CN115698086A - 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法 - Google Patents

一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115698086A
CN115698086A CN202180038651.8A CN202180038651A CN115698086A CN 115698086 A CN115698086 A CN 115698086A CN 202180038651 A CN202180038651 A CN 202180038651A CN 115698086 A CN115698086 A CN 115698086A
Authority
CN
China
Prior art keywords
constant region
antibody constant
tryptophan
ser
alanine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180038651.8A
Other languages
English (en)
Inventor
郑圣烨
朴永振
房孝住
金孟燮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Master Biology Co ltd
Original Assignee
Master Biology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Master Biology Co ltd filed Critical Master Biology Co ltd
Publication of CN115698086A publication Critical patent/CN115698086A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种具有高异二聚体形成率的蛋白复合物及其制备方法、包括蛋白复合物的癌症预防或治疗用药物组合物以及使用其的癌症预防或治疗方法。据此，可以容易地制备具有增加的稳定性的双特异性抗体或抗原结合片段、受体和受体结合激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)、细胞因子或受体诱饵(decoy)双缀合物，并且可以用于疾病预防或治疗、疾病诊断等各个领域。

Description

一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法
技术领域
本申请要求于2020年6月1日提交的韩国专利申请第10-2020-0066030号的优先权，所述说明书全文为本申请的参考文献。
本发明涉及一种具有高异二聚体形成率的双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法。
背景技术
天然人免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)由彼此相同的两条重链(heavy chain)和两条轻链(light chain)结合而组成。另外，免疫球蛋白在功能上可分为抗原-抗体结合的抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)区和由两条重链形成二聚体(dimer)的片段可结晶(fragment crystallizable，Fc)区。由于这些天然免疫球蛋白，即单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，通常具有相同的两个Fab区，因此其靶向相同抗原的相同结合表位(epitope)，并且具有二价(bi-valent)单特异性(mono-specific)结合特性。
免疫球蛋白由于Fab区的靶特异性抗原结合功能以及Fc区的诱导免疫细胞和增加体内半衰期的功能而广泛用作各种疾病的治疗剂。然而，近年来，在癌症或自身免疫性疾病等难治性疾病中，由于使用作用于不同靶点的两种药物的协同治疗显示出比使用单一药物更高的治疗效果，因此已经开发出多种可作用于两种靶标物质的双特异性(bi-specific)抗体。
在如此开发的双特异性抗体中，不同抗体的可变区片段通过多肽链连接而成的scFv-scFv型双抗体具有分子量小、稳定性低、不能在体内停留时间长且维持药效的缺点。另外，其他抗体的可变区片段连接到天然免疫球蛋白多肽末端的scFv-Fab-Fc或Fab-Fc-scFv型双抗体具有由于结构稳定性低而形成聚集体(aggregate)并在体内表现出免疫原性(immunogenicity)的缺点。因此，为了解决这些问题，需要开发具有不同可变区的双抗体，同时尽可能遵循天然免疫球蛋白的形式。
为了形成这种类型的双抗体，应该在两种不同Fab-Fc的Fc区之间形成异二聚体(heterodimer)。由于各CH3结构域相互作用的位置的氨基酸在Fc异二聚体形成中起重要作用，因此正在开发用其他氨基酸取代这些氨基酸的方法的Fc异二聚体技术(美国专利号5731168A(1998年3月24日)，韩国专利号10-2098919(2020年4月2日))。
然而这些开发的现有的Fc异二聚体技术也有一个局限性，即不能将所有的Fc结构物制成100％异二聚体的形式，而形成异二聚体和同源二聚体的混合物。
因此，需要开发具有改进的异二聚体形成效率的蛋白复合物、包括其的双特异性抗体或其抗原结合片段、受体和受体结合激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)和受体诱饵(decoy)双缀合物等。
发明内容
技术问题
本发明的一方面提供一种具有高异二聚体形成率的蛋白复合物。
本发明的另一方面提供一种具有高异二聚体形成率的蛋白复合物的制备方法。
本发明的又一方面提供一种用于预防或治疗疾病的药物组合物，其包括具有高异二聚体形成率的蛋白复合物。
本发明的再一方面提供一种使用具有高异二聚体形成率的蛋白复合物来预防或治疗疾病的方法。
本发明的再一方面还提供一种具有高异二聚体形成率的蛋白复合物在制备疾病的预防剂或治疗剂中的用途。
技术方案
本发明的一方面一种蛋白复合物，其包括含有第一CH3抗体恒定区的第一多肽和含有第二CH3抗体恒定区的第二多肽，所述第一多肽和第二多肽形成异二聚体(heterodimer)。
根据一具体实施例，所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)，所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)；以及第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区中的至少一个包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。
所述蛋白复合物包括含有第一CH3抗体恒定区的第一多肽和含有第二CH3抗体恒定区的第二多肽，所述第一多肽和第二多肽可以形成异二聚体(heterodimer)。
术语“抗体(antibody)”与术语“免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)”互换使用。完整抗体具有两条全长(full length)轻链和两条全长重链的结构，每条轻链通过二硫键(disulfide bond，SS-bond)与重链键合。所述轻链(light chain)有两种类型，λ和κ，由大约211至217个氨基酸组成。再每个人的抗体中，同样只有一条轻链。轻链由连续的恒定区和可变区组成。所述重链(heavy chain)有五种(γ、δ、α、μ、ε)类型，重链决定抗体的类型。α和γ由450个氨基酸组成，μ和ε由550个氨基酸组成。重链有两个区域，即可变区和恒定区。所述可变区(variable region)是指抗体中抗原结合的区域。所述可变区可以包括赋予抗原结合特异性的互补决定区(complementarity determining region，CDR)。
所述抗体可以包括与抗原结合的抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)区和与细胞表面受体结合的片段可结晶(fragment crystallizable，Fc)区。当用木瓜蛋白酶(papain)切割时，完整的抗体可以切割成两个Fab和一个Fc区。在Fab区中，包括重链的可变区(VH)结构域和重链的恒定区1(CH1)结构域的多肽和包括轻链的可变区(VL)结构域和轻链的恒定区(CL)结构域的多肽可以通过二硫键连接。在Fc区中，可以连接包括重链的恒定区2(CH2)结构域和恒定区3(CH3)结构域的两条多肽。Fc区可以形成铰链区。
所述CH3抗体恒定区是指抗体的重链恒定区3结构域。
第一多肽和第二多肽可以形成抗体的Fc区。
所述异二聚体(heterodimer)或异源二聚体是指具有不同序列、数目或类型的氨基酸残基的两种多肽的组合。所述蛋白复合物可以是双特异性抗体或其抗原结合片段，其通过结合两种特异性结合不同靶标的多肽而形成。
所述蛋白复合物可以是双特异性(bispecific)抗体或其抗原结合片段、受体和激动剂(agonist)的缀合物、受体和拮抗剂(antagonist)的缀合物、受体和配体(ligand)的缀合物、或配体和诱饵(decoy)受体的缀合物。另外，所述蛋白复合物可以包括选自由抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、膜受体的细胞外结构域、激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)、诱饵(decoy)受体、细胞因子、凝血因子和亲和性标签组成的组。
所述抗体可以是例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体可以是动物来源抗体、小鼠-人嵌合抗体(chimeric antibody)、人源化抗体(humanized antibody)或人抗体。
术语“抗原结合片段(antigen-binding fragment)”是指针对整个免疫球蛋白结构的片段，是指包括抗原结合部分的多肽的一部分。例如，抗原结合片段可以是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、Fab'、Fv F(ab')2或其组合。
术语“双特异性(bispecific)”是指对不同靶蛋白的特异性识别。双特异性抗体或其抗原结合片段是指具有两个识别不同靶抗原的抗原结合位点的抗体或其抗原结合片段。双特异性抗体或其抗原结合片段也可称为双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)。
所述双特异性抗体或其抗原结合片段可以是kih(knob into hole)IgG、scFv-Fc、scFv2-Fc、TrioMab、IgG样(IgG-like)抗体、CrossMab、2:1CrossMab、2:2CrossMab、DuoBody、双可变域免疫球蛋白(dual variable domain immunoglobulin，DVD-Ig)、scFv-IgG、IgG-IgG、Fab-scFv-Fc、ADPTIR、双特异性T细胞接合剂(bispecific T cell engager，BiTE)-Fc、双亲和重靶向分子(Dual affinity retargeting，DART)-Fc、四价DART-Fc、LP-DART、交叉双重可变结构域(cross-over dual variable，CODV)-Ig、CODV-Fab-TL、半衰期延长(half-life extended，HLE)-Bite、串联仅重链可变结构域(heavy chain-onlyvariable domain，VHH)-Fc，或其组合。
