CN104721232B - 脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明利用新生儿脐带血中的免疫细胞，在体外定向扩增之后，再输注到患者体内来纠正患者体内免疫偏倚或缺陷。经过试验性治疗，结果证实脐带血免疫细胞对银屑病患者的治疗效果明显。本发明的治疗方法简便，易于施治，患者的依从性好，无明显的副作用，更重要的是本发明的治疗方法能够达到临床治愈水平，患者能够得到长期的临床无病缓解。

Description

脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用，具体涉及脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

银屑病俗称“牛皮癣”，是一种常见的易于复发的慢性炎症性皮肤病，特征性损害为红色丘疹或斑块上覆有多层银白色鳞屑。青壮年发病最多，男性发病多于女性，北方多于南方，春冬季易发或加重，夏秋季多缓解。病因和发病机理未完全明确。研究发现，本病的发病与遗传因素、感染链球菌、免疫功能异常，代谢障碍及内分泌变化等有关。其中，免疫调节功能紊乱作为致病原因近年来越发受到重视。

临床上银屑病有四种类型：寻常型、脓胞型，红皮病型和关节病型。寻常型银屑病最常见，病情较轻。本病目前尚无特效疗法，适当的对症治疗可以控制症状。由于本病是一种慢性复发性疾病，不少患者需要长期医治，主要有联合疗法、交替疗法、序贯和间歇疗法等。然而，以上各种疗法都有一定的不良反应。比如外用药中的维生素D3类似物会引起钙代谢异常，进而导致高血钙。糖皮质激素虽然短期疗效显著，但是停药后极易引起反跳。内服药中甲氨蝶呤的长期用药可引起肝脏广泛性纤维化和肝硬化。维A酸类长期口服可致畸胎、血脂升高及肝脏损害等。免疫疗法和生物制剂疗法通过抑制免疫细胞而达到治疗银屑病的效果，但是免疫系统长期受抑制后易引发多种不良后果。综合目前的治疗方法，可以看出本病呈慢性经过，治疗后容易复发，并且，随着病程的延长，病情有逐渐加重的趋势。

2010年《检验医学》上发表的一篇文章《银屑病患者外周血CD3+CD(16+56)+NK T细胞和CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞显著减少》，介绍了银屑病患者体内NK T细胞和DN T细胞显著减低，CD4/CD8比值显著升高。并推测这两类细胞的异常减低与银屑病患者体内免疫调节功能失衡有关。该文章的结果提示：向患者体内适当补充免疫细胞，纠正患者体内的免疫失衡，会对银屑病起到革命性的治疗效果。

关于脐带血的临床应用，2014年12月22日，欧洲药品管理局用药产品委员会向欧盟推荐批准广泛使用的新药中，来自于脐带血干细胞的生物制剂赫然在列，用以补充角膜缘干细胞的缺损。其效用性和安全性已经得到了欧盟用药产品委员会的高度认可。而脐带血中的免疫细胞，在经过体外定向诱导和扩增后，可以在一定程度上补充银屑病患者缺失的免疫细胞成分，纠正患者免疫失衡状态并对银屑病起治疗作用。

发明内容

针对目前银屑病病程长、对常规治疗方法敏感度差、易复发、一旦罹患后痛苦不堪的临床特点，同时根据银屑病患者体内免疫失衡的病理特点，本发明利用新生儿脐带血中的免疫细胞，在体外定向扩增之后，再输注到患者体内来纠正患者体内免疫偏倚或缺陷。本发明克服了现有银屑病治疗过程中的缺点和误区，提供了一种相对安全、便捷、治疗效果更佳的治疗方法。

本发明的目的在于提供脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述脐带血免疫细胞采用以下方法制备：

(1)脐带血的采集

对离断后的胎儿脐带清洁后进行采血，采血前使采血管壁充分覆盖抗凝剂，然后将采血袋置于低于脐带的位置，将采血针刺入脐静脉充盈处的下端，利用重力及挤压使脐带血进入采血袋中，边采集脐血边轻轻摇晃采血袋，使脐带血与抗凝剂充分混和，当脐静脉塌陷、变白或者采集袋中的脐带血停止流入时即可终止采集脐带血，采集的脐带血4℃冰箱暂存，24小时内，经由配备有恒温设备的转运车运至GMP实验室进行分离和培养；

