KR102365669B1 - 이중특이 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

이중특이 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체, 이를 제조하는 방법, 단백질 복합체를 포함한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 이를 이용한 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이에 따르면, 증가된 안정성을 갖는 이중특이 항체 또는 항원-결합 단편, 수용체와 수용체에 결합하는 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 사이토카인 또는 수용체 유인(decoy) 이중접합체를 쉽게 제조할 수 있고, 질병 예방 또는 치료, 및 질병 진단 등 다양한 분야에 활용 가능하다.

Description

이중특이 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이를 제조하는 방법{Bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof and method for preparing the same}
헤테로다이머 형성률이 높은 이중특이 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
자연적인 인간 면역글로불린(immunoglobulin: Ig)은 서로 동일한 두 개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain)가 결합된 형태로 이루어져 있다. 또한, 면역글로불린은 기능적으로 항원-항체 결합을 이루는 Fab(antigen-binding fragment) 영역과 2 개의 중쇄가 다이머(dimer)를 형성하는 Fc(fragment crystallizable) 영역으로 나눌 수 있다. 이러한 자연적 면역글로불린, 즉 단일클론 항체(monoclonal antibody: mAb)는 일반적으로 두 개의 Fab 영역이 서로 동일하기 때문에, 동일한 항원의 동일한 결합위치(epitope)를 표적으로 작용하고, 2가(bi-valent)의 단일특이적(mono-specific)인 결합특성을 가진다.
면역글로불린은, Fab 영역이 가지는 표적-특이적 항원 결합 기능과 Fc 영역이 가지는 면역세포 유도 및 생체 내 반감기 증가 기능으로 인해, 다양한 질병의 치료제로서 널리 활용되고 있다. 그러나 최근 들어 암 또는 자가면역질환과 같은 난치성 질환에서, 서로 다른 표적에 작용하는 두 가지 약물을 함께 사용해 시너지를 내는 치료법이, 단일 약물을 사용하는 것 보다 높은 치료 효과를 보이게 되면서, 두 가지 표적물질에 작용할 수 있는 다양한 이중특이(bi-specific) 항체들이 개발되고 있다.
이렇게 개발된 이중특이 항체 중, 서로 다른 항체의 가변 부위 절편들을 폴리펩티드 사슬로 연결한 scFv-scFv 형태의 이중항체는, 분자량이 작고 안정성이 낮아 생체 내에 오래 머무르며 약효를 지속할 수 없다는 단점을 가진다. 또한 자연적인 면역글로불린의 폴리펩티드 말단에 다른 항체의 가변부위 절편을 연결한 scFv-Fab-Fc 또는 Fab-Fc-scFv 형태의 이중항체는, 구조적 안정성이 낮아 응집물(aggregate)을 형성하고 생체 내에서 면역원성(immunogenicity)을 나타낼 수 있는 단점이 있다. 때문에 이러한 문제들을 해결하기 위하여, 가급적 자연적인 면역글로불린의 형태를 따르면서 서로 다른 가변 부위를 가지는 이중항체의 개발이 필요하다.
이러한 형태의 이중항체가 형성되기 위해서는, 서로 다른 두 Fab-Fc의 Fc 영역 간에 헤테로다이머(heterodimer) 형성이 이루어져야 한다. Fc 헤테로다이머 형성에는 각각의 CH3 도메인이 서로 상호작용하는 위치의 아미노산들이 중요하게 작용하므로, 이들 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 방식으로 Fc 헤테로다이머 기술 개발이 이루어지고 있다(미국 특허번호 5731168 A (1998.03.24), 한국 특허번호 10-2098919(2020.04.02)).
그러나 이렇게 개발된 기존의 Fc 헤테로다이머 기술들도 모든 Fc 구조체를 100% 헤테로다이머 형태로 만들지 못하는 한계를 가지고 있으며, 헤테로다이머와 호모다이머의 혼합물을 형성하게 된다.
따라서, 헤테로다이머 형성 효율이 개선된 단백질 복합체, 이를 포함하는 이중특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 수용체와 수용체에 결합하는 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 및 수용체 유인(decoy) 이중접합체 등을 개발할 필요성이 있다.
일 양상은 헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체를 포함한 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체를 이용한 질병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 제1 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하는 단백질 복합체를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366번째 위치에 트립토판(W)을 포함하고, 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 및 407 위치에 발린(V)을 포함하고; 및 제1 CH3 항체 불변 영역 및 제2 CH3 항체 불변 영역 중 하나 이상은 351 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 단백질 복합체는 제1 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 헤테로다이머(heterodimer)를 형성할 수 있다.
용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin: Ig)"과 상호 교환적으로 사용된다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond: SS-bond)으로 결합한다. 상기 경쇄(light chain)는 λ, κ 2가지 종류가 있으며 대략 211 내지 217개의 아미노산으로 구성되어 있다. 사람의 항체 각각에는 모두 동일하게 1가지의 경쇄만이 존재한다. 경쇄는 불변 영역과 가변 영역이 연속적으로 이루어져 있다. 상기 중쇄(heavy chain)는 5가지(γ, δ, α, μ, ε) 종류가 있으며 중쇄가 항체의 종류를 결정짓는다. α와 γ는 450개, μ 와 ε는 550개의 아미노산으로 구성되어 있다. 중쇄는 두 영역 즉 가변 영역과 불변 영역이 있다. 상기 가변 영역(variable region)은 항체에서 항원이 결합하는 영역을 의미한다. 상기 가변 영역은 항원과의 결합 특이성을 부여하는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함할 수 있다.
상기 항체는 항원에 결합하는 Fab(antigen-binding fragment) 영역과 세포 표면 수용체에 결합하는 Fc(fragment crystallizable) 영역을 포함할 수 있다. 파파인(papain)으로 절단할 경우, 완전한 항체는 2개의 Fab와 1개의 Fc 영역으로 절단될 수 있다. Fab 영역은 중쇄의 가변 영역(VH) 도메인과 중쇄의 불변 영역1(CH1) 도메인을 포함한 폴리펩티드와 경쇄의 가변 영역(VL) 도메인과 경쇄의 불변 영역(CL) 도메인의 폴리펩티드가 이황화 결합으로 연결된 것일 수 있다. Fc 영역은 중쇄의 불변 영역2(CH2) 도메인과 불변 영역3(CH3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 2개가 연결된 것일 수 있다. Fc 영역은 힌지 영역을 형성할 수 있다.
상기 CH3 항체 불변 영역은 항체의 중쇄 불변 영역3 도메인을 의미한다.
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 항체의 Fc 영역을 형성할 수 있다.
상기 헤테로다이머(heterodimer) 또는 이종이합체는 아미노산 잔기의 순서, 개수, 또는 종류가 서로 다른 두 개의 폴리펩티드가 결합한 것을 의미한다. 상기 단백질 복합체는 서로 다른 표적에 특이적으로 결합하는 두 개의 폴리펩티드가 결합하여 형성된 이중특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 단백질 복합체는 이중특이(bispecific) 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 수용체와 작용제(agonist)의 접합체, 수용체와 길항제(antagonist)의 접합체, 수용체와 리간드(ligand)의 접합체, 또는 리간드와 유인(decoy) 수용체의 접합체일 수 있다. 또한, 상기 단백질 복합체는 항원-결합 단편(Fab), 단쇄 가변 단편(scFv), 막 수용체의 세포외 도메인, 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 유인(decoy) 수용체, 사이토카인, 응고 인자 및 친화성 태그로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항체는 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM일 수 있다. 상기 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 동물 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 또는 인간 항체일 수 있다.
용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')2, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "이중특이(bispecific)"는 서로 다른 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 것을 의미한다. 이중특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상이한 표적 항원을 인식하는 두 개의 항원 결합 부위를 가진 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 이중특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중특이 항체(Bispecific antibody: BsAb)로도 불릴 수 있다.
