CN117377685A

CN117377685A - 具有对Fc受体的增强的亲和力和改善的热稳定性的Fc变体

Info

Publication number: CN117377685A
Application number: CN202280037409.3A
Authority: CN
Inventors: J·贝宁加; B·卡梅隆; I·福肯; S·卡图里亚; C·朗格; A·马西罗; S-H·朴; B·蒂尔曼
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2024-01-09

Abstract

本公开文本提供了Fc结构域变体，包括效应子感受态Fc结构域变体。本公开文本还提供了编码Fc结构域变体的核酸和用于制造Fc结构域变体的宿主细胞。还提供了用于增加Fc结构域变体的产量的方法，和使用Fc结构域变体来治疗疾病的方法。

Description

具有对Fc受体的增强的亲和力和改善的热稳定性的Fc变体

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月27日提交的美国临时专利申请序列号63/193,665和2021年7月15日提交的欧洲申请号21315127.7的优先权，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。

背景技术

抗体的片段可结晶(Fc)区与Fcγ受体(FcγR)之间的特异性接合是效应子功能(如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))的初始步骤(Arnold等人,2007)。在人中，激活FcγRIIIa是在自然杀伤细胞的表面上表达的。FcγRIIIa是一种低亲和力受体，并且细胞的激活是由于这些表面受体在抗体-抗原免疫复合物中聚集的Fc区接合后交联而产生的。Fc区也与新生Fc受体(FcRn)相互作用。已经显示这种相互作用通过减少内皮细胞中的溶酶体降解来延长IgG的半衰期。

Fc工程化已经被广泛采用，以鉴定增强对Fc受体的亲和力并且从而增强ADCC活性和/或血清半衰期的Fc结构域变体。需要新型Fc结构域变体。

发明内容

本公开文本部分地涉及这样的发现：与野生型Fc结构域相比，具有改变的效应子功能的Fc结构域变体具有降低的热稳定性。因此，本公开文本进一步部分地涉及具有增加的热稳定性和出乎意料地增加的体内稳定性的新型Fc结构域变体的发现。

在一方面，提供了一种分离的效应子感受态多肽，所述分离的效应子感受态多肽包含含有第一重链和第二重链的糖基化Fc结构域，其中至少一条重链包含由一对半胱氨酸(C)介导的工程化的链内二硫键，所述半胱氨酸取代：(i)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；(ii)氨基酸位置287处的丙氨酸(A)和氨基酸位置306处的亮氨酸(L)；或(iii)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)；其中所述氨基酸位置根据EU编号；其中所述糖基化Fc结构域能够与抗体效应子分子相互作用；并且其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性。

在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的工程化或非天然聚糖。在某些示例性实施方案中，所述工程化或非天然聚糖是经修饰的聚糖。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。

在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含与治疗性分子缀合的经修饰的聚糖。

在某些示例性实施方案中，所述第一重链包含所述半胱氨酸对。在某些示例性实施方案中，所述第一重链和所述第二重链各自包含所述半胱氨酸对。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在某些示例性实施方案中，其中所述IgG1 Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。

在某些示例性实施方案中，所述抗体效应子分子是FcRn。在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与所述FcRn的增强的结合亲和力。

在某些示例性实施方案中，所述抗体效应子分子是FcγRIIIa。在某些示例性实施方案中，与包含野生型Fc结构域的多肽相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与FcγRIIIa的增强的结合亲和力。

在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改变的血清半衰期。在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有延长的血清半衰期。在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改善的体内稳定性。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置332处的取代，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置332处的取代是谷氨酸(E)。在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236、239或330处的一个或多个取代，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置236处的取代是丙氨酸(A)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置239处的取代是天冬氨酸(D)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置330处的取代是亮氨酸(L)。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256和/或307处的取代，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置256处的取代是天冬氨酸(D)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置307处的取代是谷氨酰胺(Q)。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

在另一方面，提供了一种分离的效应子感受态多肽，所述分离的效应子感受态多肽包含：含有第一重链和第二重链的糖基化Fc结构域，其中至少一条重链包含由一对半胱氨酸(C)介导的工程化的链内二硫键，所述半胱氨酸取代：(i)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；(ii)氨基酸位置287处的丙氨酸(A)和氨基酸位置306处的亮氨酸(L)；或(iii)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)；其中所述糖基化Fc结构域能够与抗体效应子分子相互作用并且包含氨基酸位置332处的谷氨酸(E)；其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用并且包含氨基酸位置332处的谷氨酸(E)的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性；并且其中所述氨基酸位置根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述工程化或非天然聚糖是经修饰的聚糖。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。在某些示例性实施方案中，所述经修饰的聚糖与治疗性分子缀合。

在某些示例性实施方案中，所述经修饰的Fc结构域是经修饰的人Fc结构域。在某些示例性实施方案中，所述经修饰的Fc结构域是经修饰的人IgG1 Fc结构域。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽进一步包含：氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)；氨基酸位置236处的丙氨酸(A)；氨基酸位置330处的亮氨酸(L)；氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)；和/或氨基酸位置30处的谷氨酰胺(Q)。

在某些示例性实施方案中，所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于相同重链上。

在某些示例性实施方案中，所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于不同重链上。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽进一步包含结合结构域。在某些示例性实施方案中，所述结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域与肿瘤抗原特异性结合。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域与免疫细胞上的抗原特异性结合。在某些示例性实施方案中，所述结合多肽包含治疗性多肽。在某些示例性实施方案中，所述治疗性多肽可以是受体、配体或酶。

在某些示例性实施方案中，所述多肽是抗体。在某些示例性实施方案中，所述多肽是单克隆抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗体是全长抗体。

在某些示例性实施方案中，所述多肽是单结构域抗体。在某些示例性实施方案中，所述单结构域抗体是VHH抗体。

在某些示例性实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体具有选自以下的形式：DVD-Ig、基于CODV的形式如CODV-Ig、CrossMab、CrossMab-Fab和Tandem Fab。基于CODV平台的多特异性抗体特别描述于WO 2012135345、WO 2016116626、WO 2017180913中。/>是Sanofi的注册商标。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体是T细胞衔接器(engager)。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体是NK细胞衔接器。

在某些示例性实施方案中，所述结合多肽与所述Fc结构域的N末端和/或C末端连接。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)耗尽靶细胞。

在某些示例性实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。

在某些示例性实施方案中，所述靶细胞是免疫细胞。

在某些示例性实施方案中，所述多肽是Fc融合多肽。

在另一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码上文所述的分离的效应子感受态多肽的核酸。

在某些示例性实施方案中，载体包含所述分离的核酸分子。在某些示例性实施方案中，所述载体是表达载体。

在另一方面，提供了包含所述载体的宿主细胞。

在某些示例性实施方案中，所述宿主细胞是真核或原核起源的。在某些示例性实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物起源的。在某些示例性实施方案中，所述宿主细胞是细菌起源的。

在另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上文所述的分离的效应子感受态多肽。

在一方面，提供了一种增加分离的效应子感受态多肽的产量的方法，所述方法包括：表达包含第一重链和第二重链的糖基化Fc结构域，其中至少一条重链包含由一对半胱氨酸(C)介导的工程化的链内二硫键，所述半胱氨酸取代：(i)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；(ii)氨基酸位置287处的丙氨酸(A)和氨基酸位置306处的亮氨酸(L)；或(iii)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)；其中所述氨基酸位置根据EU编号；其中所述糖基化Fc结构域能够与抗体效应子分子相互作用；并且其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性；以及纯化所述效应子感受态多肽，其中与包含野生型糖基化Fc结构域的多肽相比，所述多肽的产量增加。

在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的工程化或非天然聚糖，即任选地经修饰的聚糖。在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。在某些示例性实施方案中，所述经修饰的聚糖可以与治疗性分子缀合。

在某些示例性实施方案中，所述第一重链包含所述半胱氨酸对。

在某些示例性实施方案中，所述第一重链和所述第二重链各自包含所述半胱氨酸对。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域是人Fc结构域。在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。

在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改变的血清半衰期。在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有延长的血清半衰期。

在某些示例性实施方案中，所述分离的多肽进一步包含一个或多个增强效应子功能的氨基酸取代，任选地氨基酸位置332处的取代，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置332处的取代是谷氨酸(E)。在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236、239或330处的一个或多个取代，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置236处的取代是丙氨酸(A)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置239处的取代是天冬氨酸(D)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置330处的取代是亮氨酸(L)。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽进一步包含氨基酸位置256和/或307处的取代，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置256处的取代是天冬氨酸(D)。在某些示例性实施方案中，所述氨基酸位置307处的取代是谷氨酰胺(Q)。

在某些示例性实施方案中，所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于相同重链上。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于不同重链上。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽进一步包含结合多肽。在某些示例性实施方案中，所述结合多肽包含一个或多个抗原结合结构域。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。在某些示例性实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域与免疫细胞上的抗原特异性结合。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是抗体。在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是单克隆抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗体是全长抗体。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是单结构域抗体。在某些示例性实施方案中，所述单结构域抗体是VHH抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体具有选自以下的形式：DVD-Ig、基于CODV的形式如CODV-Ig、CrossMab、CrossMab-Fb和Tandem Fab。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体是T细胞衔接器。在某些示例性实施方案中，所述多特异性抗体是NK细胞衔接器。

在某些示例性实施方案中，所述结合多肽包含治疗性多肽。在某些示例性实施方案中，所述治疗性多肽可以是受体、配体或酶。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)耗尽靶细胞。在某些示例性实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。在某些示例性实施方案中，所述靶细胞是免疫细胞。

在某些示例性实施方案中，所述分离的效应子感受态多肽是Fc融合多肽。

在另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述效应子感受态多肽。

在某些示例性实施方案中，所述疾病或障碍是癌症。在某些示例性实施方案中，所述疾病或障碍是炎性疾病。在某些示例性实施方案中，所述疾病或障碍是自身免疫性疾病。

附图说明

根据以下说明性实施方案的详细描述结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点。

图1A-图1B描绘了300K和370K处的疏水性接触频率的平均值。图1A描绘了氨基酸位置332处的谷氨酸(E)残基的疏水性接触的平均频率。图1B描绘了300K处α碳的均方根波动(以埃为单位)。

图2描绘了在具有结构上紧密靠近的I332E(绿色CPK绘制)和L242C+K334C工程化二硫键(橙色CPK绘制)的Fc CH2结构域结构域(呈线-带)上的DSB移植的例子。

图3描绘了I332(左小图，疏水接触以虚线突出显示)和I332E(右小图，静电接触以虚线突出显示)的非共价键网络的例子。

图4描绘了针对DSB突变选择的位置的例子。在左小图上，L242+K334(在圆内的棒)。在右小图上，R292和V302(在圆内的棒)。

图5描绘了被选择为阴性对照的A287和L306(下部黄色棒)位置。这两个残基接近FcRn结合表面，并且位于IgG CH2结构域的边界，其预测的结构影响低于两个先前的DSB方案。

图6描绘了具有mAb1 ADLE和DSB突变型的二硫键的提取离子色谱图(XIC)肽定量曲线。对于ADLE，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到八个二硫桥。对于ADLE_DQ_R292C_V302C，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到九个二硫桥。对于ADLE_DQ_L242C_K334C，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到八个二硫桥，并且具有一个共同的肽(突变和铰链相同)。

图7A-图7B描绘了具有mAb1 DE和DSB突变型(图7A)和mAb1 ADE和DSB突变型(图7B)的二硫键的XIC肽定量曲线。对于DE，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到八个二硫桥。对于DE_DQ_R292C_V302C，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到九个二硫桥。对于DE_DQ_L242C_K334C，除218LC-223HC(在死体积中洗脱)外，检测到九个二硫桥，并且具有一个共同的肽(突变和铰链相同)。

图8描绘了如通过纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)确定的mAb1 ADLE变体的二硫化物稳定化的热稳定性作用。

图9A-图9B描绘了如通过nanoDSF确定的mAb1 DE变体(图9A)和ADE变体(图9B)的二硫化物稳定化的热稳定性作用。

图10描绘了如通过纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)确定的mAb3和mAb4的DE、ADE、DE+DSB(R292C-V302C)和ADE+DSB(R292C-V302C)变体的二硫化物稳定化的热稳定性作用。左小图描绘mAb3变体，并且右小图描绘了mAb4变体，使用以下颜色代码：绿色DE、红色ADE、DE+DSB紫色、ADE DSB蓝色、WT黑色。

图11描绘了对于mAb1+/-ADLE、DE或ADE+/-DSB(L242C_K334C或R292C_V302C)，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的CDC活性。

图12描绘了对于mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-R292C_V302C，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的CDC活性。

图13描绘了对于mAb1+ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-L242C_K334C，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的CDC活性。

图14描绘了对于mAb1+/-ADLE、DE或ADE+/-L242C_K334C或R294C_V304C，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的ADCC活性。

图15描绘了对于mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-R292C_V302C，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的ADCC活性。

图16描绘了对于mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-DSB L242C_K334C，与IgG1野生型相比，ADLE变体、DE变体和ADE变体的ADCC活性。

图17描绘了具有或不具有R292C-V302C DSB取代的ADE变体和DE变体的细胞毒性活性。特异性裂解百分比在y轴上，并且mAb3浓度(nM)在x轴上。

图18描绘了Tg32小鼠中mAb1抗体的平均PK曲线(对数标度)。

图19描绘了Tg32小鼠中另外的mAb1抗体的平均PK曲线(对数标度)。

图20描绘了Tg32小鼠中mAb3抗体的平均PK曲线(对数标度)。

具体实施方式

本公开文本提供了具有改善的热稳定性的新型Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)。本公开文本还提供了具有与Fc受体的改善的结合的新型Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)。本公开文本进一步提供了包含糖基化Fc结构域的新型Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的结合多肽)，与野生型(例如，未经修饰的)Fc结构域相比，所述糖基化Fc结构域增强与抗体效应分子的相互作用。本公开文本还提供了编码Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)的核酸、用于制造Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)的重组表达载体和宿主细胞，以及包含分离的Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)的药物组合物。还提供了使用本公开文本的Fc结构域变体(例如，包含Fc结构域变体的新型结合多肽)治疗一种或多种疾病或障碍的方法。

应理解，本公开文本中描述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语是仅仅出于描述具体实施方案的目的，而不意图限制。

此外，除非另外指示，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。此类技术是熟练工作者所熟知的，并且在文献中已充分解释。参见例如，Ausubel等人,编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,纽约,纽约州(1987-2008)，包括所有增补本，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第四版)MR Green和J.Sambrook，以及Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,第14章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013，第2版)。

除非另外定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式如“包括”(“includes”和“included”)的使用不是限制性的。

通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语是本领域公知且常用的。除非另外指示，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行的。根据制造商的说明书如本领域通常所实现的或如本文所述的那样进行酶促反应和纯化技术。关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。将常规技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

为了可以更容易地理解本公开文本，下面定义了选择的术语。

除非上下文另外矛盾，否则术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合体链，并且涵盖天然或人工蛋白质、蛋白质序列的多肽类似物或变体或其片段。多肽可以是单体或聚合体的。例如，多肽片段包含至少约5个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸或至少约20个连续氨基酸。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是指这样的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽由于其起源或衍生源不与其天然状态下伴随它的天然缔合组分缔合；基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或者在自然界中不存在。因此，化学合成的或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中合成的蛋白质或多肽将是与其天然缔合组分“分离的”。通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术分离，也可以使蛋白质或多肽基本上不含天然缔合组分。

如本文所用，术语“结合蛋白”或“结合多肽”应当指代含有至少一个结合位点的蛋白质或多肽(例如，抗体或免疫粘附素)，所述结合位点负责与目的靶抗原(例如，人靶抗原)选择性地结合。示例性结合位点包括抗体可变结构域、受体的配体结合位点或配体的受体结合位点。在某些方面，结合蛋白或结合多肽包含多个(例如，两个、三个、四个或更多个)结合位点。在某些方面，结合蛋白或结合多肽是治疗性酶。

术语“配体”是指能够结合或被结合至另一种物质的任何物质。类似地，术语“抗原”是指可以产生针对其的抗体的任何物质。尽管“抗原”通常关于抗体结合底物使用，并且“配体”通常在提及受体结合底物时使用，但这些术语彼此没有区别，并且涵盖范围广泛的重叠化学实体。为免生疑问，抗原和配体贯穿本文可互换地使用。抗原/配体可以是肽、多肽、蛋白质、适配体、多糖、糖分子、碳水化合物、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、合成分子、无机分子、有机分子及其任何组合。

