JP2021500348A - 単一特異性抗体から多重特異性抗体を生成させるための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
単一特異性抗体誘導体を、組み立てられた二重特異性抗体へと生化学的に変換するための、現行最先端の方法では、(i)半抗体相補反応および(ii)IgG-IgG交換反応が利用される。
・どちらもヒト免疫グロブリン(IgG1)CH3ドメインを含む第1(単量体)ポリペプチドと第2(単量体)ポリペプチドとを含む第1結合物質(これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である)/多量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、ここで、第1CH3ドメインおよび第2CH3ドメイン中の前記2つ以上の変異は、ヘテロ二量体の形成をもたらし、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、ヘテロ二量体化に必要な変異とは異なる(そしてE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される)少なくとも1つの/第1の撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合する/共有結合的または非共有結合的二量体を形成する/互いに共有結合的または非共有結合的に会合している/共有結合的または非共有結合的二量体である(ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす)、
第1結合物質/多量体ポリペプチドと、
どちらもヒト免疫グロブリン(IgG1)CH3ドメインを含む第3(単量体)ポリペプチドと第4(単量体)ポリペプチドとを含む第2結合物質(これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である)/多量体ポリペプチドであって、
第3ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、ここで、第1CH3ドメインおよび第2CH3ドメイン中の前記2つ以上の変異はヘテロ二量体の形成をもたらし、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、ヘテロ二量体化に必要な変異とは異なる(そしてE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される)少なくとも1つの/第2の撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第3ポリペプチド中の変異は第2ポリペプチド中の変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合し/共有結合的または非共有結合的二量体を形成し/互いに共有結合的または非共有結合的に会合しており/共有結合的または非共有結合的二量体であり(ここで、第3ポリペプチド中の撹乱変異は、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす)、
第2ポリペプチド中の(第1)撹乱変異と第3ポリペプチド中の(第2)撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2結合物質/多量体ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって、(多重特異性)結合物質を生産する、工程。
・どちらもヒト免疫グロブリン(IgG1)CH3ドメインを含む第1(単量体)ポリペプチドと第2(単量体)ポリペプチドとを含む第1結合物質(これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である)/多量体ポリペプチドであって、
(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ(knob)を含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール(hole)を含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される)少なくとも1つの/第1の撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合する/共有結合的または非共有結合的二量体を形成する/互いに共有結合的または非共有結合的に会合している/共有結合的または非共有結合的二量体である(ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす)、
第1結合物質/多量体ポリペプチドと、
どちらもヒト免疫グロブリン(IgG1)CH3ドメインを含む第3(単量体)ポリペプチドと第4(単量体)ポリペプチドとを含む第2結合物質(これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である)/多量体ポリペプチドであって、
(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される)少なくとも1つの/第2の撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第3ポリペプチド中の変異は第2ポリペプチド中の変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合し/共有結合的または非共有結合的二量体を形成し/互いに共有結合的または非共有結合的に会合しており/共有結合的または非共有結合的二量体であり(ここで、第3ポリペプチド中の撹乱変異は、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす)、
第2ポリペプチド中の(第1)撹乱変異と第3ポリペプチド中の(第2)撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす
第2結合物質/多量体ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって、(多重特異性)結合物質を生産する、工程。
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-1)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-1)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-1)第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは二量体である、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
(a-2)(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
(b-2)第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-2)第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-2)における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-2)第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
(e-2)第3ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは二量体であり、
(f-2)第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
またはアミノ酸配列
のどちらか1つ、(ii)ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、および(iii)ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含む。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群から選択される。
第1結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する(ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす)、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
と、を含み、かつ
第2結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド、
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する(ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第4ポリペプチドと第5ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす)、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
と、を含む。
第1結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する(ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす)、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
とを含み、かつ
第2結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド、
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する(ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第4ポリペプチドと第5ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす)、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
と、を含む。
・第1の多数の(単一特異性)結合物質から選択された第1(単一特異性)結合物質と第2の(ただし第1の多数の単一特異性結合物質とは異なる)多数の(単一特異性)結合物質から選択された第2(単一特異性)結合物質との各組合せを本発明の方法に供することによって、多数の(二重特異性)結合物質を生産する工程、
・例えばELISAアッセイまたはSPRアッセイなどの結合アッセイにおいて、少なくとも2種の抗原への、生産された多数の結合物質のうちの各結合物質の同時結合(の量)を、個別に測定する工程、および
・多数の結合物質から、例えばELISAアッセイまたはSPRアッセイなどの結合アッセイの結果に基づいて結合物質を選択する工程であって、それによって(二重特異性)結合物質の組合せを同定する、工程。
両ポリペプチドはヒト免疫グロブリン(IgG1)CH3ドメインを含み、
(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、少なくとも1つの撹乱変異(E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される)を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する(ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす)、
多量体ポリペプチドである。
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、ならびに
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ変異ノブまたは変異ホールを含み、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドである。
第1ヘテロ三量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、ならびに
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
と、
第3ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
と、を含む、第1ヘテロ三量体ポリペプチド
および
第2ヘテロ三量体ポリペプチドであって、
第1(第4)ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第2(第5)ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン(IgG1)において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン(IgG1)野生型アミノ酸残基を含む、ここで、第1(第4)ポリペプチド中の撹乱変異は第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第2(第5)ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン(由来のCH1ドメイン)、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン(由来の軽鎖定常ドメイン)、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および(同じポリペプチドの)結合ドメインの第2部分は(会合して)標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片(VH-CH1またはCH1-VH)であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片(VL-CLまたはCL-VL)であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1(第4)ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1(第4)ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第3(第6)ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1(第4)ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
とを含む、第2ヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
(i)第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第2ヘテロ三量体(第4)ポリペプチドの第1ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第2ヘテロ三量体(第4)ポリペプチドの第1ポリペプチドは変異ホールを含み、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドと第2ヘテロ三量体(第4)ポリペプチドの第1ポリペプチドとは、同じ位置には撹乱変異を含まない/異なる位置に撹乱変異を含む、
組成物である。
本発明は、少なくとも部分的には、出発材料として非完全抗体、すなわち二重特異的には結合しない抗体を使用する半抗体交換反応によって、多重特異性抗体を得ることができるという知見に基づく。例示的な非完全抗体はいわゆる2/3-IgGである。例示的な2/3-IgGは、抗体軽鎖と、抗体重鎖(重鎖と軽鎖は互いに共有結合的に会合して、それらのVHドメインおよびVLドメインのペアによる結合部位を形成する)と、抗体重鎖Fc領域断片とを含む。該重鎖Fc領域断片は、それ自体、例えば完全抗体重鎖または延長型抗体重鎖または変異体抗体重鎖などの一部であることができる。2/3-IgG中に存在する重鎖::重鎖Fc領域断片ペアおよび(機能的)結合部位は、本発明の交換反応に要求される最小構造要素を規定する。非完全抗体において、例えば2/3-IgGなどにおいて、Fc領域間の相互作用は、非対称な撹乱変異によって、好ましくはFc領域断片中に存在するものによって、不安定化される。撹乱変異は、より良くマッチする相補的な非完全抗体が存在する場合に、出発非完全抗体の解離と、正しく組み立てられた完全二重特異性抗体の精製とを促進する。