상기 이중특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 kih(knob into hole) IgG, scFv-Fc, scFv2-Fc, 트리오맙(TrioMab), IgG-유사(IgG-like) 항체, CrossMab, 2:1 CrossMab, 2:2 CrossMab, DuoBody, DVD-Ig(dual variable domain immunoglobulin), scFv-IgG, IgG-IgG, Fab-scFv-Fc, ADPTIR, BiTE(bispecific T cell engager)-Fc, DART(Dual affinity retargeting)-Fc, Tetravalent DART-Fc, LP-DART, CODV(cross-over dual variable)-Ig, CODV-Fab-TL, HLE(half-life extended)-Bite, Tandem VHH(heavy chain-only variable domain)-Fc, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "수용체(receptor)"는 생물학적 시스템으로 전달될 수 있는 신호를 받거나 전달하는 물질을 의미한다. 상기 수용체는 단백질 수용체일 수 있다. 상기 수용체는 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand) 또는 사이토카인(cytokine)에 결합할 수 있다. 상기 작용제는 수용체와 결합하여 수용체를 활성화시켜 생물학적 반응을 유도하는 물질일 수 있다. 상기 길항제는 수용체와 결합하여 수용체를 억제하여 생물학적 반응을 억제하는 물질일 수 있다. 상기 리간드는 수용체에 결합하는 물질일 수 있다. 상기 리간드는 유인(decoy) 수용체와 결합할 수 있다. 유인 수용체는 리간드에 특이적으로 결합함으로써, 실제 수용체를 통한 신호전달을 저해하는 수용체를 의미한다. 상기 사이토카인은 세포의 신호전달, 염증 과정의 조절 및 유지에 작용하는 소형 단백질을 의미한다.
상기 단백질 복합체는 변형된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 복합체는 접합(conjugation) 또는 결합, 당화(glycosylation), 태그 부착, 또는 이들의 조합으로 변형된 것일 수 있다. 상기 항체는 항암제와 같은 다른 약물과 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 복합체는 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼린 포스파타아제, 햅텐(hapten), 비오틴, 스트렙타비딘, 형광 물질, 방사성 물질, 양자점, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol: PEG), 히스티딘 태그, 또는 이들의 조합과 결합된 것일 수 있다. 상기 형광 물질은 Alexa Fluor®532, Alexa Fluor®546, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®680, Alexa Fluor®750, Alexa Fluor®790, 또는 Alexa Fluor??350일 수 있다.
상기 아미노산의 위치는 Kabat EU index ('Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)'에 기재된 EU-인덱스)에 따른다. 상기 CH3 도메인의 아미노산 위치 및 이에 해당하는 아미노산 종류는 인간 IgG1을 기준으로 한다.
상기 단백질 복합체에서, 제1 CH3 항체 불변 영역은 366번째 위치에 트립토판(W)을 포함할 수 있다. 제1 CH3 항체 불변 영역에서, 366번째 위치는 트레오닌(T)으로부터 트립토판(W)으로 치환된 것(T366W)일 수 있다. 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 및 407 위치에서 발린(V)을 포함할 수 있다. 제2 CH3 항체 불변 영역에서, 366 위치는 트레오닌(T)으로부터 세린(S)으로 치환된 것(T366S)일 수 있다. 제2 CH3 항체 불변 영역에서, 368 위치는 류신(L)으로부터 알라닌(A)으로 치환된 것(L368A)일 수 있다. 제2 CH3 항체 불변 영역에서, 407 위치는 타이로신(Y)으로부터 발린(V)으로 치환된 것(Y407V)일 수 있다.
상기 단백질 복합체에서, 제1 CH3 항체 불변 영역 및 제2 CH3 항체 불변 영역 중 하나 이상은 351 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M), 알라닌(A), 이소류신(I) 및 세린(S)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 351 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M), 알라닌(A) 및 이소류신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 351 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M), 알라닌(A), 및 세린(S)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함하고, 394 위치에 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 또는 트립토판(W)을 포함할 수 있다. 상기 394 위치는 트레오닌(T)으로부터 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 또는 트립토판(W)으로 치환된 것(T394F, T394H, 또는 T394W)일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함하고, 351 위치에 트립토판(W), 발린(V), 알라닌(A) 또는 페닐알라닌(F)을 포함할 수 있다. 상기 351 위치는 류신(L)으로부터 트립토판(W), 발린(V), 알라닌(A) 또는 페닐알라닌(F)으로 치환된 것(L351W, L351V, L351A 또는L351F)일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M) 또는 페닐알라닌(F) 을 포함할 수 있다. 상기 351 위치는 류신(L)으로부터 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M) 또는 페닐알라닌(F) 으로 치환된 것(L351A, L351G, L351V, L351M 또는 L351F)일 수 있다.
상기 제1 CH3 항체 불변 영역은
366 위치에 트립토판(W);
366 위치에 트립토판(W) 및 394 위치에 히스티딘(H);
366 위치에 트립토판(W) 및 394 위치에 페닐알라닌(F);
366 위치에 트립토판(W) 및 394 위치에 트립토판(W);
366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 페닐알라닌(F);
366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 트립토판(W);
366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 발린(V);
366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 알라닌(A); 및
366 위치에 트립토판(W), 394 위치에 히스티딘(H), 및 351 위치에 페닐알라닌(F)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
상기 제2 CH3 항체 불변 영역은
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 및 407 위치에서 발린(V);
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 알라닌(A);
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 글리신(G);
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 발린(V);
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 메티오닌(M); 및
366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 페닐알라닌(F)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함하고 및 394 위치에 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 또는 트립토판(W)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 및 407 위치에 발린(V)을 포함할 수 있다.
상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 페닐알라닌(F)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 알라닌(A)을 포함할 수 있다. 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 394 위치에 히스티딘(H)을 더 포함할 수 있다.
상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에서 발린(V), 및 351 위치에 글리신(G)을 포함할 수 있다. 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 351 위치에 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)을 더 포함할 수 있다.
상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 발린(V) 또는 메티오닌(M)을 포함할 수 있다. 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 351 위치에 발린(V), 또는 알라닌(A)을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 발린(V)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 알라닌(A)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W) 및 351 위치에 알라닌(A)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 페닐알라닌(F)을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질 복합체는 Fc 변이체의 역서열 치환된 변이체인 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어, "역서열 치환 변이체"는 단백질 복합체의 좌우 중쇄 불변 영역이 좌표평면 상에서 Y축에 대하여 대칭된 구조를 나타낸다. 예를 들어, 상기 역서열 치환 변이체는 일 구체예에 따른 단백질 복합체에서 아미노산 치환된 특정 위치 및 종류는 동일하되, 제1 CH3 항체 불변 영역과 제2 CH3 항체 불변 영역이 좌표평면 상에서 Y축에 대하여 대칭된 구조를 나타낼 수 있다. 상기 역서열 치환 변이체는 특정 아미노산의 치환 전과 유사한 비율로 헤테로다이머를 형성하므로 고효율의 Fc 변이체를 형성할 수 있다. 상기 단백질 복합체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 및 407 위치에 발린(V)을 포함하고, 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366번째 위치에 트립토판(W)을 포함하고; 및 제1 CH3 항체 불변 영역 및 제2 CH3 항체 불변 영역 중 하나 이상은 351 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에, 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H), 글리신(G), 발린(V), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 CH3 항체 불변 영역 및 제2 CH3 항체 불변 영역의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
또한, 제1 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 세린(S), 368 위치에 알라닌(A), 407 위치에 발린(V), 및 351 위치에 글리신(G)을 포함하고; 및 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366 위치에 트립토판(W)을 포함할 수 있다. 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 351 위치에 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서는 항체의 CH3 항체 불변 영역에서 특정 위치의 아미노산을 치환하여 선별된 Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성율을 비교한 결과, 야생형 IgG1 및 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 이중항체와 비교하여 헤테로다이머 형성율이 현저하게 높을 뿐만 아니라 열역학적 안정성이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 상기 Fc 변이체들의 역서열 치환된 변이체에서도 야생형 IgG1 및 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 이중항체와 비교하여 헤테로다이머 형성율이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 단백질 복합체는 헤테로다이머 형성 효율이 개선되었는 바, 이를 포함하는 이중특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 수용체와 수용체에 결합하는 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 사이토카인 및 수용체 유인(decoy) 이중접합체 등으로 활용 가능하다.
