최근, 조직재생에 공헌할 수 있는 생체 유래의 세포가 계속하여 주목되고 있다. 성체로부터 얻어지는 분화능을 가지는 세포로서, 예를 들어, 뼈, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로의 분화능을 가지는 골수간엽계 세포분획(MSC)(비특허문헌 1 및 2)이 알려져 있는데, 이것은 다양한 세포를 포함하는 세포군으로, 그 분화능을 담당하는 세포의 실체를 알 수 없어, 치료효과에 편차가 컸다. 또한, 성체 유래의 다능성 줄기세포로서 iPS세포(특허문헌 1)가 보고되어 있는데, iPS세포의 수립에는 간엽계 세포인 피부선유아 세포분획 등에 특정한 유전자나 특정한 화합물을 체세포에 도입한다고 하는 매우 복잡한 조작을 필요로 함과 더불어, iPS세포가 높은 종양형성능력을 가지는 것으로부터, 임상응용으로의 매우 높은 장애물이 존재하고 있다.

본 발명자들 중 한 사람인 데자와씨의 연구에 의하여, 간엽계세포분획에 존재하고, 유도조작 없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 다능성 줄기세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse세포)가 간엽계 세포분획을 가지는 다능성을 담당하고 있고, 조직재생을 목표로 한 질환치료에 응용할 수 있는 가능성이 있다는 것을 알게 되었다(특허문헌 2; 비특허문헌 3; 비특허문헌 4). 또한, 다능성 줄기세포(Muse세포)는 생체 내의 간엽계 조직에 존재하고, 생체조직에 손상이 생기면, 그 부위에 집적하여, 조직재생을 담당하는 것을 알게 되었다(특허문헌 2; 비특허문헌 3). 하지만, Muse세포가 손상된 조직으로 유도되는 메커니즘은 해명되어 있지 않을 뿐만 아니라, Muse세포를 손상부위로 유도하는 유주인자도 동정되어 있지 않다.

선행기술문헌

(특허문헌)

특허문헌 1: 일본특허공보 제4183742호

특허문헌 2: 국제공개공보 WO2011/007900호

(비특허문헌)

비특허문헌 1: Dezawa,M., et al., J.Clin. Invest., Vol.113, p.1701-1710(2004).

비특허문헌 2: Dezawa,M., et al., Science, Vol.309, p.314-317(2005).

비특허문헌 3: Kuroda,Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.107, p.8639-8643(2010).

비특허문헌 4: Wakao, S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.108, p.9875-9880(2011)

본 발명은 재생의료에 있어서, 다능성 줄기세포(Muse세포)를 이용한 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 하고, Muse세포의 유주능활성을 항진하여, 손상부위에 Muse세포를 효율적으로 집적시키기 위한 유주인자를 동정하는 동시에, 유주인자를 포함하는 의료조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 프로테옴 해석을 구사함으로써, Muse세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 동정하는 것에 성공하여서, 유주인자를 하나로서 스핑고신-1-인산(S1P)이 Muse세포의 유주능활성을 항진하고, 손상부위로의 집적에 관여하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 유주능활성을 항진한다는 것은, 간엽계조직 내에 존재하는 Muse세포의 손상부위로의 유주를 개시시키는 것을 포함한다.

즉, 본 발명은 다음과 같다.

[1] 스핑고신-1-인산 수용체(2)를 활성화하는 화합물을 유효성분으로서 포함하는 다능성 줄기세포의 유주를 활성화하기 위한 의약조성물.

[2] 스핑고신-1-인산 수용체(2)를 활성화하는 화합물이, 스핑고신-1-인산 수용체(2)의 아고니스트인 상기 [1]에 기재된 의약조성물.

[3] 스핑고신-1-인산 수용체(2)의 아고니스트가, 스핑고신-1-인산 또는 그 유도체인 상기 [2]에 기재된 의약조성물.

[4] 스핑고신-1-인산 수용체(2)의 아고니스트가, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2(1H)-온, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)피롤리딘-2,5-디온, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-3-메틸이미다졸리딘-2,4,5-트리온, 1-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-((1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오)에타논, 및 (S)-1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-2',3'-디하이드로스피로[이미다졸리딘-4,1'-인덴]-2,5-디온으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 상기 [2]에 기재된 의약조성물.

[5] 스핑고신-1-인산 수용체(2)를 활성화하는 화합물이, 스핑고신-1-인산 리아제 저해제인 상기 [1]에 기재된 의약조성물.

[6] 스핑고신-1-인산 리아제 저해제가, (E)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라하이드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논옥심, (1R,2S,3R)-1-(2-(이소옥사졸-3-일)-1H-이미다졸-4-일)부탄-1,2,3,4-테트라올, 및 1-(5-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라하이드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 상기 [5]에 기재된 의약조성물.

[7] 유주의 활성화가 생체의 손상부위로의 유도인 상기 [1] 내지 [6]에 기재된 의약조성물.

[8] 상기 다능성 줄기세포가 SSEA3 양성인 상기 [1] 내지 [7]에 기재된 의약조성물.

[9] 상기 다능성 줄기세포가 CD105 양성인 상기 [1] 내지 [8]에 기재된 의약조성물.

[10] 상기 다능성 줄기세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 상기 [1] 내지 [9]에 기재된 의약조성물.

[11] 상기 다능성 줄기세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 한 항에 기재된 의약조성물.

[12] 상기 다능성 줄기세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 상기 [1] 내지 [11]에 기재된 의약조성물.