本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabatナンバリングシステム(647〜660頁参照)を使用し、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2およびCH3)には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム(661〜723頁参照)を使用する(この場合、本明細書では、「ナンバリングはKabat EUインデックスに従う」ということによって、これをさらに明確にする)。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。CH2ドメインは、もう一つのドメインと密接にはペアを形成していない点でユニークである。むしろ、無傷のネイティブFc領域の2つのCH2ドメインの間には、2つのN結合型分岐糖質鎖が差し挟まれている。この糖質はドメイン-ドメインペア形成の代用物となっていて、CH2ドメインの安定化に役立つのだろうと推測されている。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
・FcγRI(CD64)は、単量体IgGに高いアフィニティーで結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327およびP329(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)のうちの少なくとも1つにおけるIgGのFc領域中の修飾は、FcγRIへの結合を低減する。IgG2の233〜236番目の残基でIgG1中およびIgG4中の残基を置換すると、FcγRIへの結合は103分の1に低減し、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答は排除された(Armour,K.L.,et al,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。
・FcγRII(CD32)は、複合体化したIgGに、中〜低アフィニティーで結合し、広く発現している。この受容体は2つのサブタイプFcγRIIAおよびFcγRIIBに分類することができる。FcγRIIAは、キリング(killing)に関与する多くの細胞(例えばマクロファージ、単球、好中球)に見いだされ、キリングプロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、B細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球上に見いだされる。これは、B細胞上では、さらなる免疫グロブリン生産および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制する機能を果たすようである。FcγRIIBは、マクロファージ上では、FcγRIIAによって媒介される貪食を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、IgEがその別個の受容体に結合することによって起こるこれらの細胞の活性化を抑制するのに、このB型が役立ちうる。FcγRIIAに対する結合の低減は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292およびK414(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
・FcγRIII(CD16)は中〜低アフィニティーでIgGに結合し、2つのタイプとして存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好中球ならびに一部の単球およびT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球に高発現している。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338およびD376(ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う)のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域はアミノ酸配列HTCPXCP(SEQ ID NO:31)を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域はアミノ酸配列CPXCP(SEQ ID NO:32)を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域は内部ジスルフィド結合を有しない。これは、SEQ ID NO:32の配列中の(同様にSEQ ID NO:30および31中の)システイン残基をセリン残基によって置換することによって、またはSEQ ID NO:30、31または32のヒンジ領域からCPXCストレッチ(SEQ ID NO:89)を欠失させることによって、達成される。
に配置される。この小さな繰り返し単位は、2〜5回繰り返されて、例えば
などの多量体単位を形成しうる。一態様において、ペプチド性リンカーはSEQ ID NO:69〜82のリンカーの群より選択される。一態様において、ペプチド性リンカーのそれぞれは、SEQ ID NO:69〜82からなるリンカーの群から、互いに独立して選択される。好ましい一態様において、ペプチド性リンカー/各ペプチド性リンカーは、SEQ ID NO:75〜81からなるリンカーの群より(互いに独立して)選択される。マルチマー単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端には、任意の天然アミノ酸を6個まで追加することができる。他の合成ペプチド性リンカーは、例えばリンカー
中のセリンなど、10〜20回繰り返される単一アミノ酸で構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に任意の天然アミノ酸をさらに6個まで含みうる。すべてのペプチド性リンカーは核酸分子によってコードすることができるので、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるから、抗融合性ペプチド(antifusogenic peptide)は、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合によって、リンカーにつながれる。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)、
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabat,E.A.et al,Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)、
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)および93〜101(H3)に存在する抗原コンタクト(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)および94〜102(H3)を含む(a)、(b)および/または(c)の組み合わせ
を含む。
多重特異性抗体、例えば二重特異性または三重特異性抗体における使用に最適な結合物質の組合せを同定するには、可能な限り多くの組合せを試験することが望ましい。それゆえに、それぞれが異なる結合特異性を持つ多数の異なる結合部位、すなわち結合物質を互いに組み合わせて、結合アッセイまたは機能アッセイにおいて最適な組合せをスクリーニングすることを可能にする方法が必要になる。
本発明の方法により、単一特異性(一価)抗体または抗体断片の、二価bsAbへの変換が達成される。これらの方法は、未変換出発材料、および二価だが単一特異性である副生成物、および反応中に形成される凝集物の、容易な除去を可能にする。すなわち本発明の方法は、なかんずく、二価単一特異性抗体および望ましくない凝集物が最終調製物中に存在するという少なくとも2つの問題を解決する。
・第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドを、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドと共にインキュベートすることで、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを交差的に交換して、第3ヘテロ二量体ポリペプチドおよび第4ヘテロ二量体ポリペプチドを形成させる工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4(交換済み)ヘテロ二量体ポリペプチドを回収する工程
を含み、ここで、
(i)第2ポリペプチドは、第2ポリペプチド中の変異を除けば第1ヘテロ二量体ポリペプチドと同一である(ヘテロ二量体)ポリペプチドと比べて、第1ヘテロ二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす(第1撹乱)変異を含み、
(ii)第3ポリペプチドは、第3ポリペプチド中の変異を除けば第2(ヘテロ二量体)ポリペプチドと同一であるヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、第2ヘテロ二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす(第2撹乱)変異を含み、
(iii)第2ポリペプチド中の(第1撹乱)変異と第3ポリペプチド中の(第2撹乱)変異は、第1(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドおよび/または第2(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3(交換済み)ヘテロ二量体ポリペプチドの安定化をもたらし、
(iv)第4(交換済み)ヘテロ二量体ポリペプチドは、第1(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドおよび/または第2(出発)ヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、より安定である。
EGADは、CH3ドメイン境界面に加えられたさまざまな変異の結合自由エネルギーを比較するために使用することができる。変異型の結合自由エネルギーはΔΔGmut=μ(ΔGmut-ΔGwt)(mut=変異型、wt=野生型)と定義される。ここで、μ(一般的には=0.1)は、結合アフィニティーの予測される変化を、実験的エネルギーと比較したときに傾きが1になるように標準化するために使用される換算係数(scaling factor)である。解離の自由エネルギー(ΔG)は、複合体(ΔGbound)と遊離状態(ΔGfree)の間のエネルギー差と定義される。
(i)重鎖-ノブ(-cys)::MHCFcRP-ホール、および
(ii)重鎖-ホール(-cys)::MHCFcRP-ノブ。
本発明の方法では、異なる結合特異性を組み合わせることが可能であるばかりでなく、それと同時に、それらの組合せを異なるフォーマット内でかつ異なる価数で生産することも可能である。これは、上記のセクションで概説した方法において使用される出発材料を拡張することによって達成される。
・重鎖(H鎖)の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」、
・H鎖のN末端とC末端にFabアームを有する分子については「ncAまたはncB」。
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さらなるフォーマットとして、1つの2/3-IgGのFab領域をアフィボディ(affibody)で置き換えた(図19参照)。交換反応は同様に奏効した(図23参照、ELISA結果)。
さらなるフォーマットでは、2/3-IgGの一方が第2のFab領域を含んだ(Fab延長型2/3-IgG;図26参照)。交換反応は同様に奏効した(図27参照)。
・重鎖の通常のn末端に2つのFabアームを有する分子(Fab延長型2/3-IgG)については「dA」
・重鎖(H鎖)の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cB」、
・H鎖のN末端およびC末端にFabアームを持つ分子については「ncB」。
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さらなるフォーマットでは、2/3-IgGの一方が、Fab領域の代わりに、WO 2017/191101(参照により本明細書に組み入れられる)に記載の拘束型結合物質を含んだ(拘束型2/3-IgG、conA、conB;図31参照)。交換反応は同様に奏効した(図32、33および34参照)。
・Fc領域のN末端側にある結合部位の第1部分とFc領域のC末端側にある結合部位の第2部分とを含む拘束型結合部位を有する分子については「conAまたはconB」。ここで、第1部分と第2部分は互いに会合して、結合部位を形成し、これらの分子は環状である。
・重鎖(H鎖)の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」、
・ H鎖のN末端およびC末端にFabアームを持つ分子については「ncAまたはncB」。
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重鎖鎖間ジスルフィド結合は抗体を安定化し、ヒンジにつながれたFabアームの可動性を規定している。ヒンジ領域を含む出発抗体の交換アプローチは、交換反応前または交換反応中にこれらのジスルフィドを還元することと、交換反応が完了した後に還元剤を除去することとを必要とする(実施例3および実施例7参照)。そのような還元工程を回避することは、いくつかのアプローチにとって望ましい場合があり、交換生成物の下流プロセシングを容易にしうる。
一定の態様では、本明細書に提供される2/3-IgGのFc領域に1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させうる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域)を含みうる。
(i)両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234AおよびL235Aを持つヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
(ii)両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、S228PおよびL235Eを持つヒトIgG4サブクラスのFc領域、または
(iii)両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを持つか、または両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、およびY436Aを持つ、ヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
(iv)両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、L234AおよびL235Aを含み、かつ
(a)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
(b)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
(c)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む
ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
(v)両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、S228PおよびL235Eを含み、かつ
(a)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
(b)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
(c)一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む、
ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
(vi)(i)、(ii)および(iii)のうちの1つと(iv)および(v)のうちの1つとの組合せ
を含む(位置はいずれもKabatのEUインデックスに従う)。
ヘテロ二量体化をサポートすることを目的とするCH3修飾のためのいくつかのアプローチは、例えばWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