结合蛋白的解离常数(K_D)可以例如通过表面等离子体共振来确定。通常，表面等离子体共振分析通过表面等离子体共振(SPR)使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韦，新泽西州)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析还可以通过固定分析物(生物传感器基质上的结合蛋白)并呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所用术语“K_D”是指特定结合蛋白与靶抗原之间的相互作用的解离常数。

如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体或免疫粘附素以至多约1x10^-6M、约1x10^-7M、约1x10^-8M、约1x10^-9M、约1x10^-10M、约1x10^-11M、约1x10^-12M或更低的解离常数(K_D)与靶标(例如，抗原)结合，和/或以其对非特异性抗原的亲和力至少约两倍的亲和力与抗原结合的能力。抗体的特异性结合可以是通过CDR序列与靶抗原特异性结合。抗体也可以通过Fc区与FcR(如FcRn或FcγRIIIa)特异性结合。

如本文所用，术语“抗体”是指这样的组装体(例如，完整抗体分子、免疫粘附素或其变体)，其对目的抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著已知的特异性免疫反应活性。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，其间具有或不具有链间共价连接。已相对充分地理解脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构。

如下面将更详细讨论的，通用术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的五种不同类别的抗体。虽然所有五个抗体类别显然均在本公开文本的范围内，但以下讨论将总体上涉及免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，免疫球蛋白包含分子量为大约23,000道尔顿的两条相同的轻链和分子量为53,000-70,000的两条相同的重链。四条链以“Y”构型通过二硫键接合，其中轻链从“Y”的口部开始包围重链并持续至可变区。

免疫球蛋白的轻链被分类为卡帕(κ)或拉姆达(λ)。每种重链类别均可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程化的宿主细胞产生时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫连接或非共价连接彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。本领域技术人员将理解，重链被分类为伽马(γ)、缪(μ)、阿耳法(α)、德耳塔(δ)或伊普西隆(ε)，在它们之中具有一些亚类(例如，γl-γ4)。此链的性质可将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。已充分地表征免疫球蛋白同种型亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)，并且已知它们赋予功能特化。鉴于本公开文本，这些类别和同种型中的每一种的修饰形式对于熟练技术人员来说均是容易辨别的，因此，它们在本公开文本的范围内。

轻链和重链二者均被分成具有结构和功能同源性的区域。术语“区域”是指免疫球蛋白或抗体链的一部分(part或portion)，并且包括恒定区或可变区以及所述区域的更离散的部分(parts或portions)。例如，轻链可变区包括如本文所定义的散布在“框架区”或“FR”之间的“互补决定区”或“CDR”。

免疫球蛋白重链或轻链的区域可以被定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区，在“恒定区”的情况下是基于各个类别成员的区域内序列变化的相对缺乏，或在“可变区”的情况下是基于各个类别成员的区域内的显著变化。术语“恒定区”和“可变区”也可以关于功能使用。在这方面，将理解，免疫球蛋白或抗体的可变区确定抗原识别和特异性。相反，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应子功能，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是熟知的。

免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区被折叠成结构域。术语“结构域”是指重链或轻链的球状区，其包含例如通过β折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3至4个肽环)。免疫球蛋白轻链上的恒定区结构域可互换地称为“轻链恒定区结构域”、“CL区”或“CL结构域”。重链上的恒定结构域(例如，铰链、CH1、CH2或CH3结构域)可互换地称为“重链恒定区结构域”、“CH”区结构域或“CH结构域”。轻链上的可变结构域可互换地称为“轻链可变区结构域”、“VL区结构域”或“VL结构域”。重链上的可变结构域可互换地称为“重链可变区结构域”、“VH区结构域”或“VH结构域”。

按照惯例，可变恒定区结构域的氨基酸的编号随着它们离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端越来越远而增加。免疫球蛋白的每条重链和轻链的N末端是可变区，并且C末端是恒定区。CH3和CL结构域分别包含重链和轻链的羧基末端。因此，轻链免疫球蛋白的结构域以VL-CL取向排列，而重链的结构域以VH-CH1-铰链-CH2-CH3取向排列。

每个可变区结构域的氨基酸分配是按照Kabat的定义，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州,1987和1991)。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的相应残基被分配相同的编号。VL结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。VH结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。如果这样指出，则CDR的分配可以按照(Lefranc等人,Developmental&Comparative Immunology 27:55-77；2003)，而非Kabat。重链恒定区的编号是经由如Kabat(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州,1987和1991)中所述的EU索引。

如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“VL结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。

如本文所用，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域，其例如按Kabat编号系统从大致位置114延伸至位置223(EU位置118-215)。CH1结构域与VH结构域和免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端相邻，并且不构成免疫球蛋白重链的Fc区的一部分。

如本文所用，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域与CH2结构域接合的部分。铰链区包含大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域(Roux等人J.Immunol.1998,161:4083)。

如本文所用，术语“CH2结构域”包括重链免疫球蛋白分子的这样的部分，其例如按Kabat编号系统从大致位置244延伸至位置360(EU位置231-340)。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。而是两条N连接的支链碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包含源自IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH2结构域。

如本文所用，术语“CH3结构域”包括重链免疫球蛋白分子的这样的部分，其从CH2结构域的N末端延伸大约110个残基，例如按Kabat编号系统从大致位置361延伸至位置476(EU位置341-445)。CH3结构域通常形成抗体的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的结构域可以从CH3结构域延伸以形成分子的C末端部分(例如，IgM的μ链和IgE的e链中的CH4结构域)。在一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包含源自IgG1分子(例如，人IgG1分子)的CH3结构域。

如本文所用，术语“CL结构域”包括免疫球蛋白轻链的恒定区结构域，其例如从大致Kabat位置107A延伸至大致Kabat位置216。CL结构域与VL结构域相邻。在一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包含源自κ轻链(例如，人κ轻链)的CL结构域。

抗体的可变区允许其选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区(Fv)。此四元抗体结构形成存在于“Y”构型的每条臂的末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由每个重链和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)限定。如本文所用，术语“抗原结合位点”包括特异性结合抗原(例如，细胞表面或可溶性抗原)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。抗原结合位点由可变区形成，所述可变区在抗体之间有所不同。本公开文本的经改变的抗体包含至少一个抗原结合位点。

在某些实施方案中，本公开文本的结合多肽包含提供结合多肽与选择的抗原的缔合的至少两个抗原结合结构域。抗原结合结构域不必源自相同的免疫球蛋白分子。在这方面，可变区可能源自或源自任何类型的动物，其可以被诱导产生体液反应并产生针对所需抗原的免疫球蛋白。因此，结合多肽的可变区可以是例如哺乳动物起源的，例如可以是人、鼠、大鼠、山羊、绵羊、非人灵长类动物(如食蟹猴、猕猴等)、狼或骆驼科动物(例如，来自骆驼、美洲驼和相关物种)。

在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个CDR是短的非连续的氨基酸序列，其特异性定位以形成抗原结合位点，因为假定抗体在水性环境中呈现其三维构型。其余的重和轻可变结构域在氨基酸序列中显示出较小的分子间变异性，并且被称为框架区。框架区主要采用β片层构象，并且CDR形成环，其连接β片层结构，并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。因此，这些框架区起到形成支架的作用，所述支架提供六个CDR通过链间非共价相互作用在正确取向上的定位。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。此互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。

示例性结合多肽包括抗体变体。如本文所用，术语“抗体变体”包括抗体的合成和工程化形式，所述抗体被改变使得它们不是天然存在的，例如包含至少两个重链部分但不是两条完整重链的抗体(如结构域缺失的抗体或微型抗体)；多特异性形式的(例如，双特异性、三特异性等)抗体，其被改变以与两种或更多种不同的抗原或与单一抗原上的不同表位结合；与scFv分子接合的重链分子等。此外，术语“抗体变体”包括多价形式的抗体(例如，结合相同抗原的三个、四个或更多个拷贝的三价、四价等抗体)。

如本文所用，术语“价态”是指多肽中潜在的靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合一种靶分子或靶分子上的特异性位点。当多肽包含多于一个靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以与不同的配体或不同的抗原或者相同抗原上的不同表位结合)。主题结合多肽通常具有对人抗原分子具有特异性的至少一个结合位点。例如，典型的IgG1单克隆抗体对一种靶抗原具有特异性。二价抗体是包含靶向两种不同抗原的抗原结合结构域或靶向一种抗原的两个抗原结合结构域的抗体。类似地，三价抗体可以是具有针对单个抗原的三个靶向结构域的单特异性抗体。如果三价抗体结合具有两个结合结构域的第一抗原和具有另一个结合结构域的第二抗原，则所述三价抗体可以是双特异性的。三价抗体可能是三特异性的，并且与三个不同的靶标结合。

术语“特异性”是指特异性结合(例如，与……免疫反应)给定靶抗原(例如，人靶抗原)的能力。结合多肽可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在某些实施方案中，结合多肽对相同靶标的两个不同(例如，非重叠)部分具有特异性。在某些实施方案中，结合多肽对多于一种靶标具有特异性。示例性结合多肽(例如，抗体)是本领域已知的，所述多肽包含结合肿瘤细胞上表达的抗原的抗原结合位点，并且来自此类抗体的一个或多个CDR可以包括在如本文所述的抗体中。

如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”是指能够被结合多肽的结合位点结合的分子或分子的一部分。靶抗原可具有一个或多个表位。

术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的约20％内，如在约10％内、在约5％内或在约1％内或更少。

如本文所用，“施用(administer)”或“施用(administration)”是指将存在于体外的物质(例如，本文所提供的分离的结合多肽)注射或以其他方式物理递送至患者的行为，如通过但不限于肺部(例如，吸入)、粘膜(例如，鼻内)、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当要管理或治疗疾病或其症状时，物质的施用通常在疾病或其症状发作之后进行。当要预防疾病或其症状时，物质的施用通常在疾病或其症状发作之前进行，并且可以长期持续以延迟或减少疾病相关症状的出现或程度。

如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖含有任选的指定量的指定成分(例如，本文所提供的分离的结合多肽)的产品，以及直接或间接由任选的指定的量的指定成分的组合产生的任何产品。

“有效量”意指活性药剂(例如，本公开文本的分离的结合多肽)的足以在需要药剂的个体中实现所需生理学结局的量。根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类组、组合物的配制、个体医疗状况的评估和其他相关因素，有效量可以在个体之间有所不同。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。如本文所用，受试者可以是哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在某些实施方案中，如本文所用，术语“受试者”是指脊椎动物，如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、野生动物、未驯服的动物、农场动物、运动动物和宠物。

如本文所用，术语“疗法”是指可以用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或与其相关的症状的任何方案、方法和/或药剂。在一些实施方案中，术语“疗法”是指可以用于调节受试者对感染的免疫反应或与其相关的症状的任何方案、方法和/或药剂。在一些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指本领域技术人员(如医务人员)已知的可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或与其相关的症状的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。在其他实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指本领域技术人员(如医务人员)已知的可用于调节受试者对感染的免疫反应或与其相关的症状的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由一种或多种疗法的施用(包括但不限于一种或多种预防或治疗剂(如本文所提供的分离的结合多肽)的施用)引起的疾病或与其相关的症状的进展、严重程度和/或持续时间的降低或改善。如本文所用，术语“治疗”还可以指代改变被治疗受试者的病程。治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和一种或多种症状、减少疾病的直接或间接病理后果、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。

Fc结构域

在本公开文本的某些方面，提供了Fc结构域，例如Fc结构域变体。如本文所用，术语“Fc区”或“Fc结构域”是指重链恒定区的这样的部分，其始于恰在木瓜蛋白酶切割位点(即，IgG中的残基216，将重链恒定区的第一个残基取为114)上游的铰链区并在抗体的C末端结束。因此，完整的Fc区至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。

抗体的Fc区参与非抗原结合，并且可以通过与Fc受体结合来介导效应子功能。存在几种不同类型的Fc受体，所述Fc受体基于它们识别的抗体类型进行分类。例如，Fcγ受体(FcγR)与IgG类抗体结合，Fcα受体(FcαR)与IgA类抗体结合，并且Fcε受体(FcεR)与IgE类抗体结合。新生Fc受体(FcRn)与抗体的Fc区相互作用以通过挽救正常的溶酶体降解促进抗体循环。FcγR属于包括几个成员(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb)的家族。

如本文所用，术语“天然Fc”或“野生型Fc”是指对应于由抗体消化产生或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子，无论呈单体还是多聚体形式，并且可以含有铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源通常是人起源的，并且可以是任何免疫球蛋白，如IgG1和IgG2。天然Fc分子由可以通过共价(即，二硫键)和非共价缔合连接成二聚或多聚形式的单体多肽构成。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4，这取决于类(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。天然Fc的一个例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键键合的二聚体。如本文所用，术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。

如本文所用，术语“Fc结构域变体”、“Fc变体”或“经修饰的Fc”是指从天然/野生型Fc修饰而来但仍包含FcR的结合位点的分子或序列。因此，术语“Fc变体”可以包括从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的区域，因为它们提供了本文所述的抗体样结合多肽不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包括这样的分子或序列，其缺少一个或多个天然Fc位点或残基，或者在其中一个或多个Fc位点或残基已经被修饰，所述位点或残基影响或参与：(1)二硫键形成，(2)与选择的宿主细胞的不相容性，(3)在选择的宿主细胞中表达时的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与除了补救受体之外的Fc受体结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

如本文所用，“效应子感受态Fc变体”或“效应子感受态多肽”是指具有一种或多种如本文进一步描述的Fc效应子功能的Fc结构域。

在某些示例性实施方案中，与野生型Fc相比，本文特定的Fc变体具有增加的血清半衰期、增强的FcRn结合亲和力、在酸性pH下增强的FcRn结合亲和力、增强的FcγRIIIa结合亲和力和/或类似的热稳定性中的一种或多种。

FcγRIIIa V158、或人CD16a-V受体、或CD16a^V是指包含CD16人受体的片段的多肽构建体，所述片段与天然抗体的Fc区结合，介导抗体依赖性细胞毒性，并在位置158上带有缬氨酸(V)，其在文献中也被报道为同种异型CD16a V158。

FcγRIIIa F158、或人CD16a-F受体、或CD16a^F是指包含CD16人受体的片段的多肽构建体，所述片段与天然抗体的Fc区结合，介导抗体依赖性细胞毒性，并在位置158上带有苯丙氨酸(F)，其在文献中也被报道为同种异型CD16a F158。

如本文所用的术语“Fc结构域”涵盖如本文所定义的天然/野生型Fc以及Fc变体和序列。与Fc变体和天然Fc分子一样，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是从完整抗体消化而来还是通过其他手段产生。

在某些示例性实施方案中，如本文所述的Fc结构域是热稳定的。

在某些示例性实施方案中，如本文所述的Fc结构域是糖基化的(例如，经由N连接的糖基化)。在某些示例性实施方案中，Fc结构域包含N连接的糖基化，例如在含有氨基酸序列NXT或NXS(X是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基)的N连接的糖基化基序处。在某些示例性实施方案中，Fc结构域在氨基酸位置297处糖基化，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，如本文所述的Fc结构域是效应子感受态的。

在某些示例性实施方案中，如本文所述的Fc结构域是热稳定的、糖基化的和效应子感受态的任何组合。

热稳定的Fc结构域变体

恒定抗体结构域的结构类似于由用环和短螺旋连接的β链组成的可变结构域的结构。与其他结构域中展现的广泛的链间相互作用相反，重恒定区的CH2结构域展现出弱的碳水化合物介导的链间蛋白质-蛋白质相互作用。分离的鼠CH2结构域在生理温度下相对不稳定(Feige等人,2004,J.Mol.Biol.344:107-118)，但是先前的努力表明CH2结构域的热稳定性可以用添加链内二硫键增强，并且这些链内二硫键可以用作结合剂的支架(Gong等人,2009,J.Biol.Chem.284:14203-210)。

相对于野生型Fc结构域，展现出增加的热不稳定性(即，降低的热稳定性)的效应子增强Fc结构域变体是已知的。例如，S239D/I332E和S239D/I332E/A330L变体导致CH2结构域的稳定性降低，如通过差示扫描量热法(DSC)分析中的熔化温度(Tm)的降低所指示的。G236A/S239D/A330L/I332E具有与野生型相比时降低的蛋白质热位移测量值，以及在hFcγR转基因小鼠中显著缩短的半衰期。(综述参见Liu等人(2014)J.Biol.Chem.289(6):3571，和Liu等人(2020)Antibodies 9(4):64。)