[13] 상기 다능성 줄기세포가, 이하의 성질의 전부를 가지는 다능성 줄기세포인 상기 [1] 내지 [12]에 기재된 의약조성물:

(i) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 자기재생능력을 가짐.

본 발명에 따르면, Muse세포에 의한 조직재생에 있어서, Muse세포의 유주능활성을 항진하고, 손상부위로 Muse세포를 유도하는 유주인자를 포함하는 의약조성물이 제공된다.

도 1은 Muse세포에 있어서의 각종 스핑고신-1-인산 수용체(S1PR)의 발현량을 실시간 PCR(정량적 PCR)을 이용하여 NHDF(정상인 피부선유아세포)에서의 발현량을 기준으로 한 상대값으로 하여서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 Muse세포의 유주를 측정하기 위하여 사용한 보이덴 챔버와 유주인자에 의한 세포유주를 모식적으로 나타내는 도면이다. 보이덴 챔버는, 그 내부에 미세구멍 직경이 8㎛인 인서트를 가진다. 인서트의 상부에 Muse세포 또는 비Muse세포를 포함하는 배양액을 첨가하고, 인서트의 하부에 유주인자를 포함하는 배양액을 첨가하여, 18시간 후에 인서트를 통과한 세포수를 계산한다.
도 3은 보이덴 챔버를 이용하여 측정한 유주세포의 계산을 상대적으로 평가한 도면이다. 도면 중, 가로축은 유주인자가 다른 농도를 나타내고, 세로축은 유주인자(OnM)에 의하여 유주되는 Muse세포를 1로 한 경우의 상대값을 나타낸다.
도 4는 Muse세포의 유주를 측정하기 위하여 사용한 간이형 세포동태 해석장치(EZ-TAXIScan)의 개념도이다. 장치에는 2개의 슬릿이 있고, 각각에 세포 또는 유주인자를 첨가하며, 플레이트 상을 세포가 유주인자로 지향되는 모습을 화살표로 나타낸다.
도 5는 간이형 세포동태 해석장치를 이용하여 측정한 세포유주를 나타내는 사진이다. Muse세포는, 테라스라고 불리는 길이 250㎛, 깊이 8㎛의 구조를 빠져나가도록 하여, 유주인자의 농도 구배에 따라서 이동한다. 사진의 왼쪽은 스핑고신-1-인산(S1P)을 2μM 첨가한 경우이고, 사진의 오른쪽은 S1P를 첨가하지 않은 경우의 세포 이동을 나타낸다.
도 6은 S1P에 의한 Muse세포의 유주를 간이형 세포동태 해석장치에 의하여 해석한 결과를 나타낸다. 왼쪽 도면은, Muse세포가 S1P를 향하여 직선적으로 유주하는 모습을 실시간으로 측정한 결과를 나타낸다. 오른쪽 도면은 S1P를 포함하지 않은 경우에는, Muse세포가 임의로 확산되는 모습을 실시간으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 마우스를 이용한 유주인자에 의한 Muse세포의 유주시험 순서를 설명하는 도면이다. 사용한 마우스는, 사람세포를 거절하지 않는 면역부전의 SCID 마우스(7주령)이다. S1P용액을 흡수시킨 생분해성 하이드로겔을 마우스의 등에 이식하고, GFP 양성 사람 Muse세포를 미정맥 투여 후, 하이드로겔의 이식부위 주변의 조직을 채취하여, 그 부위에 Muse세포가 집적되었는지를 검증한다.
도 8은 하이드로겔에 흡수시킨 S1P용액의 농도를 500nM 및 1,000nM로 한 경우의 하이드로겔에 집적한 GFP 양성 사람 Muse세포의 집적을 나타내는 도면이다. GFP의 염색에는, 항GFP 항체(Alexa568)를 이용하였다. 이 결과는 Muse세포가 S1P용액의 농도에 의존하여 집적되는 것을 나타낸다.
도 9는 하이드로겔에 집적된 Muse세포를 1㎟당의 세포수로 하여 평가하였다. 도 8의 결과와 마찬가지로, Muse세포는 S1P농도에 의존하여 집적되었다.

본 발명은 다능성 줄기세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 포함하는 조성물 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 다능성 줄기세포(Muse세포)

본 발명의 유주인자에 의하여 손상부위로 유도되는 다능성 줄기세포는, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가 사람 생체 내에 그 존재를 발견하고, '뮤즈(Multilineage-differentiating Stress Enduring)세포'라고 명명한 세포이다. Muse세포는, 골수액이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이 세포는, 다능성 줄기세포와 간엽계 줄기세포의 양쪽 성질을 가지는 세포이며, 예를 들어 각각의 세포표면마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블 양성으로서 동정된다. 따라서, Muse세포 또는 Muse세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있다. Muse세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공개공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계 세포를 배양하고, 그것을 Muse세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성세포의 전부가 CD105 양성세포인 것을 알고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 의약조성물에 있어서는, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 줄기세포로부터 Muse세포를 분리하는 경우에는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로 하여 Muse세포를 정제하여 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, SSEA-3을 항원마커로 하여, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 줄기세포(Muse세포) 또는 Muse세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성세포'로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse세포'란, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성세포' 이외의 세포를 가리킨다.