・N、R、Q、K、D、EおよびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸Tの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)、
・R、W、YおよびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸Dの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)、
・E、D、RおよびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸Sの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)、
・I、M、T、S、VおよびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸Fの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)、
・R、KおよびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸Nの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)、ならびに
・V、M、R、L、FおよびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸Kの置換(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)
である。
(i)第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含むか、または
(ii)第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含むか、または
(iii)第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含むか、または
(iv)第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異L251D、L314DおよびL432Dを含むか、または
(v)第1Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
(a)変異I253A、H310AおよびH435A、もしくは
(b)変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
(c)変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
(vi)第1Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
(a)変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
(b)変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
(vii)第1Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
(a)変異L251D、L314DおよびL432D
を含む。
本発明の態様の第1の例示的セット:
1. 多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む、第1多量体ポリペプチドであって、
(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは二量体である、
第1多量体出発ポリペプチド
と、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む、第2多量体ポリペプチドであって、
(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは二量体であり、
第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチド
とを、インキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって(多重特異性)結合物質を生産する、工程。
またはアミノ酸配列
のどちらか一方、(ii)IgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、および(iii)IgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む、態様1〜2のいずれかの方法。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、
態様1〜4のいずれかの方法。
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2CH1ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体である、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2結合物質は、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体である、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、
態様1〜7のいずれかの方法。
・第1の多数の結合物質から選択される第1結合物質と第2の多数の結合物質から選択される第2結合物質との各組合せを態様1〜11のいずれかの方法に供することによって、多数の結合物質を生産する工程、
・生産された多数の結合物質の各結合部位の、少なくとも2種の抗原への同時結合を、ELISAアッセイにおいて個別に測定する工程、および
・ELISAの結果に基づいて多数の結合物質から結合物質を選択する工程であって、それによって結合物質の組合せを同定する、工程。
両ポリペプチドはヒト免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、少なくとも1つの撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体である、
多量体ポリペプチド。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって
変異ノブまたは変異ホールを含み、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、変異ノブまたは変異ホールを含むヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、
態様13の多量体ポリペプチド。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
と、
第1ポリペプチドにジスルフィド結合によって共有結合された、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチド
とを含む、第1ヘテロ三量体ポリペプチド
ならびに、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1(第4)ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1(第4)ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第6ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
とを含む、第2ヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第2ポリペプチドと第4ポリペプチドは同じ位置に撹乱変異を含まない、
組成物。
1. 多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-1)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-1)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-1)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
(a-2)(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブ-cysを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホール-cysを含み、
(b-2)第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-2)第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-2)における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-2)第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
(e-2)第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
(f-2)第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす(ように設計される)、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-1)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-1)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-1)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
(e-1)第1ポリペプチドは、ヒンジ領域に、IgG1野生型アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含む、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
(a-2)(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
(b-2)第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-2)第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-2)における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(d-2)第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
(e-2)第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
(f-2)第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらし、
(g-2)第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはIgG1野生型ヒンジ領域配列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:85)を含む、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-1)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-1)第2ポリペプチドはCH3ドメイン中に第1撹乱変異として変異E357Kを含み、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、
(d-1)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
(a-2)(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
(b-2)第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-2)第3ポリペプチドはCH3ドメイン中に第2撹乱変異として変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含み、
(d-2)第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
(f-2)第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-1)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-1)第2ポリペプチドはCH3ドメイン中に第1撹乱変異として変異D356Kを含み、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、
(d-1)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
(a-2)(i)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、(i)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または(ii)第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
(b-2)第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(c-2)第3ポリペプチドはCH3ドメイン中に第2撹乱変異として変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含み、
(d-2)第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
(e-2)第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
またはアミノ酸配列
またはアミノ酸配列DKTHT(SEQ ID NO:91)のいずれか1つ、(ii)IgG1 CH2ドメイン、および(iii)IgG1 CH3ドメインを含む、態様1〜3および態様7〜11のいずれかの方法。
(A)N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群、
または
(B)
N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群
から選択される、態様1〜14のいずれかの方法。
第1多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含むポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
とを含むか、
または
(B)
第1多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
とを含む、
態様1〜16のいずれかの方法。
または
(ii)タグがアミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有し、回収がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
態様19の方法。
(a)第1の多数の多量体ポリペプチドから選択される第1多量体出発ポリペプチドと第2の多数の多量体ポリペプチドから選択される第2多量体出発ポリペプチドとの各組合せを、態様1〜20のいずれかの方法に供することによって、多数の多量体ポリペプチドを生産する工程、
(b)工程(a)において生産された多数の多量体ポリペプチドの、少なくとも2種の抗原への同時結合を、結合アッセイにおいて個別に測定する工程、および
(c)多数の多量体ポリペプチドから、結合の結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多量体ポリペプチドの組合せを同定する、工程。
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含むか、または(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、
(b-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(b-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