如与野生型相比具有改善的FcγR结合的效应子增强Fc结构域变体是已知的，其中稳定性没有显著降低。(参见例如，Igawa等人,EP 2 940 135，例如，实施例10。)

已经进一步发现，可以通过在Fc结构域中引入一个或多个二硫键来产生热稳定的Fc结构域变体。因此，在一方面，本公开文本提供了一种Fc结构域变体，其包含一个或多个工程化(例如，非天然)二硫键，例如由例如一对或多对半胱氨酸介导的链内二硫键。

在某些示例性实施方案中，二硫键是Fc结构域的两个CH2区之间的链内二硫键。在某些示例性实施方案中，二硫键是Fc结构域的两个CH3区之间的链内二硫键。在某些示例性实施方案中，在Fc结构域的两个CH2区之间和/或Fc结构域的两个CH2区之间存在两个或更多个链内二硫键。

Fc结构域(例如，或一天与或不具有结合多肽的Fc结构域)的热稳定性或解折叠的倾向可以使用本领域已知的各种方法来确定。例如，解折叠或变性温度可以通过纳米形式差示扫描量热法(nanoDSC)或纳米形式差示扫描荧光分析法(nanoDSF)来测量(Wen等人,2020Anal.Biochem.593:113581)。蛋白质开始解折叠时的可检测温度是T起始。如本文所用，术语“Tm”是指分子的熔化温度。如本文所用，术语“Tm1”是指本公开文本的Fc结构域的解折叠温度，特别是CH2结构域的解折叠温度。

在某些示例性实施方案中，相对于未热稳定的Fc结构域变体，热稳定的Fc结构域变体(例如，具有一个或多个工程化的二硫键)的T起始增加。在某些示例性实施方案中，相对于未热稳定的Fc结构域变体，热稳定的Fc结构域变体的T起始增加约1.0℃、约1.5℃、约2.0℃、约2.5℃、约3.0℃、约3.5℃、约4.0℃、约4.5℃、约5.0℃、约5.5℃、约6.0℃、约6.5℃、约7.0℃、约7.5℃、约8.0℃、约8.5℃、约9.0℃、约9.5℃、约10.0℃、约10.5℃、约11.0℃、约11.5℃、约12.0℃、约12.5℃、约13.0℃、约13.5℃、约14.0℃、约14.5℃、约15.0℃、约15.5℃、约16.0℃、约16.5℃、约17.0℃、约17.5℃、约18.0℃、约18.5℃、约19.0℃、约19.5℃、约20.0℃、约20.5℃、约21.0℃、约21.5℃、约22.0℃、约22.5℃、约23.0℃、约23.5℃、约24.0℃、约24.5℃或约25.0℃。

在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体具有选自以下位置处的半胱氨酸取代的一个或多个氨基酸取代对：氨基酸位置242和334；氨基酸位置240和334；氨基酸位置287和306；氨基酸位置292和302；氨基酸位置323和332；氨基酸位置259和306；氨基酸位置350和441；氨基酸位置343和431；氨基酸位置375和404；氨基酸位置375和396；和氨基酸位置348和439，根据EU编号。(综述参见Wozniak-Knopp等人,2012,PLoS One 7:e30083；Jacobsen等人,2017J.Biol.Chem.202:1865-75；WO 2014153063。)

在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体包含由一对半胱氨酸介导的工程化(例如，非天然)链内二硫键，所述半胱氨酸取代(i)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；(ii)氨基酸位置287处的丙氨酸(A)和氨基酸位置306处的亮氨酸(L)；或(iii)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)，根据EU编号。

在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体包含由一对半胱氨酸介导的工程化(例如，非天然)链内二硫键，所述半胱氨酸取代氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)。在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体包含由一对半胱氨酸介导的工程化(例如，非天然)链内二硫键，所述半胱氨酸取代氨基酸位置287处的丙氨酸(A)和氨基酸位置306处的亮氨酸(L)。在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体包含由一对半胱氨酸介导的工程化(例如，非天然)链内二硫键，所述半胱氨酸取代氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)。在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体可以包含至少一个工程化的链内二硫键。在某些示例性实施方案中，热稳定的Fc结构域变体可以包含多于一个的工程化的链内二硫键。

效应子增强Fc结构域变体

在一方面，本公开文本提供了包含效应子增强氨基酸取代的Fc结构域变体。

在一个实施方案中，具有改变的FcγRIIIa结合的Fc结构域变体包含一个或多个如本文所公开的氨基酸取代。在一个实施方案中，具有增强的FcγRIIIa结合亲和力的Fc结构域变体具有一个或多个如本文公开的氨基酸取代。在一个实施方案中，具有增强的FcγRIIIa结合亲和力的Fc结构域变体包含两个或更多个如本文公开的氨基酸取代。在一个实施方案中，具有增强的FcγRIIIa结合亲和力的Fc结构域变体包含三个或更多个如本文公开的氨基酸取代。在一个实施方案中，具有增强的FcγRIIIa结合亲和力的Fc结构域变体包含四个或更多个如本文所公开的氨基酸取代。

在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的Fc结构域变体包含具有一个或多个如本文公开的氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施方案中，具有增强的FcRn结合亲和力的Fc结构域变体包含具有一个或多个如本文公开的氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施方案中，具有增强的FcRn结合亲和力的Fc结构域变体包含具有两个或更多个如本文公开的氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施方案中，具有增强的FcRn结合亲和力的Fc结构域变体包含具有三个或更多个如本文公开的氨基酸取代的Fc结构域。

在一些实施方案中，Fc结构域变体可以展现出物种特异性FcRn结合亲和力。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以展现出人FcRn结合亲和力。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以展现出食蟹猴FcRn结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以展现出跨物种的FcRn结合亲和力。这种Fc结构域变体被认为在一种或多种不同物种之间具有交叉反应性。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以展现出人和食蟹猴FcRn结合亲和力两者。

新生Fc受体(FcRn)与抗体的Fc区相互作用以通过挽救正常的溶酶体降解促进循环。这一过程是pH依赖性过程，其发生在酸性pH下(例如，pH小于6.5)的内体中，但不发生在血流的生理pH条件下(例如，非酸性pH)。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体具有在酸性pH下增强的FcRn结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体在小于7的pH下，例如在约pH 6.5、约pH 6.0、约pH 5.5、约pH 5.0下，具有增强的FcRn结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域在升高的非酸性pH下的FcRn结合亲和力相比，Fc结构域变体在小于7的pH下，例如在约pH 6.5、约pH 6.0、约pH5.5、约pH 5.0下，具有增强的FcRn结合亲和力。升高的非酸性pH可以是例如大于7的pH、约pH 7、约pH 7.4、约pH 7.6、约pH 7.8、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0。

在某些实施方案中，可能需要Fc结构域变体在非酸性pH下展现出与野生型Fc结构域大致相同的FcRn结合亲和力。在一些实施方案中，可能需要Fc结构域变体在非酸性pH下展现出比包含具有双重氨基酸取代M428L/N434S(根据EU编号)的经修饰的Fc结构域的结合多肽更小的FcRn结合亲和力(参见USPN 8,088,376)。因此，可能需要Fc结构域变体展现出对pH依赖性FcRn结合的最小扰动。

在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，具有在酸性pH下增强的FcRn结合亲和力的Fc结构域变体具有降低的(即，更慢的)FcRn解离速率。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域在升高的非酸性pH下的FcRn解离速率相比，与所述结合多肽在升高的非酸性pH下的FcRn结合亲和力相比具有在酸性pH下增强的FcRn结合亲和力的Fc结构域变体具有在酸性pH下更慢的FcRn解离速率。

某些实施方案包括这样的Fc结构域变体，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸已经缺失或以其他方式改变以提供所需的生物化学特征，如当与具有大致相同的免疫原性的完整的未改变的抗体相比时，降低或增强的效应子功能、非共价二聚化的能力、增强的定位于肿瘤部位的能力、缩短的血清半衰期、或增加的血清半衰期。

在某些其他实施方案中，Fc结构域变体包含源自不同抗体同种型的恒定区(例如，来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的两种或更多种的恒定区)。在其他实施方案中，Fc结构域变体包含嵌合铰链(即，包含源自不同抗体同种型的铰链结构域的铰链部分的铰链，所述铰链结构域例如来自IgG4分子的上部铰链结构域和IgG1中部铰链结构域)。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的技术使Fc结构域突变以增加或减少效应子功能。

在一些实施方案中，Fc结构域变体具有与Fc受体的改变的结合亲和力。存在几种不同类型的Fc受体，所述Fc受体基于它们识别的抗体类型进行分类。例如，Fcγ受体(FcγR)与IgG类抗体结合，Fcα受体(FcαR)与IgA类抗体结合，并且Fcε受体(FcεR)与IgE类抗体结合。FcγR属于包括几个成员(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb)的家族。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体具有改变的FcγRIIIa结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体具有降低的FcγRIIIa结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体具有增强的FcγRIIIa结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域变体经修饰的Fc结构域可以大致相同的FcγRIIIa结合亲和力。

在某些实施方案中，Fc结构域变体包含介导一种或多种效应子功能的抗体恒定区(例如，IgG恒定区，例如人IgG恒定区，例如人IgG1恒定区)。例如，C1复合物与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体系统的激活在调理作用和细胞病原体的裂解中是重要的。补体系统的激活还刺激炎性反应，并且还可能参与自身免疫性超敏反应。此外，抗体经由Fc结构域与多种细胞上的受体结合(抗体Fc区上的Fc受体结合位点与细胞上的Fc受体(FcR)结合)。存在许多Fc受体，其对不同类别的抗体(包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体))具有特异性。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合引发许多重要且多样的生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。在一些实施方案中，Fc结构域变体，例如结合多肽(例如，抗体或免疫粘附素)与Fc-γ受体结合。在可替代实施方案中，Fc结构域变体包含没有一种或多种效应子功能(例如，ADCC活性)和/或不能结合Fcγ受体的恒定区。

在某些示例性实施方案中，效应子增强Fc结构域变体具有一个或多个选自以下的氨基酸取代：氨基酸位置221处的天冬氨酸(D)；氨基酸位置222处的半胱氨酸(C)；氨基酸位置234处的酪氨酸(Y)；氨基酸位置236处的丙氨酸(A)；氨基酸位置236处的色氨酸(W)；氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)；氨基酸位置243处的亮氨酸(L)；氨基酸位置267处的谷氨酸(E)；氨基酸位置268处的苯丙氨酸(F)；氨基酸位置292处的脯氨酸(P)；氨基酸位置298处的丙氨酸(A)；氨基酸位置300处的亮氨酸(L)；氨基酸位置305处的异亮氨酸(I)；氨基酸位置324处的苏氨酸(T)；氨基酸位置326处的色氨酸(W)；氨基酸位置326处的丙氨酸(A)；氨基酸位置330处的亮氨酸(L)；氨基酸位置332处的谷氨酸(E)；氨基酸位置333处的丙氨酸(A)；氨基酸位置333处的丝氨酸(S)；氨基酸位置334处的丙氨酸(A)；氨基酸位置336处的丙氨酸(A)；氨基酸位置345处的精氨酸(R)；以及氨基酸位置396处的亮氨酸(L)，根据EU编号。(综述参见Saunders,2009,Front.Immunol.doi:10.3389/fimmu.2019.01296。)

在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含在选自以下位置处的氨基酸取代：氨基酸位置236、239、330和332，根据EU编号。在一些实施方案中，所述取代可以包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)、和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含在选自以下的任两个氨基酸位置处的双重氨基酸取代：氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含在选自以下的任三个氨基酸位置处的三重氨基酸取代：氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含在选自以下的任四个氨基酸位置处的四重氨基酸取代：氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含含有氨基酸239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)的氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含含有氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置处的天冬氨酸(D)和位置332处的谷氨酸的氨基酸取代的组合。

在一些实施方案中，Fc结构域变体可以进一步包含氨基酸位置256和/或307处的氨基酸取代，根据EU编号。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以包含含有氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)的氨基酸取代的组合(参见Mackness等人,2019 MAbs 11:1276-88；WO 2019147973A1，通过引用以其整体并入本文)。

糖基化Fc结构域变体

在某些示例性实施方案中，Fc结构域变体是糖基化的。已知抗体在其恒定区的保守位置处的糖基化对抗体功能具有深远的影响，特别是效应子功能，如上述那些，参见例如Boyd等人(Mol.Immunol,32:1311-1318,1996)。考虑了本发明的Fc结构域变体的糖基化，其中添加、取代、缺失或修饰了一个或多个碳水化合物部分。在一些实施方案中，Fc结构域的糖基化是N连接的糖基化。天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的引入产生碳水化合物部分的酶促附接的潜在位点，并且因此可用于操纵Fc结构域变体的糖基化。在Raju等人(Biochemistry 40:8868-8876,2001)中，通过使用β-1,4-半乳糖基转移酶和/或α,2,3唾液酸转移酶的再半乳糖基化和/或再唾液酸化的过程来增加TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。增加末端唾液酸化被认为会增加免疫球蛋白的半衰期。

与大多数糖蛋白相同，抗体通常作为糖形混合物而产生。当在真核细胞，特别是哺乳动物细胞中产生抗体时，这种混合物尤为明显。已经开发了多种方法来制造定义的糖形(参见Zhang等人2004,Science 303:371；Sears等人,2001,Science 291:2344；Wacker等人,2002,Science 298:1790；Davis等人2002,Chem.Rev.102:579；Hang等人,2001,Acc.Chem.Res.34:727)。在一些实施方案中，所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。已知IgG1的CH2结构域中氨基酸位置297处的天冬酰胺的糖基化有助于Fc结构域与FcγR之间的相互作用。此糖基化位点的消除消除了效应子功能(Leabman等人,2013,MAbs 5:896-903)。在具体示例性实施方案中，Fc结构域在氨基酸位置297处包含野生型水平或接近野生型水平的糖基化，根据EU编号。

在一些实施方案中，所述糖基化Fc结构域变体包含工程化或非天然聚糖。在一些实施方案中，所述工程化或非天然聚糖是可以与治疗性分子缀合的经修饰的聚糖(例如，抗体-药物缀合物)。

具有增强的体内稳定性的Fc结构域变体

在一方面，本公开文本提供了一种包含增强的体内稳定性(例如，延长的血清半衰期或降低的清除率)的分离的Fc结构域变体。如本文所用，术语“体内稳定性”是指本发明公开的效应子感受态多肽用于以下的稳定性：保持完整(例如，有限的降解和/或解折叠)、功能性(例如，保持结合活性)、以及保持血清中的足够高浓度以引发可测量的活性(例如，靶肿瘤细胞杀伤)。在某些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改善的体内稳定性。在某些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有降低的体内清除率。

如本文所用，术语“血清半衰期”是指物质(例如，分离的Fc结构域变体)从最大血清浓度到所述最大血清浓度的一半所用时间。血清半衰期可以部分通过增强的与FcRn的结合亲和力而增强。在某些示例性实施方案中，与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与所述FcRn的增强的结合亲和力。

体内稳定性、血清半衰期和清除率可以通过本领域已知的任何方法确定(参见Valente等人,2020MAbs 12:13https://doi.org/10.1080/19420862.2020.1829337)。举例来说，可以采用实施例7中所述的用于进行药代动力学(PK)分析的方法。

含Fc的结合多肽

在一方面，本公开文本提供了一种分离的Fc结构域变体，其包含或复合有(例如，融合至)至少一个结合结构域(例如，至少一个结合多肽)。在某些实施方案中，所述结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。抗原结合结构域不需要与亲本Fc结构域源自相同的分子。在某些实施方案中，所述Fc结构域变体存在于抗体中。

在一个实施方案中，Fc结构域变体存在于抗体中或与抗体复合。来自任何来源或物种的任何抗体均可以与本文所公开的Fc结构域变体一起使用。合适的抗体包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。合适的抗体包括但不限于全长抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或单结构域抗体，如VHH抗体。

在某些示例性实施方案中，Fc结构域变体可以与抗体的抗原结合片段结合或复合。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与完整抗体(即，与它们所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)。抗原结合片段可以通过本领域熟知的重组或生物化学方法产生。示例性抗原结合片段包括Fv、Fab、Fab'和(Fab')2。在某些示例性实施方案中，本公开文本的结合多肽包含至少一个抗原结合片段和Fc结构域变体。