术语“受体(receptor)”是指接收或传递可传递到生物系统的信号的物质。所述受体可以是蛋白质受体。所述受体可以结合于激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)或细胞因子(cytokine)。所述激动剂可以是与受体结合并激活受体以诱导生物反应的物质。所述拮抗剂可以是与受体结合并抑制受体以抑制生物反应的物质。所述配体可以是与受体结合的物质。所述配体可以结合于诱饵(decoy)受体。诱饵受体是指与配体特异性结合以抑制通过实际受体的信号转导的受体。所述细胞因子是指一种作用于细胞信号传导、调节和维持炎症过程的小蛋白质。
所述蛋白复合物可以是经过修饰的。例如，所述蛋白复合物可以通过缀合(conjugation)或结合、糖基化(glycosylation)、标签附着或其组合来修饰。所述抗体可以与其他药物如抗癌药物缀合。例如，所述蛋白复合物可以是与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶、半抗原(hapten)、生物素、链霉抗生物素蛋白、荧光材料、放射性材料、量子点、聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)、组氨酸标签或其组合结合的。所述荧光材料可以是Alexa
Figure BDA0003967714840000031
Alexa
Figure BDA0003967714840000032
Alexa
Figure BDA0003967714840000033
Alexa
Figure BDA0003967714840000034
Alexa
Figure BDA0003967714840000035
Alexa
Figure BDA0003967714840000036
或Alexa
Figure BDA0003967714840000037
所述氨基酸的位置根据Kabat EU指数(“Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991)”中记载的EU-指数)。所述CH3结构域的氨基酸位置和其相应的氨基酸类型以人IgG1为准。
在所述蛋白复合物中，第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)。在第一CH3抗体恒定区中，第366位可以用色氨酸(W)取代苏氨酸(T)(T366W)。所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)。在第二CH3抗体恒定区中，366位可以用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)(T366S)。在第二CH3抗体恒定区中，366位可以用丙氨酸(A)取代亮氨酸(L)(L368A)。在第二CH3抗体恒定区中，407位可以用缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)(Y407V)。
所述蛋白复合物中，第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区中的至少一个可以包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)和丝氨酸(S)中的至少一个氨基酸。
例如，所述第一CH3抗体恒定区可以包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)和异亮氨酸(I)中的至少一个氨基酸。另外，所述第二CH3抗体恒定区可以包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)中的至少一个氨基酸。
根据一具体实施例，所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)、394位的苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或色氨酸(W)。所述394位可以用苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或色氨酸(W)取代苏氨酸(T)(T394F、T394H或T394W)。
根据另一具体实施例，所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)，可以包括351位的色氨酸(W)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或苯丙氨酸(F)。所述351位可以用色氨酸(W)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)(L351W、L351V、L351A或L351F)。
根据另一具体实施例，所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)或苯丙氨酸(F)。所述351位可以用丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)或苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)(L351A、L351G、L351V、L351M或L351F)。
所述第一CH3抗体恒定区可以包括选自由下项组成的组：
366位的色氨酸(W)；
366位的色氨酸(W)和394位的组氨酸(H)；
366位的色氨酸(W)和394位的苯丙氨酸(F)；
366位的色氨酸(W)和394位的色氨酸(W)；
366位的色氨酸(W)和351位的苯丙氨酸(F)；
366位的色氨酸(W)和351位的色氨酸(W)；
366位的色氨酸(W)和351位的缬氨酸(V)；
366位的色氨酸(W)和351位的丙氨酸(A)；以及
366位的色氨酸(W)，394位的组氨酸(H)和351位的苯丙氨酸(F)。
所述第二CH3抗体恒定区包括选自由下项组成的组：
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的缬氨酸(V)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的蛋氨酸(M)；以及
366位的丝氨酸(S)，368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的苯丙氨酸(F)。
所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)，并包括394位的苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或色氨酸(W)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)。
所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)和351位的苯丙氨酸(F)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)。所述第一CH3抗体恒定区还可以包括394位的组氨酸(H)。
所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)。所述第一CH3抗体恒定区还可以包括351位的苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)或蛋氨酸(M)。所述第一CH3抗体恒定区还可以包括351位的缬氨酸(V)或丙氨酸(A)。例如，所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)和351位的缬氨酸(V)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)。另外，所述第一CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)和351位的丙氨酸(A)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的苯丙氨酸(F)。
根据本发明一方面的蛋白复合物可以是Fc变体的反向序列取代变体。如本文所用，术语“反向序列取代变体”是指蛋白复合物的左右重链恒定区相对于坐标平面上的Y轴对称的结构。例如，所述反向序列取代变体可以表示在根据一具体实施例的蛋白复合物中氨基酸取代的特定位置和类型相同，但第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区相对于坐标平面上的Y轴对称的结构。由于所述反向序列取代变体以与特定氨基酸的取代前相似的比率形成异二聚体，因此可以高效地形成Fc变体。所述蛋白复合物的具体细节如上所述。
根据一具体实施例，所述第一CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)，所述第二CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)；以及第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区中的至少一个包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。所述第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区的具体细节如上所述。
另外，第一CH3抗体恒定区可以包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)；以及所述第二CH3抗体恒定区可以包括366位的色氨酸(W)。所述第二CH3抗体恒定区还可以包括351位的苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
在一实施例中，根据比较将抗体的CH3抗体恒定区中特定位置的氨基酸取代所选择的Fc变体的异二聚体形成率的结果，与野生型IgG1和Genentech的旋钮入孔(knobs-in-hole，KiH)双抗体相比，确认了不仅异二聚体的形成率显著高，而且热力学稳定性也很优异。另外，在所述Fc变体的反向序列取代变体中，与野生型IgG1和Genentech的旋钮入孔(knobs-into-hole，KiH)双抗体相比，确认了异二聚体形成率显著高。因此，根据本发明一方面的蛋白复合物具有改进的异二聚体形成效率，从而其可以用作包括其的双特异性抗体或其抗原结合片段、受体和受体结合激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)和受体诱饵(decoy)双缀合物等。