다른 양상은 일 양상에 따른 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 하나 이상의 세포에 형질전환하여 상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현시키는 단계를 포함하는 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 단백질 복합체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
발현 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 삽입된 핵산 서열이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적 단백질을 코딩하는 핵산이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 발현 벡터는 상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 발현 벡터는 유전자의 발현에 필요한 조절부위, 예를 들어, 인핸서(enhancer), 프로모터, 폴리(A) 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 세포는 암세포일 수 있다. 상기 세포는 시험관 내(in vitro) 세포일 수 있다. 상기 세포는 세균, 효모, 식물 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 세균은 대장균일 수 있다. 상기 포유동물 세포는 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 양, 소, 말, 원숭이, 침팬지, 또는 인간으로부터 유래된 세포를 의미한다. 상기 세포는 세포주일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary: CHO) 세포, 인간 배아 신장(human embryonic kidneyL HEK) 세포, 새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK) 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, HeLa 세포, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포, SP2/0 마우스 골수종 세포, COS-7, 및 YB2/0 래트 골수종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 CHO 세포는 CHO DG44, CHO-K1, CHO-S, GS-CHO, 또는 CHO DUKX(DXB11) 세포일 수 있다. 상기 HEK 세포는 HEK 293 세포일 수 있다.
"형질전환(transformation)"은 특정 핵산 단편을 세포의 유전체 내로 삽입하여 삽입된 핵산이 발현되도록 하는 방법을 의미한다.
상기 제1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터와 상기 제2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 세포에 공형질전환(co-transfection)하거나 또는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터와 상기 제2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 2종 이상의 세포에 각각 형질전환시킬 수 있다.
상기 세포는 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포 배양 배지는 세포를 배양하는데 필요한 영양 성분을 함유한 용액을 의미한다. 상기 배지는 세포를 배양하는데 이용되는 상업화된 또는 제조된 배지를 포함한다. 상기 세포 배양 배지는 항생제를 함유할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 G418(제네티신(geneticin)), 푸로마이신(Puromycin), 블라스티시딘(Blasticidin), 제오신(Zeocin), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 화학 조성 배지(chemically defined medium)를 포함할 수 있다.
상기 세포는 세포의 생존 또는 증식을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 세포의 생존 또는 증식을 허용하는 조건은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 세포는 약 25℃ 내지 약 42℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 37℃ 또는 약 37℃에서 배양될 수 있다. 상기 세포는 약 1% CO2 내지 약 10% CO2, 또는 약 5% CO2 내지 약 10% CO2의 공기의 존재에서 배양될 수 있다. 상기 세포는 약 pH 6 내지 약 pH 8, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.8, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.6, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.4, 또는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.2의 배지에서 배양될 수 있다. 상기 세포는 용존 산소 약 10% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 70%, 또는 약 20% 내지 약 60%의 조건에서 배양될 수 있다.
상기 배양은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 배양은 알려진 방법을 이용할 수 있다. 상기 배양은 플레이트, 플라스크 등에서 수행될 수 있다. 상기 배양은 기질에 부착시키거나 또는 배양액에 부유시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 배양은 계대 배양(subculture), 회분 배양(batch culture), 유가 배양(fed-batch culture), 관류 배양(perfusion culture), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 배양 시 세포 배양 배지를 신선한 배지로 주기적으로 교환할 수 있다. 상기 세포를 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 약 1주일 이상, 약 10일 이상, 약 2주일 이상, 약 3주일 이상, 약 1개월 이상, 약 1일 내지 약 1개월, 약 1일 내지 약 3주, 약 1일 내지 약 2주, 약 2일 내지 약 2주, 약 3일 내지 약 2주, 약 4일 내지 약 2주, 약 5일 내지 약 2주, 약 6일 내지 약 2주, 또는 약 1주 내지 약 2주 동안 배양할 수 있다.
상기 세포 또는 세포 배양액으로부터 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 단백질 복합체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 세포 배양액은 상기 세포가 없는 배양액일 수 있다.
상기 발현 벡터를 세포에 공형질전환할 경우, 상기 세포 또는 세포 배양액으로부터 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 단백질 복합체를 수득할 수 있다. 상기 제1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터와 상기 제2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 2종 이상의 세포에 각각 형질전환할 경우, 상기 세포 또는 세포 배양액으로부터 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 각각 수득할 수 있다.
상기 단백질 복합체를 수득하는 단계는 수득된 제1 폴리펩티드와 수득된 제2 폴리펩티드를 인큐베이션하여 단백질 복합체를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 환원 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 환원 조건은 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol: 2-ME), 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 또는 이들의 조합의 존재 하일 수 있다.
상기 단백질 복합체를 수득하는 단계는 단백질 복합체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 여과, 원심분리, 크로마토그래피, 투석, 면역침강, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 단백질 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 단백질 복합체에 관한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 의미한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 상기 암은 유방암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 대장암, 결장직장암, 위암, 난소암, 전립선암, 방광암, 요도암, 간암, 신장암, 투명세포 육종, 흑색종, 뇌척수종양, 뇌암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 부갑상선암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨병(Hodgkin's Disease), 내분비계암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질환을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 다른 항암제를 더 포함할 수 있다. 상기 항암제는 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(Panitumumab), 엘로티닙(erlotinib), 게피티닙(Gefitinib), 트라스투주맙(trastuzumab), T-DM1, 페르제타(Perjeta), 라파티닙(lapatinib), 파클리탁셀, 탁솔, 타목시펜, 시스플라틴, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 단일 조성물 또는 개별적인 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조성물은 비경구 투여 제형의 조성물이고, 항암제는 경구 투여 제형의 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 단백질 복합체를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 단백질 복합체를 세포 또는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 단백질 복합체, 세포, 암, 예방, 또는 치료에 관한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 암을 앓거나 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에게 제2의 유효 성분을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2의 유효 성분은 암의 예방 또는 치료를 위한 유효 성분일 수 있다. 상기 유효 성분은 상기 단백질 복합체와 동시, 개별, 또는 순차로 투여될 수 있다.
상기 단백질 복합체는 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 단백질 복합체는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.
상기 단백질 복합체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
헤테로다이머 형성률이 높은 단백질 복합체, 이를 제조하는 방법, 단백질 복합체를 포함한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 이를 이용한 암의 예방 또는 치료 방법에 따르면, 증가된 안정성을 갖는 이중특이 항체 또는 항원-결합 단편, 수용체와 수용체에 결합하는 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 사이토카인 또는 수용체 유인(decoy) 이중접합체를 쉽게 제조할 수 있고, 질병 예방 또는 치료, 및 질병 진단 등 다양한 분야에 활용 가능하다.
도 1은 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: PTCWT(음성 대조군), 019: PTC019(양성 대조군), 039: PTC039, 040: PTC040, 074: PTC074, 111: PTC111).
도 2는 Fc 변이체들의 CE-SDS(capillary electrophoresis-SDS) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 도 3e는 각각 PTCWT, PTC019, PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(Size exclusion-high-performance liquid chromatography: SE-HPLC) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 역서열 치환 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: PTCWT(음성 대조군), 019: PTC019(양성 대조군), 088: PTC088, 089: PTC089, 090: PTC090).
도 5는 일부 서열 치환 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: PTCWT(음성 대조군), 019: PTC019(양성 대조군), 074: PTC074, 097: PTC097, 098: PTC098, 099: PTC099). 111: PTC111, 113: PTC113).
도 6는 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용 된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체).
도 7은 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체).
도 8은 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체).
도 9는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 in vitro 암세포 사멸 유도능을 평가한 그래프이다(Avelumab: 양성대조군, anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv BsAb: CH3 도메인에 PTC074 서열을 보유하고 있는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체).
도 10은 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 in vivo 암 성장 억제 효능을 평가한 그래프이다(Avelumab: 양성대조군, anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv BsAb: CH3 도메인에 PTC074 서열을 보유하고 있는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. Fc 헤테로다이머 변이체의 준비
항체의 CH3 도메인에서 아미노산 치환으로 인해 변화되는 Fc 헤테로다이머 형성능력을 평가하기 위하여, 설계된 각 Fc 변이체들의 발현 시스템을 구축하였다.