(a-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはIgG1野生型ヒンジ領域配列
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:85)を含む、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、(a-2)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
(b-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはIgG1野生型ヒンジ領域配列
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:85)を含む、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異E357Kを含み、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異D356Kを含み、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
(b-2)第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含み、
(b-4)第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:85)を含む、態様29〜32のいずれかの多量体ポリペプチド。
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eから選択される変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているか、
または
(B)
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eから選択される変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、
態様22〜33のいずれかの多量体ポリペプチド。
1. ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・ (i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる第1変異であって、該第1変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第1変異、を含む、
第1多量体
と、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-1)第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-2)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)、(a-2)および(b-1)における変異とは異なる第2変異であって、該第2変異の導入が、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第2変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
・ (i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる第1変異であって、該第1変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第1変異、を含み、
(a-3)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第1多量体
と、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-1)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-2)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)、(a-2)および(b-1)における変異とは異なる変異であって、該第2変異の導入が、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(b-3)第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
態様1または5の方法。
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・ (i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-1)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-2)第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・ (i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-1)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-2)第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
態様4〜12のいずれかの方法。
(i)互いに独立して、
アミノ酸配列:
またはアミノ酸配列:
またはアミノ酸配列:
DKTHT(SEQ ID NO:91)
のうちのいずれか、
(ii)IgG1 CH2ドメイン、および
(iii)IgG1 CH3ドメイン
を含む、態様1〜16のいずれかの方法。
(ii)第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
態様1〜17のいずれかの方法。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、態様1〜19のいずれかの方法。
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下:
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、態様1〜21のいずれかの方法。
(ii)タグがアミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
態様25の方法。
(a)第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、(第1標的とは異なる)第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、態様1〜26のいずれかの方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程;
(b)工程(a)において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程;および
(c)多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド;または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
(b-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(b-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む、単離された多量体ポリペプチド。
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なるさらなる変異であって、該さらなる変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、さらなる変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なるさらなる変異であって、該さらなる変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、さらなる変異、を含み、
(a-3)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-1)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、態様29〜41のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと;
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと;
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、態様43の単離された多量体ポリペプチド。
(ii)タグが、アミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有する、
態様45の単離された多量体ポリペプチド。
2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成
概論
図1に、本発明の方法において使用される2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成を示す。これらの2/3-IgGは、3つの個別の鎖、すなわち1つの軽鎖(通常は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む完全長軽鎖)、1つの重鎖(通常は重鎖可変ドメインとヒンジ領域を含むすべての重鎖定常ドメインとを含む完全長重鎖)および1つの重鎖Fc領域ポリペプチド(通常はヒンジ-CH2-CH3を含む重鎖Fc領域断片)で構成される。軽鎖と重鎖の可変ドメインは機能的結合部位を形成する。重鎖(通常はヒトIgG1サブクラスに由来するもの)は、ノブ・イントゥ・ホールFc領域二量体の形成を可能にするために、CH3中にノブ-cys変異またはホール-cys変異のどちらかを含有する(抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366WおよびS354Cは「ノブ-cys変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407V、Y349Cは「ホール-cys変異」と表される(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う))。重鎖Fc領域ポリペプチドは、いわゆる「ダミーFc」/HCFcRP(下記参照)、すなわち、VHおよびCH1を欠き、N末端はヒンジ領域配列で始まり、His6タグをそのC末端に保持するIgG1誘導体である。加えて、2/3-IgGの重鎖Fc領域ポリペプチドはそのCH3ドメイン中にノブ変異またはホール変異のどちらか一方を含有する(抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wは「ノブ変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407Vは「ホール変異」と表される(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う))。ノブ変異またはホール変異に加えて、重鎖Fc領域ポリペプチドは、野生型配列に対して1つの(すなわち単一の追加)反発電荷を導入する不安定化変異、すなわちD356KまたはE357KまたはK370EまたはK439Eを含む:SEQ ID NO:35〜38。この変異型重鎖Fc領域ポリペプチドは以下の説明ではMHCFcRPと表される。
(i)重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホール、および
(ii)重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブ。
本発明の2/3-IgGの発現および精製
2/3-IgGの発現は、軽鎖、重鎖(ノブ変異またはホール変異を持つもの)および適合するMHCFcRP(ホールまたはノブ)をコードするプラスミドを、最先端の技術で、哺乳動物細胞(例えばHEK293)に共トランスフェクトすることによって達成された。
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
・真核細胞における選択可能マーカーとしてのハツカネズミ(Mus musculus)由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含有した。
・5'端のユニークな制限部位、
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・cDNA編成の場合は、それに続くイントロンA配列
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNA編成としての、またはゲノム編成としての(免疫グロブリンエクソン-イントロン編成が維持されている)、抗体鎖、
・ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
・3'端のユニークな制限部位。
2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体(bsAb)の生成
軽鎖、重鎖およびMHCFcRPを含有する2/3-IgGを、完全長重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールおよび完全長重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブという2タイプのKiHヘテロ二量体で、生成させた。両タイプの2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、MHCFcRPは適合する完全長重鎖対応物がない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、図4に示すように、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。2/3-IgG Aの完全長重鎖(ノブ-cys)と2/3-IgG Bからの完全長重鎖(ホール-cys)は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP(ホール-電荷)がMHCFcRP(ノブ-電荷)と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、(電荷が)適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
2/3-IgG(A)-His6(8)+2/3-IgG(B)-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)
2/3-IgG交換反応によって生成した二重特異性抗体(bsAb)の機能的評価
2/3-IgG交換反応の生成物として生成したbsAbの二重特異的機能性をブリッジングELISAアッセイによって評価した。図8に、一例として、本発明の交換反応によって生成した抗フルオレセイン/ビオシチンアミド二重特異性抗体に関する結合結果を示す。反応には、出発分子として、ビオシチンアミド(bio)結合2/3-IgGとフルオレセイン(fluos)結合2/3-IgGとを、使用した。抗fluos/bio二重特異性抗体のfluos結合アームは、fluos-BSAコートELISAプレートに結合する。続いてbio-Cy5に曝露すると、bsAbのbio結合アームを介したbio-Cy5のbsAbによる捕捉が起こった場合にのみ、シグナルが生成する。ブリッジングによるシグナルはbsAbでしか起こらず、単一特異性Fluos結合物質または単一特異性Bio結合物質のどちらかでは起こらないので、アッセイに2/3-IgGしか使用しない場合には、シグナルは観察されなかった。それゆえに、そしてまた交換反応が分子凝集を強いることはないので、このようなブリッジングELISAは、非bsAb分子のNiNTAによる枯渇を必要とすることなく、交換反応混合物で直接行うことができる。反応混合物を適用したときに観察されるシグナルにより、機能的bsAbの生成の成功とその存在が示された。ブリッジングELISAによるシグナル生成は、交換反応に使用した入力体の量に依存した。
本明細書に掲載される交換反応は、出発2/3-IgGの結合特異性またはV領域組成とは無関係に機能的である
2/3-IgGの生産および交換反応が、異なる抗体についてもそれらの特異性およびV領域組成とは無関係に機能するかどうか、そしてまた異なる抗体の組合せについても機能するかどうかを評価するために、さまざまな2/3-IgGを生産した。
フォーマット変異体のデザイン、組成および生成