(2)脐带血单核细胞的制备

用移液管吸取DPBS加入到步骤(1)采集的脐带血中，稀释脐带血细胞，将脐带血细胞稀释液，加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心后，吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的离心管中，加入ALYS505N-0无血清细胞培养基，离心后弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀，即得到脐带血单核细胞；

(3)单核细胞的诱导和扩增

将步骤(2)收集到的单个核细胞加入到含有IL-12的ALYS505N-0无血清细胞培养液中，制成细胞悬液，并转移到75cm²细胞培养瓶中，同时加入IL-12，置于37℃饱和湿度、5％CO₂培养箱中连续培养，培养至第3天，补充含有IL-2的ALYS505N-0无血清细胞培养液，待显微镜下观察细胞状态良好，细胞密度达到或接近100％铺壁率时，轻轻吹打成细胞悬液，将悬液转移至225cm²细胞培养瓶中，继续培养，每2-3天加液一次，待细胞密度达到或接近100％铺壁率时，轻轻吹打成细胞悬液，将悬液分装，并加入含有IL-2的ALYS505N-0无血清细胞培养基继续培养，待细胞培养至第14天，轻轻吹打培养瓶中的培养物，制成单细胞悬液，转移悬液至离心管中，室温离心，细胞沉降下来后弃掉上清，加入生理盐水重悬细胞，再次离心后弃上清，如此洗涤细胞3次，最后重悬于生理盐水中。

在本发明中，优选的，所述脐带血免疫细胞的给药方式为静脉输注。

在本发明中，优选的，所述脐带血免疫细胞的治疗量为1×10⁹个细胞。

本发明的技术方案由以下4个步骤组成，各步骤之间有时间和技术上的承接关系，此技术方案的序贯性不能更改(见图1)。

(1)脐带血采集，此步骤是为免疫细胞的扩增提供基础细胞；

(2)脐带血单核细胞制备，此步骤是去除无核红细胞的污染，富集脐带血中的免疫细胞；

(3)单核细胞的诱导和扩增，此步骤是为了获得经过定向诱导的，足够回输量的免疫细胞。

(4)静脉输注，此步骤是将符合质控标准的脐带血免疫细胞经过静脉输入患者体内，纠正免疫失衡。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

截至目前，我们应用此方法已完成7例银屑病患者的试验性治疗。我们发现，应用本方法不但能够有效控制银屑病的现有症状、体征，而且明显减慢复发病程，即本方法能够比现有方法治愈率高，且无任何不良反应。

具体来讲，(1)本方法能够迅速治愈较轻的寻常型银屑病，对于较重的关节病型银屑病，也能有效缓解和控制病情；

(2)应用本方法能够更有效的延长患者无病缓解期：最长一例患者已经10年未发病，较近的一例患者在应用此方法后也有3年未发病；

(3)应用本方法起效迅速，通常在使用后3天开始起效，一个月之内达到最大治疗效果；

(4)应用本方法最常见的副作用是患者在静脉输注后发生轻微的低热，未见其它任何副作用(10年以上的远期副作用未做评估)，因此本方法耐受性良好；

(5)应用此方法患者的依从性好，只需数次静脉输注，相较于其他类型的治疗方式如长期的外用药、口服治疗都更容易被患者接受；

(6)应用此方法最大优势还在于迄今为止未发现停药后病情反跳的病例。

附图说明

图1为采用脐带血免疫细胞进行银屑病治疗的方法流程图；

图2为典型的脐带血免疫细胞显微镜下照片图(×20物镜)，其中A图为初始瓶中细胞达到分瓶标准的培养状态显微镜下照片图，B图为分瓶后大量增殖的细胞显微镜下照片图；

图3为治疗前及接受治疗1个月之后的对比图(患者接受单次细胞治疗，治疗量为1×10⁹个细胞)；

图4为治疗前及接受治疗1个月之后的对比图(患者接受连续两次细胞静脉输注，每次治疗量为1×10⁹个细胞)。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1脐带血免疫细胞体外分离、培养