提供一种蛋白复合物的制备方法，其包括：将编码根据本发明一方面的第一多肽、第二多肽或其组合的至少一个表达载体转化到至少一个细胞以表达所述第一多肽、第二多肽或其组合。
所述第一多肽、第二多肽和蛋白复合物的具体细节如上所述。
表达载体是可在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，是指包括可操作地连接以表达插入的核酸序列的必需调节元件的载体。所述“可操作地连接(operablylinked)”是指核酸表达控制序列与编码靶蛋白的核酸功能性地连接以发挥一般功能。所述表达载体可以包括编码所述第一多肽、第二多肽或其组合的多核苷酸。所述表达载体可以包括基因表达所必需的调控区，例如增强子(enhancer)、启动子、多聚(A)序列等。
所述细胞可以是癌细胞。所述细胞可以是体外(in vitro)细胞。所述细胞可以是细菌、酵母、植物细胞或哺乳动物细胞。所述细胞可以是大肠杆菌。所述哺乳动物细胞是指来源于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、羊、牛、马、猴子、黑猩猩或人的细胞。所述细胞可以是细胞系。所述细胞可以选自例如中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞、人胚胎肾细胞(human embryonic kidney，HEK)、幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney，BHK)、NS0细胞、PER.C6细胞、HeLa细胞、马丁达比犬肾(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)细胞、SP2/0小鼠骨髓瘤细胞、COS-7和YB2/0大鼠骨髓瘤细胞。所述CHO细胞可以是CHO DG44、CHO-K1、CHO-S、GS-CHO或CHO DUKX(DXB11)细胞。所述HEK细胞可以是HEK293细胞。
“转化(transformation)”是指将特定核酸片段插入细胞基因组中以使所插入的核酸表达的方法。
可以将编码所述第一多肽的表达载体和编码所述第二多肽的表达载体共转化(co-transfection)到细胞，或者将编码所述第一多肽的表达载体和编码所述第二多肽的表达载体分别转化到至少两种细胞。
所述细胞可以在细胞培养基中培养。细胞培养基是指含有培养细胞所必需的营养成分的溶液。所述培养基包括用于培养细胞的商业化的或制备的培养基。所述细胞培养基可以含有抗生素。所述细胞培养基可以包括G418(遗传霉素(geneticin))、嘌呤霉素(Puromycin)、杀稻瘟菌素(Blasticidin)、博莱霉素(Zeocin)或其组合。所述细胞培养基可以包括化学成分确定的培养基(chemically defined medium)。
所述细胞可以在允许细胞存活或增殖的条件下培养。所述允许细胞存活或增殖的条件可能因细胞类型而不同。所述细胞可以在约25℃至约42℃、约25℃至约40℃、约30℃至约40℃、约30℃至约37℃或约37℃培养。所述细胞可以在约1％二氧化碳至约10％二氧化碳或约5％二氧化碳至约10％二氧化碳的空气存在下培养。所述细胞可以在约pH6至约pH8、约pH6.2至约pH7.8、约pH6.4至约pH7.6、约pH6.6至约pH7.4或约pH6.8至约pH7.2的培养基中培养。所述细胞可以在约10％至约80％、约15％至约70％或约20％至约60％的溶解氧条件下培养。
所述培养可能因细胞类型而不同。所述培养可以使用已知的方法。所述培养可以在板、烧瓶等上进行。所述培养可以通过附着在基材上或漂浮在培养液中来进行。所述培养可以是继代培养(subculture)、分批培养(batch culture)、补料分批培养(fed-batchculture)、灌流培养(perfusion culture)或其组合。在所述培养过程中，细胞培养基可以定期更换新鲜培养基。所述细胞可以培养约1天或更多、约2天或更多、约3天或更多、约4天或更多、约5天或更多、约6天或更多、约1周或更多、约10天或更多、约2周或更多、约3周或更多、约1个月或更多、约1天至约1个月、约1天至约3周、约1天至约2周、约2天至约2周、约3天至约2周、约4天至约2周、约5天至约2周、约6天至约2周或约1周至约2周。
可以包括：从所述细胞或细胞培养液获得第一多肽、第二多肽或第一多肽和第二多肽的蛋白复合物。
所述细胞培养液可以是不含所述细胞的培养液。
当将所述表达载体共转化到细胞中时，可以从所述细胞或细胞培养液获得第一多肽和第二多肽的蛋白复合物。当分别将编码所述第一多肽的表达载体和编码所述第二多肽的表达载体转化到至少两种细胞时，可以分别从所述细胞或细胞培养液获得第一多肽和第二多肽。
所述获得蛋白复合物的步骤可以包括：将所获得的第一多肽和所获得的第二多肽孵育以形成蛋白复合物。所述孵育可以在还原条件下进行。所述还原条件可以在2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)或其组合存在下。
所述获得蛋白复合物的步骤可以包括：纯化蛋白复合物。所述纯化可以通过过滤、离心分离、色谱、透析、免疫沉淀或其组合进行。
本发明另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括根据本发明一方面的蛋白复合物。
所述蛋白复合物的具体细节如上所述。
所述癌症可以是实体癌或非实体癌。实体癌是指例如肝脏、肺、乳房和皮肤等器官中出现的癌性肿瘤。非实体癌是指在血液中出现的癌症，也称为血癌。所述癌症可以是癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、造血细胞衍生的癌症、生殖细胞肿瘤(germ cell tumor)或母细胞瘤(blastoma)。所述癌症可以选自乳腺癌、皮肤癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、结肠直肠癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、肾癌、透明细胞肉瘤、黑色素瘤、脑脊髓肿瘤、脑癌、胸腺瘤、间皮瘤、食道癌、胆道癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)、骨髓纤维化(myelofibrosis)、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、内分泌系统癌和肉瘤。
术语“预防”是指通过施用所述药物组合物来抑制疾病或延迟其发作的任何行为。术语“治疗”是指通过施用所述药物组合物来改善或有益地改变疾病症状的任何行为。
所述药物组合物可以包括药学上可接受的载体。所述载体以包括赋形剂、稀释剂或佐剂的意义使用。所述载体可以选自例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、生理盐水、缓冲剂如PBS、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。所述组合物可以包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、保存剂或其组合。
所述药物组合物可以根据常规方法制备成任何剂型。所述组合物可以例如配制成口服剂型(例如，粉剂、片剂、胶囊、糖浆、丸剂或颗粒剂)，或非口服剂型(例如，注射剂)。另外，所述组合物可以制备成全身剂型或局部剂型。
所述药物组合物还可以包括其他抗癌剂。所述抗癌剂可以是西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、T-DM1、帕妥珠单抗(Perjeta)、拉帕替尼(lapatinib)、紫杉醇、泰素、他莫昔芬、顺铂或其组合。所述药物组合物可以是单一组合物或单独的组合物。例如，所述抗体或其抗原结合片段的组合物可以是非口服剂型的组合物，抗癌剂可以是口服剂型的组合物。
所述药物组合物可以包括有效量的蛋白复合物。术语“有效量”是指当施用于需要预防或治疗疾病的个体时足以显示预防或治疗效果的量。所述有效量可以由本领域技术人员根据所选择的细胞或个体适当地选择。可以根据疾病的严重程度、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄比率、治疗期间、包括与所用组合物联合使用或同时使用的药物在内的因素以及医学领域已知的其他因素来确定。所述有效量可以是每个所述药物组合物的约0.5μg至约2g、约1μg至约1g、约10μg至约500mg、约100μg至约100mg或约1mg至约50mg。
例如，基于成人，所述药物组合物的剂量范围可以为约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。所述施用可以在每天一次、每天多次，或每周一次、每两周一次、每三周一次，或每四周一次至每年一次。
本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括将根据本发明一方面的蛋白复合物施用于细胞或个体。
所述蛋白复合物、细胞、癌症、预防或治疗的具体细节如上所述。
所述个体可以是哺乳动物，例如人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以是患有或很有可能患有癌症的个体。
所述方法还可以包括：向个体施用第二活性成分。第二活性成分可以是用于预防或治疗癌症的活性成分。所述活性成分可以与所述蛋白复合物同时、分开或依次施用。
所述蛋白复合物可以通过任何方式直接施用于个体，例如口服、静脉内、肌内、口服、经皮(transdermal)、粘膜、鼻内(intranasal)、气管内(intratracheal)或皮下施用。所述蛋白复合物可以全身或局部施用，单独施用或与其他药物活性化合物组合施用。
所述蛋白复合物的优选剂量取决于患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式、施用途径和期间，但本领域的技术人员可以适当地选择。例如，基于成人，所述剂量的范围可以为约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。所述施用可以在每天一次、每天多次，或每周一次、每两周一次、每三周一次，或每四周一次至每年一次。
有益效果
根据具有高异二聚体形成率的蛋白复合物、其制备方法、包括蛋白复合物的用于预防或治疗癌症的药物组合物以及使用其的预防或治疗癌症的方法，可以容易地制备具有增加稳定性的双特异性抗体或抗原结合片段、受体和受体结合的激动剂、拮抗剂、配体、细胞因子或受体诱饵双缀合物，可以容易地制备具有增加的稳定性的双特异性抗体或抗原结合片段、受体和受体结合激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、配体(ligand)、细胞因子或受体诱饵(decoy)双缀合物，并且可以用于疾病预防或治疗、疾病诊断等各个领域。
附图说明
图1是Fc变体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT(阴性对照组)，019：PTC019(阳性对照组)，039：PTC039，040：PTC040，074：PTC074，111：PTC111)。
图2是Fc变体的毛细管电泳-SDS(capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS)分析结果的曲线图。
