KR20190054425A - 마이크로입자 및 세포 스페로이드를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물 - Google Patents

마이크로입자 및 세포 스페로이드를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

연골 형성 촉진 인자가 결합된 마이크로입자 및 세포 스페로이드를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 탈분화된 연골세포의 재분화를 유도할 수 있다.

Description

마이크로입자 및 세포 스페로이드를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물{Composition for inducing chondrogenic differentiation comprising microparticle and cell spheroid}
본 발명은 연골 형성 촉진 인자와 세포외기질 단백질이 결합된 마이크로입자 및 세포 스페로이드를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.
연골은 천층, 중간층, 심층, 석회층으로 구성되어 있는 결합조직의 특수한 형태로 세포외 기질이 단단하여 물리적인 힘에 의해 손상을 받지 않도록 하는데 중요한 역할을 한다. 연골 조직은 퇴행성 변화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 또한 연골세포의 기능에도 변화가 유발된다. 사람에게 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환 중하나인 골관절염의 유발요인으로 연골의 탈분화 현상이 중요하게 생각되고 있다(비특허문헌 1). 또한, 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재 다양한 의공학적 접근방법으로 퇴행성 연골 질환을 치료하려는 노력이 진행되고 있으나, 정상적인 연골조직 재생에는 아직까지 많은 한계점이 있다.
연골세포는 이미 분화된 세포로서 조직 내에서 세포 분열이 왕성하지 않지만, 분리 후 체외에서 단층배양시 증식이 촉진되어 충분한 수의 연골세포를 수득할 수 있다. 그러나 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 연골세포의 표현형이 감소하는 탈분화 현상이 일어날 뿐 아니라, 생체 내 이식시 섬유화 연골조직 및 석회화(Calcification)된 조직이 형성되는 문제점이 있다(Fischer J et al. Arthritis & Rheumatism, 62(9), pp. 2696-2706, 2010).
따라서, 이식에 적합한 연골세포를 수득하기 위해서는 생체 내 환경과 유사한 환경을 조성하면서 연골세포의 분화를 유도할 필요가 있다.
1. Ann. Rheum. Dis., 63(12), pp.1618-1622, 2004 2. Arthritis&Rheumatism, 62(9), pp. 2696-2706, 2010
본 발명의 일 목적은 연골 형성 촉진 인자 및 세포외기질 단백질이 결합된 마이크로입자; 및 세포 스페로이드(spheroid)를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연골세포 분화 유도용 조성물을 이용한 연골질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 연골 형성 촉진 인자 및 세포외기질(extracellular matrix) 단백질이 결합된 마이크로입자; 및 세포 스페로이드(spheroid)를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "연골세포(Chondrocyte, cartilage cell)"는 연골조직을 구성하고 있는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "연골세포 분화 유도"란 탈분화된 연골세포의 재분화를 유도하거나, 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포가 연골세포로 분화하도록 유도하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 연골 형성 촉진 인자는 TGF-β(transforming growth factor β) 및 BMP(bone morphogenetic protein)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 TGF-β3일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포외기질 단백질은 매트릴린-1(matrilin-1), 매트릴린-2 및 매트릴린-3으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 매트릴린-3인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 마이크로입자는 생체 적합성 고분자로 이루어진 마이크로입자일 수 있다. 예를 들어, 젤라틴 마이크로입자, 히알루론산 마이크로입자, 알긴산 마이크로입자 및 콜라겐 마이크로입자로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 젤라틴 마이크로입자인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포 스페로이드"는 단면이 원형 또는 타원형으로 나타나는 세포가 응집된 입체 구조를 의미하며, 삼차원 세포 배양으로 제조될 수 있다. 삼차원 세포 배양은 전형적인 단층배양(2D culture, monolayer culture)이 생명 시스템의 복잡한 미세환경(microenvironment)을 재현하는데 제한적인 점을 보완하고, 세포-세포(cell-cell) 및 세포-세포외기질(cell-extracellular matrix, cell-ECM)로 유지되는 생체 내와 유사한 환경을 제공할 수 있는 세포배양 방법이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 스페로이드는 줄기세포로 이루어진 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 근육, 지방조직 또는 신경 조직 유래 등 다양하게 이용할 수 있으며, 예를 들어 지방조직-유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예서, 상기 연골세포 분화 유도용 조성물은 연골조직 재생용 조성물로서 사용될 수 있다. "연골조직 재생"이란 손상된 연골조직을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골조직을 재생(regeneration)하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 상기 연골세포 분화 유도용 조성물은 주사용 제형 또는 스프레이형 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 연골세포 분화 유도용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골질환 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 연골 질환은 연골세포의 비정상적 소멸 또는 연골 조직의 손상에 의해 야기되는 연골 질환일 수 있다. 예를 들어 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 및 수핵 탈출증(herniated nucleus pulposus)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 연골세포 분화 유도용 조성물은 탈분화된 연골세포의 재분화를 유도할 수 있다.