在一些实施方案中，结合多肽包含单链可变区序列(ScFv)。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单一多肽，例如通过柔性接头与VH结构域连接的VL结构域。ScFv分子可以以VH-接头-VL取向或VL-接头-VH取向构建。连接VL和VH结构域构成抗原结合位点的柔性铰链包括约10至约50个氨基酸残基。连接肽是本领域已知的。结合多肽可以包含至少一个scFv和/或至少一个恒定区。在一个实施方案中，本公开文本的结合多肽可以包含与Fc结构域变体连接或融合的至少一个scFv。

在一些实施方案中，本公开文本的结合多肽是多价(例如，四价)抗体，其通过将编码抗体的DNA序列与ScFv分子(例如，经改变的ScFv分子)融合而产生。例如，在一个实施方案中，组合这些序列使得ScFv分子(例如，改变的ScFv分子)在其N末端或C末端经由柔性接头(例如，gly/ser接头)与Fc结构域变体连接。在另一个实施方案中，本公开文本的四价抗体可以通过将ScFv分子与连接肽融合来制备，所述连接肽与Fc结构域变体融合以构建ScFv-Fab四价分子。

在另一个实施方案中，本公开文本的结合多肽是经改变的微型抗体。本公开文本的改变的微型抗体是由两条多肽链组成的二聚体分子，每条多肽链包含经由连接肽与Fc结构域变体融合的ScFv分子。可以通过使用本领域描述的方法(参见例如美国专利5,837,821或WO 94/09817Al)构建ScFv组分和连接肽组分来制备微型抗体。在另一个实施方案中，可以构建四价微型抗体。可以以与微型抗体相同的方式构建四价微型抗体，不同的是使用柔性接头连接两个ScFv分子。然后将连接的scFv-scFv构建体与Fc结构域变体接合。

在另一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包括双抗体。双抗体是二聚体四价分子，其各自具有与scFv分子类似的多肽，但是通常具有连接两个可变结构域的短(少于10个，例如约1至约5个)氨基酸残基接头，使得在同一多肽链上的VL和VH结构域不能相互作用。相反，一条多肽链的VL和VH结构域(分别)与第二多肽链上的VH和VL结构域相互作用(参见例如，WO 02/02781)。本公开文本的双抗体包含与Fc结构域变体融合的scFv样分子。

在另一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包含单结构域抗体(sdAb)，也称为VHH或nanobody。是Ablynx的注册商标。VHH包含没有轻链的可变重链结构域。与常规VH结构域类似，VHH含有四个FR和三个CDR。VHH具有优于常规抗体的优势。因为它们比IgG分子小约十倍，正确折叠的功能VHH可以通过体外表达产生，同时实现高产量。此外，VHH非常稳定并且对蛋白酶的作用具有抗性。VHH的特性和产生已经综述于Harmsen和De HaardH J(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007年11月；77(1):13-22)中。

在某些示例性实施方案中，Fc结构域与一个或多个VHH融合。

在其他实施方案中，结合多肽包含多特异性或多价抗体，所述多特异性或多价抗体在同一多肽链上串联地包含一个或多个可变结构域，例如串联的可变结构域(TVD)多肽。示例性TVD多肽包括美国专利号5,989,830中描述的“双头”或“双Fv”构型。在双Fv构型中，两种不同抗体的可变结构域在两条单独的链(一条重链和一条轻链)上以串联取向表示，其中一条多肽链具有被肽接头隔开的串联的两个VH结构域(VH1-接头-VH2)，并且另一条多肽链由通过肽接头串联连接的互补VL结构域组成(VL1-接头-VL2)。在交叉双头构型中，两种不同抗体的可变结构域在两条单独的多肽链(一条重链和一条轻链)上以串联取向表示，其中一条多肽链具有被肽接头隔开的串联的两个VH结构域(VH1-接头-VH2)，并且另一条多肽链由通过肽接头以相反取向串联连接的互补VL结构域组成(VL2-接头-VL1)。基于“双Fv”形式的另外的抗体变体包括双可变结构域IgG(DVD-IgG)双特异性抗体(参见美国专利号7,612,181)和TBTI形式(参见US2010/0226923 A1)。在一些实施方案中，结合多肽包括多特异性或多价抗体，所述多特异性或多价抗体包含在与Fc结构域变体融合的同一多肽链上串联的一个或多个可变结构域。

在另一个实施方案中，结合多肽包含基于“双头”构型的交叉双可变结构域IgG(CODV-IgG)双特异性抗体(参见US20120251541 A1，其通过引用以其整体并入本文)。

在其他实施方案中，结合多肽包含CrossMab或CrossMab-Fab多特异性形式(参见WO 2009080253和Schaefer等人,PNAS(2011),108:11187--1191)。基于CrossMab形式的抗体变体在双特异性IgG抗体的一个臂内具有抗体结构域的交叉，从而能够实现正确的链关联。

在其他实施方案中，糖基化的效应子感受态多肽包含呈T细胞衔接器形式的多特异性抗体。“T细胞衔接器”是指针对宿主的免疫系统(更具体地针对T细胞的细胞毒性活性)以及针对肿瘤靶蛋白的结合蛋白。在一些实施方案中，分离的效应子感受态多肽包含呈NK细胞衔接器形式的多特异性抗体。“NK细胞衔接器”是指包含靶向激活NK细胞受体的单克隆抗体片段、抗原特异性靶向区和Fc区的结合蛋白(Gauthier等人Cell(2019),177:1701-13)。

包含本文所述的Fc结构域变体的本公开文本的结合多肽可以包括已知“亲本”抗体的CDR序列或可变结构域序列。在一些实施方案中，除了对本文公开的Fc结构域的修饰之外，亲本抗体和本公开文本的抗体可以共有类似或相同的序列。

在另一个实施方案中，所述结合多肽包含治疗性多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽可以是受体、配体或酶。在一些实施方案中，所述治疗性多肽可以是凝血因子。在一些实施方案中，所述凝血因子选自FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、VWF、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤维蛋白溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、其任何酶原、其任何活性形式及其任何组合。在一些实施方案中，所述治疗性多肽可以是生长因子。生长因子可以选自本领域中已知的任何生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子是激素，在其他实施方案中，所述生长因子是细胞因子。在一些实施方案中，所述生长因子是趋化因子。在一些实施方案中，所述结合多肽包含与本发明的Fc结构域的N末端和/或C末端连接的治疗性分子或治疗性多肽。在一些实施方案中，所述多肽是Fc融合多肽。

核酸和载体

在一方面，提供了编码本文公开的Fc结构域变体和/或结合多肽的多核苷酸。还提供了制造Fc结构域变体和/或结合多肽的方法，所述方法包括表达这些多核苷酸。

通常将编码本文公开的Fc结构域变体和/或结合多肽的多核苷酸插入表达载体中以引入宿主细胞中，所述宿主细胞可以用于产生所需量的要求保护的抗体、治疗性多肽和Fc融合蛋白。因此，在某些方面，本发明提供了包含本文公开的多核苷酸的表达载体以及包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。

出于说明书和权利要求的目的，在本文中使用术语“载体”或“表达载体”来意指用于在细胞中引入和表达所需基因的载体。如本领域技术人员所知，此类载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，载体将包含选择标记、适当的限制性位点以促进所需基因的克隆、以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。

可以采用许多表达载体系统。例如，一类载体利用来源于动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他载体类涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可以通过引入一种或多种标记来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞，所述一种或多种标记允许选择转染的宿主细胞。标记可以针对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂(例如抗生素)抗性或对重金属如铜的抗性来提供。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接，或通过共转化引入同一细胞中。还可能需要另外的元件来最佳地合成mRNA。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方案中，将克隆的可变区基因与如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(如人基因)一起插入表达载体中。

在其他实施方案中，如本文所述的糖基化的效应子感受态多肽可以使用多顺反子构建体来表达。在此类表达系统中，可以从单一多顺反子构建体产生多种目的基因产物，如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的IRES序列在美国专利号6,193,980中披露，所述专利通过引用并入本文。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本申请中公开的全系列多肽。

更一般地，一旦已经制备了编码本公开文本的Fc结构域变体和/或结合多肽的载体或DNA序列，便可以将表达载体引入适当的宿主细胞中。也就是说，可以转化宿主细胞。可以通过本领域技术人员公知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜DNA的细胞融合、显微注射和用完整病毒感染。参见例如，Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"第24.2章,第470-472页Vectors,Rodriguez和Denhardt编辑(Butterworths，波士顿，马萨诸塞州1988)。使转化的细胞在适合于产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。

如本文所用，术语“转化”应在广义上使用，是指将DNA引入受体宿主细胞中，从而改变基因型并因此导致受体细胞的变化。

沿着相同的思路，“宿主细胞”是指已经用载体转化的细胞，所述载体是使用重组DNA技术构建的并且编码至少一种异源基因。在从重组宿主分离多肽的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，以表示抗体来源，除非另外明确指定。换言之，从“细胞”中回收多肽可以意指从离心沉淀的全细胞，或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中回收。

在一个实施方案中，用于表达Fc结构域变体和/或结合多肽的宿主细胞系是真核或原核起源的。在一个实施方案中，用于表达Fc结构域变体和/或结合多肽的宿主细胞系是细菌起源的。在一个实施方案中，用于表达Fc结构域变体和/或结合多肽的宿主细胞系是哺乳动物起源的。本领域技术人员可以确定最适合在其中表达所希望的基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、293(人肾)。在一个实施方案中，细胞系提供由其表达的抗体的改变的糖基化，例如非岩藻糖基化(例如，PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8敲除CHO细胞系(POTELLIGENTTM细胞)(Biowa，普林斯顿，新泽西州))。在一个实施方案中，可以使用NS0细胞。宿主细胞系通常可从商业服务机构、美国组织培养物保藏中心(American TissueCulture Collection)或从公开的文献获得。

体外产生允许按比例放大以得到大量的所需Fc结构域变体和/或结合多肽。用于在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培育的技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养(例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中)，或者固定化或截留式细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷盒上)。如果必要和/或需要的话，可以通过常规色谱方法(例如凝胶过滤、离子交换色谱、在DEAE-纤维素上的色谱和/或(免疫)亲和色谱)纯化多肽的溶液。

编码糖基化Fc结构域变体和/或结合多肽的一种或多种基因也可以在非哺乳动物细胞(如细菌或酵母或植物细胞)中进行表达。在这一方面，应当理解，也可以转化多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌，即能够在培养或发酵中生长的那些微生物。易于转化的细菌包括以下的成员：肠杆菌科，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应理解，当在细菌中表达时，Fc结构域变体和/或结合多肽可以成为包涵体的一部分。必须将Fc结构域变体和/或结合多肽分离，纯化，然后组装成功能性分子。

除原核生物外，还可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其他菌株是通常可获得的。对于在酵母属(Saccharomyces)中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,Nature,282:39(1979)；Kingsman等人,Gene,7:141(1979)；Tschemper等人,Gene,10:157(1980))。此质粒已经含有TRP1基因，所述基因提供针对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变型菌株的选择标记，例如ATCC号44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损伤的存在提供通过在没有色氨酸的情况下生长来检测转化的有效环境。

使用/治疗方法

在一方面，本发明提供了治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的Fc结构域变体。在某些实施方案中，本公开文本提供了用于治疗需要这种治疗的哺乳动物受试者的疾病和障碍(例如癌症)的试剂盒和方法。

本公开文本的Fc结构域变体可用于许多不同的应用。例如，在一个实施方案中，主题Fc结构域变体可用于减少或消除带有被所述Fc结构域变体的结合结构域识别的表位的细胞。在另一个实施方案中，所述主题Fc结构域变体在降低循环中的可溶性抗原的浓度或消除所述可溶性抗原方面是有效的。在另一个实施方案中，主题Fc结构域变体作为T细胞衔接器是有效的。在一个实施方案中，Fc结构域变体可以减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤动物的存活时间。因此，本公开文本还涉及通过向人或动物施用有效无毒量的Fc结构域变体来治疗这种人或其他动物中的肿瘤的方法。

在另一个实施方案中，主题Fc结构域变体可用于治疗其他障碍，包括但不限于传染病、自身免疫障碍、炎性障碍、肺病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、抑郁症等。传染病的非限制性例子包括由RNA病毒(例如，正粘病毒(例如，流感)、副粘病毒(例如，呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、偏肺病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病病病毒)、冠状病毒(例如，SARS-CoV)、甲病毒(例如，基孔肯雅病毒)、慢病毒(例如，HIV)等)或DNA病毒引起的那些传染病。传染病的例子还包括但不限于由例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌属、链球菌属、大肠杆菌引起的细菌性传染病和其他传染病，包括例如由白色念珠菌引起的那些传染病。其他传染病包括但不限于疟疾、SARS、黄热病、莱姆病、利什曼病、炭疽和脑膜炎。示例性自身免疫性障碍包括但不限于银屑病和狼疮。因此，本公开文本涉及治疗各种病症的方法，所述病症将受益于使用具有例如增加的半衰期的主题效应子感受态多肽。

通过常规实验，本领域技术人员将能够确定Fc结构域变体可用于治疗恶性肿瘤的目的的有效无毒量。例如，本公开文本的Fc结构域变体的治疗活性量可以根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病阶段(例如，阶段I与阶段IV)、年龄、性别、医疗并发症(例如，免疫抑制的病症或疾病)和体重，以及经修饰的抗体在所述受试者中引发所需反应的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几个分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧急性所示按比例减少剂量。

一般而言，本公开文本中提供的组合物可用于预防性或治疗性地治疗包含抗原标记的任何肿瘤，所述抗原标记允许所述Fc结构域变体靶向癌细胞。

药物组合物及其施用

制备并向受试者施用本公开文本的Fc结构域变体的方法是本领域技术人员所熟知的或容易确定的。本公开文本的结合多肽的施用途径可以是口服的、肠胃外的、通过吸入或局部的。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。虽然所有这些施用形式被认为明显在本公开文本的范围内，但施用形式将是用于注射、特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选稳定剂(例如人白蛋白)等。在一些实施方案中，Fc结构域变体可以直接递送至不良细胞群的部位，从而增强患病组织对治疗剂的暴露。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性的溶液、悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本公开文本的组合物和方法中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M(例如，0.05M)磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地，适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶的情况下)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在此类情况下，组合物必须是无菌的并且流动性应达到存在可注射性的程度。它应该在制造和储存条件下稳定，并且通常可以抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。

在许多情况下，将在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

在任何情况下，可以通过将活性化合物(例如，Fc结构域变体自身或与其他活性剂组合)以所需的量掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，所述溶剂根据需要具有本文列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，从而从活性成分加任何另外的所需成分的先前无菌过滤的溶液产生其粉末。将注射用制剂加工，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，所述制剂可以试剂盒的形式包装和出售。此类制品通常将具有标签或包装说明书，其表明相关组合物可用于治疗患有或易患自身免疫或肿瘤障碍的受试者。

用于治疗上述病症的本公开文本组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。

可以在多个时机施用本公开文本的Fc结构域变体。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量Fc结构域变体或抗原在患者体内的血液水平所指示，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调整剂量以实现血浆经修饰的结合多肽浓度为约1-1000μg/ml，并且在一些方法中为约25-300μg/ml。可替代地，Fc结构域变体可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要较不频繁的施用。对于抗体，剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人源化抗体显示出最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人抗体。

施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本发明多肽或其混合物的组合物，以增强患者的抵抗力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在此用途中，精确量还取决于患者的健康状态和总体免疫性，但是通常范围从约0.1至约25mg/剂，尤其是从约0.5至约2.5mg/剂。在很长一段时间内以相对较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量(例如，每剂量约1至400mg/kg抗体，其中约5至25mg的剂量更常用于放射免疫缀合物，并且更高剂量用于经细胞毒素-药物修饰的抗体)，直到疾病进展减少或终止，或直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。

本公开文本的Fc结构域变体可任选地与有效治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性)的障碍或病症的其他药剂组合施用。本公开文本的⁹⁰Y标记的经修饰抗体的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)范围在约5与约75mCi之间，如在约10与约40mCi之间。¹³¹I修饰的抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量的范围在约5与约70mCi之间，或在约5与约40mCi之间。¹³¹I标记的抗体的有效单次治疗消融剂量(即，可能需要自体骨髓移植)的范围在约30与约600mCi之间，如在约50与小于约500mCi之间。与嵌合抗体一起，由于与鼠抗体相比更长的循环半衰期，碘-131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量的范围在约5与约40mCi之间，如小于约30mCi。例如，¹¹¹In标记的成像标准通常小于约5mCi。