图3a至3e是分别显示PTCWT、PTC019、PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的尺寸排阻-高效液相色谱(Size exclusion-high-performance liquid chromatography，SE-HPLC)分析结果的曲线图。
图4是反向序列取代Fc变体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT(阴性对照组)，019：PTC019(阳性对照组)，088：PTC088，089：PTC089，090：PTC090)。
图5是一些序列取代Fc变体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT(阴性对照组)，019：PTC019(阳性对照组)，074：PTC074，097：PTC097，098：PTC098，099：PTC099，111：PTC111，113：PTC113)。
图6是Fab-Fc×scFv-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体)。
图7是Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体)。
图8是Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体)。
图9是评估anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体在体外(in vitro)诱导癌细胞死亡的能力的曲线图(阿维单抗(Avelumab)：阳性对照组，anti-PD-L1×anti-CD3scFv BsAb：CH3结构域中具有PTC074序列的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体)。
图10是评估anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体在体内(in vivo)抑制癌细胞生长的功效的曲线图(阿维单抗(Avelumab)：阳性对照组，anti-PD-L1×anti-CD3scFv BsAb：CH3结构域中具有PTC074序列的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体)。
具体实施方式
在下文中，提供了优选的实施例以帮助理解本发明。然而，以下实施例仅为了便于理解本发明而提供，本发明的内容不受以下实施例的限制。
[实施例]
实施例1、准备Fc异二聚体变体
为了评估由于抗体CH3结构域中的氨基酸取代而改变的Fc异二聚体形成能力，构建了设计的每个Fc变体的表达系统。
为了便于区分和分析构成异二聚体的两条Fc多肽，将第一多肽设计为表达重链和轻链均连接的完整的IgG链(Fc1)，而将第二多肽设计为仅表达重链的Fc区(Fc2)。Fc1基于包括野生型IgG1 Fc区的阿维单抗(Avelumab)抗体(
Figure BDA0003967714840000102
Pfizer)取代CH3结构域的氨基酸，Fc2基于野生型IgG1抗体的Fc区取代CH3结构域的氨基酸。Fc1轻链具有与阿维单抗(Avelumab)抗体轻链相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
为了比较，野生型IgG1(对应于表1的“PTCWT”)用作阴性对照组，Genentech的旋钮入孔(KiH)双抗体(对应于表1的“PTC019”)用作阳性对照组。
具体而言，通过将编码每个多肽的核苷酸开放阅读框(open reading frame，ORF)引入pCHO1.0载体来准备表达载体。ExpiCHO-STM(Thermo Fisher)细胞系在ExpiCHOTM表达培养基中培养。使用ExpiFectamieTM CHO转染试剂盒(Thermo Fisher)，将Fc1表达载体和Fc2表达载体以1:1混合并转染到ExpiCHO-STM细胞系。在表达培养基中培养转染细胞后，分离和回收培养液。使用蛋白A HP SpinTrapTM柱(GE Healthcare)纯化所回收的培养液中的表达蛋白质。对于所纯化的蛋白质，用PBS(pH 7.4)交换缓冲液，并测量蛋白质浓度。
表达的氨基酸序列如下所述。
[PTCWT]
Fc1重链：
Figure BDA0003967714840000101
Figure BDA0003967714840000111
(粗体：L351，粗体和下划线：T366)
Fc1轻链：
Figure BDA0003967714840000112
Fc2的Fc链：
Figure BDA0003967714840000113
(粗体：L351，粗体和下划线：T366，下划线：L368，斜体：Y407)
[PTC019]
Fc1重链：
Figure BDA0003967714840000114
Figure BDA0003967714840000121
(粗体：L351，粗体和下划线：T366W)
Fc1轻链(SEQ ID NO：2)
Fc2的Fc链：
Figure BDA0003967714840000122
(粗体：L351，粗体和下划线：T366S，下划线：L368A，斜体：Y407V)
[PTC039]
Fc1重链：
Figure BDA0003967714840000123
(粗体：L351F，粗体和下划线：T366W)
Fc1轻链(SEQ ID NO：2)
Fc2的Fc链：
Figure BDA0003967714840000124
Figure BDA0003967714840000131
(粗体：L351G，粗体和下划线：T366S，下划线：L368A，斜体：Y407V)
[PTC040]
Fc1重链：
Figure BDA0003967714840000132
(粗体：L351W，粗体和下划线：T366W)
Fc1轻链(SEQ ID NO：2)
Fc2的Fc链(SEQ ID NO：7)
[PTC074]
Fc1重链(SEQ ID NO：4)
Fc1轻链(SEQ ID NO：2)
Fc2的Fc链(SEQ ID NO：7)
[PTC111]
Fc1重链(SEQ ID NO：4)
Fc1轻链(SEQ ID NO：2)
Fc2的Fc链：
Figure BDA0003967714840000141
(粗体：L351F，粗体和下划线：T366S，下划线：L368A，斜体：Y407V)
实施例2、比较Fc变体异二聚体的形成能力
使用所述实施例1中构建的暂时表达系统，比较了因CH3结构域的氨基酸取代而改变的Fc异二聚体的形成能力，并由此选择了高效的Fc异二聚体变体。
作为评估方法，在非还原性SDS-PAGE后，测量对应于异二聚体的PAGE条带的强度并进行比较。
具体而言，准备将实施例1中纯化的蛋白质用2-巯基乙醇还原或未经2-巯基乙醇处理的样本。还原或非还原的样本通过SDS-PAGE方法进行电泳，并使用ChemiDocTM成像系统(Bio-Rad)和Image LabTM软件(Bio-Rad)测量电泳条带的强度。
通过测得的条带强度计算根据CH3结构域氨基酸取代的Fc异二聚体形成能力，结果如下表1所示。
[表1]
Figure BDA0003967714840000151
其结果，如表1所示，可以确认阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)的异二聚体形成率分别为41.5％和64.6％，而PTC032、PTC033、PTC034、PTC037、PTC039、PTC040、PTC061、PTC074、PTC082、PTC091、PTC111和PTC113的异二聚体形成率分别为78.7％、76.4％、76.1％、85.8％、93.8％、94.6％、70.9％、94.9％、79.3％、75.4％、92.7％和82.8％。尤其，可以确认PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的Fc异二聚体的比率超过90％。
即，根据本发明一方面的Fc变体可以表现出非常优异的Fc异二聚体形成能力。
实施例3、评估高效Fc变体的异二聚体形成能力
3-1、SDS-PAGE分析
为了评估实施例2中选定的高效Fc变体的异二聚体形成能力，以与实施例2相同的方法进行了SDS-PAGE分析。
具体而言，电泳条带的强度由SDS-PAGE分析测定。然后，通过测得的条带强度计算根据CH3结构域氨基酸取代的Fc异二聚体形成比率，结果如下表2所示(无：不适用)。
[表2]
Figure BDA0003967714840000161
图1是Fc变体的SDS-PAGE分析结果图。
其结果，如图1所示，可以确认，与阴性对照组(PTCWT)相比，选定的PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的Fc变体显着降低了Fc1-1同源二聚体(146.8kDa)的条带强度，与阳性对照组(PTC019)相比，显着降低了Fc2单体(25.9kDa)的条带强度。另一方面，可以确认，在99.3kDa处以高效率形成了Fc1-2异二聚体。
另外，如表1所示，可以确认，对阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)而言，除了Fc1-2异二聚体之外，Fc1-1同源二聚体也在阴性对照组(PTCWT)中以17.1％的比率形成，Fc-2-2同源二聚体在阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)中的形成比率分别为39.9％和13.3％。另一方面，可以确认，对选定的PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的Fc变体而言，Fc1-1同源二聚体和Fc-2-2同源二聚体的形成率较低，而Fc1-2异二聚体的形成率显着高。
即，可以看出，根据本发明一方面的Fc变体可以选择性地形成Fc1-2异二聚体。
3-2、CE-SDS分析
为了验证实施例2中选定的高效Fc变体的异二聚体形成能力，进行了毛细管电泳-SDS(capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS)分析。
具体而言，使用PA800plusTM药物分析系统(SCIEX)进行毛细管电泳，以验证Fc变体的Fc异二聚体形成比率，其结果见下表3。
[表3]
注释 分子量(kDa) PTCWT PTC019 PTC039 PTC040 PTC074 PTC111
Fc1-1同源二聚体 144.0 11.1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
Fc1-2异二聚体 98.0 40.1 60.1 81.0 80.2 83.8 84.8
轻链游离Fc1-2异二聚体 75.2 4.8 2.5 3.8 7.7 8.5 6.6
Fc1单体 71.9 0.5 0.3 1.0 1.4 0.6 0.4
Fc-2-2同源二聚体 49.2 34.4 13.7 n.d. n.d. n.d. 0.6
Fc2单体 24.6 n.d. 20.3 11.3 7.5 2.4 2.0
游离(free)轻链 22.8 2.5 0.4 1.8 2.3 2.7 2.0
图2是Fc变体的毛细管电泳-SDS(capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS)分析结果的曲线图。