도 1은 TGF-β3 또는 매트릴린-3(matrilin-3)을 고정시킨 GMP를 형광현미경으로 관찰한 이미지를 보여준다: MATN3은 매트릴린-3을 나타낸다.
도 2는 TGF-β3 및 매트릴린-3을 같이 고정시킨 GMP를 형광현미경으로 관찰한 이미지를 보여준다: MATN은 매트릴린-3을 나타낸다.
도 3은 TGF-β3, 매트릴린-3 또는 TGF-β3+매트릴린-3이 고정된 GMP/ASC 스페로이드(gelatin microparticle/adipose-derived stem cell spheroid)에서 SOX 9, AGG(aggrecan) 및 COL2A(collagen2a)의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 연골세포와 공동 배양한 GMP/ASC 스페로이드의 ASC에서 SOX 9, AGG 및 COL2A의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 GMP/ASC 스페로이드와 공동 배양한 연골세포에서 SOX 9, AGG 및 COL2A의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 시약
돼지 피부(porcine skin)로부터 분리한 젤라틴, 파라핀 오일, 스팬 80 (span 80) 및 NHS(N-Hydroxysuccinimide)는 Sigma Aldrich(미국)로부터 구입하였다. 50% 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde)와 아세톤은 (주)대정화금 (Daejung Chemicals and Metals; 대한민국)으로부터 구입하였다. TGF-β3 및 매트릴린-3(matrilin-3)은 R&D System(미국)에서 구입하였고, TGF-β3 항체는 Biorbyt (미국)에서 구입하였다. Alexa Fluor 594 antibody labeling kit는 Life Technologies(미국)에서 구입하였고, ASC(지방조직-유래 줄기세포, adipose-derived stem cell)와 연골세포(chondrocyte)는 차의과학대학교(CHA University; 대한민국)로부터 제공받았다. StemFit 3D®은 Microfit(대한민국)에서 구입하였고, 모든 세포 배양 배지는 Hyclone(GE Healthcare; 미국)에서 구입하였다. CCK-8(Cell counting kit-8)은 Dojindo(일본)에서, 키아졸(Qiazol)은 Qiagen(독일)에서 각각 구입하고, 역전사 키트(reverse transcription kit) 및 SYBR® Green은 Takara(일본)에서 구입하였다.
2. 단백질이 결합된 젤라틴 마이크로입자 제조
2-1. 젤라틴 마이크로입자 제조
젤라틴 타입 A 6 g을 증류수(distilled water) 40 ㎖에 용해시켜 젤라틴 용액을 제조하고, 여기에 파라핀 오일(100 ㎖)과 스팬 80(1.2 ㎖)의 혼합물을 한방울씩 떨어뜨려 혼합하였다. 60℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 교반한 후, 혼합물의 온도를 10℃까지 냉각시켰다. 이후, 50% 글루타르알데하이드 200 ㎕를 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 아세톤 500 ㎖로 세척 및 여과한 후, 과량의 아세톤은 데시케이터(desiccator)로 제거하였다. 젤라틴 마이크로입자 (gelatine microparticle, 이하 GMP로 기재함)를 체(청계상공사; 대한민국)로 걸러내어 38 ㎛ 내지 63 ㎛ 크기의 GMP를 수득하였다.
2-2. GMP에 단백질 고정(immobilization)
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) 200 ㎕에 TGF-β3 또는 매트릴린-3을 50 ng, 100 ng 또는 200 ng 농도로 각각 용해시켰다. 또한, TGF-β3와 매트릴린-3을 각각 25+25, 50+50, 100+100 및 200+200 (단위: ng)의 양으로 DPBS 200 ㎕에 용해시켰다.
EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 3.6 ㎎과 NHS 9 ㎎을 DPBS 400 ㎕에 용해시켜 EDC 용액을 제조하고, 상기 EDC 용액과 GMP 3.89x105개를 30분 동안 반응시켰다. 이후, TGF-β3 용액, 매트릴린-3 용액 또는 TGF-β3+ 매트릴린-3 용액과 혼합하여 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 남아있는 화합물을 제거하고, GMP를 30분 동안 소니케이션(sonication)한 후 48시간 동안 동결 건조시켰다. 실험에 사용하기 전 GMP는 EO 멸균(ethylene oxide sterilization; ALOPS Corp., SE30, 대한민국)을 수행하였다.
2-3. 면역 염색을 통한 단백질 고정 여부 확인
제조사의 매뉴얼에 따라 항체에 Alexa Fluor 594를 표지하고, 형광이 표지된 항체를 GMP와 30분 동안 반응시켰다. 이후, GMP의 염색 정도를 형광 현미경(OLYMPUS, CKX41, 일본)으로 관찰하였다.
3. GMP / ASC 스페로이드 제조
3-1. 세포 배양
ASC는 CO2 배양기에서 37℃로 배양하고, 배양 배지는 2일마다 교체하였다. 배양 배지는 저농도 글루코스 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제-항진균 용액을 첨가하여 이용하였다. ASC가 배양 플레이트의 70% 정도 생장하면, 트립신을 처리하여 세포를 회수하였다.
3-2. GMP/ASC 스페로이드 제조
389 마이크로웰(microwell; StemFit 3D®)을 DPBS로 세척하고, 3% BSA 용액 1 ㎖을 각 웰에 분주하여 2시간 동안 반응시켰다. GMP를 각각 97,250 GMPs/㎖ (100 GMPs/웰), 194,500 GMPs/㎖ (200 GMPs/웰) 및 4,862,500 세포 (1,000 세포/웰)의 농도로 BSA 용액에 준비하였다.
ASC는 648,333개/㎖ (1,000개 세포/웰) 및 1,296,666개/㎖ (2,000개 세포/웰)의 농도로 BSA 용액에 현탁시켰다.
마이크로웰에 GMP 용액 400 ㎕와 세포 현탁액 600 ㎕을 첨가하고, CO2 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 마이크로웰의 가장자리(rim)에 남아있는 세포 및 GMP가 제거되었는지 현미경으로 확인한 후, 마이크로웰을 CO2 배양기에 방치하여 스페로이드(spheroid)를 제조하였으며, 배양 배지는 2일마다 교체하였다. DPBS로 세척한 후, 마이크로피펫으로 GMP/ASC 스페로이드를 수거하였다. 700 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 GMP/ASC 스페로이드를 수득하였다.
4. 탈분화 (de-differentiated) 연골세포와 GMP / ASC 스페로이드의 공동배양(co-culture)
계대수 6(passage 6)의 세포로 탈분화 연골세포를 준비하여 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 이후, GMP/세포 스페로이드를 넣은 인서트(insert; StemFit 3D®)를 6-웰 플레이트에 위치시켜 배양하고, 배양 배지는 매일 교체하였다.
연골 형성 관련 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여, 공동배양 시작 후 1일 및 7일 되는 날 세포를 회수하였다.
5. 유전자 발현 분석
총 mRNA는 제조사의 매뉴얼에 따라 키아졸로 분리하였다. 분리한 mRNA는 microplate reader(BioTek instruments Inc., 미국)로 정량하고, 역전사 키트를 이용하여 Takara의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR; Thermo Fisher Scientific, Step One Plus™ Real Time PCR system, 미국)을 실시하였다. SYBR Green PCR 조건은 95℃에서 10분, (95℃에서 15초, 60℃에서 1분)*40회 및 95℃에서 15초로 설정하였다. PCR에 이용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
서열 서열번호
18s rRNA F GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT 1
R CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG 2
SOX 9 F GTA CCC GCA CTT GCA CAA C 3
R TCT CGC TCT CGT TCA GAA GTC 4
AGG F GCC TGC GCT CCA ATG ACT 5
R ATG GAA CAC GAT GCC TTT CAC 6
COL2A F GGG AGT AAT GCA AGG ACC CA 7
R ATC ATC ACC CAG GCT TTC CAG 8
6. 통계 분석
실험 결과는 평균±표준편차로 기재하였고, Bonferroni test를 이용한 일원 반복 측정 분산분석(one-way repeated measures ANOVA)으로 비교하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)로 수행하였다.