간단하게는, Muse세포 또는 Muse세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하거나, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하여, 생체조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는 수정란이나 포배기보다 발생단계가 이전인 배자는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배자는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 사람, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 대상이 되는 Muse세포는, 생체의 조직유래인 점에서, 배성줄기세포(ES세포)나 배성생식 줄기세포(EG세포)로 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계조직'이란, 뼈, 골막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 결합조직을 말한다. 예를 들어, Muse세포는, 골수나 피부로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse세포를 분리하여, 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 배양간엽계 세포로부터 Muse세포를 분리하여도 좋다.

상기와 같이, Muse세포 또는 Muse세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어, SSEA-3 양성 또는 SSEA-3 양성과 CD105 양성의 이중양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 성인 사람의 피부에는, 다양한 형태의 줄기세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse세포는, 이들의 세포와 같지 않다. 이와 같은 줄기세포 및 전구세포에는, 피부유래 전구세포(SKP), 신경제 줄기세포(NCSC), 멜라노 블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방유래 줄기세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유마커의 '비발현'을 지표로 하여, Muse세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌 블라스트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 대상이 되는 상기 특징을 가지는 Muse세포는, 이하:

(i) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 자기재생능력을 가짐

으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 한 국면에서는, 본 발명에 있어서 대상이 되는 Muse세포는, 상기 성질을 모두 가진다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머라아제 활성을 검출한 경우, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머라아제 활성이 '낮음'이란, 예를 들어 체세포인 사람선유아세포와 같은 정도의 텔로머라아제 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소(精巢)에 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)로 유주 및 생착하여, 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse세포는 부유배양에서는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 10일간 정도에서 증식이 멈춘다고 하는 성질을 가지며, 더욱이 정소에 이식한 경우, 적어도 반년간은 암화되지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse세포는, 자기재생(자기복제)능력을 가진다. 여기에서, '자기재생'이란, 1개의 Muse세포를 부유배양함으로써 얻어지는 배양체 양세포 덩어리에 포함되는 세포를 배양하고, 다시 배양체 양세포 덩어리를 형성하도록 하는 것을 말한다. 자기재생은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 좋다.

2. Muse세포에 특이적으로 발현하고 있는 단백질의 동정

이제까지, Muse세포는 생체에 투여되면 손상부위로 호밍(homing)하고, 한편 비Muse세포는 손상부위로 호밍하지 않는 것이 알려져 있는데, Muse세포를 손상부위로 유도하는 유주인자는 알려져 있지 않다. 그래서, 손상부위로 Muse세포를 유도하는 유주인자가 존재한다고 가정한 경우, 최초로 Muse세포에 특이적으로 발현하고 있지만, 비Muse세포에는 발현하고 있지 않은 단백질(특히, 수용체)을 특정함으로써, 그에 대한 리간드 등이 유주인자일 가능성이 높다고 생각된다.

일반적으로, 미지의 인자를 동정하기 위한 수법으로는, 프로테옴 해석이 유용하다는 것이 알려져 있다. 이 해석은, 세포 또는 조직으로부터 유출한 단백질의 생화학적 및 물리화학적 특성을 분석하고, 게놈 해석에 의하여 명확하게 된 유전자 정보를 이용하여, 상기 단백질과 그것을 코드하는 유전자와의 대응을 명확하게 하는 것, 더욱이 게놈 배열정보를 이용하면서, 모든 유전자의 번역산물에 대하여 기능을 해명해가는 것을 목적으로 하는 연구를 위한 해석수법이다.

프로테옴 해석에 있어서, 현재 잘 사용되고 있는 수법으로는, 펩티드 매스 핑거프린팅(peptide mass-finger printing: PMF)법을 들 수 있다. PMF법에서는, 2차원 전기영동 등에 의하여 단백질을 분리하고, 그 단백질을 트립신 등의 소화효소로 펩티드로 소화 후, 펩티드 혼합물의 질량 스펙트럼(펩티드 매스 핑거프린트)을 질량분석장치를 이용하여 취득하고, 이것과 게놈 데이터 베이스로부터의 DNA의 염기배열에 대응하는 아미노산 배열로부터 계산되는 이론적인 질량 스펙트럼을 검색함으로써, 단백질 및 그 단백질을 코드하는 유전자를 동정할 수 있다.

본 발명에 따르면, Muse세포의 유주인자에 대한 리셉터를 동정하는 것을 목적으로 하여, 수도대학도쿄의 이소베 도시아키 교수 등의 그룹에 의하여 개발된 프로테옴 해석을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 비교할 2개의 세포그룹(Muse세포 그룹과 비Muse세포 그룹)으로부터 단백질(혼합물)을 추출하고, 이들의 혼합물을 분자량의 차이에 근거하여 전기영동함으로써 분리한다. 분리된 단백질은, 겔 상에서는 각 밴드로서 식별된다. 다음으로, 겔로부터 잘려진 밴드의 각각을 LC-MS 분석에 의하여 질량을 측정한다. 더욱이, 이들의 질량값을 이용하여, 데이터베이스 상으로부터 단백질을 자동검색하여 골라내고, 2개의 세포그룹 사이에 있어서 다른 단백질을 동정할 수 있다(예를 들어, 다오카 마사토 등, '결정판!프로테옴 해석 매뉴얼'(이소베 도시아키, 다카하시 노부히로 편집) pp.92-100, 요도사, 2004를 참조). 한편, 상기 데이터베이스는, 한정되지 않지만, 이미 공개되어 있는 단백질 데이터베이스인 'SwissProt'을 사용할 수 있다. 본 발명자들은, 상기 프로테옴 해석을 이용함으로써, 비Muse세포와 비교하여, Muse세포에 특이적으로 발현되고 있는 단백질을 특정하였다(데이터 미개시). 후술하는 바와 같이, 이들의 특정된 단백질 중, 예를 들어 스핑고신-1-인산 수용체2(단순히, 'S1PR2'라고 기재하는 경우가 있음)는, Muse세포에 있어서 특이적으로 발현하고 있는데, 비Muse세포에 있어서는 발현하고 있지 않은 단백질인 것을 알 수 있었다(실시예 2).