尽管可以如上文刚刚所述施用Fc结构域变体，但必须强调的是，在其他实施方案中，所述多肽可以作为一线疗法施用至其他方面健康的患者。在此类实施方案中，可以将Fc结构域变体施用至具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或施用至尚未经历治疗和不是正在经历治疗的患者。如本文所用，所述多肽与辅助疗法结合或组合的施用意指依序、同时、同延、并行、伴随或同期施用或施加所述疗法和所公开的抗体。本领域技术人员将理解，可以定时施用或施加组合的治疗性方案的各种组分以增强治疗的总体有效性。

如前所述，本公开文本的Fc结构域变体、抗体、治疗性多肽或其Fc结构域变体融合多肽可以以用于哺乳动物障碍的体内治疗的药学有效量施用。在这一方面，应当理解，所公开的Fc结构域变体将被配制成有利于施用且促进活性剂的稳定性。

根据本公开文本的药物组合物可以包含药学上可接受的无毒无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请的目的，与治疗剂缀合或未缀合的Fc结构域变体的药学有效量应保持意指足以实现与抗原的有效结合且足以获得益处(例如，足以改善疾病或障碍的症状或检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下，所述多肽可以与肿瘤细胞或免疫反应细胞上选择的抗原相互作用，并提供这些细胞死亡的增加。当然，本公开文本的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用，以提供药学有效量的经修饰的结合多肽。

与本公开文本的范围一致，可以将本公开文本的Fc结构域变体按照上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量施用至人或其他动物。可以将本公开文本的Fc结构域变体以常规剂型施用至这种人或其他动物，所述常规剂型通过根据已知的技术将本公开文本的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂组合来制备的。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量，施用的途径和其他公知的变量。本领域技术人员将进一步理解，包含本公开文本所述的一个或多个种类的结合多肽的混合物可以证明是特别有效的。

本文提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文件和电子可用信息通过引用以其整体特此并入，其程度如同每个单独的出版物被具体且单独地指出通过引用并入。申请人保有将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文件的任何和所有材料和信息实际纳入本申请的权利。

虽然已经参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等效方案。本领域技术人员将易于明了，在不背离本文公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等效方案对本文所述的方法进行其他合适的修改和改编。另外，可以进行许多修改以适应特定的情况、材料、物质组成、过程、过程步骤或步骤，以达到本发明的目的、精神和范围。所有此类修改均旨在在所附权利要求的范围内。虽然现已详细描述某些实施方案，但参照以下实施例将更清楚地理解所述实施方案，所述实施例仅出于说明目的而被包括，并且不打算具有限制性。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当被解释为进一步限制。

实施例1：用于增加稳定性的二硫键的计算机模型和鉴定

为了表征在Fc结构域的CH2区中的工程化二硫键的潜在稳定化作用，对取自PDB结构1HZH的Fc结构域进行了分子动力学(MD)模拟。在300K和370K下模拟所有系统，以估计热休克对所述结构域的影响并且确定对所述结构域的潜在弱相互作用。对以下Fc变体进行模拟：WT IgG1 Fc结构域、DE+DQ、ADLE+DQ、DE+DQ+L242C/K334C、DE+DQ+R292C/V302C、ADLE+DQ+L242C/K334C和ADLE+DQ+R292C/V302C。结果被报告为在300K或370K的温度下，残基I332E的疏水接触的平均频率(图1A)以及由相应碳α的均方根波动(RMSF)指数表示的含有所述突变的区域的平均灵活性(图1B)。

结果

在CH2结构域中引入负电荷(I332E)会导致疏水接触平均频率(例如，DQ+DE和DQ+ADLE系统-图1A)的损失，并且潜在地破坏所述结构域的疏水核。R292C+V302C或L242C+K334C突变的引入部分恢复或改善了这些接触。

已针对所有系统监测DQ突变的灵活性指数(RMSF-图1B)，以估计对所有变体的半衰期延长的潜在影响。在DQ突变的情况下包含I332E突变的系统似乎在位置256和307处相对于WT显示出更高的灵活性。DSB稳定化的引入似乎部分地改善了针对WT行为的灵活性指数(例如，DQ DE L242C+K334C-图1B)。

图2描绘了具有结构上紧密靠近的I332E(绿色CPK绘制)和L242C+K334C工程化二硫键(橙色CPK绘制)的Fc CH2结构域结构域(呈线-带)上的DSB移植的例子。

图3中的两个图像之间的结构比较指出，I332E突变在CH2结构域的疏水核内引入了负电荷。这种突变导致疏水核内疏水性接触的损失，并且因此已经被确定为关于较差热稳定性的潜在驱动现象。

计算机研究的原理是找到二硫化物稳定化的可能位置，以创建新的共价硫-硫接触，以恢复由于疏水性网络破坏而导致的焓损失，从而挽救在正常N-糖基化的CH2结构域折叠的基础的疏水性网络。先前已经测试了几个二硫键来稳定非糖基化的IgG1(参见，Gong等人2009.J.Biol.Chem.284,14203-14210；Jacobsen等人2017.J.Biol.Chem.292,1865-1875)。其中，两个二硫化物方案符合上述假设，并且位置和突变是L242C+K334C和R292C+V302C(参见图4)。

作为阴性对照，选择远离位置332的两个残基以引入二硫桥，位置和突变为A287C+L306C。此二硫化物稳定化侧接疏水核并且位于作为IgG CH2结构域的特征的β折叠的边界处(参见图5)。即使引入共价硫-硫键可以稳定非糖基化的IgG1支架，但是与I332E突变的距离应使这种二硫化物稳定化被认为在含有I332E突变的增强的效应子功能支架内是无效的。

二硫键的计算机模型以及其对与C1q、FcγRIIIa、FcγRIIa和FcRn结合的影响

使用计算机模型确定二硫键对与C1q、FcγRIIIa、FcγRIIa和FcRn的结合的影响。

材料与方法

已经对可用的晶体结构进行了此分析，PDB ID：6FCZ-C1q、与GASDALIE Fc复合的5D6D-FcγRIIIa、3RY6-FcγRIIa和4N0U-FcRn。必须考虑两个结构的低分辨率(6FCZ-基于与C1q复合的Fc的低温EM结构的模型，以及3RY6-与FcγRIIa复合的Fc的分辨率为的X射线结构)，并且结论可能由于分辨率差而有偏差。已经通过选择所有距受体/>内的Fc残基来确定相互作用残基，并且用增强效应子功能突变和DSB突变进行交叉检查。由于选择的相互作用距离高于上述两个晶体结构的分辨率(分别为/>和/>)，这应该会减少偏差，这应当仅在确定残基-残基直接相互作用评价的情况下才是决定因素，而在确定整个相互作用表面的情况(即当前情况)下不是决定因素。

与C1q的接触残基

此分析表明，对于Fc链1和链2，在两个CH2结构域中发现的最接近的残基分别是以下。

Fc链1：E233、L234、L235、G236、G237、K322、S324、N325、K326、A327、L328、P329、A330、P331、E333。残基G236和A330分别在ADLE和ADE方案中带有突变G236A和A330L。A330(在ADLE中的L)与C1q受体直接接触，并且当突变为亮氨酸时可能对结合有直接影响。此外，P331与C1q直接接触，并且位于I332前(ADE/DE/ADLE中的E)。

Fc链2：H268、E269、E294、S298、Y300。这些位置不包含任何工程化突变，既不增强效应子功能也不稳定。

基于此分析，DE、ADE和ADLE突变可能会影响与C1q的结合，这是由于与C1q受体接触或接近的残基所致。在最接近C1q的残基内未发现DSB位置，并且不应影响与C1q的结合。T256D和T307Q突变远离相互作用表面，并且因此不应影响与C1q的结合。

与FcγRIIIa的接触残基

此分析表明，对于Fc链1和链2，在两个CH2结构域中发现的最接近的残基分别是以下：Fc链1：A236、G237、P238、D239、D265、V266、S267、H268、D270、Y296、N297、S298、T299和A327。

Fc链2：G236、G237、P238、S239、K326、A327、L328、P329、A330、I332。

以粗体显示的残基属于DE、ADE和ADLE增强效应子功能突变。它解释并且报道了增加与FcγRIIIa的结合。鉴于上述位置均不包含DSB突变，这不应影响与FcγRIIIa的结合。T256D和T307Q突变远离相互作用表面，并且因此不应影响与FcγRIIIa的结合。

与FcγRIIa的接触残基

此分析表明，对于Fc链1和链2，在两个CH2结构域中发现的最接近的残基分别是以下：Fc链1：L235、G236、G237、P238、K326、A327、L328、P329。残基G236在ADLE和ADE方案中带有突变G236A。

Fc链2：L234、L235、G236、G237、P238、S239、V264、D265、V266、S267、N297、S298、T299。

残基G236和S239分别在ADLE、ADE和DE方案中带有突变G236A和S239D。基于此分析，ADLE突变可能会影响与FcγRIIa的结合。然而在最接近FcγRIIa的残基内未发现DSB位置，并且不应影响与FcγRIIa的结合。T256D和T307Q突变远离相互作用表面，并且因此不应影响与FcγRIIa的结合。

与FcRn的接触残基

基于结构分析，DSB位置不应对FcRn结合表面产生影响。DSB突变的位置不是FcRn结合表面的一部分，并且也不靠近包含所述结合表面的CH2-CH3弯部(elbow)。

对DSB的杵臼结构(KIH)和RF突变的影响

基于结构分析，DSB不应对RF或KIH方案产生任何影响，因为它们属于Fc链的不同IgG结构域(对于DSB，属于CH2结构域，并且对于KIH和RF突变，属于CH3结构域)。

实施例2：稳定的变体的构建和表征

单克隆抗体(mAb)通过引入点突变，用增强的效应子感受态Fc骨架格式化(Lazar等人,PNAS,103:4005-10(2006))。引入Fc结构域中的突变是：1)氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)(“DE”变体)；2)氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)(“ADE”变体)或3)氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)(“ADLE”变体)(参见Smith等人,PNAS,109:6181-86(2012))。引入了另外的突变以增加带有Fc的多肽的半衰期。在氨基酸位置256处引入天冬氨酸(D)并且在氨基酸位置307处引入谷氨酰胺(Q)。氨基酸位置编号基于EU编号。

为了产生具有更高热稳定性的DE、ADE和ADLE变体，引入了半胱氨酸取代以工程化链内二硫键。用半胱氨酸对取代以下位置处的氨基酸：1)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；和2)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)。氨基酸位置编号基于EU编号。

将点突变引入编码人IgG1 Fc结构域的核酸序列中。然后将这些核酸序列与mAb1(针对存在于免疫细胞表面的蛋白质抗原的IgG1抗体)的可变结构域的编码序列融合，并且克隆到含有巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子和SV40多聚A信号的哺乳动物表达质粒中。根据制造商的说明，将所得质粒转染到HEK293细胞中。

mAb1变体的人IgG1重恒定结构域的氨基酸序列

mAb1

mAb1(wt)(IgG1)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

mAb1-DE(残基D239和E332加下划线)

mAb1-DE-DQ(残基D239、E332、D256、Q307加下划线)

mAb1-DE-DQ-L242C-K334C(残基D239、E332、D256、Q307、C242和C334加下划线)

mAb1-DE-DQ-R292C-V302C(残基D239、E332、D256、Q307、C292和C302加下划线)

mAb1-DE-R292C-V302C(残基D239、E332、C292和C302加下划线)

mAb1-DE-L242C-K334C(残基D239、E332、C242和C334加下划线)

mAb1-ADE(残基A236、D239和E332加下划线)

mAb1-ADE-DQ(残基A236、D239、E332、D256和Q307加下划线)

mAb1-ADE-DQ-R292C-V302C(残基A236、D239、E332、D256、Q307、C292和C302加下划线)

mAb1-ADE-DQ-L242C-K334C(残基A236、D239、E332、D256、Q307、C242和C334加下划线)

mAb1-ADE-R292C-V302C(残基A236、D239、E332、C292和C302加下划线)

mAb1-ADE-L242C-K334C(残基A236、D239、E332、C242和C334加下划线)

mAb1-ADLE(残基A236、D239、L330、E332加下划线)

mAb1-ADLE-DQ(残基A236、D239、L330、E332 D256、Q307加下划线)

mAb1-ADLE-DQ-L242C-K334C(残基A236、D239、L330、E332、D256、Q307、C242和C334加下划线)

mAb1-ADLE-DQ-R292C-V302C(残基A236、D239、L330、E332、D256、Q307、C292和C302加下划线)

mAb1-ADLE-R292C-V302C(残基A236、D239、L330、E332、C292和C302加下划线)

mAb1-ADLE-L242C-K334C(残基A236、D239、L330、E332、C242和C334加下划线)

mAb1变体以1.5升规模产生并且通过两步法纯化，所述两步法包括用PBS平衡的蛋白A亲和色谱法(HI Screen MAbSelect Sure蛋白A，Cytiva)和尺寸排阻色谱法(HI Load26/600superdex 200pg，Cytiva)。通过使用至多10mg/mL的Sartorius Vivaspin 10KDa浓缩级分合并物(pool)。然后将样品过滤灭菌，并且在4℃下储存直至使用。通过UV、在还原和非还原条件下的LabChip GXII touch HT protein、SEC-HPLC和LC-MS分析多个批次的定量、纯度和身份。在用Lys-C、胰蛋白酶或胰蛋白酶+Glu-C丝氨酸蛋白酶混合物进行酶消化后，经由包含LC_MS(Q-Tof)的提取离子色谱法(XIC)分析工程化二硫键，以进行肽作图。

结果

表1.抗体产生

产生多个批次，并且用预期的曲线进行表征。与任何其他构建体相比，A287C+L306C构建体的样品产量非常低。通过XIC确定二硫键，并且如预期的那样存在另外的二硫键，如图6(具有mAb1 ADLE DQ和DSB突变型的二硫键的XIC曲线)以及图7A和图7B(具有mAb1_DE和DSB突变型和mAb1_ADE&DSB突变型的二硫键的XIC曲线)所示。

为了测试具有Fc变体的mAb的热稳定性，将mAb以10mg/mL稀释于PBS中。通过纳米格式的差示扫描荧光测定法(nanoDSF)和Prometheus NT48使用标准毛细管来确定热稳定性，并且以1℃/分钟的加热速率从20℃至95℃施加线性温度梯度。

NanoDSF使用蛋白质固有荧光的变化来监测随温度升高而变化的蛋白质解折叠。使用266 nm波长的光源激发蛋白质溶液，以及在330 nm和350 nm下酪氨酸和色氨酸残基的荧光发射。酪氨酸和色氨酸残基的发射最大值和强度高度依赖于它们的直接环境，并且可以在热变性期间随着蛋白质解折叠而变化。监测330 nm和350 nm下的荧光强度比率随温度的变化产生S形曲线，所述曲线表示蛋白质的解折叠转变。S形曲线的中点表示熔化温度(Tm)。蛋白质开始解折叠时的可检测温度是T起始。存在三个拐点(IP)，两个对应于Fc结构域的CH2和CH3，并且第三个拐点对应于Fab结构域。Tagg是蛋白质展现出聚集趋势时的温度。

ADE、DE和ADLE变体的热稳定性研究的结果可在表2和图8和图9A-图9B中找到。NanoDSF使用蛋白质固有荧光的变化来监测随温度升高而变化的蛋白质解折叠。监测330nm和350 nm下的荧光强度比率随温度的变化产生S形曲线，所述曲线表示蛋白质的解折叠转变。S形曲线的中点表示熔化温度(Tm)。蛋白质开始解折叠时的可检测温度是T起始。记录了三个拐点(IP)：两个对应于Fc结构域的CH2和CH3，并且第三个拐点对应于Fab结构域。Tagg是蛋白质开始聚集时的温度。

表2.具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb1的热稳定性

所有Fab都非常稳定，Tm在82℃与83℃之间。

WT IgG1(mAb1)的T起始是65℃，并且对于具有或不具有DQ突变的mAb1 ADLE、ADE和DE的T起始低于50℃。另一方面，当引入R292C_V302C或L242C_K334C DSB时，T起始远高于50℃，像野生型IgG1分子。对于含有R292C_V302C或L242C_K334C DSB的分子，IP Fc高于60℃，像野生型IgG1。在具有或不具有DQ增强的半衰期突变的ADCC增强的Fc ADLE、ADE或DE的情况下，R292C_V302C或L242C_K334C DSB的引入恢复了热稳定性。