実施例4の2/3-IgG交換反応を、重鎖のC末端に1つの結合部位を有する出発分子またはN末端とC末端とに結合部位を持つ重鎖を有する出発分子へと拡張した。交換済みbsAbを生成させるために、交換を推進する原理(欠陥入力ヘテロ二量体から適合出力ヘテロ二量体への変換)には手を加えなかった。MHCFcRPの組成も上述のとおりに保った。
価数、化学量論およびジオメトリーが異なる複合的結合機能性を持つbsAbの特性解析
3つの異なる出発分子(N末端、C末端、N末端およびC末端結合部位を持つ2/3-IgG)を、本発明の交換反応において互いに組み合わせることで、9つの異なるbsAbフォーマットをもたらすことができる。これらは、価数、ジオメトリーおよび個々の結合部位の位置が異なる。これらの異なるbsAbを生成させるための交換反応を、実施例3に概説したものと同じ条件下で行った。
・完全長重鎖(H鎖)の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」
・H鎖のN末端およびC末端にFabを持つ分子については「ncAまたはncB」。
2/3-IgG(nA)-His-タグ+2/3-IgG(nB)-His-タグ→bsAb(nAnB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(nA)-His-タグ+2/3-IgG(cB)-His-タグ→bsAb(nAcB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(nA)-His-タグ+2/3-IgG(ncB)-His-タグ→bsAb(nAncB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(cA)-His-タグ+2/3-IgG(cB)-His-タグ→bsAb(cAcB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(cA)-His-タグ+2/3-IgG(nB)-His-タグ→bsAb(cAnB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(cA)-His-タグ+2/3-IgG(ncB)-His-タグ→bsAb(cAncB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(ncA)-His-タグ+2/3-IgG(nB)-His-タグ→bsAb(ncAnB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(ncA)-His-タグ+2/3-IgG(cB)-His-タグ→bsAb(ncAcB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG(ncA)-His-タグ+2/3-IgG(ncB)-His-タグ→bsAb(ncAncB)+Fc-His-タグ
2/3-IgG交換による機能的bsAbの生成と所望の機能性を持つbsAbのスクリーニング/同定は、小型化およびハイスループットならびに自動化技術に適合する
結合部位の配列および/またはフォーマットが異なる多数の異なるbsAbを扱うには、ハイスループットおよび自動化技術の応用が望ましく、多くの場合、それが必要である。そこで、本発明の2/3-IgG交換法によるbsAb生成およびそれによって生成した二重特異性抗体の機能性、すなわち二重特異的結合の分析/スクリーニングを、ハイスループットおよび自動化技術と適合するように小型化することができるかどうかを分析した。
総体積30μlの1×PBS+0.05%Tween 20中で、等モル量(4μM)の交換パートナー(ホール-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ノブ-K370Eとからなる2/3-IgG分子1、ノブ-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ホール-E357Kとからなる2/3-IgG分子2)を混合した。384深底ウェルプレート(Greiner 384 masterblock(登録商標))において、タンパク質溶液を4回、1:3希釈した。この希釈系列からの各試料20μlを、384ウェルREMP(登録商標)プレート(Brooks、#1800030)で、20μlの0.5 mM TCEP溶液と混合することで、2μM〜0.025μMの最終タンパク質濃度および0.25 mM TCEPにした。遠心分離後に、プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートした。
1つの結合部位で第1抗原を標的とし、他の2つの結合部位でさらにもう一つの抗原を標的とする、3つの結合部位を持つbsAbの生成
本発明の方法はT細胞二重特異性抗体(TCB)の生成に使用することができる。これらは以前に述べられたようなフォーマットを有しうる(例えばWO 2013/026831参照)。TCB交換アプローチの場合、一方のH鎖(上述のようにノブ-cysを持つかまたはホール-cysを持つもの)は、そのヒンジのN末端にCD3結合性のCrossFab由来の実体を含有し、N末端は別の抗体に由来するターゲティング実体によってさらに延長されている。交換反応は、上述の条件と同じ条件下で実行され、CD3結合体と2つの追加結合体とを保持するTCBをもたらす。これらは標的細胞抗原に結合することができる。これらの分子は、T細胞上のCD3と標的(例えば腫瘍細)細胞上の抗原とに同時に結合することによって、標的細胞のキリングを誘導することができる。
(ヒンジ領域およびCH3ドメイン中に)Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGのデザインおよび生成
Fc領域(ヒンジ領域)ジスルフィド含有2/3-IgGによる鎖交換は、鎖の分離とそれに続く所望のbsAbの組立てを可能にするために、初期工程として還元を必要とする。還元工程と、それに付随して還元剤を除去する必要とを回避するために、ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGを生成させた。原理を図15に示す。ヒンジジスルフィド形成を担うヒンジ領域中のシステイン残基をセリンへの変異によって除去した。KiH関連ジスルフィド結合を形成する354番目または349番目のCH3-システインも省いた。それぞれのアミノ酸配列は次のとおりである。
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による機能的bsAbの生成
Fc領域鎖間ジスルフィド結合を含有しない2/3-IgGを、初期還元工程を省略した点以外は上述のように、鎖交換反応に供した(実施例3参照)。2/3-IgGは、fluos結合部位またはbio結合部位のどちらか一方と、完全長重鎖とMHCFcRPの間に鎖間ジスルフィド結合を持たないFc領域とを含有した。これらの2/3-IgGの組成および生産は実施例10で説明した。開始のための還元を伴わない交換反応に続いて、bsAbの二重特異的機能性を実証するために、ブリッジングELISAを行った。ブリッジングELISAは、固定化fluos-BSAへの交換反応生成物の添加と、それに続く洗浄工程、続いてbsAbの第2結合アームの存在を探るためのbio-Cys5の添加を含んだ(ブリッジングELISAの詳細については前述の実施例を参照されたい)。正しい、組み立てられた機能的bsAbだけが、それらのfluos結合部位によってアッセイプレートに結合することができ、保持され、bio-Cy5を捕捉し保持することによってシグナルを生成する。二重特異性を持たない分子はシグナルを生成しない。それらはプレートに結合しないか(bioのみを結合する物質)またはシグナルを生成するbio-Cy5を捕捉することができない(fluosのみを結合する物質)からである。これらの分析の結果(この実施例では精製bsAbを陽性対照として、2.5μMの入力分子濃度で交換反応を行う)を図17に示す。これらの結果は、Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない単一特異性2/3-IgG入力分子を使った鎖交換によるbsAb生成の成功を実証している。初期還元を必要とすることなく、生産的な鎖交換が起こった。このようにFc領域ポリペプチド間ジスルフィド結合の除去により、初期還元工程の必要性は排除された。結果として生じるbsAbは非共有結合的Fc-Fc相互作用によって一つにまとまっている。このように、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、還元の必要がない、対応するFc領域ミスマッチ推進型の交換反応を可能にする。
鎖交換反応は、部分的に不安定化された完全長重鎖-MHCFcRP境界面によって推進される
2/3-IgGからbsAbへの変換の推進要因は、完全長重鎖とMHCFcRPの間の意図的な「欠陥」境界面である。この人工的反発境界面は、MHCFcRPのノブ-またはホール-CH3ドメインに導入された変異の結果である。2/3IgGの発現中、MHCFcRPは依然として、対応する(「通常の」)ノブパートナーまたはホールパートナーと会合する(上記実施例参照)。これらの分子は2/3-IgGを、望ましくない凝集傾向を伴わない正しく振る舞う分子として提示するのに十分な安定性を有する。
非抗体部分によるターゲティングおよび鎖交換反応を可能にする2/3-IgGのデザイン
本発明の交換反応は、CH3ノブ体とCH3ホール体の間の境界面変異を利用して、鎖交換反応を推進する。それぞれが「不完全」なFc境界面で構成されるH鎖ヘテロ二量体である2つの分子の相互作用により、それらのH鎖の交換が起こって、それぞれが「完全」なH-H鎖境界面を持つ2つの新しい実体が形成されるという原理を、図18に示す。この原理を応用することで、例えばスクリーニングのために、多種多様な二重特異性抗体およびフォーマットを生成させることができる。
ニッケルアフィニティークロマトグラフィー
未反応出発材料およびヒスチジンタグを保持する交換生成物の除去は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使って行うことができる。
本発明のFab延長型2/3-IgGの発現および精製
Fab延長型2/3-IgGの発現は、Fab延長型軽鎖、Fab延長型重鎖(ノブ変異またはホール変異を持つもの)および適合するMHCFcRP(ホールまたはノブ)をコードするプラスミドを、最先端の技術で、哺乳動物細胞(例えばHEK293)に共トランスフェクトすることによって達成された。
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
・真核細胞における選択可能マーカーとしてのハツカネズミ由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含有した。
・5'端のユニークな制限部位、
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・cDNA編成の場合は、それに続くイントロンA配列
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNA編成としての、またはゲノム編成としての(免疫グロブリンエクソン-イントロン編成が維持されている)、それぞれの抗体鎖、
・ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
・3'端のユニークな制限部位。
出発材料としてFab延長型2/3-IgGを使った2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体(bsAb)の生成
2つの軽鎖、重鎖およびMHCFcRPを含有するFab延長型2/3-IgGを、KiHヘテロ二量体、すなわち完全長重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールとして生成させた。Fab延長型2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。MHCFcRPが、完全長重鎖対応物中に適合する電荷を持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。Fab延長型2/3-IgG Aの完全長重鎖(ノブ)と2/3-IgG Bからの完全長重鎖(ホール)は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP(ホール-電荷)がMHCFcRP(ノブ-電荷)と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、(電荷が)適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
Fab延長型2/3-IgG-His6(8)+2/3-IgG-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)
1 mgのFab延長型2/3-IgG(dA)を、総体積2 mlの1×PBS緩衝液中で、それぞれの2/3-IgGフォーマット(nBまたはcBまたはncB)1 mgと混合した。1×PBS緩衝液中の16倍モル当量のTCEPを混合物に加えた。試料を37℃および350 rpm撹拌下で1時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、試料をNiNTAクロマトグラフィーカラム(HisComplete(商標)、Roche、スイス・バーゼル)で精製した。組み立てられた二重特異性抗体は素通り画分に収集された。素通り画分を室温で一晩、さらにインキュベートした。次に、分析用SEC、CE-SDSおよび質量分析法によって試料を分析した。
交換反応後の精製のための代替的タグ
交換反応が、使用したタグの影響を受けないことを示すために、これらの実験では、ポリヒスチジン-タグの代わりにEPEA C-タグ(SEQ ID NO:87)を使用した。
それぞれの出発2/3-IgG各300μl(c=1 mg/ml、合計600μl)を混合した。TCEPを15倍モル過剰に加えた。試料を37℃および400 rpmでインキュベートした。360μlの試料を200μlのC-タグ樹脂(Thermo Scientific、1×PBS pH 7.4で洗浄した50%スラリー)と混合し、スピンカップカラム中、室温および800 rpm撹拌下で60分インキュベートした。インキュベーション後に、スピンカラムを室温、800 rpmで5分間遠心分離し、素通り画分を収集した。樹脂を1×PBS pH 7.4(100μl、続いて遠心分離工程)で数回洗浄した。洗浄後に、試料の樹脂を100μlのHCl緩衝液pH 2.6と混合し、室温および800 rpm撹拌下で30分インキュベートした。室温および800 rpmで5分間の遠心分離によって、溶出液を生成させた。
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体の生産
Fc領域ジスルフィドを含有する2/3-IgGを使った鎖交換は、鎖分離と、その後の再組み立てによる所望の二重特異性抗体の形成とを可能にするために、初期工程として還元を必要とする。2/3-IgGは非ヒンジジスルフィド結合(ジスルフィドシャフリング)も含有するので、還元工程と、それに付随する副反応とを避けるために、H鎖FcとMHCFcRP Fcとの間にジスルフィドを持たない2/3-IgGを生成させた。これは、ノブ半抗体およびホール半抗体中ならびにノブまたはホールMHCFcRP鎖中の、ヒンジジスルフィド形成を担うシステインを変異させることによって達成された。半抗体間のKiH関連鎖間ジスルフィドを形成するCH3-システインも除去した。
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体の生成
軽鎖、重鎖および相補的Fc領域を含有する2/3-IgGを、2タイプのKiHヘテロ二量体、すなわち重鎖-ノブ::対応するFc領域-ホールおよび重鎖-ホール::対応するFc領域-ノブとして生成させた。両タイプの2/3IgGには「欠陥」がある。相補的Fc領域は、適合するH鎖対応物を持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、完全なヘテロ二量体を再編成する能力を有する。すなわち2/3-IgG Aの重鎖(ノブ)と2/3-IgG Bからの重鎖(ホール)とが完全なヘテロ二量体を形成する。完全なヘテロ二量体は、相補的Fc領域(ホール-電荷)が相補的Fc領域(ノブ-電荷)と相互作用する場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGタイプの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、完全なヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって、交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つの相補的Fc領域ヘテロ二量体とに変換した。