3. 유주인자의 동정 및 확인

상기에서 동정된 Muse세포에 특이적으로 발현하고 있는 단백질 중, 예를 들어 유주인자의 수용체가 될 수 있는 것을 선택하고, 이들의 수용체에 대한 리간드가 유주인가가 될 수 있는지 어떤지를 검토함으로써, Muse세포의 유주인자를 특정할 수 있다. 일반적으로, 세포의 유주를 측정하는 방법으로는, 한정되지 않지만, in vitro의 실험계에서는 보이덴 챔버법, 세포동태 해석기술 등을 이용할 수 있다. 간단하게는, 보이덴 챔버법은, 세포 주화성(走化性)을 정량하는 유효한 방법이고, 보이덴 챔버 내에 별개의 구획으로서 인서트가 있으며, 이 인서트의 바닥면은 균일한 크기(예를 들어, 약 8㎛)의 미세구멍을 다수개 가지는 필터가 장착되어 있다. 그 필터 상에 세포를 포함하는 세포배양액을 첨가하고, 인서트의 하부에 유주인자를 포함하는 배양액을 첨가함으로써, 필터의 미세구멍에 발생하는 유주인자의 농도 구배를 따라서 세포가 필터를 빠져나가서 아래쪽으로 이동하는 것을 이용한 것이다(도 2)(예를 들어, Boyden, S., J. Exp. Med., Vol. 115, p.453-466(1962)을 참조). 이와 같이, 필터를 통과한 세포수를 계산함으로써 주화성의 정도를 정량적으로 측정할 수 있다. 본 발명에서는, 유주인자의 후보물질을 인서트의 하측에 첨가하고, 상측에 Muse세포를 첨가한 후, Muse세포의 이동도를 계산함으로써, 첨가한 후보물질이 유주인자로서 작용할 수 있는지를 평가할 수 있다.

한편, 세포동태 해석기술이란, ECI사가 개발한 세포유주능 해석법이고(Nitta, et al., Journal of Immunological method; 320, 155-163(2007)을 참조), 최신의 미세가공기술을 구사하여 작성한 실리콘 웨이퍼칩을 이용하여, 유리기판 상에서 일정한 주화성 인자의 농도 구배를 형성시키고, 그 구배 의존적인 세포의 수평방향으로의 유주성을 측정할 수 있는 시스템이다. 이러한 시스템을 이용하여 얻어진 화상을 실시간으로 해석함으로써, 방향성(예를 들어, Muse세포가 유주인자의 고농도측에 대하여 얼마만큼 방향적으로 진행하였는지)을 정량화할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 후보물질의 하나로서 스핑고신-1-인산(S1P)을 이용한 경우, 보이덴 챔버법 및 세포동태 해석기술을 이용한 어떤 실험계에서도 Muse세포의 유주성이 현저하게 관찰되었다(실시예 2).

또한, in vivo의 실험계에서는, 예를 들어 마우스를 실험모델로 한 계를 이용하여 유주인자를 동정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 사람세포를 거절하지 않는 면역부전 마우스의 조직 내에 유주인자를 흡수시킨 겔(예를 들어, 하이드로겔)을 이식하고, 그 후, 미정맥으로부터 GFP표식된 사람 Muse세포를 투여함으로써, 이 Muse세포가 이식된 유주인자를 포함하는 겔에 집적할 수 있는지 어떤지를 조직화학적으로 관찰함으로써 유주인자를 특정할 수 있다. 후술하는 실시예 2에 나타내는 바와 같이, GFP 양성 Muse세포가 S1P 농도에 의존하여 집적되는 것을 알 수 있었다.

4. 유주인자의 이용

본 발명은, Muse세포의 유주능 활성을 항진하고, Muse세포를 손상부위로 유도하는 유주인자를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물을 제공한다. 본 발명의 의약조성물에 사용되는 '유주인자'란, 예를 들어 Muse세포의 세포표면 상에 발현하고 있는 수용체에 결합하고, 그 결합을 통하여, 세포의 유주에 관여하는 시그널 전달계가 활성된 결과, 세포를 유주인자에 지향되어 유주시키는 물질을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 사용할 때, 용어 '손상부위'란, 생체 내에서의 각종 장기, 기관, 및 조직에 있어서, 외상, 염증, 질환, 허혈, 괴사, 종양형성, 또는 가령(加齡) 등을 원인으로 한 각종 세포 및 조직과의 변성 또는 탈락에 의하여 잃게 된 특정 부위를 의미한다. 본 발명에 따르면, Muse세포를 손상부위에 집적시키기 위하여는, 유주인자를 의약으로서 허용되는 담체, 및/또는 희석제를 배합한 의약조성물로서 사용하여도 좋고, 또는 유주인자를 단독으로 사용하여도 좋다. 여기에서, 본 발명의 의약조성물에 함유하는 유주인자로서는, Muse세포를 손상부위에 유도하는 능력을 가지는 물질(예를 들어, 단백질, 펩티드, 지질, 화합물 등)이라면 특별히 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 유주인자는, 스핑고신-1-인산(S1P), 스핑고신-1-인산 유도체, 및 스핑고신-1-인산 수용체의 아고니스트이다. 여기에서, '스핑고신-1-인산(S1P)'이란, 하기 식:

[화학식 1]

을 가지는, 세포막을 구성하는 스핑고 지질의 대사산물이다. S1P는, 어느 종류의 효소에 의하여 세포막으로부터 잘라져서 유리된 후, 세포막 상에 발현하고 있는 G단백질 공액수용체에 결합함으로써, 세포 유주 등을 일으키는 생리활성물질로서도 알려져 있다. 또한, S1P에 대한 수용체로는, G단백질 공액수용체인 S1P수용체가 알려져 있고, 이제까지 S1PR1~S1PR5의 5종류가 존재하는 것을 알 수 있다. 여기에서, Muse세포 및 비Muse세포에서의 S1P수용체의 발현을 조사해 보면, S1PR1은, 양 세포에 발현하고 있지만, S1PR2는 Muse세포에 발현하고 있는 것이 본 발명자들에 의하여 밝혀졌다(데이터 미개시).

본 발명에 따르면, 본 발명의 의약조성물에 사용되는 유주인자로는, Muse세포의 유주성을 높이는 물질이라면 S1P로 한정되지 않으며, 그 S1P 유도체도 사용 가능하다. S1P 유도체로는, 특별히 한정되지 않지만, 스핑고실코린, 갈락토실스핑고신(사이코신), 글루코실스핑고신(글루코사이코신), 술포갈락토실스핑고신(리조술퍼티드), N,N-디메틸스핑고신1-인산, N,N,N-트리메틸스핑고신1-인산, 세라미드1-인산, 디히드로스핑고신1-인산, 피트스핑고신1-인산, 및 디하이드로피트스핑고신1-인산, 그리고 그들의 염을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 본 발명의 의약조성물에 사용되는 유주인자로서, S1PR2에 대한 아고니스트를 이용할 수 있다. 이러한 아고니스트로는, 하기의 구조:

[화학식 2]

을 가지는 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2(1H)-온(예를 들어, Park,S.W., et al., J.Am. Soc. Nephrol., 23, p.266-80(2012)을 참조), 하기의 구조:

[화학식 3]

을 가지는 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)피롤리딘-2,5-디온, 하기의 구조:

[화학식 4]

을 가지는 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-3-메틸이미다졸리딘-2,4,5-트리온, 하기의 구조:

[화학식 5]

을 가지는 1-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-((1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오)에타논, 및 하기의 구조:

[화학식 6]

을 가지는 (S)-1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-2',3'-디히드로스피로[이미다졸리딘-4,1'-인덴]-2,5-디온 등을 들 수 있다.

또한, S1P는 생체 내에서 소포체에 존재하는 스핑고신-1-인산 리아제에 의하여 탈인산화되고, trans-2-헥사데세날과 에탄올아민인산으로 분해되는데, 통상적으로 이러한 탈인산화 반응과, trans-2-헥사데세날에 인산을 부가하는 반응은 평형 상태에 있는 것이 알려져 있다. 그래서, S1P의 농도를 높이기 위하여는, 탈인산화 반응을 담당하는 S1P 리아제를 저해하는 물질도 또한 본 발명의 의약조성물에 사용할 수 있다. 이와 같은 S1P 리아제를 저해하는 물질로서는, 하기의 구조:

[화학식 7]

을 가지는 (E)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라히드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논옥심(예를 들어, Bagdanoff, J. T., et al., J. Med. Chem., Vol.53, p.8650-8662(2010)를 참조);

[화학식 8]

구조:

을 가지는 (1R,2S,3R)-1-(2-(이소옥사졸-3-일)-1H-이미다졸-4-일)부탄-1,2,3,4-테트라올(Bagdanoff 등, 상술); 및

[화학식 9]

구조:

을 가지는 1-(5-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라히드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논(예를 들어, Cayman Chemical Item Number 13222 Cayman Chemical Com., Michigan, USA) 등을 들 수 있다.

본 발명의 유주인자를 포함하는 의약조성물을 조직재생을 목적으로 한 치료에 이용하는 경우, 투여경로는, 특별히 한정되지 않지만, 치료목적에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제, 경구제, 좌제, 흡입제 등 중 어느 것이어도 좋은데, Muse세포를 손상부위에 집적시키는 것을 목적으로 한 경우, 본 발명의 유주인자 또는 의약조성물을 손상부위에 직접 투여하는 것이 보다 바람직하다. 한편, 본 발명의 의약조성물이 손상부위에 송달되도록 수식 등이 되어 있는 경우에는, 손상부위에 직접 주입하는 것에 한정되지 않으며, 의약조성물을 정맥투여하는 것도 가능하다. 또한, 생체 내의 간엽계 조직에 존재하는 Muse세포의 유주를 개시시키는 목적으로 정맥투여 등 전신성으로 투여하는 것도 가능하다. 한편, 이들 투여 형태에 적합한 의약조성물은, 공지의 제제방법을 이용함으로써 제조할 수 있다.