一、脐带血采集

1)备品：脐带血采集袋1个，《供者健康和信息采集登记表》1张，无菌止血钳3把，无菌剪刀1把，无菌手套1副，无菌生理盐水500毫升，无菌纱布块若干，碘酒，75％乙醇；

2)脐带血采集前检查采血用备品有无缺损，确保脐带血采集袋无渗漏，抗凝液未变质，无浑浊和异物，且在保质期内，检查信息采集表填写是否规范完整；

3)胎儿脐带离断：胎儿娩出十秒钟内，将脐带在近胎儿侧5-8厘米处用两把止血钳夹住，两止血钳之间有1-2厘米的间距，在两止血钳之间用剪刀剪断脐带。胎儿抱走清洁处理；

4)脐带清洁：用无菌纱布沾取无菌生理盐水擦拭脐带，清理粘液、羊水及胎粪等污物。在脐带的断端静脉充盈处用碘酒擦拭两遍，并用75％乙醇脱碘两遍，充分消毒；

5)脐带血采集：采血前需要把抗凝剂经采血管释放几滴，使采血管壁充分覆盖抗凝剂，然后将采血袋置于低于脐带的位置，将采血针刺入脐静脉充盈处的下端，利用重力及挤压使脐带血进入采血袋中，边采集脐血边轻轻摇晃采血袋，使脐带血与抗凝剂充分混和，当脐静脉塌陷、变白或者采集袋中的脐带血停止流入时即可终止采集脐带血；

6)采血终止：在采血针刺入点上方用止血钳夹住脐带，拔出采血针，分离采血针后，将采血管抬高，使采血管中的脐带血充分流到采血袋中，在距离采血袋2厘米处，用卡扣或连续打结密闭采血管，轻轻翻转采血袋，进一步混匀脐带血和抗凝剂，通常一次采血会收集到不少于50毫升的脐带血；

7)标注和运输：采集完毕，将采集袋外包装的条形码揭下，粘在采血袋上，标明孕妇姓名和采血时间，要求精确到分钟，将密封好的脐血采集袋、《供者健康和信息采集登记表》统一打包放入4℃冰箱暂存，24小时内，经由配备有恒温设备的转运车运至GMP实验室进行分离和培养。

二、脐带血单核细胞制备

1)备品：ALYS505N-0无血清细胞培养基，50毫升离心管，DPBS，医用淋巴细胞分离液，巴氏吸管，橡胶乳头，移液管，电动移液器，隔离服，手套，以上备品均为无菌，另外仪器设备需要生物安全柜，离心机，倒置显微镜，细胞计数仪，真空泵；

2)将25毫升采集到的脐带血转移至无菌无热源的50毫升离心管中，用移液管吸取25毫升DPBS加入到离心管中，轻轻颠倒离心管两到三次，混匀并稀释血细胞；

3)吸取淋巴细胞分离液20毫升，加入到一个新的50毫升离心管中；

4)将血细胞稀释液，加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，要求逐滴缓慢地加在淋巴细胞分离液液面上；

5)调节离心机设置，使离心机缓慢升速，缓慢降速。室温，800g离心15分钟；

6)离心结束后，用巴氏吸管小心整体吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50毫升离心管中；

7)向装有单个核细胞的离心管中加入ALYS505N-0无血清细胞培养基至50毫升，轻轻吹打洗涤细胞，放入离心机，室温，梯度离心10分钟。弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；

8)重复上一步骤2次，弃上清，保留细胞，计数后预留出1×10⁶个细胞用做流式分析，其余细胞备用。

三、单核细胞的诱导和扩增

1)备品：75cm²细胞培养瓶，225cm²细胞培养瓶，ALYS505N-0无血清细胞培养基，移液管，电动移液器，隔离服，手套，以上备品均为无菌；

2)将收集到的单个核细胞加入到50毫升含有IL-12(10ng/L)的ALYS505N-0无血清细胞培养液中，制成细胞悬液，加入到75cm²细胞培养瓶中，同时加入IL-12(10ng/L)，置于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中连续培养；