헤테로다이머를 이루는 두 Fc 폴리펩티드의 구분 및 분석을 용이하게 하기 위하여, 제1 폴리펩티드는 중쇄와 경쇄가 모두 연결된 온전한 형태의 IgG 사슬(Fc1)을 발현하도록 설계하였으며, 제 2 폴리펩티드는 중쇄의 Fc 영역(Fc2)만을 발현하도록 설계하였다. Fc1은 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 Avelumab 항체(Bavencio®, Pfizer)를 기반으로 CH3 도메인의 아미노산을 치환하고, Fc2는 야생형 IgG1 항체의 Fc 영역을 기반으로 하여 CH3 도메인의 아미노산을 치환하였다. Fc1 경쇄는 Avelumab 항체의 경쇄와 동일한 아미노산 서열(서열번호 2)를 갖는다.
비교를 위해, 야생형 IgG1(표 1의 "PTCWT"에 대응됨)을 음성 대조군으로 하고, Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 이중항체(표 1의 "PTC019"에 대응됨)를 양성 대조군으로 이용하였다.
구체적으로, 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 열린해독틀(open reading frame: ORF)을 pCHO1.0 벡터에 도입하여 발현 벡터를 준비하였다. ExpiCHO-S™(Thermo Fisher) 세포주를 ExpiCHO™ 발현 배지에서 배양하였다. ExpiFectamie™ CHO Transfection Kit(Thermo Fisher)를 사용하여, Fc1 발현 벡터와 Fc2 발현 벡터를 1:1로 혼합하고, ExpiCHO-S™ 세포주에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 발현 배지에서 배양한 후 배양액을 분리 및 회수하였다. 회수된 배양액은 Protein A HP SpinTrap™ 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 발현 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 완충액을 PBS(pH 7.4)로 교환하고, 단백질의 농도를 측정하였다.
발현된 아미노산 서열은 아래에 기재된 바와 같다.
[PTCWT]
Fc1 중쇄:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITFY
ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIK LGTVTTVDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSL T C LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (서열번호 1)
(굵은 글씨: L351, 굵은 글씨 및 밑줄: T366)
Fc1 경쇄:
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQQ HPGKAPKLMI YDVSNRPSGV
SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC SSYTSSSTRV FGTGTKVTVL GQPKANPTVT
LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADGSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS
YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS (서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬:
EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSL T CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (서열번호 3)
(굵은 글씨: L351, 굵은 글씨 및 밑줄: T366, 밑줄: L368, 이탤릭: Y407)
[PTC019]
Fc1 중쇄:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITFY
ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIK LGTVTTVDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSL W C LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (서열번호 4)
(굵은 글씨: L351, 굵은 글씨 및 밑줄: T366W)
Fc1 경쇄(서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬:
EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSL S CAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (서열번호 5)
(굵은 글씨: L351, 굵은 글씨 및 밑줄: T366S, 밑줄: L368A, 이탤릭: Y407V)
[PTC039]
Fc1 중쇄:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITFY
ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIK LGTVTTVDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTFPPSRDE
LTKNQVSL W C LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (서열번호 6)
(굵은 글씨: L351F, 굵은 글씨 및 밑줄: T366W)
Fc1 경쇄(서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬:
EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT GPPSRDELTK NQVSL S CAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (서열번호 7)
(굵은 글씨: L351G, 굵은 글씨 및 밑줄: T366S, 밑줄: L368A, 이탤릭: Y407V)
[PTC040]
Fc1 중쇄:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITFY
ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIK LGTVTTVDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTWPPSRDE
LTKNQVSL W C LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (서열번호 8)
(굵은 글씨: L351W, 굵은 글씨 및 밑줄: T366W)
Fc1 경쇄(서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬(서열번호 7)
[PTC074]
Fc1 중쇄(서열번호 4)
Fc1 경쇄(서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬(서열번호 7)
[PTC111]
Fc1 중쇄(서열번호 4)
Fc1 경쇄(서열번호 2)
Fc2의 Fc 사슬:
EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT FPPSRDELTK NQVSL S CAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (서열번호 9)
(굵은 글씨: L351F, 굵은 글씨 및 밑줄: T366S, 밑줄: L368A, 이탤릭: Y407V)
실시예 2. Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성 능력 비교
상기 실시예 1에서 구축된 일시적 발현 시스템을 이용하여, CH3 도메인의 아미노산 치환으로 인해 변화되는 Fc 헤테로다이머의 형성 능력을 비교하고, 이를 통해 고효율 Fc 헤테로다이머 변이체를 선별하였다.
평가 방법으로, 비환원 SDS-PAGE 후, 헤테로다이머에 해당하는 PAGE 밴드의 강도를 측정하여 비교하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 정제된 단백질을 2-머캅토에탄올로 환원시키거나 2-머캅토에탄올로 처리하지 않은 시료를 준비하였다. 환원 또는 비환원된 시료를 SDS-PAGE 방법으로 전기영동하고, ChemiDoc™ Imaging System(Bio-Rad)과 Image Lab™ Software(Bio-Rad)를 이용하여 전기영동 밴드의 강도를 측정하였다.
측정된 밴드의 강도를 통해 CH3 도메인의 아미노산 치환에 따른 Fc 헤테로다이머 형성 능력을 산출하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
번호 Fc1 아미노산 변이 Fc2 아미노산 변이 발현량 (mg/L) 헤테로다이머비율 (%)
PTCWT(음성 대조군) - - 269.5±9.7 41.5
PTC019(양성 대조군 T366W T366S, L368A, Y407V 183.3±11.1 64.6
PTC023 L351F L351G 140.1±4.8 27.2
PTC024 L351W L351A 112.3±22.0 2.0
PTC025 L351W L351G 100.0±18.5 15.4
PTC031 T394W - 253.8±11.2 29.5
PTC032 T366W, T394H T366S, L368A, Y407V 143.8±40.0 78.7
PTC033 T366W, T394F T366S, L368A, Y407V 162.7±20.0 76.4
PTC034 T366W, T394W T366S, L368A, Y407V 211.8±10.9 76.1
PTC037 L351F, T366W L351A, T366S, L368A, Y407V 193.4±77.5 85.8
PTC038 L351W, T366W L351A, T366S, L368A, Y407V 142.8±6.7 63.1
PTC039 L351F, T366W L351G, T366S, L368A, Y407V 151.2±13.7 93.8
PTC040 L351W, T366W L351G, T366S, L368A, Y407V 146.1±34.7 94.6
PTC053 L351F, T394H L351A 46.1±4.8 1.0
PTC054 L351F, T394F L351A 50.6±5.7 1.1
PTC061 L351F, T366W, T394H L351A, T366S, L368A, Y407V 73.2±23.9 70.9
PTC062 L351F, T366W, T394F L351A, T366S, L368A, Y407V 32.7±7.7 44.0
PTC074 T366W L351G, T366S, L368A, Y407V 125.9±13.9 94.9
PTC075 T366W, T394H L351G, T366S, L368A, Y407V 33.4±6.6 21.9
PTC076 L351F, T366W, T394H L351G, T366S, L368A, Y407V 34.9±8.4 33.1
PTC082 L351V, T366W L351A, T366S, L368A, Y407V 55.0±3.4 79.3
PTC083 L351I, T366W L351A, T366S, L368A, Y407V 42.6±5.1 < 1
PTC091 T366W L351A, T366S, L368A, Y407V 52.1±6.1 75.4
PTC111 T366W L351F, T366S, L368A, Y407V 55.8±5.0 92.7
PTC112 T366W L351W, T366S, L368A, Y407V 30.9±4.1 < 1
PTC113 L351A, T366W L351F, T366S, L368A, Y407V 146.3±6.3 82.8
PTC114 L351A, T366W L351W, T366S, L368A, Y407V 22.0±5.6 < 1
PTC115 L351G, T366W L351F, T366S, L368A, Y407V 79.4±8.4 < 1
PTC116 L351G, T366W L351W, T366S, L368A, Y407V 23.1±5.7 < 1
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 음성 대조군(PTCWT) 및 양성 대조군(PTC019)의 헤테로다이머 형성률은 각각 41.5% 및 64.6%를 나타내는 반면, PTC032, PTC033, PTC034, PTC037, PTC039, PTC040, PTC061, PTC074, PTC082, PTC091, PTC111 및 PTC113의 헤테로다이머 형성률은 각각 78.7%, 76.4%, 76.1%, 85.8%, 93.8%, 94.6%, 70.9%, 94.9%, 79.3%, 75.4%, 92.7% 및 82.8%을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히, PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111은 Fc 헤테로다이머의 비율이 90%를 초과하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 매우 우수한 Fc 헤테로다이머 형성 능력을 나타낼 수 있다. .