주사제를 조제하는 경우에는, 유주인자에 pH조정제, 완충제, 안정화제, 등장화제, 국소마취제 등을 첨가하고, 통상법을 이용하여 국소용 주사제를 제조할 수 있다. pH조정제 및 완충제로는, 예를 들어, 구연산나트륨, 초산나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 피로아황산나트륨, EDTA(에데트산나트륨), 티오글리콜산, 티오유산 등을 들 수 있다. 국소마취제로는, 예를 들어 염산프로카인, 염산리도카인 등을 들 수 있다. 등장화제로는, 예를 들어 염화나트륨, 포도당 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 의약조성물 또는 유주인자를 손상부위에 직접 주입하는 경우, 상기 주사제의 성분을 포함하는 생분해성 하이드로겔 등의 담체에 본 발명의 의약조성물 또는 유주인자를 포함시킨 시트를 이용하여도 좋다. 사용 가능한 생분해성 하이드로겔로는, 한정되지 않지만, 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 아가로스 등을 주성분으로 하는 겔을 들 수 있다. 그리고, 손상부위로의 직접 주입뿐만 아니라, 경색 등이 일어났을 때에는 혈관확장을 하기 위한 스텐트의 내경에 본 발명의 의약조성물 또는 유주인자를 도포할 수도 있다. 또한, Muse세포에 의한 조직재생을 지원하는 것을 목적으로서, 집적된 Muse세포의 생존성을 높이는 성분(예를 들어, 증식인자, 사이토카인)을 혼입하여도 좋다.

본 발명의 의약조성물에 포함시키는 유주인자의 농도는, 손상부위에서의 손상의 정도, 유주인자의 종류에 따라서 적절히 변경할 수 있다. Muse세포를 유도시키기 위하여 유효한 유주인자의 농도는, 한정되지 않지만, 예를 들어 1nM~100μM이다. 또한, 의약조성물로서 유주인자를 주입 또는 투여하는 경우에는, 상기 유주인자의 농도 또는 손상의 정도를 고려하여, 의약조성물의 주입량 또는 투여량, 투여형태, 및 그 횟수, 기간 등을 적절히 결정할 수 있다.

이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 어떤 한정이 되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 프로테옴 해석에 의한 유주인자의 후보물질의 선출

Muse세포를 손상부위로 유도하는 유주인자의 후보물질을 선출하기 위하여, 수도대학도쿄의 이소베 교수 등의 그룹에 의하여 개발된 프로테옴 해석법을 사용하였다(다오카 등(2004), 상술 참조). 이 방법은, 단백질 혼합물의 프로테아제 소화에서 발생하는 복잡한 펩티드 혼합물을 분석함으로써, 원래의 시료에 포함되는 단백질을 다량으로 동정하는 방법으로, '쇼트건법'이라고도 불린다. 이 방법을 실시하기 위한 자동화 시스템은, 이온 교환 LC, 분리용 역상 LC, 및 탈염시스템을 연결한 복합형 LC시스템과, 하이브리드형 질량분석계, 데이터 해석 시스템으로 구성되어 있다. 복합형 LC시스템에서는, 특히 분리 양식이 다른 2종류의 LC(이온 교환계 및 역상계)를 조합하는 것을 특징으로 하며, 시스템 전체의 분리능은, 각각의 분리법이 가지는 분리능의 곱으로 얻어지므로, 매우 다수의 단백질 또는 펩티드를 분리할 수 있다. 다음으로, 생체시료를 질량에 의존하여 고해상도로 분리하고, 더욱이 질량정보를 주는 MS를 이용함으로써, 연이은 배열정보의 데이터베이스 검색에 의하여 단백질 또는 펩티드를 동정할 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 조직의 대략적인 추출액을 트립신 소화하여 얻어진 매우 복잡한 펩티드 혼합물로부터, 1회의 분석으로 약 10,000~15,000의 MS/MS스펙트럼을 취득하고, 대략 1,000종류의 단백질에 유래하는 2,000~3,000 종류의 펩티드를 동정할 수 있다. 본 실시예에 있어서는, 상기 이소베 등의 자동화 시스템을 이용함으로써, 비Muse세포와 비교하여, Muse세포에 특이적으로 발현하고 있는 단백질을 특정하였다.

실시예 2: 유주인자의 동정

(1) 사람Muse세포의 조제

사람Muse세포의 조제는, 국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿에 기재된 방법에 따라서 행하였다. 보다 구체적으로는, 사람골수액으로부터 접착성을 가지는 간엽계 세포를 배양하고, 증식을 거쳐, 렌티바이러스-GFP를 세포에 도입하였다. GFP로 표식된 Muse세포 또는 Muse세포를 포함하는 세포집단을 GFP와 SSEA-3의 이중 양성세포로 하여 FACS로 분리하였다. 또한, 비Muse세포는, 상기 간엽계 세포 중, SSEA-3 음성인 GFP 양성의 세포 그룹이고, 대조로서 사용하였다. 그 후, 인산 완충 생리식염수 또는 배양액을 이용하여, 소정 농도로 조정하고, 이하의 보이덴 챔버법 및 세포동태 해석기술에 사용하였다. 한편, 골수 간엽계 세포 등의 간엽계 세포를 배양하여 얻은 것을 Muse세포의 모집단으로서 이용하는 경우, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, SSEA-3 양성 세포는 모두 CD105 양성 세포인 것을 알 수 있다.