在没有DQ增强的半衰期突变的ADCC增强的Fc ADLE、ADE或DE中，A287C_L306CDSB没有恢复热稳定性。

mAb2

基于mAb2(针对免疫细胞表面的G偶联蛋白受体(GCPR)的IgG1单克隆抗体)制备以下其他Fc变体：mAb2(wt)(野生型IgG1 Fc)、mAb2-DE(对应于具有另外的取代S239D和I332E的mAb2)、mAb2-DE-R292C/V302C(对应于具有另外的取代R292C和V302C的mAb2-DE)和mAb2-R292C/V302C(对应于具有取代R292C和V302C的mAb2 wt)。

使用与上文针对mAb1所述相同的方法测试mAb2wt、mAb2-DE、mAb2-DE-R292C/V302C和mAb2-R292C/V302C的热稳定性，并且结果提供在表3中。

表3具有或没有二硫键的具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb2的热稳定性

克隆	TM1(℃)
		mAb2-R292C/V302C	73.0
mAb2 wt(对照)	71.9
		mAb2-DE-R292C/V302C	67.9
mAb2-DE	51.0

这些结果表明，mAb2中的DE突变导致较低的热稳定性(mAb2 wt的Tm为71.9℃，而mAb2-DE的Tm为51.0℃)，并且二硫键的引入恢复了热稳定性(Tm 67.9℃)。

mAb3

基于mAb3(针对免疫细胞表面存在的蛋白质抗原和癌细胞表面存在的蛋白质抗原的IgG1单克隆二价双特异性CODV-OL1抗体)制备了以下其他Fc变体：mAb3(wt)(野生型IgG1Fc)、mAb3-DE(对应于具有另外的取代S239D和I332E的mAb3)、mAb3-DE-R292C/V302C(对应于具有另外的取代R292C和V302C的mAb3-DE)、mAb3-ADE(对应于具有另外的取代G236A、S239D和I332E的mAb3)和mAb3-ADE-R292C/V302C(对应于具有另外的取代R292C和V302C的mAb3-ADE)。

如下产生mAb3抗体：

使编码相应构建体不同链的表达质粒在大肠杆菌(E.coli)DH5a中繁殖。使用EndoFree Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。使用聚乙烯亚胺转染试剂用所指示的质粒转染在F17无血清悬浮培养(Invitrogen)中生长的HEK 293-FS细胞。在37℃与8％ CO2下培育6天之后，通过离心去除细胞，并且使上清液通过0.22μm过滤器以去除颗粒。在MabSelect SuRe(Cytiva)上捕获蛋白质，并且用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH3.0洗脱，并且用1M Tris pH 9中和。在通过使用Superdex200 26/60(Cytiva)的尺寸排阻色谱法(SEC)和0.22μm过滤精制蛋白质并进行UV280浓度确定之后，将蛋白质用于进一步表征。产量报告在下表4中。

表4具有或没有二硫键的具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb3的产量

具有正常IgG1 Fc骨架的抗体显示大于20mg/L的样品产量，而Fc骨架中具有ADE或DE突变的抗体显示样品产量的低于10mg/L的降低。含有具有ADE或DE突变并且具有二硫键的IgG1 Fc的抗体显示出与WT相似的样品产量和样品产量的4至6倍的增加，其中mAb3-DE-R292C/V302C和mAb3-ADE-R292C/V302C示出了大于20mg/L的样品产量。

用与上文针对mAb1所述相同的方法测试mAb3抗体的热稳定性，并且结果提供在表5中。

表5具有或没有二硫键的具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb3的热稳定性

克隆	T起始	Tm1
			mAb3-WT	58.5	64.3
mAb3-DE	40.4	47.5
			mAb3-ADE	41.2	46.8
mAb3-DE-R292C/V302C	57.8	65.9
			mAb3-ADE-R292C/V302C	57.5	65.9

具有正常IgG1 Fc骨架的mAb3是稳定的，Tm1为64.3℃且T起始为58.5℃。在IgG1Fc中具有ADE或DE突变的mAb3分子显示低于50℃的Tm1和T起始。含有具有ADE或DE突变且具有二硫键的IgG1 Fc的分子示出了热稳定性的提高。mAb3-DE-DSB分子显示65.9℃的Tm1和57.8℃的T起始，并且mAb3-ADE-DSB显示65.9℃的Tm1和57.5℃的T起始。

mAb3内二硫键R292C/V302C的化学完整性

Fc CH2结构域上的二硫键(DSB)的工程化提高了稳定性。为了确保mAb3内的工程化DSB R292C_V302C和ADE突变(G236A/S239D/I332E)不会异常地影响DSB还原行为，通过DTT和随后的胰蛋白酶肽作图来测量还原速率。

材料和方法

还原敏感性测定

进行DTT在PBS-E中的连续稀释(测定中的最终DTT浓度：20、10、5、2、1、0.5、0.2和0.1mM)。使用旋转脱盐柱将蛋白质批次FF-20-819-1、FF-20-821-1和FF-21-170-5透析到PBS-E缓冲液中，以确保在还原期间获得pH 7.2。将蛋白质样品归一化为在PBS-E中的1.5mg/mL。将两份归一化的样品与一份每种DTT稀释液添加到PCR板中，并且在添加后混合。在一分钟内从最低浓度到最高浓度的DTT浓度进行此步骤。通过在ThermostatCThermoblock上在25℃下孵育10分钟进行还原。通过向所有孔中添加3份NEM储备溶液来使反应淬灭。为了确保测定的一致性，在一分钟内从最低至最高DTT浓度进行NEM添加，并且在添加后混合。将制备的板在室温下保存，直到通过毛细管凝胶电泳(cGE)和质谱法(肽作图)进行测量。

下表6A和表6B分别含有还原敏感性测定和毛细管凝胶电泳的试剂和材料列表。

表6A-还原敏感性测定的试剂和材料列表

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表6B-毛细管凝胶电泳(cGE)的试剂和材料列表

进行还原敏感性测定后，根据制造商的说明，通过使用Protein Clear HR测定的非还原方案测量样品。

为了制备芯片，允许所有测定组分平衡至室温。根据制造商的说明，将ProteinClear HR凝胶基质与Protein Clear HR染料溶液混合并且过滤，然后将其添加到冲洗的芯片孔中。

根据制造商的说明，将所提供的测定对照VeriMAb-标准物稀释于非还原性样品缓冲液中，在70℃下变性10分钟，并且与水混合，并且将其放置在LabChip GXII Touch仪器中进行测定校准。在水中1:10稀释Protein Clear HR梯后，将所指示体积的梯溶液和ProteinClear HR洗涤缓冲液转移到相应的管中，并且放入LabChip GXII Touch仪器中。在测量样品之前，校准过程已经成功完成。

为了制备样品，将来自还原敏感性测定的5μL的每个样品添加到PCR板中的18μL的非还原样品缓冲液中，将板密封，并且使样品在Thermostat C Thermoblock上在70℃下变性10min。变性后，将样品用35μL水稀释。将制备的测定板在室温下储存，直到用LabChipGXII Touch仪器对其进行测量。

测量后，使用LabChip Reviewer软件分析数据。将相对峰面积≥0.85％的所有峰积分。将剩余完整分子的相对峰面积[％]针对DTT浓度作图，并且通过4参数逻辑斯谛模型/S型剂量-反应模型(XLfit，Dose Response One Site，模型205)拟合曲线。使用不添加DTT的样品的面积进行标准化，并且将其设置为100％。使用剩余50％完整分子的每个样品的DTT浓度作为EC50值，以评价分子对还原的敏感性。

胰蛋白酶肽作图实验的还原测定后的抗体样品制备

进行还原敏感性测定后，使样品经历消化程序。通过用0.5mL Zeba旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，目录号89883)进行的缓冲液交换，使用0.2mol/L组氨酸氯化物，5.6mmol/L盐酸胍pH 6，使100μg的每个抗体样品变性。重复一次缓冲液交换，以确保完全去除NEM。然后，通过添加10mmol/L TCEP(三(2-羧乙基)膦，Thermo Fisher Scientific，目录号T2556)使样品在37℃下还原1h。随后，用0.5mL Zeba旋转脱盐柱(Thermo FisherScientific，目录号89883)将缓冲液交换为20mmol/L组氨酸氯化物，0.5mmol/L TCEP，pH6。将抗体以1:20的酶与底物比率在37℃下用胰蛋白酶中消化过夜。通过添加7μL的10％甲酸溶液来停止消化，并且将样品在-80℃下冷冻直至进一步分析。

通过液相色谱法串联质谱法检测经修饰的肽

使用与配备有EASY-ETD离子源的orbitrap FUSION^TM LUMOS^TM TRIBRID^TM质谱仪(Thermo Fisher Scientific，圣何塞，加利福尼亚州，美国)偶联的VANQUUISH^TM FlexUHPLC系统来分析肽。

对于肽分离，使用二元溶剂系统：(A)0.1％甲酸和(B)90％乙腈，0.1％甲酸。将2μg的胰蛋白酶消化的样品在HYPERSIL GOLD^TM C18 LC柱(150mm x 2.1mm，1.9μm粒度，ThermoFisher Scientific，目录号25003-152130-V)上用以下的1h梯度分离：线性渐增浓度的溶剂B持续50min，随后在95％ B下洗涤5min，并且在5％溶剂B中再平衡5min。通过以下关键设置检测在所述柱上分离的肽：以120,000的分辨率(以200m/z定义)获得完整的MS谱，质量范围设置为375-2000，自动增益控制(AGC)目标为4.0e5，最大注射时间为50ms和1μscan。在200ms的注射时间内累积5.0e4 AGC目标之后，使用15,000的分辨率(以200m/z定义)以前5种数据依赖性模式获得数据依赖性(MS/MS)光谱。将离子在1.6Th分离窗处分离，并且以30％归一化碰撞能量使用HCD、EThcD或ETciD片段化。将动态排除设置为10s。

数据处理

将获得的MS数据使用Expressionist软件(GeneData 13.5版)处理并且手动检查以确保正确的分配和相对定量准确性。针对样品分子的氨基酸序列搜索质谱。关键设置是MS和MS/MS谱的质量公差，分别设置为10ppm。使用来自Expressionist的IgG N-聚糖文库，认为在搜索参数内的翻译后修饰是对半胱氨酸的NEM修饰和常见的N末端糖基化。

结果

如下表6C所示，从剂量反应曲线计算EC50值。通过毛细管电泳(cGE)测量的通过DTT对未还原样品的主峰的还原对于mAb3 wt、mAb3ADE和mAb3 ADE-DSB是相同的，表明ADE突变和CH2结构域中工程化的二硫键都对蛋白质的还原敏感性没有影响。

通过肽作图分析的来自还原敏感性测定的蛋白质mAb3 wt、mAb3 ADE和mAb3 ADE-DSB展现出还原敏感的分子间二硫键(DSB)的类似还原行为。基于剂量反应曲线，估计三种蛋白质的EC50值在1.2-1.5mM DTT的范围内，表明工程化DSB与典型的分子间DSB是类似地还原稳定的。

表6C-从通过毛细管电泳(cGE)测量的DTT对未还原样品的主峰的还原的剂量反应曲线计算的EC50值

蛋白质样品	EC50[mM DTT]
		Adapt_标准物(mAb对照)	0.8
mAb3 wt	1.2
		mAb3 ADE	1.2
mAb3 ADE-DSB	1.2

mAb4

基于mAb4(针对免疫细胞表面存在的蛋白质抗原和癌细胞表面存在的蛋白质抗原的IgG1单克隆四价双特异性CODV抗体)制备以下其他Fc变体：mAb4(wt)(野生型IgG1Fc)、mAb4-DE(对应于具有另外的S239D和I332E取代的mAb4)、mAb4-DE-R292C/V302C(对应于具有另外的取代R292C和V302C的mAb4-DE)、mAb4-R292C/V302C(对应于具有R292C和V302C取代的mAb4 wt)、mAb4-ADE(对应于具有另外的取代G236A、S239D和I332E的mAb4)和mAb4-ADE-R292C/V302C(对应于具有另外的取代R292C和V302C的mAb4-ADE)。

如下产生mAb4抗体：

使编码相应构建体不同链的表达质粒在大肠杆菌DH5a中繁殖。使用EndoFreePlasmid Mega试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。使用聚乙烯亚胺转染试剂用所指示的质粒转染在F17无血清悬浮培养(Invitrogen)中生长的HEK 293-FS细胞。在37℃与8％ CO2下培育6天之后，通过离心去除细胞，并且使上清液通过0.22μm过滤器以去除颗粒。在MabSelect SuRe(Cytiva)上捕获蛋白质，并且用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.0洗脱，并且用1M Tris pH 9中和。在通过使用Superdex200 26/60(Cytiva)的尺寸排阻色谱法(SEC)和0.22μm过滤精制蛋白质并进行UV280浓度确定之后，将蛋白质用于进一步表征。产量报告在下表7中。

表7：具有或没有二硫键的具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb4的产量

克隆	样品产量(mg/L)
		mAb4-WT	30.6
mAb4-DE	2.7
		mAb4-ADE	4.7
mAb4-DE-R292C/V302C	17.9
		mAb4-ADE-R292C/V302C	19.4

具有正常IgG1 Fc的mAb4分子显示出30.6mg/L的样品产量，而在Fc部分中具有ADE或DE突变的mAb4分子显示出样品产量显著降低，其值低于5mg/L。含有具有ADE或DE突变且具有二硫键的IgG1 Fc的mAb4分子显示出样品产量的提高。mAb4-DE-R292C/V302C显示出17.9mg/L的样品产量，并且mAb4-ADE-R292C/V302C显示19.4mg/L的样品产量。

使用与上文针对mAb1所述相同的方法测试mAb4抗体的热稳定性，并且结果提供于表8中。

表8：具有或没有二硫键的具有野生型IgG1或具有增强的Fc结构域的mAb4的热稳定性

克隆	T起始	Tm1
			mAb4-WT	59.0	66.4
mAb4-DE	45.3	50.3
			mAb4-ADE	44.6	49.9
mAb4-DE-R292C/V302C	59.4	67.2
			mAb4-ADE-R292C/V302C	58.2	66.6

具有正常IgG1 Fc的mAb4分子是稳定的，Tm1为66.4℃且T起始为59℃。在IgG1 Fc中具有ADE或DE突变的mAb4分子显示出50℃或低于50℃的Tm1和T起始。含有具有ADE或DE突变且具有二硫键的IgG1 Fc的mAb4分子示出了热稳定性的提高。mAb4-DE-R292C/V302C分子显示67.2℃的Tm和59.4℃的T起始，并且mAb4-ADE-R292C/V302C显示66.6℃的Tm和58.2℃的T起始。

图10描绘了如通过纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)所确定，对于DE、ADE、DE+DSB和ADE+DSB，二硫化物稳定化的热稳定性作用。左小图描绘了mAb3并且右小图描绘了mAb4。使用R292C/V302C的稳定化导致热稳定性增益约10℃。

实施例3：稳定的mAb1变体的结合参数

方法和材料

使用流式细胞术确定mAb1与表达靶抗原的几种重组细胞系的二价EC50结合：人preB-300.19细胞、食蟹猴preB-300.19细胞、HEK293T-FcγRIIIa F158、FcγRIIIa V158和CHO-人FcRn表达细胞(GenScript；M00603)。将细胞在96孔板中培养直到达到40,000个细胞/孔的密度。在4℃下添加mAb(100μL/孔)持续45min。孵育后，将孔用PBS+1％ BSA洗涤三次。在4℃下添加山羊抗人IgG-Alexa488抗体持续45min，并且用PBS+1％ BSA洗涤三次。在细胞的离心和通过添加200μL/孔的PBS+1％ BSA重悬后评价抗体结合，并且使用GuavaeasyCyte 8HT流式细胞术系统评价结合。分别使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED软件估计表观KD和EC50值。

在HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4)中在25℃下在Biacore T200仪器上通过表面等离子体共振(SPR)测定来测量与huFcγRIIIa蛋白的抗体结合动力学。人FcγRIIIa_His蛋白(huFcγRIIIa_V158；huFcγRIIIa_F158)以0.05μg/mL被捕获在抗His表面(用抗His抗体固定的CM5传感器芯片)上。注射从2.5μM开始的一系列抗体浓度持续1min，并且监测解离3.5min(30μL/min)。用10mM甘氨酸-HCl pH 1.5的1min脉冲(10μL/min)使抗His表面再生。