실시예 3. 고효율 Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성 능력 평가
3-1. SDS-PAGE 분석
상기 실시예 2에서 선별된 고효율 Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성 능력을 평가하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
구체적으로, SDS-PAGE 분석으로부터 전기영동 밴드의 강도를 측정하였다. 이후, 측정된 밴드의 강도를 통해 CH3 도메인의 아미노산 치환에 따른 Fc 헤테로다이머 형성 비율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다(N/A: 해당사항 없음).
비고 분자량(kDa) PTCWT PTC019 PTC039 PTC040 PTC074 PTC111
다합체 N/A <1 <1 <1 <1 <1 <1
Fc1-1 호모-다이머 146.8 17.1 <1 2.1 1.1 0.7 <1
Fc1-2 헤테로-다이머 99.3 41.5 64.6 93.8 94.6 94.9 92.7
Fc1 모노머 73.4 1.5 2.4 3.3 3.4 3.6 5.2
Fc-2-2 호모-다이머 51.8 39.9 13.3 <1 <1 <1 <1
Fc2 모노머 25.9 <1 19.7 <1 <1 <1 <1
유리(free) 경쇄 23.7 <1 <1 <1 <1 <1
도 1은 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다.그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 선별된 PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 Fc 변이체들은 음성대조군(PTCWT)과 비교하여 Fc1-1 호모-다이머(146.8 kDa)의 밴드 강도가 현저하게 감소하였고, 양성대조군(PTC019)과 비교하여 Fc2 모노머(25.9 kDa)의 밴드 강도가 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Fc1-2 헤테로-다이머는 99.3kDa에서 고효율로 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 1에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군(PTCWT) 및 양성 대조군(PTC019)의 경우, Fc1-2 헤테로-다이머 뿐만 아니라 Fc1-1 호모-다이머가 음성대조군(PTCWT)에서 17.1%의 비율로 형성되고, Fc-2-2 호모-다이머가 음성대조군(PTCWT)에서 39.9% 및 양성대조군(PTC019)에서 13.3%의 비율로 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 선별된 PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 Fc 변이체의 경우, Fc1-1 호모-다이머 및 Fc-2-2 호모-다이머의 형성율이 낮았으며, Fc1-2 헤테로-다이머의 형성률이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 Fc1-2 헤테로-다이머의 선택적 형성이 가능한 것을 알 수 있다.
3-2. CE-SDS 분석
상기 실시예 2에서 선별된 고효율 Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성 능력을 검증하기 위하여 모세관 전기영동법인 CE-SDS(capillary electrophoresis-SDS) 분석을 수행하였다.
구체적으로, PA 800 plus™ pharmaceutical analysis system(SCIEX)을 이용하여 모세관 전기영동을 수행하여 Fc 변이체들의 Fc 헤테로다이머 형성 비율을 검증하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
비고 분자량(kDa) PTCWT PTC019 PTC039 PTC040 PTC074 PTC111
Fc1-1 호모-다이머 144.0 11.1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
Fc1-2 헤테로-다이머 98.0 40.1 60.1 81.0 80.2 83.8 84.8
경쇄 유리 Fc1-2 헤테로-다이머 75.2 4.8 2.5 3.8 7.7 8.5 6.6
Fc1 모노머 71.9 0.5 0.3 1.0 1.4 0.6 0.4
Fc-2-2 호모-다이머 49.2 34.4 13.7 n.d. n.d. n.d. 0.6
Fc2 모노머 24.6 n.d. 20.3 11.3 7.5 2.4 2.0
유리(free) 경쇄 22.8 2.5 0.4 1.8 2.3 2.7 2.0
도 2는 Fc 변이체들의 CE-SDS(capillary electrophoresis-SDS) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 머무름 시간의 23분경에서 음성대조군(PTCWT)의 Fc-2-2 호모-다이머 형성율은 34.44%를 나타내었고, 양성대조군(PTC019)의 Fc-2-2 호모-다이머 형성율을 13.71%인 것을 확인할 수 있었다. 반면, PCT039, PTC040, PTC074의 경우, Fc-2-2 호모-다이머가 형성되지 않았으며 PCT111의 경우 0.57%로 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PCT019)과 비교하여 현저하게 낮은 비율로 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 헤테로다이머 형성률은 각각 81.0%, 80.2%, 83.8% 및 84.8%로 음성대조군(PCTWT) 및 양성 대조군(PTC019)와 비교하여 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 헤테로다이머 형성 능력이 우수한 것을 알 수 있다.
3-3. SE-HPLC 분석
상기 실시예 2에서 선별된 고효율 Fc 변이체들의 헤테로다이머 형성 능력을 검증하기 위하여 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(size exclusion-high-performance liquid chromatography: SE-HPLC) 분석을 수행하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
비고 머무름 시간
(분) 		PTCWT PTC019 PTC039 PTC040 PTC074 PTC111
다합체 11.4 0.4 16.5 4.7 5.9 2.9 4.0
Fc1-1 호모-다이머 16.0 10.86 0.6
Fc1-2 헤테로-다이머 17.0 42.16 58.24 90.76 87.51 90.59 91.6
Fc1 모노머 N/A
Fc-2-2 호모-다이머 18.4 46.03 13.13 1.5 0.96 2.7
Fc2 모노머 19.2 25.78 1.0
유리(free) 경쇄 19.8
도 3a 내지 도 3f는 각각 PTCWT, PTC019, PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(Size exclusion-high-performance liquid chromatography: SE-HPLC) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.그 결과, 도 3a 내지 도 3f에 나타낸 바와 같이, Protein A로 정제된 단백질의 SE-HPLC 분석에서 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)을 포함한 FC 변이체는 머무름시간 16.989 내지 17.197분에서 헤테로다이머의 주 피크(main peak)가 관찰되었다. 구체적으로, 음성대조군(PTCWT)의 경우, 머무름시간 16.079분에서 Fc-1-1 호모-다이머 피크 및 18.377분에서 Fc2-2 호모-다이머 피크가 관찰되었다(도 3a). 또한, 양성대조군(PTC019)의 경우, 머무름시간 18.343분에서 Fc-2-2 호모-다이머 피크 및 19.14분에서 Fc-2 모노머 피크가 관찰되었다(도 3b). 즉, 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PCT019)의 경우, Fc1-2 헤테로-다이머를 포함한 다중 피크(multi peak)를 나타내어 헤테로다이머 형성율이 낮은 것을 확인할 수 있었다, 반면, PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 Fc 변이체의 경우, 주 피크가 단일 피크의 형태로 관찰되었다. 즉, 선별된 Fc 변이체의 경우, 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)과 비교하여 헤테로다이머의 형성율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 4에 나타난 바와 같이, 선별된 PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111의 Fc 변이체들은 헤테로다이머 형성 능력이 PTCWT과 PTC019의 두 대조군에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 양상에 따른 FC 변이체는 헤테로다이머를 고효율로 형성할 수 있는 바, 이중특이 항체를 용이하게 제조할 수 있다.
실시예 4. 고효율 Fc 변이체 헤테로다이머의 열역학적 안정성 평가
상기 실시예 3에서 확인된 고효율 Fc 변이체들의 헤테로다이머 구조 안정성을 간접적으로 확인하기 위하여, 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC)을 이용한 열역학적 안정성 평가를 수행하였다.
구체적으로, Nano DSC™(TA instruments)를 사용하여 선별된 Fc 변이체들의 열적 안정성을 측정하고, 융점(melting temperature: Tm, ℃)을 산출하였다. 산출된 Fc 변이체들의 융점을 하기 표 5에 나타내었다.