실험 결과
1. TGF - β3 및 매트릴린 -3의 GMP 고정 여부 확인
형광이 표지된 TGF-β3 항체 또는 매트릴린-3 항체와 GMP를 반응시킨 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 형광 신호를 확인하여 GMP에 TGF-β3 또는 매트릴린-3가 잘 고정된 것을 알 수 있었다. 아울러, TGF-β3 또는 매트릴린-3의 농도가 증가할수록 형광 신호 또한 강해지는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이 TGF-β3 및 매트릴린-3을 같이 고정시킨 경우에도 형광 신호를 확인하여 두 단백질이 GMP에 잘 고정되었음을 알 수 있었다.
2. 연골 형성 유전자의 발현 변화
2-1. GMP / ASC 스페로이드에서 연골 형성 유전자의 발현 변화
공동 배양을 이용할 TGF-β3 및 매트릴린-3의 농도를 결정하기 위하여, GMP/ASC 스페로이드 자체의 연골 분화(chondrogenic differentiation) 정도를 배양 1일 차에 확인하였다. 연골 형성 유전자는 SOX 9, AGG(aggrecan) 및 COL2A (collagen2a)를 확인하였다.
확인 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 SOX-9과 COL2A의 발현 수준은 매트릴린-3이 5 ng 고정된 GMP/ASC 스페로이드에서 가장 높았다. AGG의 경우, TGF-β3가 20 ng 고정된 GMP/ASC 스페로이드와 TGF-β3 및 매트릴린-3가 모두 고정된 GMP/ASC 스페로이드에서 발현이 거의 두 배로 증가하였다.
상기 실험 결과를 토대로, GMP/ASC 스페로이드와 연골세포의 공동 배양에는 매트릴린-3은 5 ng, 10 ng 및 20 ng을 이용하고, TGF-β3는 5 ng을 이용하였으며, 매트릴린-3와 TGF-β3가 각각 5 ng씩 고정된 GMP/ASC 스페로이드를 이용하였다. 또한, 가장 높은 AGG 발현 수준을 보인 매트릴린-3 10 ng 및 20 ng 농도 또한 이용하였다.
2-2. GMP / ASC 스페로이드와 연골세포를 공동 배양한 경우 연골 형성 유전자의 발현 변화
ASC의 경우, 도 4에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 매트릴린-3이 고정된 GMP/ASC 스페로이드에서 발현 수준이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. TGF-β3가 고정된 스페로이드의 경우 AGG의 발현 수준이 증가하였고, TGF-β3 및 매트릴린-3가 모두 고정된 GMP/ASC 스페로이드에서는 COL2A의 발현이 높아지는 것을 알 수 있었다. ASC가 연골세포로 분화하는 것은 확인할 수 없었다.
연골세포의 경우, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 모든 실험군에서 SOX 9, AGG 및 COL2A의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 매트릴린-3이 10 ng 또는 20 ng 고정된 GMP/ASC 스페로이드와 배양한 경우, AGG의 발현이 7배 증가하였다. TGF-β3 또는 매트릴린-3+TGF-β3가 고정된 GMP/ASC 스페로이드와 배양한 경우, 탈분화된 연골세포가 연골세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험들을 통하여 GMP/ASC 스페로이드가 주변분비 효과(paracirine effect)를 통하여 탈분화된 연골세포의 재분화를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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Claims (8)

  1. 연골 형성 촉진 인자 및 세포외기질 단백질이 결합된 마이크로입자; 및
    세포 스페로이드(spheroid)를 포함하는 연골세포 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연골 형성 촉진 인자는 TGF-β(transforming growth factor β) 및 BMP(bone morphogenetic protein)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외기질 단백질은 매트릴린-1(matrilin-1), 매트릴린-2 및 매트릴린-3으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 젤라틴 마이크로입자, 히알루론산 마이크로입자, 알긴산 마이크로입자 및 콜라겐 마이크로입자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 스페로이드는 줄기세포(stem cell) 스페로이드인 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방조직-유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)인 것인 조성물.
  7. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골질환 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 및 수핵 탈출증(herniated nucleus pulposus)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 연골질환 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
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