在PBST缓冲液(1.5mM KH2PO4，2.7mM Na2HPO4-7H2O，300mM NaCl，0.05％ Tween-20，pH 6.0)中在25°下在Biacore T200仪器上通过SPR来测量与人FcRn(huFcRn)蛋白的抗体结合动力学。huFcRn在传感器芯片_CAP-链霉亲和素上被捕获。然后注射从2μM开始的一系列抗体浓度持续1min并且监测解离1.5min(30μL/min)。用6M盐酸胍、0.25M NaOH的一次2min脉冲(10μL/min)使所述表面再生。

抗原结合(FACS)

mAb1变体与人和食蟹猴靶抗原二者结合的结果可在表9中找到。与引入Fc结构域中的突变无关，与靶抗原的结合是相似的。对于人靶抗原，EC50值在0.65与0.85nM之间，并且对于食蟹猴靶抗原，EC50值在1.36与1.78之间。引入工程化二硫键没有影响与靶抗原的结合。

表9：如通过FACS测量的与靶抗原的结合

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huFcγRIIIaV/F158动力学和FACS

通过SPR和FACS测量mAb与人FcγRIIIa蛋白的结合。结果可以在表10中找到。对于具有包含DE、ADE和ADLE突变的Fc结构域的所有变体，相比于具有WT IgG1的抗体与FcγRIIIa V158或F158的结合，与FcγRIIIa V158或F158的结合显著改善，如通过FACS和SPR测量的。对于FcγRIIIA V158(分别地，FcγRIIIA F158)，如通过FACS所测量改善10至100倍，并且通过SPR所测量改善6至20倍(分别地，18至29倍)。工程化二硫键(L242C/K334C或R292C/V302C)的引入没有影响mAb1与FcγRIIIa V158或F158的结合。

表10：如通过FACS和SPR测量的与FcγRIIIa V158和F158的结合

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huFcγRIIaH/R131动力学和FACS

通过SPR和FACS测量mAb与人FcγRIIa蛋白的结合。结果可以在表11中找到。当在存在或不存在DQ突变的情况下引入DSB R292C_V302C或L242C_K334C突变时，与IgG1相比，与呈IgG1_ADE形式的FcyRIIA的改善的亲和力消失了。在IgG1_ADLE或DE形式中，在有和没有DSB突变的情况下，对FcyRIIA的亲和力保持较低。

表11：如通过FACS和SPR测量的与FcγRIIa H131和R131的结合

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huFcRn动力学和FACS

huFcRn结合研究的结果可以在表12中找到。对于含有具有DQ突变的Fc变体的所有mAb，与不具有DQ突变的Fc相比，与huFcRn的结合得到改善。当Fc含有_DQ突变时，DSB的引入维持这种改善。

表12：如通过FACS和SPR测量的与huFcRn的结合

实施例4：稳定的mAb2变体的结合参数

方法和材料：

表面等离子体共振测定

使用表面等离子体共振(SPR)的Fcγ受体结合

使用抗His捕获在Biacore T200仪器上进行与重组人FcγRIIIa-V158的抗体结合的分析。将抗四His(Qiagen)缓冲液交换到PBS pH 7.2(Gibco)中，在10mM乙酸钠pH 4.0中稀释至25μg/mL，并且使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒将其直接固定到系列S CM5芯片上，表面密度为约10,000RU。将His标记的重组人FcγRIIIa-V158(内部产生)在HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20)中稀释至0.5和1μg/mL，并且以10μL/min的流速注射30sec，以获得6和14RU的捕获水平。在运行缓冲液中将mAb2-wt抗体从3000至37nM连续稀释3倍，并且将mAb2-DE抗体稀释至111、37、12和4nM，并且一式两份在捕获的受体上注射2min，然后在缓冲液中解离2min。用10mM甘氨酸pH 1.5使表面再生30sec。使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)处理传感图，并且拟合到1:1结合模型以获得动力学常数。报告的KD是从两个捕获水平取平均值。

使用表面等离子体共振(SPR)的FcRn结合

使用抗Fab捕获方法在Carterra LSA仪器上进行与重组人、食蟹猴(cyno)和小鼠FcRn的抗体结合的分析。将山羊抗人IgG(F(ab')2特异性)(Jackson Labs)在10mM乙酸钠pH4.5中稀释至20μg/mL并且在25mM MES pH 6.0、0.05％ Tween-20运行缓冲液中使用由Carterra提供的胺偶联试剂直接固定在HC200M芯片上，表面密度为约9,000RU。将mAb2抗体一式两份地在单独的象限中在PBSP+pH 6.0(20mM NaPi，2.7mM KCl，137mM NaCl，0.05％表面活性剂P20)中以6和15μg/mL以捕获阵列格式印刷至抗Fab表面上。将每个种类的FcRn(内部产生)在PBSP+pH 6.0中连续稀释2倍，并且在捕获的mAb2上注射用于2或3min缔合，然后解离5min，以测量在pH 6.0下的亲和力。每个浓度系列含有总共10个FcRn浓度，其中最高浓度具有FcRn物种特异性：4000nM、2000nM食蟹猴和500nM小鼠FcRn。缓冲液注射在受体注射之间均匀分布，以减去适当的空白。为了测量在pH7.4下的FcRn结合，如上所述捕获mAb2抗体，同时在PBSP+pH 7.4中将人和食蟹猴FcRn稀释至1000nM，并且将小鼠FcRn稀释至500nM，并且在捕获的mAb2上注射用于2分钟缔合，然后解离2min。用Carterra K.I.T.InspectionTool处理传感图并且拟合至1:1结合模型，以获得pH 6.0下的动力学常数，或缔合阶段结束时在pH 7.4下计算稳态反应。报告的结合亲和力是从来自人FcRn的两个单独测定运行以及食蟹猴和小鼠FcRn的单个测定运行的所有mAb2印刷物取平均值。

结果：

表13：与huFcgRIIIa-V158的结合亲和力

与huFcgRIIIa-V158的结合的SPR结果示出了对mAb2-wt、mAb2-R292C/V302C的可比较的亲和力。mAb2-DE和mAb2-DE-R292C/V302C示出了比WT或WT变体高22-39倍的与huFcgRIIIa-V158的结合亲和力，并且对彼此具有可比较的亲和力。

表14：在pH 6.0下与FcRn的结合亲和力

结果表明，在mAb2-wt上或在mAb2-DE上添加R292_V302C突变对与人、食蟹猴或小鼠FcRn的结合亲和力没有显著影响。所有分子与每个物种的亲和力是可比较的。

表15：在pH 7.4下对FcRn的稳态结合反应

结果表明，在测试的条件下，在中性pH下，没有mAb2分子与人、食蟹猴或小鼠FcRn结合。

实施例5：稳定的mAb3变体与人CD16a的结合参数

mAb3和mAb4两者均具有能够结合CD16a的Fc结构域。测量与CD16a的结合以证明DSB取代(R292C/V302C)不消除CD16a结合。如表16所示，与单独的DE或ADE变体相比，所有DSB变体都具有相等或更大的与两种CD16a变体(V158或F158)的结合。

表16：mAb3和mAb4与人CD16a的结合参数

实施例6：二硫键稳定的变体的体外表征

mAb1

A-评估变体在体外诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。

材料和方法：

使用表达靶标的DND41细胞系(T-ALL，T细胞急性成淋巴细胞性白血病细胞，Leukemia8:425-434(1994))评价mAb1的CDC能力。将细胞以3.106悬浮于RHBP培养基(不含酚红的RPMI 1640，0.1％ BSA，2mM HEPES，2mM谷氨酰胺)中。

将细胞以1.5x10⁵个细胞/孔铺板在96孔板中，并且在4℃下与25μl的抗体变体一起预孵育30分钟，所述抗体变体具有从167.5nM开始至0.08nM的连续稀释浓度，稀释因子为2。

在第二步骤中，每孔添加25μL的人补体(Sigma，Ref：S1764-1mL，重悬于1mL H2O+4mL RHBP中)，并且将板在37℃与5.5％的CO₂下孵育2小时。添加WST-1溶液(Roche，Ref 11644 807 001；10μL/孔)，并且将板在37℃与5.5％ CO₂下再次孵育2小时。

根据制造商的方案，在SpectraMax Plus分光光度计(Molecular Devices)上在440nm处测量吸光度。每个点一式三份进行。

如下计算活力％：

活力％＝((OD_样品-OD培养基)x100)/(OD_不含抗体的细胞-OD培养基)。

OD：光密度

数据是三个独立实验的总结。

报告的结果是IC50值的几何平均值、CV和死亡率的δ(表17至表19)，以及ADE形式、ADLE形式和DE形式的CDC活性的代表性例子(图11、图12和图13)。使用Biost@t-SPEED v2.4计算值。

结果：

表17：mAb1+/-ADLE、DE或ADE+/-DSB(L242C_K334C或R292C_V302C)的CDC活性IC50值

NA：未获得拟合

使用ADLE形式和包含ADLE形式的所有另外的突变没有检测到CDC活性，表17和图11。而CDC活性是用DE或ADE形式测量的，并且不会随着在DE或ADE形式中引入的另外的二硫键突变而改变。

表18：mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-R292C_V302C的CDC活性IC50值

*仅在3个测定中的1个中获得拟合

**在3个测定中的2个中获得拟合

使用ADLE形式以及使用另外的DQ和R292C_V302C二硫键突变未检测到CDC活性。而CDC活性是用DE形式和ADE形式测量的。当在DE形式中引入另外的DQ和R292C_V302C二硫键突变时，活性降低。当在ADE形式中引入另外的DQ和R292C_V302C二硫键突变时，CDC活性丧失(表18和图12)。

表19：mAb1+ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-L242C_K334C的CDC活性IC50值

使用ADLE形式以及使用另外的DQ和L242C_K334C二硫键突变未检测到CDC活性。而CDC活性是用DE形式和ADE形式测量的。当在DE形式中引入另外的DQ和L242C_K334C二硫键突变时，活性降低。当在ADE形式中引入另外的DQ和L242C_K334C二硫键突变时，CDC活性丧失(表19和图13)。

B-评估变体在体外诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。

材料和方法：

使用表达由mAb1识别的抗原的LP1细胞系(MM，人多发性骨髓瘤细胞，Blood.1989年3月；73(4):1020-7)作为靶细胞以及自然杀伤细胞系NK92 FCGR3A 158V(Conkwest)作为效应细胞来评价ADCC能力。

将靶细胞用钙黄绿素-乙酰氧基甲基(2mM；Invitrogen，Ref C3100MP)标记，并且以2x10⁵重悬于测定培养基(不含酚红的RPMI 1640，1％ SVF，0.77mg/mL丙磺舒，Invitrogen，P36400)中。

将靶细胞(T)以2x10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并且在37℃与5％的CO₂下和50μl的抗体变体一起预孵育30分钟，所述抗体变体具有连续稀释浓度，对于IgG1野生型从2.3nM开始，稀释因子为3，并且对于ADLE、ADE和DE变体从1.25nM开始，稀释因子为7。

作为最大钙黄绿素释放水平的阳性对照，将靶细胞与0.5％ Triton一起孵育。

将效应细胞(E)以6x10⁵重悬于测定培养基中，并且将100μL或6x10⁴个效应细胞添加到每孔的靶细胞(1:3的T:E比率)。在5％ CO₂下在37℃下孵育3小时后，将100μl的培养上清液转移到黑色96孔板中，并且在492nm激发和515nm发射下在EnVision 2104板读取器(PerkinElmer)上通过荧光测量钙黄绿素的释放。每个点一式三份进行。

如下计算细胞毒性％：

细胞毒性％＝((RLU_样品-RLU培养基)x100)/(RLU_阳性对照Triton-RLU培养基)。

RLU：相对光单位

数据是至少三个独立实验的总结。对于每个变体和每个实验，计算IC50值和死亡率百分比的δ。报告的结果是IC50值的几何平均值、CV和死亡率的δ(表20)，以及ADLE形式、ADE形式和DE形式的ADCC活性的代表性例子(图14-图16)。使用Biost@t-SPEED v2.4计算值。

结果：

表20：mAb1+/-ADLE、DE或ADE+/-DSB(L242C_K334C或R292C_V302C)的ADCC活性IC50值

NA：未获得拟合。

当在ADLE形式中引入DSB突变L242C_K334C或R292C_V302C时，用这种形式测量的ADCC活性维持在相同范围内。类似地，当在DE和ADE形式中引入这些DSB突变时，保持用这些形式测量的ADCC活性(表20和图14)。

表21：mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-R292C_V302C的ADCC活性IC50值

当在ADLE形式中引入具有或不具有R292C_V302C的另外的DQ突变时，用这种形式测量的ADCC活性维持在相同范围内。类似地，当在DE和ADE形式中引入具有或不具有R292C_V302C的另外的DQ突变时，维持用这些形式测量的ADCC活性(表21和图15)。

表22：mAb1+/-ADLE、DE或ADE-/+DQ+/-DSB L242C_K334C的ADCC活性IC50值

当在ADLE形式中引入具有或不具有L242C_K334C的另外的DQ突变时，用这种形式测量的ADCC活性维持在相同范围内。类似地，当在DE和ADE形式中引入具有或不具有L242C_K334C的另外的DQ突变时，维持用这些形式测量的ADCC活性(表22和图16)。

mAb3

为了证明具有DSB取代与ADE或DE取代组合的抗体的效力没有丧失，用mAb3进行细胞毒性测定。

如图17所示，在ADE或DE背景中，包括DSB取代(R292C_V302C)没有影响mAb3的活性。

实施例7：二硫键稳定的变体的PK分析

此实施例描述了DSB稳定的变体对PK曲线的影响

mAb1

材料和方法：

小鼠实验是在源自C57BL/6小鼠并且购自杰克逊实验室(巴尔港，缅因州)的纯合转基因Tg32(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ)小鼠中进行的。FcRn-/-hFcRn(32系)Tg小鼠携带小鼠基因的无效突变和在其天然人启动子控制下表达hFcRnα链转基因的转基因。

在研究开始时，所有小鼠均为8周龄与12周龄之间的首次进行治疗的雌性。对于给药，将抗体在DPBS1X配制缓冲液中制备，并且以1mg/kg的单次静脉内剂量以10mL/kg的剂量体积施用至尾静脉中。在28天的研究持续时间内，对于每种抗体使用连续采样方法(0.08、4、24、72、168、240、336、504和672小时)评价总共3只动物重复。按采样时间收集血液样品(约20μL)。将血液样品在4℃下以1500g离心10分钟，并且将6μL的血浆样品在60μL的DPBS1X中稀释，然后在-80℃下储存直至分析。

对于mAb1 WT抗体，使用以下通用方法通过自底向上LC-MS/MS测定来确定每个时间点的每种抗体的浓度。在血浆等分试样沉淀后，使血浆沉淀物经历蛋白质变性、还原、烷基化、胰蛋白酶消化和固相提取，然后分析替代肽。根据其选择性和反应因子，为每种抗体选择对应于属于mAb1轻链的17个氨基酸残基序列的替代肽用于定量。通过将抗体以1、2、5、10、20、50、100、200和400μg/mL掺入血浆中来制备校准标准物。在Waters Acquity UPLC系统上采用反相XBridge BEH C18柱(2.1x150mm，3.5μM，Waters)以300μL/min流速以在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸的分级式梯度进行肽分离。对于检测，以阳离子模式使用Sciex API6500+质谱仪，其中源温度为700℃，离子喷雾电压为5500V，气帘气和雾化气体为40并且碰撞气在中间。驻留时间为30ms，并且每次转化的入口电位为10V。去簇电压为90V，并且碰撞能量为26V。使用来自Analyst软件的MQIII积分算法的峰面积，相对于标准物和对照，将抗体的独特替代肽的多重反应监测转化(626.0à807.4m/z)用于浓度确定。

对于mAb1变体(ADE、DE、ADLE、DE-DQ和ADLE-DQ变体)，使用Gyrolab平台(Gyros)通过通用免疫测定方法确定每个时间点的每种抗体的浓度，其呈分级三明治形式。将样品(标准物、质量对照和研究样品)在缓冲液中稀释100倍，并且分配到96孔微量滴定板中。将捕获和检测试剂分配到第二个96孔微量滴定板中。然后将96孔微量滴定板和bioaffyCD(CD200-含有112个微结构化区段)装载到Gyrolab平台上。以下步骤由Gyrolab平台自动触发：在Gyrolab Bioaffy圆盘(CD200)内的链霉亲和素珠柱上添加生物素化的驴抗hu-IgG(捕获)，然后分配标准物、质量对照和研究样品，然后添加AlexaFluor-山羊抗hu-IgG(检测)。使用设置在1％的光电倍增管在每个微结构化区段中进行柱上荧光测量(λ激发633 nm，λ发射650 nm)。所有分析一式两份进行，并且定量范围为100至200000 ng/mL。