상기 실시예 1에서 얻어진 유주인자의 후보 중 하나인 스핑고신-1-인산 수용체2(S1PR2)는, Muse세포에 특이적으로 발현되어 있을 가능성이 시사되었다. 그래서, Muse세포 및 비Muse세포에서의 S1P에 대한 수용체의 발현을 프로테옴 해석으로 조사해 보면, S1PR2는 Muse세포에만 발현하고 있는 것을 알 수 있었다(데이터 미개시). 또한, S1PR1은, Muse세포 및 비Muse세포 모두에 발현하고 있었다(데이터 미개시). 더욱이, S1PR은, 그 발현부위, 아미노산 배열, 염기배열 등의 차이로부터 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, 및 S1PR5의 5종이 알려져 있으며, Muse세포에 있어서 이들의 발현의 유무 및 발현량의 차이를 실시간 PCR(정량적 PCR)에 의하여 비교하였다(도 1). 상기 결과를 고려하면, S1PR2가 Muse세포에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 것이 시사되었다. 그래서, 이하의 실험계를 이용하여, S1PR2에 결합하는 S1P가 Muse세포에 특이적인 유주인자 중 하나인 것을 확인하였다.

(2) 보이덴 챔버법

유주인자에 의한 Muse세포의 유주를 정량적으로 측정하기 위하여 보이덴 챔버법을 사용하였다. 사용한 보이덴 챔버는, Millipore로부터 시판되고 있는 QCM Chemotaxis Cell Migration Assay Kit(QCM 24 Well Colorimetric Cell Migration Assay)를 이용하였다. 이러한 보이덴 챔버는, 챔버 내부에 8㎛의 균일한 미세구멍을 가지는 필터를 바닥부에 가지는 인서트를 포함한다. 인서트의 필터 상부에 Muse세포 또는 비Muse세포를 포함하는 배양액을 첨가하고, 인서트의 하부에 유주인자를 포함하는 배양액을 첨가하여, 18시간 배양한 후, 필터의 미세구멍을 통과한 세포수를 계산한다(도 2를 참조). 이 방법을 이용하면, 실시예 1에서 얻어진 유주인자의 후보를 각각 시험함으로써, Muse세포에 대한 유주인자를 특정할 수 있다.

보다 구체적으로는, 필터 상에 Muse세포 또는 비Muse세포를 1×10⁵세포/웰(well)의 농도로 파종하고, 인서트의 하부에 S1P를 소정 농도(0, 100, 500, 1000, 5000nM)로 포함하는 배양액을 첨가하였다. 세포를 18시간 인큐베이트한 후, 필터의 미세구멍을 통과한 세포를 계산하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도면 중의 가로축은 S1P가 다른 농도를 나타내고, 세로축은 S1P(0nM)에 의하여 유주한 Muse세포를 1로 한 경우의 각 농도에 대한 세포수의 상대값을 나타낸다. 도 3으로부터 명확하듯이, Muse세포를 첨가한 계에서는, S1P의 농도에 의존하여, 유주된 세포수가 증대하고 있는 것으로부터, S1P는 Muse세포에 대하여 유주인자로서 기능하는 것이 시사되었다. 한편, 비Muse세포는, 어떤 농도의 S1P에 대하여도 유주성을 나타내지 않으므로, S1P는 Muse세포에 특이적인 유주인자인 것이 시사되었다.

(3) 세포동태 해석기술(TAXIScan 테크놀로지)

세포동태 해석기술은, ECI사가 개발한 세포유주능 해석법이다(Nitta, et al., Journal of Immunological method; 320, 155-163(2007)을 참조). 이 해석법에 사용되는 장치에서는, 최신의 미세가공기술을 구사하여 작성한 실리콘 웨이퍼칩을 이용하여, 일정한 주화성 인자의 농도 구배를 형성시키고, 그 구배 의존적인 세포의 수평방향으로의 유주활성측정이 가능한 시스템을 이용한다(도 4). 이 시스템으로부터 결과적으로 얻어지는 화상을 해석함으로써, 방향성(예를 들어, Muse세포가 유주인자 고농도측에 대하여 얼마만큼 방향적으로 진행하였는지)을 정량화할 수 있다(도 5).

보다 구체적으로는, 칩 상부의 챔버에 설치된 약 1mmφ의 구멍의 한쪽에 Muse세포를 임의의 세포 밀도로 첨가하고, 또 다른 한쪽의 슬릿으로부터는 유주인자로서 S1P(2μM)를 첨가하였다. 세포 및 S1P를 첨가한 후부터 타임플러스 촬영을 개시하고, 약 14시간 관찰하였다. 실리콘 웨이퍼칩에 설치된 폭 1200㎛, 테라스 길이 250㎛, 및 깊이 8㎛의 구조를 가지는 테라스를 각 세포가 그 길이방향으로 이동한 거리를 측정함으로써 세포의 유주성을 평가하였다. 한편, S1P를 첨가하지 않은 계를 대조로 하였다. 도 6의 왼쪽은, S1P를 2μM 첨가한 경우의 Muse세포(A~N)의 유주성을 실시간으로 관찰한 결과이다. 도 6의 오른쪽은, S1P를 첨가하지 않은 경우의 Muse세포의 움직임을 관찰한 결과를 나타낸다. S1P를 첨가한 계에서는, Muse세포(A~N)는, S1P의 농도 구배에 따라서 테라스를 직선적으로 통과하는 모습을 알 수 있다. 또한, 일부의 세포에서는, 테라스를 통과할 수 없었던 세포도 존재하는데, 이들은 테라스에 설치된 기둥에 의하여 유주를 저해된 것이 주요인으로 생각된다(도 6의 오른쪽). 한편, S1P를 첨가하지 않은 계에서는, Muse세포(a~j)는, 임의로 확산하는 것에 그쳤다(도 6의 왼쪽). 상기 결과로부터, 보이덴 챔버법을 이용하여 평가한 경우와 마찬가지로, S1P는 Muse세포에 특이적인 유주인자인 것이 강하게 시사되었다.