鎖交換反応は濃度依存的である
2/3-IgGから二重特異性抗体への変換の推進要因は、Fc領域間の意図的な「部分的欠陥」境界面である。この特殊な境界面は、MHCFcRP Fc分子のノブ-またはホール-CH3ドメインに導入された変異の結果である。2/3-IgGの発現中、変異型CH3ドメインは依然として、対応する「通常の」ノブパートナーまたはホールパートナーと会合する。これらの分子は2/3-IgGを、望ましくない凝集傾向を伴わない正しく振る舞う分子として提示するのに十分な安定性も有する。二重特異性抗体をもたらす生産的な鎖交換反応は、2つの相補的2/3-IgGが近接して、H鎖::MHCFcRPペアが隣り合わせに一部放出されたときに起こる。ノブ-ホールH鎖の再組立てによる、不安定化変異を持たない二重特異性抗体の形成が、そのような条件下では、好まれるはずである。なぜなら、これらのH鎖(CH3)境界面の方がより良く適合するからである。このように、二重特異性抗体生成物の鎖は、部分的に不完全な2/3-IgG入力分子の再形成に優先して会合した状態を保つ。意図的な部分的不安定化CH3境界面は、指向的鎖交換反応の成功にとってキーパラメータである。Fc境界面の部分的不安定化は、本明細書において上述したようにMHCFcRP鎖のCH3残基を変異させることによって達成することができる。
出発材料として拘束型2/3-IgGsを使った2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体(bsAb)の生成
拘束型2/3-IgGは環状であり、結合部位はFc領域のN末端側にある第1部分とFc領域のC末端側にある第2部分とで形成され、第1部分と第2部分が互いに会合して、結合部位を形成する。これをKiHヘテロ二量体、すなわち完全長環状重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールとして生成させた。拘束型2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、MHCFcRPは適合する電荷を完全長重鎖対応物に持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。2/3-IgG Aの完全長または完全長拘束型重鎖(ノブ-cys)と2/3-IgG Bからの完全長または拘束型重鎖(ホール-cys)は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP(ホール-電荷)がMHCFcRP(ノブ-電荷)と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、(電荷が)適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
拘束型2/3-IgG-His6(8)+2/3-IgG-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)
1 mgの「入力フォーマットA」を、総体積2 mlの1×PBS緩衝液中で、1 mgの「入力フォーマットB」と混合した。1×PBS緩衝液中の16倍モル当量のTCEPを混合物に加えた。試料を37℃および350 rpm撹拌下で1時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、試料をNiNTAクロマトグラフィーカラム(HisComplete(商標)、Roche、スイス)で精製した。組み立てられた二重特異性抗体は素通り画分に収集された。素通り画分を室温で一晩、さらにインキュベートした。次に、分析用SEC、CE-SDSおよび質量分析法によって試料を分析した。
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)、(a-4)および(b-3)における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1002]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含み、第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(a-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)、(a-4)および(b-3)における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(b-5)第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1006]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1010]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1011]
第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーが、第1多量体および/または第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーよりも低い、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが、(単離可能な)二量体を形成し、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとが、(単離可能な)二量体を形成する、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含み、かつ/または
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
本発明1004〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
第1ポリペプチドが変異ノブを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホールを含む、本発明1005〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、本発明1005〜1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
(i)互いに独立して、
アミノ酸配列:
またはアミノ酸配列:
またはアミノ酸配列:
DKTHT(SEQ ID NO:91)
のうちのいずれか、
(ii)IgG1 CH2ドメイン、および
(iii)IgG1 CH3ドメイン
を含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
(i)第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または
(ii)第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインがポリペプチド中で結合部位を形成する、本発明1018の方法。
[本発明1020]
第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
第1多量体および第2多量体が、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
第1多量体が、以下:
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異(perturbing mutation)D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下:
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
インキュベーション工程が還元剤の存在下または非存在下にある、本発明1001〜1003および本発明1009〜1012のいずれかの方法。
[本発明1024]
インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、本発明1004〜1008および本発明1013〜1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
(i)第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドが(C末端)タグをさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
(i)タグがアミノ酸配列HHHHHH(SEQ ID NO:67)またはHHHHHHHH(SEQ ID NO:68)を有し、回収する工程が金属(ニッケル)キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、または
(ii)タグがアミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
本発明1025の方法。
[本発明1027]
多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、(第1標的とは異なる)第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、本発明1001〜1026のいずれかの方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程;
(b)工程(a)において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程;および
(c)多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
[本発明1028]
結合アッセイがELISAまたはSPR法である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド;または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
(b-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(b-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
変異ノブを含む、多量体ポリペプチド。
[本発明1030]
撹乱変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1029の多量体ポリペプチド。
[本発明1031]
第1撹乱変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1029の多量体ポリペプチド。
[本発明1032]
(a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1033]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1032の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1034]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1032の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1035]
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、本発明1032〜1034のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1036]
(a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(a-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1037]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1036の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1038]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1036の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1039]
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、本発明1032〜1036のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1040]
(a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1041]
(a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1042]
第1ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、本発明1029〜1042のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1043]
第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、本発明1029〜1042のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1044]
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと;
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと;
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、本発明1043の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1045]
第2ポリペプチドが(C末端)タグをさらに含む、本発明1029〜1044のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1046]
(i)タグが、アミノ酸配列HHHHHH(SEQ ID NO:67)またはHHHHHHHH(SEQ ID NO:68)を有するか、または
(ii)タグが、アミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有する、
本発明1045の単離された多量体ポリペプチド。
以下の実施例、配列および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手順には、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えることができると理解される。
Claims (46)
- ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)、(a-4)および(b-3)における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。 - Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項1記載の方法。
- Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項1記載の方法。
- 第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含み、第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(a-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)、(a-4)および(b-3)における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(b-5)第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。 - Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項5記載の方法。
- Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、(b-4)における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項5記載の方法。