PK参数由单个动物数据确定，使用Phoenix WinNonlin 8.1版(Certara L.P.)中的非隔室分析。

从PK计算中排除了来自一只施用mAb1-ADLE_DQ_L242C_K334C的动物的PK曲线，所述曲线示出了浓度急剧下降(ADA干扰特有的)。由于给药问题，一只施用mAb1-DE_DQ_R292C_V302C的动物也被排除在PK分析之外。

结果：

表23：Tg32小鼠中测试的不同抗体的PK参数的总结(平均值(CV％))

用DE_DQ和ADLE_DQ的两个DSB位置(L242C-K334C和R292C-V302C)观察到相似的PK曲线和参数。DSB位置改善了DE_DQ和ADLE_DQ突变的构建体的PK特性，其消除半衰期增加3至9倍，并且清除率降低4至10倍。ADLE_DQ_DSB的消除半衰期略长于WT，而DE_DQ_DSB的t1/2z与WT相似(图18)。

也生成了没有DQ取代的mAb1变体的PK曲线。结果描绘于表24和图19中。

不论突变如何(ADE、DE或ADLE)，使用两个DSB位置(L242C-K334C和R292C-V302C)观察到相似的PK曲线和参数。与DE和ADLE突变的构建体相比，DSB位置明显改善了DE和ADLE突变的构建体的PK特性，其消除半衰期增加2.5-3倍，并且清除率降低了2.5-3倍。对于ADE突变的构建体，通过添加DSB对PK特性的改善不太明显。然而，具有DSB的所有突变的构建体的PK参数与WT构建体相似，DSB在体内稳定突变的构建体。

表24：Tg32小鼠中测试的不同抗体的PK参数的总结(平均值(CV％))

mAb3

材料和方法：

对于mAb3 ADE和ADE-DSB(R292C/V302C)变体，使用以下通用方法通过自底向上的LC-MS/MS测定来确定每个时间点的浓度：血浆等分试样沉淀后，使血浆沉淀物经历蛋白质变性、还原、烷基化、胰蛋白酶消化和固相萃取，然后分析替代肽。根据其选择性和反应因子，为每种抗体选择对应于属于Fab区(轻链)的替代肽VYACEVTHQGLSSPVTK用于定量。通过将抗体以1、2.8、7、14、40、80和100μg/mL掺入血浆中来制备校准标准物。在Shimadzu UHPLC系统上采用反相XBridge BEH C18柱(2.1x150mm，3.5μM，Waters)以600μL/min流速以在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸的分级式梯度进行肽分离。对于检测，以阳性产物离子模式使用Sciex API6600 TripleTOF质谱仪，其中源温度为500℃，离子喷雾电压为5500V，气帘气为35并且雾化气体为50。每个实验的驻留时间为15ms。去簇电压为90V，并且碰撞能量为26V。使用来自MultiQuant软件的MQ4积分算法的峰面积，相对于标准物和对照，将抗体的独特替代肽的626.0m/z亲本离子的807.4098m/z片段用于浓度确定。

对于mAb3 WT抗体，使用Gyrolab平台(Gyros)通过通用免疫测定方法来确定每个时间点的浓度，其呈分级三明治形式。将样品(标准物、质量对照和研究样品)在缓冲液中稀释100倍，并且分配到96孔微量滴定板中。将捕获和检测试剂分配到第二个96孔微量滴定板中。然后将96孔微量滴定板和bioaffy CD(CD200-含有112个微结构化区段)装载到Gyrolab平台上。以下步骤由Gyrolab平台自动触发：在Gyrolab Bioaffy圆盘(CD200)内的链霉亲和素珠柱上添加生物素化的驴抗hu-IgG(捕获)，然后分配标准物、质量对照和研究样品，然后添加AlexaFluor-山羊抗hu-IgG(检测)。使用设置在1％的光电倍增管在每个微结构化区段中进行柱上荧光测量(λ激发633nm，λ发射650nm)。所有分析一式两份进行，并且定量范围为100至200000ng/mL。

使用mAb3进行了类似的PK研究。如表25和图20所示，与mAb3 WT相比，mAb3上的ADE突变导致更高的CL和更短的消除半衰期。在mAb3-ADE构建体上添加DSB(R292C/V302C)明显改善了化合物的PK特性。mAb3 WT和mAb3-ADE-DSB构建体展现出相似的清除率和消除半衰期。

表25：Tg32小鼠中测试的不同mAb3抗体的PK参数的总结(平均值(CV％))

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Claims

1.一种分离的效应子感受态多肽，所述分离的效应子感受态多肽包含：

含有第一重链和第二重链的糖基化Fc结构域，其中至少一条重链包含由一对半胱氨酸(C)介导的工程化的链内二硫键，所述半胱氨酸取代：

(i)氨基酸位置242处的亮氨酸(L)和氨基酸位置334处的赖氨酸(K)；

或

(iii)氨基酸位置292处的精氨酸(R)和氨基酸位置302处的缬氨酸(V)；

其中所述氨基酸位置根据EU编号；

其中所述糖基化Fc结构域能够与抗体效应子分子相互作用；并且

其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性。

2.根据权利要求1所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。

3.根据权利要求1所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述糖基化Fc结构域包含工程化或非天然聚糖。

4.根据权利要求3所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述工程化或非天然聚糖是可以与治疗性分子缀合的经修饰的聚糖。

5.根据权利要求1所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述第一重链包含所述半胱氨酸对。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述第一重链和所述第二重链各自包含所述半胱氨酸对。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。

9.根据权利要求8所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述IgG1 Fc结构域是人IgG1Fc结构域。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体效应子分子是FcRn。

11.根据权利要求10所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与所述FcRn的增强的结合亲和力。

12.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体效应子分子是FcγRIIIa。

13.根据权利要求12所述的分离的效应子感受态多肽，其中与包含野生型Fc结构域的多肽相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与FcγRIIIa的增强的结合亲和力。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改变的血清半衰期。

15.根据权利要求14所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有延长的血清半衰期。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置332处的取代，根据EU编号。

17.根据权利要求16所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置332处的取代是谷氨酸(E)。

18.根据权利要求16或17所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236、239或330处的一个或多个取代，根据EU编号。

19.根据权利要求18所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置236处的取代是丙氨酸(A)。

20.根据权利要求18所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置239处的取代是天冬氨酸(D)。

21.根据权利要求18所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置330处的取代是亮氨酸(L)。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

23.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

24.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256和/或307处的取代，根据EU编号。

26.根据权利要求25所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置256处的取代是天冬氨酸(D)。

27.根据权利要求25所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述氨基酸位置307处的取代是谷氨酰胺(Q)。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

29.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

30.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

31.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

32.一种分离的效应子感受态多肽，所述分离的效应子感受态多肽包含：

或

其中所述糖基化Fc结构域能够与抗体效应子分子相互作用并且包含氨基酸位置332处的谷氨酸(E)；

其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用并且包含氨基酸位置332处的谷氨酸(E)的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性；并且

其中所述氨基酸位置根据EU编号。

33.根据权利要求32所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。

34.根据权利要求32或33所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述糖基化Fc结构域包含工程化或非天然聚糖。

35.根据权利要求34所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述工程化或非天然聚糖是可以与治疗性分子缀合的经修饰的聚糖。

36.根据权利要求32所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述第一重链包含所述半胱氨酸对。

38.根据权利要求32-36中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述第一重链和所述第二重链各自包含所述半胱氨酸对。

39.根据权利要求32-38中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述经修饰的Fc结构域是经修饰的人Fc结构域。

40.根据权利要求39所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述经修饰的Fc结构域是经修饰的人IgG1 Fc结构域。

41.根据权利要求32-40中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体效应子分子是FcRn。

42.根据权利要求41所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与所述FcRn的增强的结合亲和力。

43.根据权利要求32-40中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体效应子分子是FcγRIIIa。

44.根据权利要求43所述的分离的效应子感受态多肽，其中与包含野生型Fc结构域的多肽相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与FcγRIIIa的增强的结合亲和力。

45.根据权利要求32-44中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改变的血清半衰期。

46.根据权利要求45所述的分离的效应子感受态多肽，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有延长的血清半衰期。

47.根据权利要求32-46中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，所述分离的效应子感受态多肽进一步包含：

(i)氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)；

(ii)氨基酸位置236处的丙氨酸(A)；

(iii)氨基酸位置330处的亮氨酸(L)；

(iv)氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)；和/或

(v)氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)。

48.根据权利要求47所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

49.根据权利要求47所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

50.根据权利要求47中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

51.根据权利要求47-50中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

52.根据权利要求47-51中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于相同重链上。

53.根据权利要求47-51中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于不同重链上。

54.根据权利要求32-53中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述分离的效应子感受态多肽进一步包含结合结构域。

55.根据权利要求54所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。

56.根据权利要求55所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述一个或多个抗原结合结构域与肿瘤抗原特异性结合。

57.根据权利要求55所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述一个或多个抗原结合结构域与免疫细胞上的抗原特异性结合。

58.根据权利要求32-57中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多肽是抗体。

59.根据权利要求58所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多肽是单克隆抗体。

60.根据权利要求58或59所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

61.根据权利要求58-60中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体是全长抗体。

62.根据权利要求32-57中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多肽是单结构域抗体。

63.根据权利要求62所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述单结构域抗体是VHH抗体。

64.根据权利要求32-57中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述抗体是多特异性抗体。

65.根据权利要求64所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多特异性抗体具有选自以下的形式：DVD-Ig、基于CODV的形式即CODV-Ig、CrossMab、CrossMab-Fab或TandemFab。

66.根据权利要求64或65所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多特异性抗体是T细胞衔接器。

67.根据权利要求64或65所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多特异性抗体是NK细胞衔接器。

68.根据权利要求54所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述结合多肽包含治疗性多肽。

69.根据权利要求68所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述治疗性多肽可以是受体、配体或酶。

70.根据权利要求54-59中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述结合多肽与所述Fc结构域的N末端和/或C末端连接。

71.根据权利要求32-70中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述分离的效应子感受态多肽能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)耗尽靶细胞。

72.根据权利要求71所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述靶细胞是癌细胞。

73.根据权利要求71所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述靶细胞是免疫细胞。

74.根据权利要求32-57中任一项所述的分离的效应子感受态多肽，其中所述多肽是Fc融合多肽。

75.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码根据权利要求1-74中任一项所述的分离的效应子感受态多肽的核酸。

76.一种载体，所述载体包含根据权利要求75所述的分离的核酸分子。

77.根据权利要求76所述的载体，其中所述载体是表达载体。

78.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求76或77所述的载体。

79.根据权利要求78所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核或原核起源的。

80.根据权利要求78或79所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物起源的。

81.根据权利要求78或79所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌起源的。

82.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-74中任一项所述的分离的效应子感受态多肽。

83.一种增加分离的效应子感受态多肽的产量的方法，所述方法包括表达包含第一重链和第二重链的糖基化Fc结构域，其中至少一条重链包含由一对半胱氨酸(C)介导的工程化的链内二硫键，所述半胱氨酸取代：

或

其中所述氨基酸位置根据EU编号；

其中与具有不包含所述工程化的链内二硫键的能够与抗体效应子分子相互作用的糖基化Fc结构域的效应子感受态多肽相比，所述效应子感受态多肽具有增强的热稳定性；以及

纯化所述效应子感受态多肽，其中与包含野生型糖基化Fc结构域的多肽相比，所述多肽的产量增加。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述糖基化Fc结构域包含氨基酸位置297处的天然聚糖，根据EU编号。

85.根据权利要求83所述的方法，其中所述糖基化Fc结构域包含工程化或非天然聚糖，即可以与治疗性分子缀合的任选地经修饰的聚糖。

86.根据权利要求83所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽是N-糖基化的。

87.根据权利要求83-86中任一项所述的方法，其中所述第一重链包含所述半胱氨酸对。

88.根据权利要求83-86中任一项所述的方法，其中所述第一重链和所述第二重链各自包含所述半胱氨酸对。

89.根据权利要求83-88中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。

91.根据权利要求83-90中任一项所述的方法，其中所述抗体效应子分子是FcRn。

92.根据权利要求91所述的方法，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与所述FcRn的增强的结合亲和力。

93.根据权利要求83-90中任一项所述的方法，其中所述抗体效应子分子是FcγRIIIa。

94.根据权利要求93所述的方法，其中与包含野生型Fc结构域的多肽相比，所述分离的效应子感受态多肽具有与FcγRIIIa的增强的结合亲和力。

95.根据权利要求83-94中任一项所述的方法，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有改变的血清半衰期。

96.根据权利要求95所述的方法，其中与野生型Fc结构域相比，所述分离的效应子感受态多肽具有延长的血清半衰期。

97.根据权利要求83-96中任一项所述的方法，其中所述分离的多肽进一步包含一个或多个增强效应子功能的氨基酸取代，任选地氨基酸位置332处的取代，根据EU编号。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述氨基酸位置332处的取代是谷氨酸(E)。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236、239或330处的一个或多个取代，根据EU编号。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述氨基酸位置236处的取代是丙氨酸(A)。

101.根据权利要求99所述的方法，其中所述氨基酸位置239处的取代是天冬氨酸(D)。

102.根据权利要求99所述的方法，其中所述氨基酸位置330处的取代是亮氨酸(L)。

103.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

104.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

105.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)，根据EU编号。

106.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽进一步包含氨基酸位置256和/或307处的取代，根据EU编号。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述氨基酸位置256处的取代是天冬氨酸(D)。

108.根据权利要求106所述的方法，其中所述氨基酸位置307处的取代是谷氨酰胺(Q)。

109.根据权利要求83-108中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

110.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

111.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、和氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

112.根据权利要求83-102中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域进一步包含氨基酸位置236处的丙氨酸(A)、氨基酸位置239处的天冬氨酸(D)、氨基酸位置330处的亮氨酸(L)、氨基酸位置332处的谷氨酸(E)、氨基酸位置256处的天冬氨酸(D)和氨基酸位置307处的谷氨酰胺(Q)，根据EU编号。

113.根据权利要求97-112中任一项所述的方法，其中所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于相同重链上。

114.根据权利要求97-112中任一项所述的方法，其中所述一个或多个取代与所述工程化二硫键位于不同重链上。

115.根据权利要求83-114中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽进一步包含结合多肽。

116.根据权利要求115所述的方法，其中所述结合多肽包含一个或多个抗原结合结构域。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述一个或多个抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。

118.根据权利要求117所述的方法，其中所述一个或多个抗原结合结构域与免疫细胞上的抗原特异性结合。

119.根据权利要求83-118中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽是抗体。

120.根据权利要求119所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽是单克隆抗体。

121.根据权利要求119或120所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

122.根据权利要求119-121中任一项所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。

123.根据权利要求83-118中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽是单结构域抗体。

124.根据权利要求123所述的方法，其中所述单结构域抗体是VHH抗体。

125.根据权利要求119-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。

126.根据权利要求125所述的方法，其中所述多特异性抗体具有选自以下的形式：DVD-Ig、基于CODV的形式即任选地CODV-Ig、CrossMab、CrossMab-Fb或Tandem Fab。

127.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述多特异性抗体是T细胞衔接器。

128.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述多特异性抗体是NK细胞衔接器。

129.根据权利要求115所述的方法，其中所述结合多肽包含治疗性多肽。

130.根据权利要求129所述的方法，其中所述治疗性多肽可以是受体、配体或酶。

131.根据权利要求115-130中任一项所述的方法，其中所述结合多肽与所述Fc结构域的N末端和/或C末端连接。

132.根据权利要求83-131中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)耗尽靶细胞。

133.根据权利要求132所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。

134.根据权利要求132所述的方法，其中所述靶细胞是免疫细胞。

135.根据权利要求83-118中任一项所述的方法，其中所述分离的效应子感受态多肽是Fc融合多肽。

136.一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-74中任一项所述的效应子感受态多肽。

137.根据权利要求136所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。

138.根据权利要求136所述的方法，其中所述疾病或障碍是炎性疾病。

139.根据权利要求136所述的方法，其中所述疾病或障碍是自身免疫性疾病。