其结果，如图2所示，可以确认，在停留时间为23分钟时，阴性对照组(PTCWT)的Fc-2-2同源二聚体形成率为34.44％，而阳性对照组(PTC019)的Fc-2-2同源二聚体形成率为13.71％。另一方面，对PCT039、PTC040和PTC074而言，没有形成Fc-2-2同源二聚体，对PCT111而言，其形成率为0.57％，与阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PCT019)相比，这是一个显着较低的比率。
另外，如表2所示，PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的异二聚体形成率分别为81.0％、80.2％、83.8％和84.8％，可以确认这显着高于阴性对照组(PCTWT)和阳性对照组(PTC019)。
即，可以看出根据本发明一方面的Fc变体具有优异的异二聚体形成能力。
3-3、SE-HPLC分析
为了验证所述实施例2中选定的高效Fc变体的异二聚体形成能力，进行了尺寸排阻-高效液相色谱(size exclusion-high-performance liquid chromatography，SE-HPLC)分析，其结果如下表4所示。
[表4]
Figure BDA0003967714840000171
图3a至3f是分别显示PTCWT、PTC019、PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的尺寸排阻-高效液相色谱(Size exclusion-high-performance liquid chromatography，SE-HPLC)分析结果的曲线图。
其结果，如图3a至3f所示，在用蛋白A纯化的蛋白的SE-HPLC分析中，包括阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)的Fc变体在16.989分钟至17.197分钟的停留时间处观察到异二聚体的主峰(main peak)。具体地，对阴性对照组(PTCWT)而言，在16.079分钟的停留时间处观察到Fc-1-1同源二聚体峰，并在18.377分钟处观察到Fc2-2同源二聚体峰(图3a)。另外，对阳性对照组(PTC019)而言，在18.343分钟的停留时间处观察到Fc-2-2同源二聚体峰，并在19.14分钟处观察到Fc-2单体峰(图3b)。即，对阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PCT019)而言，显示了包括Fc1-2异二聚体的多个峰(multi peak)，从而可以确认异二聚体形成率较低。PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的Fc变体而言，观察到主峰以单峰的形式出现。即，对选定的Fc变体而言，可以确认，与阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)相比，异二聚体形成率优异。
另外，如表4所示，可以确认，选定的PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的Fc变体比PTCWT和PTC019的两个对照组具有更优异的异二聚体形成能力。
因此，根据本发明一方面的Fc变体可以高效地形成异二聚体，从而可以容易地制备双特异性抗体。
实施例4、评估高效Fc变体异二聚体的热力学稳定性
为了间接确认实施例3中证实的高效Fc变体的异二聚体结构稳定性，使用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)进行热力学稳定性评估。
具体而言，使用Nano DSCTM(TA instruments)测量所选Fc变体的热稳定性，并计算熔点(melting temperature：Tm，℃)。所计算出的Fc变体的熔点如下表5所示。
[表5]
Figure BDA0003967714840000181
其结果，如表5所示，可以确认，与野生型Fc异二聚体(PTCWT)相比，选定的Fc变体PTC039、PTC040、PTC074和PTC111的热稳定性稍微不稳定，但与Genentech公司的KiH Fc异二聚体(PTC019)相比，其具有较高的热力学稳定性。
即，根据本发明一方面的Fc变体具有优异的异二聚体形成能力和优异的热力学稳定性，从而可以形成稳定的双特异性抗体。
实施例5、比较高效Fc变体CH3结构域中的反向序列取代变体的异二聚体形成能力
为了评估所述实施例3中选定的高效Fc变体的CH3结构域中的反向序列取代变体的异二聚体形成能力，以与所述实施例2相同的方法进行了SDS-PAGE分析。
通过从SDS-PAGE分析测得的条带强度计算根据CH3结构域氨基酸取代的Fc异二聚体形成能力，结果如下表6所示。
[表6]
Figure BDA0003967714840000182
图4是反向序列取代Fc变体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT(阴性对照组)，019：PTC019(阳性对照组)，088：PTC088，089：PTC089，090：PTC090)。
其结果，如图4所示，可以确认，与阴性对照组(PTCWT)相比，反向序列取代Fc变体在150kDa附近没有形成条带，在49.2kDa处形成了微弱的条带。即，可以确认，反向序列取代Fc变体没有形成Fc-1-1同源二聚体，并且Fc-2-2同源二聚体形成减少了。另外，可以确认，与阳性对照组(PCT019)相比，在25kDa附近形成了微弱的条带。即，反向序列取代Fc变体减少了Fc-2单体的形成。由此可以看出，异二聚体形成率与PTC039、PTC040和PTC074相似(参见图1)。
另外，如表6所示，可以确认，阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)的异二聚体形成率分别为40.9％和64.7％，而PTC039、PTC040和PTC074的反向序列取代Fc变体即PTC088、PTC089和PTC090的异二聚体形成率分别为72.1％、83.3％和92.1％。
因此，可以看出根据本发明一方面的Fc变体的反向序列取代变体在取代前后以相似的比率形成异二聚体。另外，由于Fc变体的反向序列取代变体具有优异的异二聚体形成率，因此无论插入Fc1或Fc2的序列是否被取代，都可以高效地形成Fc变体。
实施例6、比较CH3结构域351位序列变化Fe变体的异二聚体形成能力
为了评估CH3结构域的351位被具有相似性质的氨基酸取代的变体的异二聚体形成能力，例如实施例3中选定的高效Fc变体PTC074和PTC111，以与所述实施例2相同的方法进行SDS-PAGE分析。
通过从SDS-PAGE分析测得的条带强度计算根据CH3结构域氨基酸取代的Fc异二聚体形成能力，结果如下表7所示。
[表7]
Figure BDA0003967714840000191
图5是一些序列取代Fc变体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT(阴性对照组)，019：PTC019(阳性对照组)，074：PTC074，097：PTC097，098：PTC098，099：PTC099，111：PTC111，113：PTC113)。
其结果，如图5所示，可以确认，对PTC074和PTC111而言，与阴性对照组(PTCWT)相比，在150kDa附近没有形成条带，与阳性对照组(PTC019)相比，49.2kDa和24.6kDa的条带强度显着降低。另外，可以确认，与序列在Fc-2 351位被取代的PTC097、PTC098和PTC099相比，24.6kDa处的条带强度显着降低了。另一方面，可以确认，条带的强度在Fc-1-2异二聚体的预期分子量即98kDa处升高了。
另外，如表7所示，PTC074、PTC097、PTC099和PTC111的异二聚体形成率分别为93.5％、82.7％、86.5％和92.7％，可以确认这显着高于阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)。尤其，可以确认，对CH3结构域的351位被甘氨酸(G)或苯丙氨酸(F)取代的PTC074和PTC111而言，Fc异二聚体的形成率超过90％。
即，可以看出，通过用特定氨基酸取代CH3结构域的351位，根据本发明一方面的Fc变体具有优异的Fc异二聚体形成能力。
实施例7、评估包括高效Fc变体的双特异性抗体的异二聚体形成能力
7-1、Fab-Fc×scFv-Fc双特异性抗体
为了评估包括所述实施例3中选定的高效Fc变体的异源双抗体的异二聚体形成产率，将第一多肽设计为表达重链和轻链均连接的完整的IgG链(Fc1)，而将第二多肽设计为表达scFV-Fc形式(Fc2)。然后，Fc1基于包括IgGl Fc区的阿维单抗(Avelumab)抗体(Bavencio，Pfizer)进行表达，Fc2以包括基于博纳吐单抗(blinatumomab)的anti-CD3scFv序列的IgGl Fc区的scFv形式进行表达。
为了比较，将博纳吐单抗(blinatumomab)的anti-CD3 scFv与具有野生型CH3结构域序列的Fc变体(对应于表1的“PTCWT”)的Fc2结合的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体用作阴性对照组，将博纳吐单抗(blinatumomab)的anti-CD3 scFv与在CH3结构域中具有Genentech的旋钮入孔(KiH)序列的Fc变体(对应于表1的“PTC019”)的Fc2结合的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体用作阳性对照组。
使用所述实施例1中构建的暂时表达系统进行各测试物质的表达，在非还原SDS-PAGE后，测量对应于异二聚体的PAGE条带的强度以比较异二聚体形成产率。
通过测得的条带强度计算根据CH3结构域氨基酸取代的Fc异二聚体形成能力，结果如下表8所示。
[表8]
Figure BDA0003967714840000201
图6是Fab-Fc×scFv-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-Fc双聚体)。
其结果，如图6所示，可以确认，与应用阴性对照组(PTCWT)序列的异源双抗体相比，应用PTC074序列的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体在144kDa处没有形成条带。另外，可以确认，应用PTC019序列的异源双抗体相比，在104.8kDa处的条带强度降低了。另一方面，可以确认，与阴性对照组(PCTWT)和阳性对照组(PTC019)相比，完整的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体的预期分子量即124.4kDa处的条带强度升高了。
另外，如表8所示，可以确认，Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体的CH3结构域序列为PTC074的异源双抗体的Fc1-2异二聚体形成率为88.8％，与阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)相比，其异二聚体形成率显着较高。