- 第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 - ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。 - ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・(a-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
(b-1)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
(b-2)
(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
(b-3)第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
(b-4)第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。 - 第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーが、第1多量体および/または第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーよりも低い、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが、(単離可能な)二量体を形成し、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとが、(単離可能な)二量体を形成する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含み、かつ/または
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列:
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。 - 第1ポリペプチドが変異ノブを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホールを含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
- 第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
- 第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- (i)第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または
(ii)第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。 - 第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインがポリペプチド中で結合部位を形成する、請求項18記載の方法。
- 第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。 - 第1多量体および第2多量体が、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 第1多量体が、以下:
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異(perturbing mutation)D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下:
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。 - インキュベーション工程が還元剤の存在下または非存在下にある、請求項1〜3および請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、請求項4〜8および請求項13〜22のいずれか一項記載の方法。
- (i)第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドが(C末端)タグをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- (i)タグがアミノ酸配列HHHHHH(SEQ ID NO:67)またはHHHHHHHH(SEQ ID NO:68)を有し、回収する工程が金属(ニッケル)キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、または
(ii)タグがアミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
請求項25記載の方法。 - 多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、(第1標的とは異なる)第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程;
(b)工程(a)において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程;および
(c)多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。 - 結合アッセイがELISAまたはSPR法である、請求項27記載の方法。
- Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
(a)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(a-1)(i)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
(ii)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(a-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(a-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド;または
(b)どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
(b-1)(i)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
(ii)第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
(b-2)第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
(b-3)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(b-1)における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
(b-4)第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
変異ノブを含む、多量体ポリペプチド。 - 撹乱変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項29記載の多量体ポリペプチド。
- 第1撹乱変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項29記載の多量体ポリペプチド。
- (a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。 - Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項32記載の単離された多量体ポリペプチド。
- Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項32記載の単離された多量体ポリペプチド。
- 第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、請求項32〜34のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
- (a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、(a-3)における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
(a-5)第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)またはアミノ酸配列HTPAPE(SEQ ID NO:86)を含む、
単離された多量体ポリペプチド。 - Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項36記載の単離された多量体ポリペプチド。
- Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、(a-4)における変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または(a-4)における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項36記載の単離された多量体ポリペプチド。
- 第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、請求項32〜36のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
- (a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。 - (a-1)(i)免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
(ii)少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
(a-2)免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
(a-3)第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
(a-4)第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。 - 第1ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(v)scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
(vi)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(ix)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(x)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(xi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(xii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(xiii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(xiv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xv)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
(xvi)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、請求項29〜42のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。 - 第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項29〜42のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
- 第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
(i)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
(ii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
(iii)SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
(iv)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(v)第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(vi)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
(vii)重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
(viii)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
(ix)重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
(x)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
(xi)第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
(xii)結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと;
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと;
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、請求項43記載の単離された多量体ポリペプチド。 - 第2ポリペプチドが(C末端)タグをさらに含む、請求項29〜44のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
- (i)タグが、アミノ酸配列HHHHHH(SEQ ID NO:67)またはHHHHHHHH(SEQ ID NO:68)を有するか、または
(ii)タグが、アミノ酸配列EPEA(SEQ ID NO:87)を有する、
請求項45記載の単離された多量体ポリペプチド。
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---|---|---|---|---|
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WO2020086758A1 (en) | 2018-10-23 | 2020-04-30 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Heterodimeric fc-fused proteins |
TW202106715A (zh) * | 2019-04-25 | 2021-02-16 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 藉由多肽鏈交換活化之治療性多特異性多肽 |
KR20220005031A (ko) * | 2019-04-25 | 2022-01-12 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 폴리펩티드 사슬 교환에 의한 항체-유래된 폴리펩티드의 산출 |
CN110669139A (zh) * | 2019-09-18 | 2020-01-10 | 沣潮医药科技(上海)有限公司 | 二聚体免疫粘附素、药物组合物和用途 |
CN111018999B (zh) * | 2019-12-05 | 2022-07-12 | 沣潮医药科技(上海)有限公司 | 二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途 |
CN115698086A (zh) * | 2020-06-01 | 2023-02-03 | 马斯得生物有限公司 | 一种双特异性抗体或其抗原结合片段及其制备方法 |
CN116601175A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-15 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒 |
CN117715939A (zh) | 2021-07-27 | 2024-03-15 | 莫佛塞斯公司 | 抗原结合分子的组合 |