Tm (℃)
Fc 변이체 CH3 CH2 Fab
PTCWT 82.75 69.01 71.88
PTC019 70.82 57.14 71.82
PTC039 77.51 65.92 69.63
PTC040 77.75 66.63 69.82
PTC074 77.72 66.84 69.68
PTC111 76.87 70.36 71.54
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 선별된 Fc 변이체인 PTC039, PTC040, PTC074 및 PTC111은 야생형 Fc 헤테로다이머(PTCWT)과 비교하여 열적 안정성이 다소 불안정하였으나, Genentech 사의 KiH Fc 헤테로다이머(PTC019)과 비교하여 비교적 높은 열역학적 안정성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 헤테로다이머 형성 능력이 우수할 뿐만 아니라, 열역학적 안정성이 우수한 바 안정된 이중특이 항체의 형성이 가능하다.
실시예 5. 고효율 Fc 변이체들의 CH3 도메인에서의 역서열 치환 변이체의 헤테로다이머 형성 능력 비교
상기 실시예 3에서 선별된 고효율 Fc 변이체들의 CH3 도메인에서의 역서열 치환 변이체의 헤테로다이머 형성 능력을 평가하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
SDS-PAGE 분석으로부터 측정된 밴드의 강도를 통해 CH3 도메인의 아미노산 치환에 따른 Fc 헤테로다이머 형성 능력을 산출하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
번호 Fc1 아미노산 변이 Fc2 아미노산 변이 발현량 (mg/L) 헤테로다이머비율 (%)
PTCWT
(음성 대조군)		 - - 147.2±37.7 40.9
PTC019(양성 대조군 T366W T366S, L368A, Y407V 118.3±39.6 64.7
PTC088 L351G, T366S, L368A, Y407V L351F, T366W 102.1±20.2 72.1
PTC089 L351G, T366S, L368A, Y407V L351W, T366W 92.2±8.9 83.3
PTC090 L351G, T366S, L368A, Y407V T366W 41.5±3.6 92.1
도 4는 역서열 치환 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: PTCWT(음성 대조군), 019: PTC019(양성 대조군), 088: PTC088, 089: PTC089, 090: PTC090).그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 역서열 치환 Fc 변이체는 음성대조군(PTCWT)과 비교하여 150 kDa 부근에서 밴드가 형성되지 않았으며, 49.2 kDa에서 밴드가 약하게 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 역서열 치환 Fc 변이체는 Fc-1-1 호모-다이머가 형성되지 않았으며, Fc-2-2 호모-다이머 형성이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군(PCT019)과 비교하여 25 kDa 부근에서 밴드가 약하게 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 역서열 치환 Fc 변이체는 Fc-2 모노머의 형성이 감소되며. 이는 PTC039, PTC040 및 PTC074와 유사한 헤테로다이머 형성율을 나타내는 것을 알 수 있다(도 1 참조).
또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)의 헤테로다이머 형성률이 각각 40.9% 및 64.7%를 나타내는 반면, PTC039, PTC040 및 PTC074의 역서열 치환 Fc 변이체인 PTC088, PTC089 및 PTC090은 각각 72.1%, 83.3% 및 92.1%의 헤테로다이머 형성률을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 양상에 따른 Fc 변이체의 역서열 치환 변이체는 치환 전, 후 유사한 비율로 헤테로다이머를 형성하는 것을 알 수 있다. 또한, Fc 변이체의 역서열 치환 변이체는 헤테로다이머 형성률이 우수하므로, Fc1 또는 Fc2에 삽입되는 서열의 치환 여부에 관계없이 Fc 변이체를 고효율로 형성할 수 있다.
실시예 6. CH3 도메인의 351 위치 서열 변경 Fc 변이체의 헤테로다이머 형성 능력 비교
상기 실시예 3에서 선별된 고효율 FC 변이체인 PTC074 및 PTC111와 같이 CH3 도메인의 351번 위치가 유사 성질의 아미노산으로 치환된 변이체의 헤테로다이머 형성 능력을 평가하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
SDS-PAGE 분석으로부터 측정된 밴드의 강도를 통해 CH3 도메인의 아미노산 치환에 따른 Fc 헤테로다이머 형성 능력을 산출하고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
번호 Fc1 아미노산 변이 Fc2 아미노산 변이 발현량 (mg/L) 헤테로다이머비율 (%)
PTCWT
(음성 대조군)		 - - 54.4±5.6 40.2
PTC019(양성 대조군 T366W T366S, L368A, Y407V 51.1±5.6 79.7
PTC074 T366W L351G, T366S, L368A, Y407V 40.4±4.1 93.5
PTC097 T366W L351V, T366S, L368A, Y407V 39.8±9.9 82.7
PTC098 T366W L351S, T366S, L368A, Y407V 26.4±12.7 76.8
PTC099 T366W L351M, T366S, L368A, Y407V 20.9±1.9 86.5
PTC111 T366W L351F, T366S, L368A, Y407V 55.8±5.0 92.7
PTC112 T366W L351W, T366S, L368A, Y407V 30.9±4.1 < 1
도 5는 일부 서열 치환 Fc 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: PTCWT(음성 대조군), 019: PTC019(양성 대조군), 074: PTC074, 097: PTC097, 098: PTC098, 099: PTC099). 111: PTC111, 113: PTC113).그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, PTC074 및 PTC111의 경우, 음성대조군(PTCWT)과 비교하여 150 kDa 부근에서 밴드가 형성되지 않았고, 양성대조군(PTC019)와 비교하여 49.2 kDa 및 24.6 kDa의 밴드의 강도가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, Fc-2 351 위치에서 서열이 치환된 PTC097, PTC098 및 PTC099와 비교하여 24.6 kDa에서 밴드의 강도가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, Fc-1-2 헤테로다이머의 예상 분자량인 98 kDa에서 밴드의 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 7에 나타낸 바와 같이, PTC074, PTC097, PTC099 및 PTC0111의 헤테로다이머 형성률은 각각 93.5%, 82.7%, 86.5% 및 92.7%를 나타내어 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)와 비교하여 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, CH3 도메인의 351번 위치를 글리신(G) 또는 페닐알라닌(F)으로 치환한 PTC074와 PTC111의 경우, Fc 헤테로다이머의 형성률이 90%를 초과하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 CH3 도메인의 351번 위치를 특정 아미노산으로 치환함으로써 우수한 Fc 헤테로다이머 형성능을 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 7. 고효율 Fc 변이체를 포함하는 이중특이항체의 헤테로다이머 형성능 평가
7-1. Fab-Fc × scFv-Fc 이중특이항체
상기 실시예 3에서 선별된 고효율 Fc 변이체를 포함하는 이종이중항체의 헤테로다이머 형성 수율을 평가하기 위하여, 제1 폴리펩티드는 중쇄와 경쇄가 모두 연결된 온전한 형태의 IgG 사슬(Fc1)을 발현하도록 설계하였으며, 제2 폴리펩티드는 scFV-Fc 형태 (Fc2)를 발현하도록 설계하였다. 이후, Fc1은 IgG1 Fc 영역을 포함하는 Avelumab 항체(Bavencio, Pfizer)를 기반으로 발현이 진행되었고, Fc2는 블리나투모맙(blinatumomab)의 anti-CD3 scFv 서열을 기반으로 한 IgG1 Fc 영역을 포함하는 scFv 형태로 발현이 진행되었다.
비교를 위하여, 야생형 CH3 도메인 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTCWT"에 대응됨)의 Fc2에 블리나투모맙(blinatumomab)의 anti-CD3 scFv을 결합한 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체를 음성 대조군으로 하고, CH3 도메인에 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTC019"에 대응됨)의 Fc2에 블리나투모맙(blinatumomab)의 anti-CD3 scFv을 결합한 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체를 양성 대조군으로 이용하였다.
상기 실시예 1에서 구축된 일시적 발현 시스템을 이용하여 각 시험 물질들의 발현을 진행하였으며, 비환원 SDS-PAGE 후, 헤테로다이머에 해당하는 PAGE 밴드의 강도를 측정하여 헤테로다이머 형성 수율을 비교하였다.