3)至培养第3天，视细胞生长状态，补充5-10毫升ALYS505N-0无血清细胞培养液(含IL-21500U/mL)；

4)转分瓶标准，待显微镜下观察细胞状态良好，细胞密度达到或接近100％铺壁率时(见图2A)，轻轻吹打培养瓶中的细胞，制成细胞悬液，将悬液转移至225cm²细胞培养瓶中，然后向原瓶中加入50毫升含IL-2(10ng/L)的ALYS505N-0无血清细胞培养基，冲洗培养瓶后将细胞悬液整体转移至225cm²细胞培养瓶中，继续培养；

5)视细胞生长情况，每2-3天加液一次，每次50毫升，待细胞密度达到或接近100％铺壁率时(见图2B)，如上一步那样制成细胞悬液，将悬液平均分配到两个225cm²细胞培养瓶中，加入等量的含IL-2(10ng/L)的ALYS505N-0无血清细胞培养基继续培养；

6)静脉输注前2天要对培养物做基本的质控分析，确保培养物不被细菌及支原体污染；

7)待细胞培养至第14天，观察细胞状态并做细胞计数，此时总细胞数应该达到2×10⁹个以上，提取至少2mL细胞悬液做质控及流式细胞分析；

8)轻轻吹打培养瓶中的培养物，制成单细胞悬液，转移悬液至50毫升离心管中，室温，600g，离心10分钟，细胞沉降下来后弃掉上清，加入50毫升生理盐水重悬细胞，再次离心后弃上清，如此洗涤细胞3次，最后重悬于20毫升生理盐水中。

实施例2脐带血免疫细胞的给药方法

静脉输注

1)备品：一次性输血器，止血带，碘伏、酒精棉签，输液贴，非那根注射液，0.9％生理盐水注射液，细胞筛，50毫升离心管，20毫升注射器；

2)取50毫升离心管置于离心管架上，将细胞筛外包装去除，置于离心管上，用20毫升注射器将经过洗涤的细胞悬液经过细胞筛的滤网，流入到细胞筛下方的离心管中；

3)用一新的20毫升注射剂收集离心管中的细胞悬液，转移入装有250毫升生理盐水的一次性输液瓶中，轻轻颠倒混匀；

4)取一次性输血器，用粗针侧刺穿输液瓶塞，形成一套完整的输注系统；

5)患者肘窝贵要静脉处皮肤常规碘酒酒精消毒，将输血器的静脉针刺入贵要静脉并用输液贴固定；

6)输注细胞前先滴注生理盐水15分钟至半小时以冲洗管道，滴速50-60滴/分钟，序贯接入装有细胞的输液瓶开始静脉输注，滴注速度控制在30-40滴/分钟，输注过程中每3分钟轻轻摇动细胞瓶一次，静脉输注完成后，再次接入生理盐水瓶，持续静脉滴注15分钟以冲洗管路；