即，可以看出，根据一方面的Fc变体可以用作形成不同结构的抗体的异源双抗体结构，并且具有优异的异二聚体形成能力。
7-2、Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双特异性抗体
使用设计为以scFv-scFv-Fc形式(Fc2)表达第二多肽的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双特异性抗体，除了基于博纳吐单抗(blinatumomab)的anti-CD3 scFv序列和贝伐单抗(Bevacizumab)的VH-VL序列以包括IgG1 Fc区的双scFv(scFv×scFv)形式表达之外，以与所述实施例7-1相同的方法评估了异二聚体形成产率。
为了比较，将双scFv与具有野生型CH3结构域序列的Fc变体(对应于表1的“PTCWT”)的Fc2结合的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc异源双抗体用作阴性对照组，将双scFv与在CH3结构域中具有Genentech的旋钮入孔(KiH)序列的Fc变体(对应于表1的“PTC019”)的Fc2结合的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc异源双抗体用作阳性对照组。
[表9]
Figure BDA0003967714840000211
图7是Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×scFv-scFv-Fc双聚体)。
其结果，如图7所示，可以确认，与应用阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)序列的聚合物相比，应用PTC074序列的Fab-Fc×scFv×scFv-Fc双聚物的196kDa条带的强度显着下降。另外，由于应用阳性对照组(PTC019)序列的双聚体中显示的异二聚体以外的条带强度降低，因此可以确认高效地形成了作为目标的167.8kDa的Fc1-2异二聚体。
另外，如表9所示，可以确认，Fab-Fc×scFv-scFv-Fc异源双抗体的CH3结构域序列为PTC074的异源双抗体的Fc1-2异二聚体形成率为70.2％，与阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)相比，其异二聚体形成率显着较高。
即，可以看出，根据一方面的Fc变体由于多个结构相连，因此不仅易于作为具有大分子量结构的异源双抗体结构应用，而且在应用于所述结构时具有优异的异二聚体形成。
7-3、Fab-Fc×细胞因子-Fc双特异性抗体
使用设计为以细胞因子-Fc形式(Fc2)表达第二多肽的Fab-Fc×细胞因子-Fc双特异性抗体，除了基于白细胞介素-2(IL-2，aldesleukine)序列以包括IgG1 Fc区的细胞因子形式表达之外，以与所述实施例7-1相同的方法评估了异二聚体形成产率。
为了比较，将IL-2变体(IL-2v)与具有野生型CH3结构域序列的Fc变体(对应于表1的“PTCWT”)的Fc2结合的Fab-Fc×IL-2v-Fc异源双抗体用作阴性对照组，将IL-2变体(IL-2v)与在CH3结构域中具有Genentech的旋钮入孔(KiH)序列的Fc变体(对应于表1的“PTC019”)的Fc2结合的Fab-Fc×IL-2v-Fc异源双抗体用作阳性对照组。
[表10]
Figure BDA0003967714840000221
图8是Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体的SDS-PAGE分析结果图(M：大小标记，WT：PTCWT序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体(阴性对照组)，019：PTC019序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体(阳性对照组)，074：PTC074序列应用于CH3结构域的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体)。
其结果，如图8所示，与阴性对照组(PTCWT)或阳性对照组(PTC019)相比，应用PTC074和PTC111序列的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体的条带强度在94.4kDa(Fc-2-2同源二聚体)和77.4kDa(Fc1单体)处降低，可以确认条带的强度在136.5kDa(Fc-1-2异二聚体)处升高。因此，可以看出，在应用PTC074和PTC111序列的Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体中，减少Fc-2-2同源二聚体带和Fc-1单体的形成，从而高效地形成Fc-1-2异二聚体。
另外，如表10所示，根据阴性对照组(PTCWT)、阳性对照组(PTC019)、PTC074和PTC111的序列反映在Fab-Fc×细胞因子-Fc双聚体中的结构，Fc-1-2异二聚体的比率分别为40.6％、68.8％、90.4％和89.9％，可以确认，与阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)相比，反映PTC074和PTC111的双聚体的异二聚体形成率显著较高。
即，可以看出，根据本发明一方面的Fc变体不仅可以作为形成抗体的结构应用，而且当应用细胞因子蛋白时，异二聚体形成能力优异。
7-4、Fab-Fc×Fab-Fc双特异性抗体
为了评估包括所述实施例3中选定的高效Fc变体的异源双抗体的异二聚体形成产率，第一多肽和第二多肽均设计为表达重链和轻链均连接的完整形式的双特异性抗体。具体而言，Fc1基于包括野生型IgG1 Fc区的阿维单抗(Avelumab)抗体(Bavencio，Pfizer)进行表达，Fc2基于包括IgG1 Fc区的贝伐单抗(bevacizumab)抗体(Avastin，Roche)进行表达。
为了比较，将包括具有野生型CH3结构域序列的Fc变体(对应于表1的“PTCWT”)的Fab-Fc×Fab-Fc异源双抗体用作阴性对照组，将包括CH3结构域中具有Genentech的旋钮入孔(KiH)序列的Fc变体(对应于表1的“PTC019”)的Fab-Fc×Fab-Fc异源双抗体用作阳性对照组。
Intact MASS(ESI-LC-MS)分析方法用作评估方法。具体而言，使用ThermoScientific DionexTM UHPLC Ultimate 3000和TripleTOF 5600+(AB sciex)进行LC-MS，作为分析程序使用
Figure BDA0003967714840000224
软件和
Figure BDA0003967714840000223
软件以计算异二聚体形成能力，其结果见表11下。
[表11]
Figure BDA0003967714840000222
如表11所示，可以确认，应用阴性对照组(PTCWT)和阳性对照组(PTC019)的序列的Fab-Fc×Fab-Fc异二聚体的Fc-1-2异二聚体形成率分别为25.4％和32.4％，而CH3结构域序列为PTC039、PTC040和PTC074的异源双抗体的Fc-1-2异二聚体形成率分别为58.1％、40.5％和46.8％。
即，可以看出，根据一方面的Fc变体不仅易于用作双特异性抗体，而且当作为所述结构应用时具有优异的异二聚体形成。
实施例8、评估包括高效Fc变体的Fab-Fc×scFv-Fc双特异性抗体的抗癌活性
8-1、确认癌细胞死亡和癌症生长抑制
评估了所述实施例7-1中制备的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体的癌细胞死亡和癌症生长抑制的能力。
具体而言，向RPMI1640培养基(#11875-093，Gibco)添加10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素(Penicilin-streptomycin)，然后在37℃和5％二氧化碳的条件下培养乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。然后，在96孔板中以10000个细胞/孔的浓度接种所述细胞后，在37℃和5％二氧化碳的条件下培养过夜(overnight)，人外周血单核细胞(Human peripheralblood mononuclear cells，PBMC)(效应细胞)以20:1的比率(效应细胞:靶(MDA-MB-231)细胞)接种并行共培养。然后，在孔中用Anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体处理所述细胞，然后培养48小时。然后，回收上清液后，使用LDH细胞毒性测定试剂盒(#C20301，Invitrogen)根据下面数学式1分析细胞毒性。阿维单抗(Avelumab)(抗PD-L1抗体，
Figure BDA0003967714840000233
)用作阳性对照组。
[数学式1]
Figure BDA0003967714840000231
[表12]
Figure BDA0003967714840000232
图9是评估anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体在体外(in vitro)诱导癌细胞死亡的能力的曲线图(阿维单抗(Avelumab)：阳性对照组，anti-PD-L1×anti-CD3scFv BsAb：CH3结构域中具有PTC074序列的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体)。
其结果，如图9所示，在物质的最大浓度下，阳性对照组的Emax(最大细胞毒性效果)为26％，而Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体的Emax为76.3％，可以确认对癌细胞的细胞毒效果显著高。另外，可以确认，阳性对照组在2log(ng/mL)或更高的物质浓度下饱和而不增加细胞裂解，在0log至2log(ng/mL)区间内形成有效量。另一方面，可以确认，Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体在1log(ng/mL)或更高的物质浓度下饱和后而不增加细胞溶解，在-1log至1log(ng/mL)形成有效量。
另外，如表12所示，对MDA-MB-231癌细胞的增殖抑制效果中，阳性对照组为11.8ng/mL EC50，而Fab-Fc×scFc-Fc异源双抗体为1.3ng/mL EC50，可以确认对癌细胞的增殖抑制效果更有效。
即，根据一方面的由Fc变体形成的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体与已知的免疫抗癌剂相比，在低浓度下显示优异的抗癌效果，从而可以替代现有治疗剂的副作用，例如正常细胞破坏或耐药性等。
8-2、确认抗癌功效