측정된 밴드의 강도를 통해 CH3 도메인의 아미노산 치환에 따른 Fc 헤테로다이머 형성 능력을 산출하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
비고 분자량(kDa) Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열
PTCWT PTC019 PTC074
Fc1-1 호모-다이머 144.0 17.6 < 1 < 1
Fc1-2 헤테로-다이머 124.4 45.4 75.8 88.8
Fc-2-2 호모-다이머 104.8 37.0 19.6 7.0
경쇄 유리 Fc1-2 헤테로-다이머 101.6 < 1 < 1 < 1
Fc 2 또는 Fc 1 중쇄 ~50 < 1 4.6 4.2
도 6는 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용 된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-Fc 이중중합체).그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체는 음성대조군(PTCWT)의 서열이 적용된 이종이중항체와 비교하여 144 kDa에서 밴드가 형성되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PTC019 서열이 적용된 이종이중항체와 비교하여 104.8 kDa에서 밴드의 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 완전한 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체의 예상 분자량인 124.4 kDa에서는 음성대조군(PCTWT) 및 양성대조군(PTC019)와 비교하여 밴드의 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 8에 나타낸 바와 같이, Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열이 PTC074인 이종이중항체의 Fc1-2 헤테로-다이머 형성율은 88.8%로 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)와 비교하여 헤테로다이머 형성율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 서로 다른 구조의 항체를 형성하는 이종이중항체 구조로 적용이 가능하며 우수한 헤테로다이머 형성 능력을 가지는 것을 알 수 있다.
7-2. Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중특이항체
제2 폴리펩티드가 scFv-scFv-Fc 형태 (Fc2)로 발현하도록 설계된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중특이항체를 사용하고, Fc2는 블리나투모맙(blinatumomab)의 anti-CD3 scFv 서열과 Bevacizumab (Avastin, Roche)의 VH-VL 서열을 기반으로 한 IgG1 Fc 영역을 포함하는 이중 scFv (scFv × scFv) 형태로 발현이 진행되었다는 점을 제외하고는 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 헤테로다이머 형성 수율을 평가하였다.
비교를 위하여, 야생형 CH3 도메인 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTCWT"에 대응됨)의 Fc2에 이중 scFv를 결합시킨 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이종이중항체를 음성 대조군으로 하고, CH3 도메인에 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTC019"에 대응됨) 의 Fc2에 이중 scFv를 결합시킨 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이종이중항체를 양성 대조 군으로 이용하였다.
비고 분자량(kDa) Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열
PTCWT PTC019 PTC074
Fc2-2 호모-다이머 196.0 9.7 5.6 < 1
Fc1-2 헤테로-다이머 167.8 42.0 57.6 70.2
Fc-1-1 호모-다이머 161.7 37.0 < 1 < 1
Unknown 1 159.1 < 1 3.5 2.6
Unknown 2 ~140~150 11.3 15.7 19.0
Unknown 3 112.9 < 1 2.8 3.4
Fc 1 또는 2 모노머 ~70~80 < 1 14.7 4.7
도 7은 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이중중합체).그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, PTC074 서열을 적용한 Fab-Fc × scFv x scFv-Fc 이중중합체는 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019) 서열이 적용된 중합체와 비교하여 196 kDa 밴드의 강도가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군(PTC019) 서열이 적용된 이중중합체에서 나타나는 헤테로다이머 이외의 밴드 강도가 감소된 바, 목표로 하는 167.8 kDa의 Fc 1-2 헤테로-다이머가 고효율로 형성된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 9에 나타낸 바와 같이, Fab-Fc × scFv-scFv-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열이 PTC074인 이종이중항체의 Fc1-2 헤테로-다이머 형성율은 70.2%로 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)와 비교하여 헤테로다이머 형성율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 여러 개의 구조가 연결되어 분자량의 크기가 큰 구조의 이종이중항체 구조로 적용이 용이할 뿐만 아니라, 상기 구조로 적용시 헤테로다이머 형성이 우수한 것을 알 수 있다.
7-3. Fab-Fc × cytokine-Fc 이중특이항체
제2 폴리펩티드가 cytokine-Fc 형태 (Fc2)를 발현하도록 설계된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중특이항체를 사용하고, Fc2는 interleukine-2 (IL-2, aldesleukine) 서열을 기반으로 한 IgG1 Fc 영역을 포함하는 cytokine 형태로 발현이 진행하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 헤테로다이머 형성 수율을 평가하였다.
비교를 위하여, 야생형 CH3 도메인 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTCWT"에 대응됨)의 Fc2에 IL-2 변이체 (IL-2v)를 결합한 Fab-Fc × IL-2v-Fc 이종이중항체를 음성 대조군으로 하고, CH3 도메인에 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTC019"에 대응됨)의 Fc2에 IL-2 변이체 (IL-2v)를 결합한 Fab-Fc × IL-2v-Fc 이종이중항체를 양성 대조군으로 이용하였다.
비고 분자량(kDa) Fab-Fc × cytokine-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열
PTCWT PTC019 PTC074 PTC111
Fc1-1 호모-다이머 187.4 < 1 < 1 < 1 <1
Fc1-2 헤테로-다이머 136.5 40.6 68.8 90.4 89.9
Fc-2-2 호모-다이머 94.4 27.1 16.5 < 1 <1
Fc1 모노머 77.4 32.3 < 1 < 1 <1
Fc 2 모노머 41.0 < 1 14.6 5.4 6.0
도 8은 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다(M: 크기 마커, WT: CH3 도메인에 PTCWT 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체(음성 대조군), 019: CH3 도메인에 PTC019 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체(양성 대조군), 074: CH3 도메인에 PTC074 서열이 적용된 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체).그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, PTC074 및 PTC111 서열을 적용한 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체는 음성대조군(PTCWT) 또는 양성대조군(PTC019)과 비교하여 94.4 kDa(Fc-2-2 호모-다이머) 및 77.4 kDa(Fc1 모노머)에서 밴드의 강도가 감소하였으며, 136.5 kDa(Fc-1-2 헤테로-다이머)에서 밴드의 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, PTC074 및 PTC111 서열을 적용한 Fab-Fc × cytokine-Fc 이중중합체는 Fc-2-2 호모-다이머 밴드 및 Fc-1 모노머의 형성이 감소함으로써 Fc-1-2 헤테로-다이머가 고효율로 형성된 것을 알 수 있다.
또한, 표 10에 나타낸 바와 같이, Fab-Fc × Cytokine-Fc 이중중합체에 음성대조군(PTCWT), 양성대조군(PTC019), PTC074, 및 PTC111의 서열이 반영된 구조에 따라 Fc-1-2 헤테로다이머의 비율이 각각 40.6%, 68.8%, 90.4%, 및 89.9%로 PTC074, PTC111이 반영된 이중중합체가 음성대조군(PTCWT), 양성 대조군(PTC019) 과 비교하여 헤테로다이머의 형성율이 유의하게 높은 것을 확인 할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 항체를 형성하는 구조로 적용할 수 있을 뿐만 아니라 사이토카인 단백질을 적용할 경우, 헤테로다이머 형성 능력이 우수한 것을 알 수 있다.
7-4. Fab-Fc × Fab-Fc 이중특이항체
상기 실시예 3에서 선별된 고효율 Fc 변이체를 포함하는 이종이중항체의 헤테로다이머 형성 수율을 평가하기 위하여 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 모두 중쇄와 경쇄가 모두 연결된 온전한 형태의 이중특이항체를 발현하도록 설계하였다. 구체적으로, Fc1은 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 Avelumab 항체(Bavencio, Pfizer)를 기반으로 발현이 진행되었고, Fc2는 IgG1 Fc 영역을 포함하는 bevacizumab 항체(Avastin, Roche)를 기반으로 발현이 진행되었다.
비교를 위하여, 야생형 CH3 도메인 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTCWT"에 대응됨)를 포함하는 Fab-Fc × Fab-Fc 이종이중항체를 음성 대조군으로 하고, CH3 도메인에 Genentech의 knobs-into-hole(KiH) 서열을 가진 Fc 변이체(표 1의 "PTC019"에 대응됨)를 포함하는 Fab-Fc × Fab-Fc 이종이중항체를 양성 대조 군으로 이용하였다.