또한, S1P 대신에, S1PR2의 아고니스트인 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2(1H)-온을 이용하여, 상기와 마찬가지로 Muse세포의 유주성을 실시간으로 관찰하였다(데이터 미개시). 그 아고니스트(2μM)를 첨가한 계에서는, Muse세포는 그 아고니스트의 농도 구배에 따라서 테라스를 직선적으로 통과하는 모습을 알 수 있다. 상기 결과로부터 Muse세포에 대한 그 아고니스트의 유주활성이 확인되었다.

(4) in vivo에 있어서의 유주인자에 의한 Muse세포의 집적

마우스를 실험 모델로 하여, 생체 내에서 유주인자에 의하여 Muse세포가 집적되는지 어떤지를 이하와 같이 행하였다(도 7을 참조). 사용한 마우스는, 사람세포를 거절하지 않는 면역부전인 SCID 마우스(수컷, 7주령)를 일본SLC 주식회사 또는 일본찰스·리버 주식회사로부터 구입하였다. 유주인자로서 S1P를 이용하였다. 미리 S1P용액(500nM 또는 1,000nM)을 흡수시킨 크기 0.5㎝×0.5㎝의 생분해성 하이드로겔(MedGel(등록상표)제품)을 마우스 등의 임의 부위에 이식하였다. 그 후, 실시예 1에서 조제한 GFP표식된 사람Muse세포를 마우스의 미정맥으로부터 주입하였다. 2일 후, 이식한 부위로부터 하이드로겔 주변의 조직을 취출하고, GFP의 항체를 이용하여 GFP표식을 검출하여서, GFP 양성의 Muse세포를 레이저 현미경으로 셈하였다.

보다 구체적으로는, 취출된 하이드로겔을 GFP에 대한 항GFP 항체(Alexa568, Invitrogen으로부터 구입)를 이용하여, 일반적으로 사용되는 조직화학적 수법에 의하여 염색하였다. 염색도를 도 8로써 나타낸다. 화살표로 나타낸 부분은, GFP 양성 Muse세포를 나타낸다. S1P의 농도를 500nM으로 한 경우(도 8의 왼쪽)와, 1,000nM으로 한 경우(도 8의 오른쪽)를 비교하면, S1P의 농도에 의존하여, Muse세포의 수가 증가하고 있는 것을 알 수 있다. 도면 중, 오른쪽 위의 화상은, 중앙부의 사각으로 둘러싼 부분의 확대도이다. 또한, 각각 얻어진 화상에 근거하여 세포수를 계산한 결과를 도 9에 나타낸다. 이 결과로부터 Muse세포는 S1P의 농도에 의존하여 집적되는 것을 알 수 있었다.

산업상의 이용가능성

본 발명의 의약조성물은, 손상부위에 Muse세포를 집적시킬 수 있어, Muse세포를 이용한 재생의료에 있어서, 효율적인 조직재생을 목적으로 한 새로운 의료용도를 제공할 수 있다.

본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의하여 전체적으로 본 명세서 중에 원용된다. 한편, 예시를 목적으로 하여, 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에서 설명하였지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고, 다양한 변경이 이루어지는 경우가 있다는 것은, 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

Claims

스핑고신-1-인산 수용체2를 활성화하는 화합물을 유효성분으로서 포함하는 다능성 줄기세포의 유주를 활성화하기 위한 의약조성물.
제 1 항에 있어서,
스핑고신-1-인산 수용체2를 활성화하는 화합물이, 스핑고신-1-인산 수용체2의 아고니스트인 의약조성물.
제 2 항에 있어서,
스핑고신-1-인산 수용체2의 아고니스트가, 스핑고신-1-인산 또는 그 유도체인 의약조성물.
제 2 항에 있어서,
스핑고신-1-인산 수용체2의 아고니스트가, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-5-(트리플루오로메틸)필리딘-2(1H)-온, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)피롤리딘-2,5-디온, 1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-3-메틸이미다졸리딘-2,4,5-트리온, 1-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-((1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오)에타논, 및 (S)-1-(2-(1-벤질-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일)-2-옥소에틸)-2',3'-디히드로스피로[이미다졸리딘-4,1'-인덴]-2,5-디온으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 의약조성물.
제 1 항에 있어서,
스핑고신-1-인산 수용체2를 활성화하는 화합물이, 스핑고신-1-인산 리아제 저해제인 의약조성물.
제 5 항에 있어서,
스핑고신-1-인산 리아제 저해제가, (E)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라히드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논옥심, (1R,2S,3R)-1-(2-(이소옥사졸-3-일)-1H-이미다졸-4-일)부탄-1,2,3,4-테트라올, 및 1-(5-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-테트라히드록시부틸)-1H-이미다졸-2-일)에타논으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 의약조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
유주의 활성화가 생체의 손상부위로의 유도인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 SSEA3 양성인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 CD105 양성인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 의약조성물.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기세포가, 이하의 성질 모두를 가지는 다능성 줄기세포인 의약조성물:
(i) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 자기재생능력을 가짐.