7)拔下静脉针，按压针孔2分钟以止血，至此静脉输注完成。

实施例3脐带血免疫细胞对银屑病患者的治疗

将实施例1培养的脐带血免疫细胞按照实施例2的给药方法对患者进行静脉输注，每位患者每次静脉输注1×10⁹个细胞，接受治疗1个月后，随访观察治疗效果。从图3和图4中可以看出，患者无论是接受单次细胞治疗还是接受连续两次细胞静脉输注，脐带血免疫细胞对银屑病患者的治疗效果明显。其中，接受单次治疗的患者，女，42岁，5岁时即突然全身起水泡，挠破后起癣，当时诊断为牛皮癣，未做分型。接受此项治疗前曾尝试中药治疗、针灸拔罐和民间偏方等治疗方式，中间有十年左右的缓解期，但是近几年复发明显，起病时肩胛、肾盂部位、肘部及脚踝外侧皮肤最重，脱屑明显，头皮中也有密集隆起的丘状皮疹。接受本疗法的单次治疗后，患者主诉皮肤瘙痒明显减轻，身体明显有力，治疗后皮损首先明显发红，然后逐渐转白，蜕皮，由病损中央向四周逐渐扩散，于接受治疗后10-15天蜕皮结束并由正常皮肤替代。其先前接受过手术的刀口也恢复迅速，疤痕周围银屑病皮损也有明显改善。接受治疗1个月之后，回访时的查体发现患者皮损较治疗前明显减轻，其腹部疤痕组织明显变薄，颜色粉红，肉芽组织生长旺盛。肘部皮损扁平，不再隆起，大部分皮损已被正常皮肤替代(图3)。头皮处的病损也较治疗前有明显好转。

接受连续两次治疗的患者，男，40岁，关节病型银屑病，于20岁左右发病，期间接受中医治疗、免疫抑制剂等治疗均未见明显效果。接受本治疗前的体检发现患者指关节变形明显，双拳不能握紧。银屑病皮损主要表现为右下腹部红色丘疹和耳后皮肤隆起性淀粉样变，接受治疗1个月之后，随访查体发现患者耳后皮肤淀粉样变显著减轻，皮损区的大部分已经被粉红色的正常皮肤替代，腹部的红色丘疹已经完全消失(图4)。患者主诉关节比治疗前灵活，握力增加，但随访时查体其关节变形未见明显改善。

截止到目前，5名患者接受本发明方法治疗的时间共计近半年，尚未见病情反复或加重的情况，大部分均能有效长期缓解。另外，最早接受本发明方法治疗的一例患者其临床无复发已经持续十年，另有一例已持续三年未复发。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.脐带血免疫细胞作为唯一有效成分在制备治疗银屑病药物中的应用，其中，所述脐带血免疫细胞采用以下方法制备：

(1)脐带血的采集

对离断后的胎儿脐带清洁后进行采血，采血前使采血管壁充分覆盖抗凝剂，然后将采血袋置于低于脐带的位置，将采血针刺入脐静脉充盈处的下端，利用重力及挤压使脐带血进入采血袋中，边采集脐血边轻轻摇晃采血袋，使脐带血与抗凝剂充分混和，当脐静脉塌陷、变白或者采集袋中的脐带血停止流入时即可终止采集脐带血，采集的脐带血4℃冰箱暂存，24小时内，经由配备有恒温设备的转运车运至GMP实验室进行分离和培养；

(2)脐带血单核细胞的制备

用移液管吸取DPBS加入到步骤(1)采集的脐带血中，稀释脐带血细胞，将脐带血细胞稀释液，加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心后，吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的离心管中，加入ALYS505N-0无血清细胞培养基，离心后弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀，即得到脐带血单核细胞；

(3)单核细胞的诱导和扩增

将步骤(2)收集到的单个核细胞加入到含有IL-12的ALYS505N-0无血清细胞培养液中，制成细胞悬液，并转移到75cm²细胞培养瓶中，同时加入IL-12，置于37℃饱和湿度、5％CO₂培养箱中连续培养，培养至第3天，补充含有IL-2的ALYS505N-0无血清细胞培养液，待显微镜下观察细胞状态良好，细胞密度达到或接近100％铺壁率时，轻轻吹打成细胞悬液，将悬液转移至225cm²细胞培养瓶中，继续培养，每2-3天加液一次，待细胞密度达到或接近100％铺壁率时，轻轻吹打成细胞悬液，将悬液分装，并加入含有IL-2的ALYS505N-0无血清细胞培养基继续培养，待细胞培养至第14天，轻轻吹打培养瓶中的培养物，制成单细胞悬液，转移悬液至离心管中，室温离心，细胞沉降下来后弃掉上清，加入生理盐水重悬细胞，再次离心后弃上清，如此洗涤细胞3次，最后重悬于生理盐水中。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带血免疫细胞的给药方式为静脉输注。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带血免疫细胞的治疗量为1×10⁹个细胞。