평가 방법으로는 Intact MASS (ESI-LC-MS) 분석 방법이 사용되었다. 구체적으로, Thermo Scientific Dionex™ UHPLC Ultimate 3000 과 TripleTOF 5600+ (AB sciex)를 이용하여 LC-MS를 진행하였으며, 분석프로그램은 Analyst® software, PeakView® Software를 이용하여 헤테로다이머 형성 능력을 산출하고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
비고 측정값
(m/z) 		Ratio (%)
Fab-Fc × Fab-Fc 이종이중항체의 CH3 도메인 서열
PTCWT PTC019 PTC039 PTC040 PTC074
Fc1-2 헤테로 다이머 147,807 ~ 148,584 25.4 32.4 58.1 40.5 46.8
Fc1 또는 Fc 2 호모-다이머 147,921 ~ 149,245 25.2 7.6 9.5 14.7 7.6
Fc1 또는 Fc 2 모노머 74,497 ~74,926 - 60.0 23.7 35.1 -
유리(free) 경쇄 21,115 ~ 27,103 49.4 - 8.7 9.8 45.7
표 11에 나타낸 바와 같이, 음성대조군(PTCWT) 및 양성대조군(PTC019)의 서열을 적용한 Fab-Fc × Fab-Fc 이종이중항체의 Fc-1-2 헤테로-다이머 형성율은 각각 25.4% 및 32.4%인 반면, CH3 도메인 서열이 PTC039, PTC040, 및 PTC074인 이종이중항체의 Fc-1-2 헤테로다이머 형성율은 각각 58.1%, 40.5%, 46.8%인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체는 이중특이항체로의 적용이 용이할 뿐만 아니라 상기 구조로 적용시 헤테로다이머 형성이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 8. 고효율 Fc 변이체들을 포함하는 Fab-Fc × scFv-Fc 이중특이항체의 항암 활성 평가
8-1. 암세포 사멸 및 암 성장 억제 확인
상기 실시예 7-1에서 제조한 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 암세포 사멸 및 암 성장 억제 능력을 평가하였다.
구체적으로, RPMI1640 배지(#11875-093, Gibco)에 10 % (v/v) FBS와 1 % (v/v) Penicilin-streptomycin을 첨가한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 유방암 세포(MDA-MB-231)를 배양하였다. 이후, 상기 세포를 10,000 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 밤새(overnight) 배양하고, 인간 말초단핵세포(Human peripheral blood mononuclear cells, PBMC) (Effector 세포)를 20:1(effector 세포: target(MDA-MB-231)세포)의 비율로 분주하여 공배양하였다. 이후, 상기 세포에 Anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체를 웰에 처리한 후, 48시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액을 회수한 후, LDH Cytotoxicity assay kit (#C20301, Invitrogen)를 사용하여 하기 수학식 1에 따라 세포 독성을 분석하였다. 양성대조군으로는 Avelumab (항 PD-L1 항체, Bavencio®)을 사용하였다.
Figure 112021062169180-pat00001
MDA-MB-231 암세포 증식 억제 효과 (EC 50 )
Anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv BsAb 1.3 ng/mL
Avelumab (항 PD-L1 항체) 11.8 ng/mL
도 9는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 in vitro 암세포 사멸 유도능을 평가한 그래프이다(Avelumab: 양성대조군, anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv BsAb: CH3 도메인에 PTC074 서열을 보유하고 있는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체).그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 양성대조군의 Emax(최대 세포독성 효과)는 물질 최대농도에서 26%인 반면 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체의 Emax는 76.3%로 암세포에 대한 세포독성 효과가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군은 물질 농도 2log (ng/mL) 이상에서 세포 용해가 증가하지 않고 포화되었으며, 0log~2log (ng/mL) 구간에서 유효량이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체는 물질농도 1log (ng/mL) 이상에서 세포 용해가 증가하지 않고 포화되었으며 -1log~1log (ng/mL)에서 유효량이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 표 12에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 암세포에 대한 증식 억제 효과가 양성대조군의 경우, 11.8 ng/mL EC50인 반면, Fab-Fc × scFc-Fc 이종이중항체는 1.3ng/mL EC50 로 암세포 증식 억제에 더 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체에 의해 형성된 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체는 공지된 면역항암제와 비교하여 낮은 농도에서 우수한 항암 효과를 나타내는 바, 정상 세포 파괴나 내성 등과 같은 기존 치료제의 부작용을 대체할 수 있다.
8-2. 항암 효능 확인
인간화된 마우스 이종이식 모델(humanized mouse xenograft model)을 사용하여 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 in vivo 항암 효능을 평가하였다. 구체적으로, MDA-MB-231 세포 (5 X 106)과 정제된 인간 T 세포(purified human T cells) (2.5 X 106) 혼합물을 동일한 양의 마트리겔과 혼합하여 NOD/SCID 마우스 (Female, 6주령, 자바이오) 옆구리에 0.2 mL/mouse의 용량으로 피하 투여하였다. 접종 한 시간 후, 상기 실시예 7-1에서 제조한 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체 2.5 mg/kg를 정맥 투여(5회/주)하였다. 양성대조물질인 Avelumab은 20 mg/kg로 정맥 투여(3회/주)하였다. 접종 7일 후부터 종양 부피를 측정(3회/주)하여 두 물질의 항암 효능을 비교 평가하였다.
도 10은 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체의 in vivo 암 성장 억제 효능을 평가한 그래프이다(Avelumab: 양성대조군, anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv BsAb: CH3 도메인에 PTC074 서열을 보유하고 있는 anti-PD-L1 × anti-CD3 scFv 이중특이 항체).
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 음성대조군의 경우, 평균 종양 부피가 600 ㎜3 이상이 될 때까지 28일 동안 점진적으로 증가하여 종양성장억제 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군의 경우, 종양 부피가 지속적으로 증가하여 28일 째에 종양성장억제효과가 59%로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Fab-Fc × scFv-Fc의 경우, 9일에서 21일까지 동일한 종양성장억제 회귀(regression)를 유지하며 28일째에 종양성장억제 효과가 80%로 인간화된 마우스 이종이식 모델에서 효과적으로 종양의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 Fc 변이체에 의해 형성된 Fab-Fc × scFv-Fc 이종이중항체는 종양성장억제 효과가 우수한 바, 유방암을 포함한 다양한 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> MUSTBIO Co., Ltd. <120> Bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof and method for preparing the same <130> PN138882KKR <150> KR 10-2020-0066030 <151> 2020-06-01 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Fc1 in PTCWT <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val 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Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of Fc1 in PTCWT <400> 2 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser 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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (26)

  1. 제1 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 CH3 항체 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하는 단백질 복합체로서,
    상기 제1 CH3 항체 불변 영역은 366번째 위치에 트립토판(W)을 포함하고, 상기 제2 CH3 항체 불변 영역은 366번째 위치에 세린(S), 368번째 위치에 알라닌(A), 및 407번째 위치에 발린(V)을 포함하고; 및
    제2 CH3 항체 불변 영역의 351번째 위치에 글리신(G) 또는 페닐알라닌(F)을 포함하는 것인 단백질 복합체.
    (단, 상기 아미노산의 위치는 Kabat EU index에 따른다)
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 복합체는 항원-결합 단편(Fab), 단쇄 가변 단편(scFv), 막 수용체의 세포외 도메인, 작용제(agonist), 길항제(antagonist), 리간드(ligand), 유인(decoy) 수용체, 사이토카인, 응고 인자 및 친화성 태그로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 단백질 복합체.
  3. 청구항 1의 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 하나 이상의 세포에 형질전환하여 상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현시키는 단계를 포함하는 단백질 복합체를 제조하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터와 상기 제2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 세포에 공형질전환(co-transfection)하거나 또는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터와 상기 제2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 2종 이상의 세포에 각각 형질전환하는 것인 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 세포 또는 세포 배양액으로부터 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 단백질 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 단백질 복합체는 이의 항원-결합 단편, 단쇄 결합 단편, 막 수용체의 세포외 도메인, 작용제, 길항제, 리간드, 또는 유인 수용체, 사이토카인, 응고 인자, 친화성 태그로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1의 단백질 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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