MX2024004564A (es) * | 2021-10-15 | 2024-04-30 | Cytomx Therapeutics Inc | Complejo polipeptidico activable. |
WO2024156759A1 (en) | 2023-01-25 | 2024-08-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Payload-bearing multispecific antibodies |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011508604A (ja) * | 2008-01-07 | 2011-03-17 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング(electrostaticsteering)効果を用いた抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
WO2016087416A1 (en) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
JP2017525690A (ja) * | 2014-08-04 | 2017-09-07 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
Family Cites Families (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
WO1990005144A1 (en) | 1988-11-11 | 1990-05-17 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
AU675916B2 (en) | 1991-06-14 | 1997-02-27 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
US5932448A (en) | 1991-11-29 | 1999-08-03 | Protein Design Labs., Inc. | Bispecific antibody heterodimers |
DE69333807T2 (de) | 1992-02-06 | 2006-02-02 | Chiron Corp., Emeryville | Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür |
WO1994029351A2 (en) | 1993-06-16 | 1994-12-22 | Celltech Limited | Antibodies |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
DE59610754D1 (de) | 1996-07-25 | 2003-11-06 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Vereinfachte herstellung bispezifischer antikörperfragmente |
EP0979281B1 (en) | 1997-05-02 | 2005-07-20 | Genentech, Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20020062010A1 (en) | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
JP2002510481A (ja) | 1998-04-02 | 2002-04-09 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗体変異体及びその断片 |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
PL209786B1 (pl) | 1999-01-15 | 2011-10-31 | Genentech Inc | Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
KR20020093029A (ko) | 2000-04-11 | 2002-12-12 | 제넨테크, 인크. | 다가 항체 및 그의 용도 |
US7361740B2 (en) | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
BRPI0316779B1 (pt) | 2002-12-16 | 2020-04-28 | Genentech Inc | anticorpo humanizado que liga cd20 humano, composição, artigo manufaturado, método de indução da apoptose, método de tratamento de câncer cd20 positivo, métodos de tratamento de doenças autoimunes, ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, método para a produção de um anticorpo 2h7 humanizado, polipeptídeo isolado, formulação líquida, método de tratamento de artrite reumatóide (ra) e anticorpos de ligação de cd20 humanizados |
WO2005042582A1 (ja) | 2003-11-04 | 2005-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体の製造方法 |
NZ544924A (en) | 2003-06-27 | 2009-03-31 | Biogen Idec Inc | Modified binding molecules comprising connecting peptides |
AU2004308439A1 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | Centocor, Inc. | Methods for generating multimeric molecules |
RU2368622C2 (ru) | 2004-04-13 | 2009-09-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Антитела к р-селектину |
TWI309240B (en) | 2004-09-17 | 2009-05-01 | Hoffmann La Roche | Anti-ox40l antibodies |
KR101370253B1 (ko) | 2004-10-22 | 2014-03-05 | 암젠 인크 | 재조합 항체의 재접힘 방법 |
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
WO2007110205A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
EP4218801A3 (en) | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
US20090182127A1 (en) | 2006-06-22 | 2009-07-16 | Novo Nordisk A/S | Production of Bispecific Antibodies |
WO2008027236A2 (en) | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
CN104497143B (zh) | 2007-03-29 | 2020-08-25 | 健玛保 | 双特异性抗体及其制造方法 |
ES2687808T3 (es) | 2007-09-26 | 2018-10-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Región constante de anticuerpo modificado |
US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US8242247B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-08-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
ES2708124T3 (es) | 2009-04-27 | 2019-04-08 | Oncomed Pharm Inc | Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas |
MX342623B (es) | 2009-06-26 | 2016-10-06 | Regeneron Pharma | Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original. |
JP5856073B2 (ja) | 2009-12-29 | 2016-02-09 | エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル, エルエルシー | Ron結合構築体およびその使用方法 |
CN103097417B (zh) | 2010-04-20 | 2019-04-09 | 根马布股份公司 | 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法 |
EP2560683B2 (en) | 2010-04-23 | 2022-07-20 | F. Hoffmann-La Roche AG | Production of heteromultimeric proteins |
JP6022444B2 (ja) | 2010-05-14 | 2016-11-09 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法 |
AU2011325833C1 (en) | 2010-11-05 | 2017-07-13 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
BR112014003598B1 (pt) | 2011-08-23 | 2022-05-31 | Roche Glycart Ag | Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica |
HUE044633T2 (hu) | 2011-10-27 | 2019-11-28 | Genmab As | Heterodimer fehérjék elõállítása |
PL2794905T3 (pl) | 2011-12-20 | 2020-11-02 | Medimmune, Llc | Zmodyfikowane polipeptydy dla rusztowań przeciwciał dwuswoistych |
SI2838918T1 (sl) | 2012-04-20 | 2019-11-29 | Merus Nv | Postopki in sredstva za proizvodnjo heterodimernih IG-podobnih molekul |
UY35148A (es) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | Immunoglobulinas heterodiméricas |
EP3050896B1 (en) | 2013-09-27 | 2021-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
CA2946430A1 (en) * | 2014-06-12 | 2015-12-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for selecting antibodies with modified fcrn interaction |
EP3842453A1 (en) * | 2014-11-06 | 2021-06-30 | F. Hoffmann-La Roche AG | Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties |
KR101851380B1 (ko) * | 2015-10-12 | 2018-04-23 | 아주대학교산학협력단 | 효모접합을 이용한 항체 ch3 도메인 이종이중체 돌연변이쌍 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 ch3 돌연변이체 쌍 |
EP3889175A1 (en) | 2016-05-02 | 2021-10-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | The contorsbody - a single chain target binder |
EP3586872A4 (en) | 2017-02-24 | 2020-12-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | PHARMACEUTICAL COMPOSITION, ANTIG-BINDING MOLECULES, TREATMENT METHODS AND SCREENING METHODS |
-
2018
- 2018-10-19 CN CN201880068221.9A patent/CN111246885B/zh active Active
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- 2018-10-19 CA CA3078157A patent/CA3078157A1/en active Pending
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-
2020
- 2020-04-06 IL IL273849A patent/IL273849A/en unknown
- 2020-04-15 US US16/849,223 patent/US20200392253A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011508604A (ja) * | 2008-01-07 | 2011-03-17 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング(electrostaticsteering)効果を用いた抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
JP2017525690A (ja) * | 2014-08-04 | 2017-09-07 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
WO2016087416A1 (en) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PNAS, vol. 110, no. 13, JPN6022043006, 2013, pages 5145 - 5150, ISSN: 0005075020 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111246885A (zh) | 2020-06-05 |
JP7450535B2 (ja) | 2024-03-15 |
US20200392253A1 (en) | 2020-12-17 |
MX2020003497A (es) | 2020-07-22 |
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BR112020007154A2 (pt) | 2020-09-29 |
WO2019077092A1 (en) | 2019-04-25 |
EP3697441B1 (en) | 2023-06-07 |
AU2018353420A1 (en) | 2020-04-16 |
TW201932142A (zh) | 2019-08-16 |
CA3078157A1 (en) | 2019-04-25 |
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