使用人源化小鼠异种移植模型(humanized mouse xenograft model)评估了anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体的体内(in vivo)抗癌功效。具体而言，将MDA-MB-231细胞(5×106)和纯化的人T细胞(2.5×106)的混合物与等量的基质胶混合，以0.2mL/小鼠的剂量将其皮下施用于NOD/SCID小鼠(雌性，6周龄，Zabio)的胁腹。接种1小时后，将所述实施例7-1中制备的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体2.5mg/kg静脉内施用(5次/周)。将作为阳性对照物质的阿维单抗(Avelumab)以20mg/kg的剂量静脉内施用(3次/周)。从接种7天起，测量肿瘤体积(3次/周)，比较并评估了两种物质的抗癌效果。
图10是评估anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体在体内(in vivo)抑制癌细胞生长的功效的曲线图(阿维单抗(Avelumab)：阳性对照组，anti-PD-L1×anti-CD3scFv BsAb：CH3结构域中具有PTC074序列的anti-PD-L1×anti-CD3 scFv双特异性抗体)。
其结果，如图10所示，对阴性对照组而言，通过28天逐渐增大直至平均肿瘤体积达到600㎜3或更多，可以确认没有肿瘤生长抑制效果。另外，对阳性对照组而言，肿瘤体积继续增大，可以确认第28日肿瘤生长抑制效果为59％。另一方面，对Fab-Fc×scFv-Fc而言，从第9日至第21日保持相同的肿瘤生长抑制回归(regression)，第28日的肿瘤生长抑制效果为80％，可以确认其在人源化小鼠异种移植模型中有效抑制肿瘤生长。
即，由根据一方面的Fc变体形成的Fab-Fc×scFv-Fc异源双抗体具有优异的肿瘤生长抑制效果，从而可用于预防或治疗包括乳腺癌在内的各种癌症。
本发明的上述描述仅用于例示，本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将其修改为其他具体形式。因此，应当理解，如上所述的实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。
序列表
<110> 马斯得生物有限公司
<120> 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法
<130> PX064553PCT
<150> KR 10-2020-0066030
<151> 2020-06-01
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTCWT中Fc1重链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTCWT中Fc1轻链
<400> 2
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在FTCWT中Fc2的Fc链
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 4
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC019中Fc1重链
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC019中Fc2的Fc链
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC039中Fc1重链
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC039中Fc2的Fc链
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Gly Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 8
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC040中Fc1重链
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Trp Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 9
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 在PTC111中Fc2的Fc链
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (28)

1.一种蛋白复合物，其包括含有第一CH3抗体恒定区的第一多肽和含有第二CH3抗体恒定区的第二多肽，所述第一多肽和第二多肽形成异二聚体，所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)，所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)；以及
第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区中的至少一个包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。
(然而，所述氨基酸的位置根据Kabat EU指数)
2.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第一CH3抗体恒定区包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第二CH3抗体恒定区包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)、394位的苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或色氨酸(W)。
5.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)、351位的缬氨酸(V)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)或苯丙氨酸(F)。
6.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)或苯丙氨酸(F)。
7.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第一CH3抗体恒定区包括选自由下项组成的组：
366位的色氨酸(W)；
366位的色氨酸(W)和394位的组氨酸(H)；
366位的色氨酸(W)和394位的苯丙氨酸(F)；
366位的色氨酸(W)和394位的色氨酸(W)；
366位的色氨酸(W)和351位的苯丙氨酸(F)；
366位的色氨酸(W)和351位的色氨酸(W)；366位的色氨酸(W)和351位的缬氨酸(V)；
366位的色氨酸(W)和351位的丙氨酸(A)；以及
366位的色氨酸(W)，394位的组氨酸(H)和351位的苯丙氨酸(F)。
8.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第二CH3抗体恒定区包括选自由下项组成的组：
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的缬氨酸(V)；
366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的蛋氨酸(M)；以及
366位的丝氨酸(S)，368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的苯丙氨酸(F)。
9.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)，并包括394位的苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或色氨酸(W)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)。
10.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)和351位的苯丙氨酸(F)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)。
11.根据权利要求10所述的蛋白复合物，所述第一CH3抗体恒定区还包括394位的组氨酸(H)。
12.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)。
13.根据权利要求12所述的蛋白复合物，所述第一CH3抗体恒定区还包括351位的苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
14.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或蛋氨酸(M)。
15.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的苯丙氨酸(F)。
16.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)和351位的缬氨酸(V)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的丙氨酸(A)。
17.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)和351位的丙氨酸(A)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的苯丙氨酸(F)。
18.根据权利要求1所述的蛋白复合物，其中，所述蛋白复合物包括选自由抗原结合片段、单链可变片段、膜受体的细胞外结构域、激动剂、拮抗剂、配体、诱饵受体、细胞因子、凝血因子和亲和性标签组成的组。
19.一种蛋白复合物，其包括含有第一CH3抗体恒定区的第一多肽和含有第二CH3抗体恒定区的第二多肽，所述第一多肽和第二多肽形成异二聚体，
第一CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)和407位的缬氨酸(V)，所述第二CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)；以及
第一CH3抗体恒定区和第二CH3抗体恒定区中的至少一个包括选自351和394中的至少一个位的选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的至少一个氨基酸。
(然而，所述氨基酸的位置根据Kabat EU指数)
20.根据权利要求19所述的蛋白复合物，其中，
所述第一CH3抗体恒定区包括366位的丝氨酸(S)、368位的丙氨酸(A)、407位的缬氨酸(V)和351位的甘氨酸(G)；以及
所述第二CH3抗体恒定区包括366位的色氨酸(W)。
21.根据权利要求20所述的蛋白复合物，其中，
所述第二CH3抗体恒定区还包括351位的苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
22.一种蛋白复合物的制备方法，其包括：将编码权利要求1或19的第一多肽、第二多肽或其组合的至少一个表达载体转化到至少一个细胞以表达所述第一多肽、第二多肽或其组合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，将编码所述第一多肽的表达载体和编码所述第二多肽的表达载体共转化到细胞，或者将编码所述第一多肽的表达载体和编码所述第二多肽的表达载体分别转化到至少两种细胞。
24.根据权利要求22所述的方法，其包括：从所述细胞或细胞培养液获得第一多肽、第二多肽或第一多肽和第二多肽的蛋白复合物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述蛋白复合物包括选自由抗原结合片段、单链可变片段、膜受体的细胞外结构域、激动剂、拮抗剂、配体、或诱饵受体、细胞因子、凝血因子和亲和性标签组成的组。
26.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括权利要求1或19的蛋白复合物。
27.一种预防或治疗癌症的方法，其包括：将权利要求1或19的蛋白复合物施用于细胞或个体。
28.权利要求1或19的蛋白复合物在制备癌症预防剂或治疗剂中的用途。
CN202180038651.8A 2020-06-01 2021-05-28 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法 Pending CN115698086A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20200066030 2020-06-01
KR10-2020-0066030 2020-06-01
PCT/KR2021/006643 WO2021246720A1 (ko) 2020-06-01 2021-05-28 이중특이 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이를 제조하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115698086A true CN115698086A (zh) 2023-02-03

Family

ID=78831197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180038651.8A Pending CN115698086A (zh) 2020-06-01 2021-05-28 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230212320A1 (zh)
EP (1) EP4159765A4 (zh)
JP (2) JP7568326B2 (zh)
KR (2) KR102365669B1 (zh)
CN (1) CN115698086A (zh)
AU (1) AU2021282817A1 (zh)
BR (1) BR112022022004A2 (zh)
CA (1) CA3177026A1 (zh)
IL (1) IL297566B2 (zh)
MX (1) MX2022013663A (zh)
WO (1) WO2021246720A1 (zh)

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2791652C (en) * 2010-03-02 2018-06-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
DK2635607T3 (da) * 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
HRP20211773T1 (hr) * 2011-11-04 2022-03-04 Zymeworks Inc. Stabilna heterodimerni dizajn antitijela s mutacijama u fc domeni
WO2013166594A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Zymeworks Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain
KR101522954B1 (ko) * 2012-11-27 2015-05-27 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
US20150038682A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 Jn Biosciences Llc Antibodies or fusion proteins multimerized via homomultimerizing peptide
BR112016010025A2 (pt) * 2013-11-11 2017-12-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd molécula de ligação de antígeno contendo região variável de anticorpo modificado
CA2931356A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2017034770A1 (en) * 2015-08-26 2017-03-02 Bison Therapeutics Inc. Multispecific antibody platform and related methods
SG11201900373WA (en) * 2016-07-19 2019-02-27 Ibentrus Inc Bispecific proteins and methods for preparing same
EP3494139B1 (en) * 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
WO2018030806A1 (ko) * 2016-08-10 2018-02-15 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP3697441B1 (en) * 2017-10-20 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for generating multispecific antibodies from monospecific antibodies
BR112020007736A2 (pt) * 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
KR20210011002A (ko) * 2018-05-16 2021-01-29 얀센 바이오테크 인코포레이티드 암을 치료하는 방법 및 t-세포 재유도 치료제의 효능을 향상시키는 방법
KR20200066030A (ko) 2018-11-30 2020-06-09 (주)아틀라스랩스 음성 id 시스템을 이용한 음성 등록 및 인증방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021282817A1 (en) 2022-11-17
CA3177026A1 (en) 2021-12-09
IL297566B1 (en) 2024-03-01
US20230212320A1 (en) 2023-07-06
BR112022022004A2 (pt) 2022-12-13
WO2021246720A1 (ko) 2021-12-09
JP2024123082A (ja) 2024-09-10
JP2023534773A (ja) 2023-08-10
KR102405816B1 (ko) 2022-06-08
KR20210148943A (ko) 2021-12-08
EP4159765A4 (en) 2024-08-07
KR20220030224A (ko) 2022-03-10
KR102365669B1 (ko) 2022-02-23
EP4159765A1 (en) 2023-04-05
IL297566A (en) 2022-12-01
IL297566B2 (en) 2024-07-01
MX2022013663A (es) 2022-11-30
JP7568326B2 (ja) 2024-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109963876B (zh) 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
AU2020286285A1 (en) Novel anti-SIRPa antibodies
EP3668898A1 (en) Humanized antibodies for cd3
WO2020156405A1 (en) Novel bispecific cd3/cd20 polypeptide complexes
WO2020192709A1 (en) Novel bispecific polypeptide complexes
US20240124574A1 (en) Bispecific Antibodies with Charge Pairs and Uses Thereof
US20240043566A1 (en) Bi-functional molecules
CA3096791A1 (en) Cell engaging binding molecules
CA3183389A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
CN112930195B (zh) 抗人Fn14抗体
WO2022127066A1 (zh) 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途
CA3227854A1 (en) Novel anti-sirpa antibodies
CN115698086A (zh) 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法
RU2818312C1 (ru) Биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и способ их получения
RU2818312C9 (ru) Биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и способ их получения
WO2024032617A1 (zh) 异多聚体蛋白质及其制备方法
WO2023051727A1 (zh) 结合cd3的抗体及其用途
WO2023222027A1 (zh) 一种抗trop-2/cd3双特异性抗体
TW202413417A (zh) 新穎抗ｃｄ３抗體及其用途
AU2013203431A1 (en) Bispecific death receptor agonistic antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination