JP2018506545A

JP2018506545A - 修飾されたＦｃＲｎ結合特性およびプロテインＡ結合特性を有するＦｃ領域変種

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Publication number: JP2018506545A
Application number: JP2017542322A
Authority: JP
Inventors: ティルマンシュロートハウアー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2018-03-08
Anticipated expiration: 2035-11-04
Also published as: RU2713131C1; WO2016071377A1; CA2960569A1; KR20170076697A; MX2017005150A; EP3842453A1; JP7061591B2; EP3215524A1; US10899846B2; US20170342168A1; JP2020007325A; CN107074966A; BR112017006591A2; US20210246228A1; AR102522A1; JP6576456B2; EP3215524B1

Abstract

N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチドと、N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドが本明細書において報告され、該第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み(ホール鎖)、かつ該第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366Wを含み(ノブ鎖)、かつ該第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異(i)I253AまたはI253Gおよび(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dを含み、かつ該第1のポリペプチドおよび該第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、かつ該第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび該第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

Description

本明細書において、Fc受容体およびプロテインAとの結合に関して修飾されたIgG Fc領域が報告される。

発明の背景
対費用効果の高い作製過程の需要のため、1つまたは複数のアフィニティークロマトグラフィー段階を含む下流精製の最適化が必要とされている。より大きい処理体積および定置洗浄(CIP)プロトコールのためのより厳しい必要条件が、解決する必要のある特色の一部である(Hober,S.,J.Chrom.B.848(2007)40-47)。

選択的なFc領域アフィニティーリガンドによるモノクローナル抗体の精製は、治療用モノクローナル抗体の大規模作製のための最も有望な方法論である。実際、この手法は、抗体の抗原特異的部分、すなわち、Fabドメインとの相互作用を確立することを必要とせず、したがって、Fabドメインは完全なまま残され、その特性を保持することができる(Salvalaglio,M.,et al.,J.Chrom.A 1216(2009)8678-8686を参照されたい)。

その選択性のため、アフィニティー精製段階を一連の精製の初期に用い、それによって、連続する単位作業の数を低下させることができる(Hober、前記;MacLennan,J.,Biotechnol.13(1995)1180;Harakas,N.K.,Bioprocess Technol.18(1994)259を参照されたい)。

IgGに選択的に結合するために最も採用されているリガンドは、Fc領域のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のヒンジ領域に位置する「コンセンサス結合部位」(CBS)(DeLano,W.L.,et al.,Science 287(2000)1279)として公知の領域において、大部分のIgGのFc領域と高度に選択的な相互作用を確立することができるブドウ球菌のプロテインAおよびプロテインGである。

ブドウ球菌プロテインA(SPA)は、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の表面上に露出した細胞壁会合タンパク質ドメインである。SPAは、様々な種に由来するIgG、例えば、ヒト、ウサギ、およびモルモットのIgGに対して高い親和性を有するが、ウシおよびマウスのIgGとは弱い相互作用しか有しない(以下の表を参照されたい)(Hober、前記;Duhamel,R.C.,et al.,J.Immunol.Methods 31(1979)211;Bjork,L.and Kronvall,G.,Immunol.J.133(1984)969;Richman,D.D.,et al.,J.Immunol.128(1982)2300;Amersham Pharmacia Biotech,Handbook,Antibody Purification(2000)を参照されたい)。

++:強い結合/+:中程度の結合/-:弱い相互作用または相互作用なし

IgGのCH2ドメインとCH3ドメインとの間の重鎖ヒンジ領域は、新生児型Fc受容体(FcRn)のような、プロテインA以外の数種のタンパク質に結合することができる(DeLano and Salvalaglio、前記を参照されたい)。

SPA CBSは、抗体の表面上の疎水性ポケットを包含する。IgG CBSを構成する残基は、Ile 253、Ser 254、Met 252、Met 423、Tyr 326、His 435、Asn 434、His 433、Arg 255、およびGlu 380(Kabat EU指標番号付与システムに基づくIgG重鎖残基の番号付与)である。荷電アミノ酸(Arg 255、Glu 380)が、Ile 253およびSer 254によって形成された疎水性ノブの周囲に位置している。これは、極性相互作用および親水性相互作用の確立をもたらす(ことができる)(Salvalaglio、前記を参照されたい)。

一般に、プロテインA-IgG相互作用は、2個の主な結合部位を使用して記載され得る。第1は、重鎖CH2ドメインに位置し、(プロテインAの)Phe 132、Leu 136、Ile 150と、Ile 253およびSer 254によって構成されたIgG疎水性ノブとの間の疎水性相互作用、およびLys 154(プロテインA)とThr 256(IgG)との間の1つの静電的相互作用を特徴とする。第2の部位は、重鎖CH3ドメインに位置し、Gln 129およびTyr 133(プロテインA)と、His 433、Asn 434、およびHis 435(IgG)との間の静電的相互作用によって支配される(Salvalaglio、前記を参照されたい)。

Lindhofer,H.ら(J.Immunol.155(1995)219-225)は、ラット/マウスクアドローマにおける優先的な種制限された重鎖/軽鎖対合を報告している。

Jedenberg,L.ら(J.Immunol.Meth.201(1997)25-34)は、2種のFc変種(それぞれ他のアイソタイプに由来するアイソタイプジペプチド置換を各々含有しているFc13およびFc31)のSPA結合分析が、Fc1およびFc31がSPAと相互作用し、Fc3およびFc13が検出可能なSPA結合を欠くことを示したと報告した。Fc領域変種Fc31の与えられたSPA結合は、導入されたジペプチド置換R435HおよびF436Yに起因すると結論付けられる。

今日、治療用モノクローナル抗体に関しては、2種またはそれ以上の標的(抗原)に特異的に結合する二重特異性抗体またはさらには多重特異性抗体の生成および使用に焦点が置かれている。

1種の発現細胞株において、4本の抗体鎖(2本の異なる重鎖および2本の異なる軽鎖)から、多重特異性ヘテロ二量体IgG抗体を生成する際の基本的課題は、いわゆる鎖会合問題である(Klein,C.,et al.,mAbs 4(2012)653-663を参照されたい)。多重特異性抗体の左アームおよび右アームとしての異なる鎖の使用が必要とされるため、1種の細胞における発現によって抗体混合物が生じ:2本の重鎖は、(理論上)4つの異なる組み合わせ(そのうち2つは同一である)で会合することができ、それらの各々が、軽鎖と確率論的に会合することができるため、2⁴(=全部で16)個の理論上可能な鎖の組み合わせをもたらす。16個の理論上可能な組み合わせのうち、10個が見出され、そのうちの1個のみが、所望の機能的な二重特異性抗体に相当する(De Lau,W.B.,et al.,J.Immunol.146(1991)906-914)。複雑な混合物の中からこの所望の二重特異性抗体を単離することの困難さおよび理論上最大で12.5％という固有の不十分な収率のため、1種の発現細胞株における二重特異性抗体の作製は極めて難題である。

鎖会合問題を克服し、2本の異なる重鎖の正確な会合を強制するため、1990年代後期に、GenentechのCarterらが、「ノブイントゥーホール」(KiH)と名付けられたアプローチを発明した(Carter,P.,J.Immunol.Meth.248(2001)7-15;Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681;Zhu,Z.,et al.,Prot.Sci.6(1997)781-788;Ridgway,J.B.,et al.,Prot.Eng.9(1996)617-621;Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35;および米国特許第7,183,076号を参照されたい)。基本的に、その概念は、大部分の相互作用が起こる抗体の2本の重鎖の2個のCH3ドメインの間の界面の修飾に頼る。かさの大きい残基が、一方の抗体重鎖のCH3ドメインへ導入され、鍵(「ノブ」)に類似した作用をする。他方の重鎖には、鍵穴を模倣して、このかさの大きい残基を収容することができる「ホール」が形成される。得られたヘテロ二量体Fc領域は、人工ジスルフィド架橋の導入/形成によってさらに安定化され得る。注目すべきことに、KiH変異は、すべて、CH3ドメイン内に埋め込まれており、免疫系に対しては「見えない」。さらに、(熱)安定性、FcγR結合、およびエフェクター機能(例えば、ADCC、FcRn結合)、および薬物動態学的(PK)挙動のような、KiH変異を有する抗体の特性は、影響されない。

ヘテロ二量体化収率が97％超の正確な重鎖会合は、6つの変異:「ノブ」重鎖におけるS354C、T366W、および「ホール」重鎖におけるY349C、T366S、L368A、Y407Vを導入することによって達成され得る(Carter、前記を参照されたい;Kabat EU指標番号付与システムに基づく残基の番号付与)。ホール-ホールホモ二量体は存在する可能性があるが、ノブ-ノブホモ二量体は典型的には観察されない。選択的な精製手法または以下に概説されるような手法のいずれかによって、ホール-ホール二量体を枯渇させることができる。

ランダムな重鎖会合の問題は取り組まれているが、正確な軽鎖会合も確実にされなければならない。KiH CH3ドメインアプローチに類似して、完全な二重特異性IgGに最終的に至ることができる非対称の軽鎖-重鎖相互作用を調査する努力がなされている。

Rocheは、最近、KiHテクノロジーと組み合わせた場合に、二重特異性ヘテロ二量体IgG抗体における正確な軽鎖対合を強制する可能性として、CrossMabアプローチを開発した(Klein、前記;Schaefer.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192;Cain,C.,SciBX 4(2011)1-4を参照されたい)。これは、一般的な様式で二重特異性抗体またはさらには多重特異性抗体の生成を可能にする。このフォーマットにおいては、意図された二重特異性抗体の1本のアームは不変のままにされる。第2のアームにおいて、Fab領域全体またはVH-VLドメインもしくはCH1-CLドメインが、重鎖と軽鎖との間のドメインクロスオーバーによって交換される。結果として、新たに形成された「クロス型」軽鎖は、もはや、二重特異性抗体の他のアームの(通常の、すなわち、非クロス型の)重鎖Fab領域とは会合しない。したがって、ドメイン配置のこの最小の変化によって、正確な「軽鎖」会合を強制することができる(Schaefer、前記を参照されたい)。

Zhuらは、ダイアボディ(diabody)変種の2個のVL/VH界面に、数個の立体的に相補的な変異およびジスルフィド架橋を導入した。変異VL Y87A/F98MおよびVH V37F/L45Wが、抗p185HER2 VL/VH界面へ導入された場合、ヘテロ二量体ダイアボディは、親ダイアボディと比較して、全収率および親和性を維持しながら、＞90％の収率で回収された(Zhu、前記を参照されたい)。

Chugaiの研究者らは、同様に、正確な軽鎖会合を促すため、VH-VL界面への変異の導入(主として、VH内のQ39およびVL内のQ38の荷電残基への変換)によって、二重特異性ダイアボディを設計した(WO 2006/106905;Igawa,T.,et al.,Prot.Eng.Des.Sel.23(2010)667-677)。

WO2011097603には、共通軽鎖マウスが報告されている。

WO2010151792には、CH3ドメインにおいて示差的に修飾された、すなわち、ヘテロ二量体である免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む、単離の容易さを提供する二重特異性抗体フォーマットが提供されている。CH3修飾に関する示差的な修飾は、非免疫原性または実質的に非免疫原性であり、修飾のうちの少なくとも1個は、プロテインAのようなアフィニティー試薬に対する二重特異性抗体の示差的な親和性をもたらし、二重特異性抗体は、プロテインAに対する親和性に基づき、破壊された細胞から、培地から、または抗体の混合物から単離可能である。

新生児型Fc受容体(FcRn)は、インビボのIgGクラスの抗体の代謝的運命にとって重要である。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGを救出し、クリアランスの低下および半減期の延長をもたらすよう機能する。それは、2種のポリペプチド:50kDaのクラスI主要組織適合複合体様タンパク質(αFcRn)および15kDaのβ2ミクログロブリン(β2m)からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体のFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。クラスIgGの抗体とFcRnとの間の相互作用は、pH依存性であり、1:2化学量論で起こる。すなわち、1個のIgG抗体分子が、その2個の重鎖Fc領域ポリペプチドを介して、2個のFcRn分子と相互作用することができる(例えば、Huber,A.H.,et al.,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083を参照されたい)。

したがって、IgGのインビトロのFcRn結合特性/特徴は、血液循環におけるインビボの薬物動態学的特性を示す。

FcRnと、IgGクラスの抗体のFc領域との間の相互作用には、重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインの異なるアミノ酸残基が関係している。

FcRn結合に影響を及ぼし、それと共に、血液循環における半減期にも影響を及ぼす種々の変異が公知である。マウスFc領域-マウスFcRn相互作用にとって重大なFc領域残基は、部位特異的変異誘発によって同定されている(例えば、Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Immunol 169(2002)5171-5180を参照されたい)。残基I253、H310、H433、N434、およびH435(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)が、相互作用に関与している(Medesan,C.,et al.,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536;Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002;Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。残基I253、H310、およびH435は、ヒトFc領域のマウスFcRnとの相互作用にとって重大であることが見出された(Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2885)。

Fc領域(および同様にIgG)のFcRnとの結合を増大させる方法は、Fc領域の様々なアミノ酸残基:Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433、およびAsn 434を変異させることによって実施されている(Kuo,T.T.,et al.,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789;Ropeenian,D.C.,et al.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725を参照されたい)。

変異M252Y、S254T、T256Eの組み合わせが、FcRn結合を改善することが、タンパク質間相互作用研究によって、Dall'Acquaらによって記載された(Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。ヒトFc領域-ヒトFcRn複合体の研究は、残基I253、S254、H435、およびY436が相互作用にとって重大であることを示した(Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002;Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。Yeung,Y.A.ら(J.Immunol.182(2009)7667-7671)に、残基248〜259および301〜317および376〜382および424〜437の様々な変異体が報告され調査されている。

US 2012/0009182には、プロテインAとの改変された結合を有する免疫グロブリン変種が報告されている。変異誘発による抗体のFcRn結合親和性または血清半減期の改変はWO 2004/035752に報告されている。

ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合し、ヒトFcRnに結合するかまたは結合しない変種Fc領域が、本明細書において報告される。これらの変種Fc領域は、CH2ドメインに特定のアミノ酸変異を含有しており、CH3ドメインはプロテインA結合に関して変化していない。これらの変異は、ヘテロ二量体Fc領域のホール鎖において使用された場合、ヘテロ二量体Fc領域の精製、すなわち、ヘテロ二量体Fc領域のホモ二量体Fc領域副産物(ホール鎖-ホール鎖二量体)からの分離を可能にすることが見出された。

本明細書において報告される1つの局面は、
N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチドと、N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体ポリペプチドであり、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み(ホール鎖)、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366Wを含み(ノブ鎖)、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D
を含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1個、2個、またはそれ以上のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインはプロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AもしくはI253G、および
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、および
(iii)T250Q、および/または
(iv)T256EもしくはT256A
を含む。

1つの態様において、第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AもしくはI253G、ならびに
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、ならびに
(iii)任意で(a)T250Qおよび/またはT256EもしくはT256A、ならびに
(iv)(a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、および/または(b)H310AもしくはH310G
を含む。

1つの態様において、第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AもしくはI253G、ならびに
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、ならびに
(iii)(a)T250Qおよび/またはT256EもしくはT256A、ならびに
(iv)(a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、および/または(b)H310AもしくはH310G、
(v)任意で、(a)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、および/または(b)Q311H、および/または(c)M252Y、および/または(d)S254T
を含む。

1つの態様において、第2のポリペプチド(ノブ鎖)は、変異
(i)T250Q、および/または
(ii)M252Y、および/または
(iii)S254T、および/または
(iv)T256EもしくはT256A、および/または
(v)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、および/または
(vi)Q311H
を含む。

1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG1サブクラスのものである。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異L234AおよびL235Aをさらに含む。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異P329Gをさらに含む。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異L234A、L235A、およびP329Gをさらに含む。

1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG4サブクラスのものである。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異S228PおよびL235Eをさらに含む。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異P329Gをさらに含む。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、変異S228P、L235E、およびP329Gをさらに含む。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドはFc領域融合ポリペプチドである。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは完全長抗体である。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異I253AおよびL314Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異L251AおよびL314Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異L251Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異I253Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異L314Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異H310Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異L251A、I253A、およびL314Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異を有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異L251A、I253A、およびL314Aを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異に加えて変異M252Y、S254T、およびT256Eを有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、ホール変異に加えて変異I253A、L314A、M428L、およびN434Hを有する第1のポリペプチド(ホール鎖)と、ノブ変異に加えて変異M252Y、S254T、およびT256Eを有する第2のポリペプチド(ノブ鎖)とを含む(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は、重鎖可変ドメインに、S17A、R19A、T57A、T57K、R66A、S70A、Y79A、Q81A、N82aA、およびS82bAを含む群より選択される変異のうちの1つまたは複数をさらに含む(Kabatに基づく番号付与)。1つの態様において、完全長抗体は、重鎖可変ドメインに、S17A、R19A、T57A、T57K、R66A、Q81A、およびN82aAからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含み、これらの変異を有しないが、その他は同一のアミノ酸配列を有する抗体と比較して、低下したプロテインAとの結合を有する(Kabatに基づく番号付与)。1つの態様において、完全長抗体は、重鎖可変ドメインに、S70A、Y79A、およびS82bAからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含み、これらの変異を有しないが、その他は同一のアミノ酸配列を有する抗体と比較して、増大したプロテインAとの結合を有する(Kabatに基づく番号付与)。

1つの態様において、完全長抗体は単一特異性抗体である。1つの態様において、単一特異性抗体は一価単一特異性抗体である。1つの態様において、単一特異性抗体は二価単一特異性抗体である。

1つの態様において、完全長抗体は二重特異性抗体である。1つの態様において、二重特異性抗体は二価二重特異性抗体である。1つの態様において、二重特異性抗体は四価二重特異性抗体である。

1つの態様において、完全長抗体は三重特異性抗体である。1つの態様において、三重特異性抗体は三価三重特異性抗体である。1つの態様において、三重特異性抗体は四価三重特異性抗体である。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、L234A、L235A、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、L234A、L235A、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dを含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、L234A、L235A、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、L234A、L235A、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dを含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、S228P、L235E、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、S228P、L235E、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D
を含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、S228P、L235E、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、S228P、L235E、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D
を含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、かつ第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、第1のscFvおよび第2のscFvは第2の抗原に特異的に結合し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、L234A、L235A、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、L234A、L235A、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dを含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、
N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第1のscFvを含む、第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第2のscFvを含む、第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む、第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、第4のポリペプチド
を含む二重特異性完全長抗体であり、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、かつ第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは、第1の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、かつ第1のscFvおよび第2のscFvは、第2の抗原に特異的に結合し、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V、L234A、L235A、およびP329Gを含み、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366W、L234A、L235A、およびP329Gを含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されている。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを作製する方法である:
(a)ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)培養培地からヘテロ二量体ポリペプチドを回収する段階、および
(c)プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってヘテロ二量体ポリペプチドを精製し、それによって、二量体ポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、以下の変異の組み合わせの使用である:
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D。

本明細書において報告される1つの局面は、そのような処置を必要とする患者に本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置の方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、硝子体内適用のための本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、医薬として使用するための本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、血管性眼疾患の処置のための本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドと、任意で薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤である。

眼のみならず身体の他の部分にも存在する抗原を標的とする/に結合する抗体を使用するためには、全身副作用を回避するため、眼から血液へと血液眼関門を通過した後の短い全身半減期が有益である。

さらに、受容体のリガンドに特異的に結合する抗体は、抗体-抗原複合体が眼から除去される場合、すなわち、抗体が受容体リガンドの眼からの輸送媒体として機能し、それによって、受容体シグナリングを阻害する場合、眼疾患の処置においてのみ有効である。

本明細書において報告される1つの局面は、可溶性受容体リガンドの眼からの血液眼関門を介した血液循環への輸送のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドの眼からの除去のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、眼疾患、特に、血管性眼疾患の処置のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間からの血液循環への輸送のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、眼疾患の処置において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、可溶性受容体リガンドの眼からの血液眼関門を介した血液循環への輸送において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドの眼からの除去において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、眼疾患、特に、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間からの血液循環への輸送において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を介して血液循環へ輸送するために有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を介して血液循環へ輸送する方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドを眼から除去するために有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において1つまたは複数の可溶性受容体リガンドを眼から除去する方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送するために有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において1つまたは複数の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送する方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を介して血液循環へ輸送するために有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において可溶性受容体リガンドを硝子体内空間または眼から血液眼関門を介して血液循環へ輸送する方法である。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは二重特異性抗体である。1つの態様において、二重特異性抗体は二価二重特異性抗体である。1つの態様において、二重特異性抗体は四価二重特異性抗体である。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは三重特異性抗体である。1つの態様において、三重特異性抗体は三価三重特異性抗体である。1つの態様において、三重特異性抗体は四価三重特異性抗体である。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドはCrossMabである。

1つの態様において、第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366Wをさらに含む。

1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、サブクラスIgG1のものである。1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異L234AおよびL235Aをさらに含む。1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異P329Gをさらに含む。

1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、サブクラスIgG4のものである。1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異S228PおよびL235Eをさらに含む。1つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異P329Gをさらに含む。

発明の態様の詳細な説明
I.定義
「約」という用語は、その後に続く数値の+/-20%の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-10%の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-5%の範囲を意味する。

本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはアミノ酸配列改変を含んでもよい。いくつかの態様において、アミノ酸改変の数は、10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、4個もしくはそれ未満、3個もしくはそれ未満、または2個もしくはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。

「親和性成熟」抗体とは、抗原に対する抗体の親和性を向上させるような改変を有していない親抗体と比べて、1つまたは複数の超可変領域(HVR)に1つまたは複数の改変を有する抗体を意味する。

「改変」という用語は、修飾された抗体または融合ポリペプチドを得るための、親抗体または融合ポリペプチド、例えば、Fc領域に関する少なくとも1つのFcRn結合部分を含む融合ポリペプチド中の1つまたは複数のアミノ酸残基の変異(置換)、挿入(付加)、または欠失を意味する。「変異」という用語は、異なるアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基で置換することを意味する。例えば、変異L234Aは、抗体Fc領域(ポリペプチド)中の234位のアミノ酸残基リジンがアミノ酸残基アラニンによって置換されていること(アラニンによるリジンの置換)(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)を意味する。

「天然に存在するアミノ酸残基」とは、アラニン(3文字コード:Ala、1文字コード:A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リジン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、およびバリン(Val、V)からなる群からのアミノ酸残基を示す。

「アミノ酸変異」という用語は、少なくとも1つの既存のアミノ酸残基を別の異なるアミノ酸残基(=置換アミノ酸残基)で置換することを意味する。置換アミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」であってよく、アラニン(3文字記号:Ala、1文字記号:A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(glee、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(lie、I)、ロイシン(Leu、L)、リジン(lees、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(seer、S)、トレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(try、Y)、およびバリン(Val、V)からなる群より選択され得る。置換アミノ酸残基は、「天然に存在しないアミノ酸残基」であってよい。例えば、US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024;および Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10(すべて、参照により全体が本明細書に組み入れられる)を参照されたい。

「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置において少なくとも1つのアミノ酸残基が取り除かれることを意味する。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体)、ならびに所望の抗原結合活性および/またはプロテインA結合活性および/またはFcRn結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む、様々な抗体構造体を包含する。

「非対称Fc領域」という用語は、Kabat EU指標番号付与システムに基づく対応位置に異なるアミノ酸残基を有する一対のFc領域ポリペプチドを意味する。

「FcRn結合に関する非対称Fc領域」という用語は、対応位置に異なるアミノ酸残基を有する2つのポリペプチド鎖からなるFc領域を意味し、これらの位置はKabat EU指標番号付与システムに基づいて決定され、それらの異なる位置は、ヒト新生児型Fc受容体(FcRn)へのFc領域の結合に影響を及ぼす。本明細書の目的において、「FcRn結合に関する非対称Fc領域」におけるFc領域の2つのポリペプチド鎖の差異には、例えば二重特異性抗体を作製する目的で、ヘテロ二量体Fc領域の形成を促進させるために導入された差異は含まれない。これらの差異もまた、非対称であり得る。すなわち、それら2つの鎖は、Kabat EU指標番号付与システムに基づく非対応アミノ酸残基において差異を有する。これらの差異は、ヘテロ二量体化を促進し、ホモ二量体化を減少させる。このような差異の例は、いわゆる「ノブイントゥーホール」置換である(例えば、US 7,695,936およびUS 2003/0078385を参照されたい)。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の各ポリペプチド鎖における次のノブアンドホール(knobs and holes)置換は、ヘテロ二量体形成を増大させることが判明している:(1)一方の鎖におけるY407Tおよび他方の鎖におけるT366Y;(2)一方の鎖におけるY407Aおよび他方の鎖におけるT366W;(3)一方の鎖におけるF405Aおよび他方の鎖におけるT394W;(4)一方の鎖におけるF405Wおよび他方の鎖におけるT394S;(5)一方の鎖におけるY407Tおよび他方の鎖におけるT366Y;(6)一方の鎖におけるT366YおよびF405A、ならびに他方の鎖におけるT394WおよびY407T;(7)一方の鎖におけるT366WおよびF405W、ならびに他方の鎖におけるT394SおよびY407A;(8)一方の鎖におけるF405WおよびY407A、ならびに他方の鎖におけるT366WおよびT394S;ならびに(9)一方の鎖におけるT366W、ならびに他方の鎖におけるT366S、L368A、およびY407V;ここで、最後に挙げたものが特に適している。さらに、2つのFc領域ポリペプチド鎖の間に新しいジスルフィド架橋を生成する変更も、ヘテロ二量体形成を促進する(例えば、US 2003/0078385を参照されたい)。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の各ポリペプチド鎖に新しい鎖内ジスルフィド結合を形成させるための適切な間隔を空けて離れたシステイン残基をもたらす次の置換は、ヘテロ二量体形成を増大させることが判明している：一方の鎖におけるY349Cおよび他方の鎖におけるS354C;一方の鎖におけるY349Cおよび他方の鎖におけるE356C;一方の鎖におけるY349Cおよび他方の鎖におけるE357C;一方の鎖におけるL351Cおよび他方の鎖におけるS354C;一方の鎖におけるT394Cおよび他方の鎖におけるE397C;または一方の鎖におけるD399Cおよび他方の鎖におけるK392C。ヘテロ二量体化を促進するアミノ酸変更のさらに別の例は、いわゆる「電荷対置換」である(例えば、WO 2009/089004を参照されたい)。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の各ポリペプチド鎖における次の電荷対置換は、ヘテロ二量体形成を増大させることが判明している：(1)一方の鎖におけるK409DまたはK409Eおよび他方の鎖におけるD399KまたはD399R;(2)一方の鎖におけるK392DまたはK392Eおよび他方の鎖におけるD399KまたはD399R;(3)一方の鎖におけるK439DまたはK439Eおよび他方の鎖におけるE356KまたはE356R;(4)一方の鎖におけるK370DまたはK370Eおよび他方の鎖におけるE357KまたはE357R;(5)一方の鎖におけるK409DおよびK360Dならびに(plus)他方の鎖におけるD399KおよびE356K;(6)一方の鎖におけるK409DおよびK370Dならびに他方の鎖におけるD399KおよびE357K;(7)一方の鎖におけるK409DおよびK392Dならびに他方の鎖におけるD399K、E356K、およびE357K;(8)一方の鎖におけるK409DおよびK392Dならびに他方の鎖におけるD399K;(9)一方の鎖におけるK409DおよびK392Dならびに他方の鎖におけるD399KおよびE356K;(10)一方の鎖におけるK409DおよびK392Dならびに他方の鎖におけるD399KおよびD357K;(11)一方の鎖におけるK409DおよびK370Dならびに他方の鎖におけるD399KおよびD357K;(12)一方の鎖におけるD399Kならびに他方の鎖におけるK409DおよびK360D;ならびに(13)一方の鎖におけるK409DおよびK439Dならびに他方におけるD399KおよびE356K。

「(抗原への)結合」という用語は、インビトロのアッセイ法における、1つの態様においては、表面に抗体を結合し、その抗体への抗原の結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定する結合アッセイ法における、抗原への抗体の結合を示す。結合とは、10^-8Mまたはそれ未満、いくつかの態様において、10^-13〜10^-8M、いくつかの態様において、10^-13〜10^-9Mの結合親和性(K_D)を意味する。

結合は、BIAcoreアッセイ法(GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden)によって調査することができる。結合親和性は、用語k_a(抗体/抗原複合体から得られる抗体の会合速度定数)、k_d(解離定数)、およびK_D(k_d/k_a)を用いて定義される。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分は、ある特定の供給源または種に由来するが、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は、異なる供給源または種に由来する、抗体を意味する。

「CH2ドメイン」という用語は、おおよそEU位置231位からEU位置340位(Kabatに基づくEU番号付与システム)まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、CH2ドメインは、

のアミノ酸配列を有する。

「CH3ドメイン」は、おおよそEU位置341位からEU位置446位まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、CH3ドメインは、

のアミノ酸配列を有する。

抗体の「クラス」という用語は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、およびIgA₂にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼ばれる。

「同程度の長さ」という用語は、2つのポリペプチドが、同じ数のアミノ酸残基を含むか、または1つもしくは複数の最大10個までのアミノ酸残基分だけ長さが異なり得ることを意味する。1つの態様において、(Fc領域)ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基を含むか、または1〜10個の数のアミノ酸残基分だけ異なる。1つの態様において、(Fc領域)ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基を含むか、または1〜5個の数のアミノ酸残基分だけ異なる。1つの態様において、(Fc領域)ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基を含むか、または1〜3個の数のアミノ酸残基分だけ異なる。

「エフェクター機能」とは、抗体クラスによって異なる、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞障害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方調節;ならびにB細胞活性化が含まれる。

作用物質、例えば薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療的結果または予防的結果を実現するのに有効な量を意味する。

「Fc融合ポリペプチド」という用語は、結合ドメイン(例えば、単鎖抗体のような抗原結合ドメインまたは受容体のリガンドのようなポリペプチド)と所望の標的結合活性、プロテインA結合活性、およびFcRn結合活性を示す抗体Fc領域との融合物を意味する。

「ヒト起源のFc領域」という用語は、ヒンジ領域についての少なくとも1つの部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む、ヒト起源の免疫グロブリン重鎖のC末端領域を意味する。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端まで伸びる。1つの態様において、Fc領域は、SEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を有する。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在する場合もあれば存在しない場合もある。

本明細書において使用される、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に記載されており、本明細書において「Kabatに基づく番号付与」と呼ばれるKabat番号付与システムによって番号付与される。具体的には、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabatの番号付与システム(647〜660頁を参照されたい)が、κアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLのために使用され、Kabat EU指標番号付与システム(661〜723頁を参照されたい)が、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3)のために使用される。

「FcRn」という用語は、ヒト新生児型Fc受容体を意味する。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGを救助する機能を果たし、その結果、クリアランスを減らし、半減期を増大させる。FcRnは、2つのポリペプチド:50kDaのクラスI主要組織適合性複合体様タンパク質(α-FcRn)および15kDaのβ2-ミクログロブリン(β2m)からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、IgGのFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。IgGとFcRnの相互作用は、pHに厳密に依存しており、1:2の化学量論比で起こり、1つのIgGが、2つの重鎖を介して2つのFcRn分子に結合する(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083)。酸性pH(pH<6.5)ではFcRn結合がエンドソーム中で起こり、中性の細胞表面(pH約7.4)ではIgGは遊離する。相互作用のpH感受性の性質のおかげで、エンドソームの酸性環境内での受容体への結合によって、細胞中へ飲作用されるIgGを細胞内分解からFcRnを介して保護することが容易になる。次いで、FcRnは、FcRn-IgG複合体が細胞外の中性pH環境に曝露された際に、細胞表面にIgGを再循環させ、続いて血流中に放出するのを促進する。

「Fc領域のFcRn結合部分」という用語は、おおよそEU位置243位からEU位置261位、ならびにおおよそEU位置275位からEU位置293位、ならびにおおよそEU位置302位からEU位置319位、ならびにおおよそEU位置336位からEU位置348位、ならびにおおよそEU位置367位からEU位置393位およびEU位置408位、ならびにおおよそEU位置424位からEU位置440位まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。1つの態様において、KabatのEU番号付与に基づく次のアミノ酸残基のうちの1つまたは複数が改変される:

（EU番号付与）。

「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を意味する。一般に、可変ドメインのFRは、4つのFRドメイン、すなわちFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、一般に、HVR配列およびFR配列は、VH(またはVL)中に次の順序で現われる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

「完全長抗体」という用語は、4つのポリペプチドを含むネイティブ抗体の構造に実質的に同様の構造を有するか、または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する、抗体を意味する。完全長抗体は、例えば、完全長抗体の鎖のうちの1つまたは複数にコンジュゲートされたscFvまたはscFabなどのさらなるドメインを含んでよい。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語に包含される。

「二量体ポリペプチド」という用語は、共有結合で会合した少なくとも2つのポリペプチドを含む複合体を示す。複合体は、他のポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合したさらなるポリペプチドを含んでいてもよい。1つの態様において、二量体ポリペプチドは、2つまたは4つのポリペプチドを含む。

「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体の」という用語は、Kabat EU指標番号付与システムによって決定される対応する位置に少なくとも1つの異なるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する(例えば、同程度の長さの)2つのポリペプチドを含む分子を示す。

「ホモ二量体」または「ホモ二量体の」という用語は、Kabat EU指標番号付与システムによって決定される対応する位置に同一のアミノ酸配列を有する同程度の長さの2つのポリペプチドを含む分子を示す。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、注目している変異または特性に関して決定されたヘテロ二量体である。例えば、FcRnおよび/またはプロテインAとの結合(すなわち、注目された特性)に関して、二量体ポリペプチドは、変異H310A、H433A、およびY436A(これらの変異は、二量体ポリペプチドのFcRnおよび/またはプロテインAとの結合特性に関して注目されている)に関してホモ二量体である(すなわち、二量体ポリペプチドの両方のポリペプチドがこれらの変異を有する)が、同時に、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V(これらの変異は、二量体ポリペプチドのヘテロ二量体化に向けられており、FcRnおよび/またはプロテインAとの結合特性に向けられてはいないため、注目されていない)、ならびに変異S354CおよびT366Wに関してはそれぞれヘテロ二量体である(第1のセットは第1のポリペプチドにのみ含まれ、第2のセットは第2のポリペプチドにのみ含まれる)。さらに、例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、変異I253A、H310A、H433A、H435A、およびY436Aに関してヘテロ二量体であり得る(すなわち、これらの変異はすべて二量体ポリペプチドのFcRnおよび/またはプロテインAとの結合特性に向けられている)。すなわち、一方のポリペプチドが、変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、他方のポリペプチドが、変異H310A、H433A、およびY436Aを含む。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて意味する。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫が継代の回数に関わらず含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は、本明細書に含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を使用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的には除く。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVHのフレームワーク配列の選抜物(selection)において最も多く存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVL配列またはVH配列の選抜物は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。通常、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3に記載されているようなサブグループである。1つの態様において、VLについて、サブグループは、Kabat et al.、前記に記載されているようなサブグループκIである。1つの態様において、VHについて、サブグループは、Kabat et al.、前記に記載されているようなサブグループIIIである。

「に由来する」という用語は、あるアミノ酸配列が、少なくとも1つの位置に改変を導入することによって、親アミノ酸配列から誘導されたことを示す。したがって、誘導されたアミノ酸配列は、少なくとも1つの対応する位置(抗体Fc領域のためのKabat EU指標に基づく番号付与)において対応する親アミノ酸配列と異なる。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜15アミノ酸残基だけ異なる。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜10アミノ酸残基だけ異なる。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜6アミノ酸残基だけ異なる。同様に、誘導されたアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列との高いアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、80％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、90％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、95％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。

「ヒトFc領域ポリペプチド」という用語は、「ネイティブ」または「野生型」のヒトFc領域ポリペプチドと同一であるアミノ酸配列を意味する。「変種(ヒト)Fc領域ポリペプチド」という用語は、少なくとも1つの「アミノ酸改変」によって「ネイティブ」または「野生型」のヒトFc領域ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を意味する。「ヒトFc領域」は、2つのヒトFc領域ポリペプチドからなる。「変種(ヒト)Fc領域」は、2つのFc領域ポリペプチドからなり、両方が変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドであってもよいか、または、一方がヒトFc領域ポリペプチドでありかつ他方が変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドである。

1つの態様において、ヒトFc領域ポリペプチドは、本明細書において報告される変異を有する、SEQ ID NO: 03のヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、またはSEQ ID NO: 04のヒトIgG2 Fc領域ポリペプチド、またはSEQ ID NO: 06のヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。1つの態様において、変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO: 03、または04、または06のFc領域ポリペプチドに由来し、SEQ ID NO: 03、または04、または06のFc領域ポリペプチドと比べて少なくとも1つのアミノ酸変異を有している。1つの態様において、変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、約1〜約10個のアミノ酸変異を、1つの態様において、約1〜約5個のアミノ酸変異を含む/有する。1つの態様において、変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO: 03、または04、または06のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約80%の相同性を有している。1つの態様において、変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO: 03、または04、または06のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約90%の相同性を有している。1つの態様において、変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO: 03、または04、または06のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約95%の相同性を有している。

SEQ ID NO: 03、または04、または06のヒトFc領域ポリペプチドに由来する変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドは、含まれているアミノ酸改変に基づいて定義される。したがって、例えば、P329Gという用語は、SEQ ID NO: 03、または04、または06のヒトFc領域ポリペプチドを基準として、アミノ酸位置329がプロリンからグリシンに変異した、ヒトFc領域ポリペプチドに由来する変種(ヒト)Fc領域ポリペプチドを意味する。

ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

。

変異L234A、L235Aを有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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Y349C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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L234A変異、L235A変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

。

L234A変異、L235A変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

。

P329G変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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L234A変異、L235A変異、およびP329G変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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P239G変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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P329G変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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L234A変異、L235A変異、P329G変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

。

L234A変異、L235A変異、P329G変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異およびL235E変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異、L235E変異、およびP329G変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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Y349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異、L235E変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異、L235E変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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P329G変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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P239G変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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P329G変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異、L235E変異、P329G変異、およびY349C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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S228P変異、L235E変異、P329G変異、およびS354C変異、T366W変異を有する、ヒトIgG4 Fc領域に由来するFc領域ポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する:

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「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基およびヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域についての少なくとも1つの部分を任意で含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。

本明細書において使用される「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変性であり(「相補性決定領域」もしくは「CDR」)、かつ特徴的な構造の(structurally defined)ループ(「超可変ループ」)を形成し、かつ/または抗原接触残基(「抗原接触部分(contact)」)を含む、抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般に、抗体は6個のHVRを含む。3個はVH中にあり(H1、H2、H3)、3個はVL中にある(L1、L2、L3)。本明細書において示すHVRは、
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b (H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に存在する抗原接触部分(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ
を含む。

別段の定めが無い限り、本明細書において、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えばFR残基)は、Kabat EU指標番号付与システム(Kabat et al.、前記)に従って番号を付与する。

「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、飼い慣らされた動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、ならびにげっ歯動物(例えば、マウスおよびラット)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、個体または対象はヒトである。

「単離された」抗体とは、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換HPLCまたは逆相HPLC)によって測定した場合に95％または99％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価するための方法に関する概要については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変種抗体を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物を作製する間に発生するこのような変種は通常、少量で存在する。様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書において説明される。

「ネイティブ抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖から構成される、約150,000Daのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)とそれに続く3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)とそれに続く軽鎖定常(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。

「添付文書」という用語は、治療的製品の市販用パッケージに習慣的に含まれる、そのような治療的製品の使用に関する適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、および/または警告についての情報を含む取扱い説明書を意味するのに使用される。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント(％)」とは、配列を整列させ、かつ必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部分とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法において、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなど公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長に渡って最大限のアライメントを実現するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のためには、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を用いて、アミノ酸配列同一性％の値を得る。配列比較コンピュータープログラムALIGN-2は、Genentech, Inc.の著作物であり、ソースコードはユーザー向け文書と共にU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に提出され、米国著作権登録番号(U.S. Copyright Registration No.)TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティング・システムにおける使用向けにコンパイルされるべきである。配列比較パラメーターはすべて、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。

ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために使用される状況において、所与のアミノ酸配列Bに対する、該配列Bとの、または該配列Bと比較しての所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性％(あるいは、所与のアミノ酸配列Bに対する、該配列Bとの、または該配列Bと比較してのある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Aと表現することもできる)は、次のとおりに算出される。
100×X/Y比
式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムによるAおよびBのアラインメントにおいて同一のマッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さに等しくない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性％は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性％と等しくならないが認識されると考えられる。別段の記載が特に無い限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列同一性％の値はすべて、すぐ前の節で説明したとおりに、ALIGN-2コンピュータープログラムを用いて得られる。

「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態で存在し、かつその製剤が投与され得る対象に対して許容されないほど毒性である追加成分を含まない、調製物を意味する。

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、薬学的製剤中の有効成分以外の成分を意味する。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において使用される「ペプチドリンカー」という用語は、1つの態様において合成起源であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。ペプチドリンカーは、1つの態様において、少なくとも30個のアミノ酸長、1つの態様において、32〜50個のアミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。1つの態様において、ペプチドリンカーは、32〜40個のアミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。1つの態様において、ペプチドリンカーは、G=グリシン、S=セリン、(x=3、n=8、9、もしくは10)または(x=4およびn=6、7、もしくは8)の(GxS)nであり、1つの態様において、x=4、n=6または7であり、1つの態様において、x=4、n=7である。1つの態様において、ペプチドリンカーは(G₄S)₆G₂である。

本明細書において使用される「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるあらゆる抗体(キメラ、ヒト化、およびヒト)を意味する。これは、NS0細胞もしくはCHO細胞などの宿主細胞からもしくはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物(例えばマウス)から単離された抗体、または宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体を含む。このような組換え抗体は、可変領域および定常領域を再配列された形態で有する。組換え抗体は、インビボの体細胞超変異に供されてよい。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来しかつ関連してはいるものの、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。

本明細書において使用される場合、「治療(treatment)」(およびその文法的変形、例えば「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」)は、治療される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を意味し、予防のために、または臨床的病状の過程中に、実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明において報告される抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、疾患の発症を遅らせるため、または疾患の進行を遅くするために使用される。

本出願内で使用される「価」という用語は、(抗体)分子中に特定の数の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、(抗体)分子中に2個の結合部位、4個の結合部位、および6個の結合部位が存在することをそれぞれ意味する。本明細書において報告される二重特異性抗体は、1つの好ましい態様において「二価」である。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体がその抗原に結合するのに関与している抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを意味する。一般に、抗体の重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の可変ドメインは、4つのフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を各ドメインが含む、類似した構造を有する。(例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい)。1つのVHドメインまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして、単離することができる（例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい）。

「眼血管疾患」という用語は、眼内血管新生症候群、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、色素性網膜炎、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症(telangectasia)、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および網膜変性症を含むが、それらに限定されるわけではない(例えば、Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710を参照されたい)。

本明細書において使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

本明細書において使用される「変異IHH-AAAを有する」という用語は、変異I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)、およびH435A(His435Ala)の組合せを意味し、本明細書において使用される「変異HHY-AAAを有する」という用語は、変異H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)、およびY436A(Tyr436Ala)の組合せを意味し、本明細書において使用される「変異YTEを有する」という用語は、変異M252Y(Met252Tyr)、S254T(Ser254Thr)、およびT256E(Thr256Glu)の組合せを意味し、これらはIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの重鎖定常領域に存在し、番号付与はKabat EU指標番号付与システムに基づいている。

本明細書において使用される「変異P329G LALAを有する」という用語は、IgG1サブクラスの定常重鎖領域における変異L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)、およびP329G(Pro329Gly)の組み合わせを指し、番号付与はKabat EU指標番号付与システムに基づく。本明細書において使用される「変異SPLEを有する」という用語は、IgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異S228P(Ser228Pro)およびL235E(Leu235Glu)の組み合わせを指し、番号付与はKabat EU指標番号付与システムに基づく。本明細書において使用される「変異SPLEおよびP329Gを有する」という用語は、IgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異S228P(Ser228Pro)、L235E(Leu235Glu)、およびP329G(Pro329Gly)の組み合わせを指し、番号付与はKabat EU指標番号付与システムに基づく。

II.組成物および方法
1つの局面において、本発明は、ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合し、ヒトFcRnに結合するかまたは結合しない変種Fc領域が、ヘテロ二量体Fc領域のホール鎖において使用された場合、ヘテロ二量体Fc領域の精製を可能にするという所見に一部分基づく。これらの変種Fc領域はCH2ドメインに特定のアミノ酸変異を含有しているが、CH3ドメインはプロテインA結合に関して変化していない。これらの変異は、ヘテロ二量体Fc領域のホール鎖において使用された場合、ヘテロ二量体Fc領域の精製、すなわち、ホモ二量体Fc領域副産物(ホール鎖-ホール鎖二量体)からのヘテロ二量体Fc領域の分離を可能にすることが見出された。

これは第1のポリペプチド(ホール鎖)において以下の変異の組み合わせを使用することによって達成され得ることが見出された:
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D。

以下の表は、相互作用に関与しているかまたは相互作用を修飾するために変化させたFc領域内のアミノ酸残基の例示的な概要を提示する。

本明細書において報告される修飾は、ブドウ球菌プロテインAとの結合を改変する。変異させられた残基は、すべて、CH2ドメイン中に位置する。CH3ドメイン中の残基もプロテインAと相互作用するが、CH2ドメイン中の残基の変異は、プロテインA結合に影響を及ぼすのに十分である。したがって、本明細書において報告されたヘテロ二量体分子および抗体において、両方のCH3ドメインが、プロテインAに関して同じ(同一の)結合特性/特徴を有する。したがって、本明細書において報告されるヘテロ二量体分子は、CH2ドメインにおいてはプロテインA結合に関してヘテロ二量体であるが、CH3ドメインにおいてはプロテインA結合に関してホモ二量体である。

1つの態様において、本明細書において報告される変異の組み合わせは、この変異の組み合わせを欠く対応するヘテロ二量体ポリペプチドと比較して、ヘテロ二量体ポリペプチドの血清半減期を改変するかまたは実質的に改変する。

1つの態様において、変異の組み合わせは、この変異の組み合わせを欠く対応するヘテロ二量体ポリペプチドと比較して、ヘテロ二量体ポリペプチドの血清半減期をさらに改変しないかまたは実質的に改変しない。

A.新生児型Fc受容体(FcRn)
新生児型Fc受容体(FcRn)は、IgGクラスの抗体のインビボでの代謝運命にとって重要である。FcRnは、リソソーム分解経路から野生型IgGを救助する機能を果たし、その結果、クリアランスを減らし、半減期を長くする。これは、2つのポリペプチド:50kDaのクラスI主要組織適合性複合体様タンパク質(α-FcRn)および15kDaのβ2-ミクログロブリン(β2m)からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体のFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。IgGクラスの抗体とFcRnとの相互作用は、pHに依存しており、1:2の化学量論比で起こる。すなわち、1つのIgG抗体分子が、その2つの重鎖Fc領域ポリペプチドを介して、2つのFcRn分子と相互作用することができる(例えば、Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照されたい)。

したがって、IgGのインビトロでのFcRn結合特性/特徴は、血液循環におけるインビボでのその薬物動態学的特性を示唆している。

FcRnとIgGクラスの抗体のFc領域との相互作用には、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインの異なるアミノ酸残基が関与している。FcRnと相互作用するアミノ酸残基は、おおよそEU位置243〜EU位置261の間、おおよそEU位置275〜EU位置293の間、おおよそEU位置302〜EU位置319の間、おおよそEU位置336〜EU位置348の間、おおよそEU位置367〜EU位置393の間、EU位置408、およびおおよそEU位置424〜EU位置440の間に位置している。より具体的には、KabatのEU番号付与に基づく次のアミノ酸残基が、Fc領域とFcRnの相互作用に関与している:F243、P244、P245 P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439、およびS440。

部位特異的変異誘発研究により、FcRnに対するIgGのFc領域中の不可欠な結合部位は、ヒスチジン310、ヒスチジン435、およびイソロイシン253、ならびに程度は落ちるが、ヒスチジン433およびチロシン436であることが判明した(例えば、Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-14657; Medesan, C., et al., J Immunol. 158 (1997) 2211-2217を参照されたい)。

FcRnへのIgG結合を増大させるための方法は、IgGの様々なアミノ酸残基:トレオニン250、メチオニン252、セリン254、トレオニン256、トレオニン307、グルタミン酸380、メチオニン428、ヒスチジン433、およびアスパラギン434を変異させることによって実施されてきた(Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789を参照されたい)。

一部の場合において、血液循環における半減期が短縮された抗体が望まれる。例えば、硝子体内に適用するための薬物は、眼において長い半減期を有し、患者の血液循環において短い半減期を有するべきである。このような抗体はまた、例えば眼の中の疾患部位への曝露が増大するという利点を有している。

FcRn結合およびそれに加えて血液循環における半減期に影響を及ぼす異なる変異は公知である。マウスFc領域とマウスFcRnの相互作用に決定的に重要なFc領域残基は、部位特異的変異誘発によって同定されている(例えば、Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照されたい)。残基I253、H310、H433、N434、およびH435(Kabatに基づくEU番号付与)が、相互作用に関与している(Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。残基I253、H310、およびH435が、ヒト FcとマウスFcRnの相互作用に決定的に重要であることが判明した(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2855)。タンパク質間の相互作用研究によってFcRn結合を改良するために、残基M252Y、S254T、T256EがDall'Acquaらによって説明されている(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。ヒトFc-ヒトFcRn複合体の研究により、残基I253、S254、H435、およびY436が相互作用に決定的に重要であることが示された(Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)において、残基248〜259位および301〜317位および376〜382位および424〜437位の様々な変異体が報告され検査されている。例示的な変異およびFcRn結合に対するそれらの影響を下記の表に挙げる。

（表）

FcRn結合に影響を及ぼすためのIgG1 Fc領域の対称的操作の結果を、下記の表に示す(変異のアライメント)およびFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムにおける保持時間)。

（表）

3分未満の保持時間は、その物質が通過画分中に存在するため、結合なしに相当する(ボイドピーク)。

単一変異H310Aは任意のFcRn結合をなくすための最もサイレントな対称的変異である。

対称的単一変異I253AおよびH435Aは、保持時間の0.3〜0.4分の相対的変化をもたらす。通常、これは、検出不可能な結合とみなすことができる。

単一変異Y436Aは、FcRnアフィニティーカラムに対する検出可能な相互作用強度をもたらす。この理論に拘泥するものではないが、この変異は、I253A変異、H310A変異、およびH435A変異の組合せ(IHH-AAA変異)のような相互作用の無い状態と区別できる、FcRnを媒介としたインビボ半減期に対する影響を有し得る。

対称的に修飾した抗HER2抗体を用いて得られた結果を、下記の表に提示する(例えば、参照のためのWO 2006/031370を参照されたい)。

（表）

B.眼血管疾患
眼血管疾患は、新しい血管の改変されたまたは制御されない増殖、および網膜または角膜のような眼組織の構造への浸潤を特徴とする病理学的状態である。

1つの態様において、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性症(滲出型AMD)、萎縮型加齢黄斑変性症(萎縮型AMD)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、嚢胞性黄斑浮腫(CME)、非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞性黄斑浮腫、血管炎(例えば、網膜中心静脈閉塞)、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、葡萄膜炎、脈絡膜炎、多発性脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ(シェーグレン病)、およびその他の眼科疾患からなる群より選択され、眼の疾患または障害は、眼血管新生、血管漏出、および/または網膜浮腫に関連している。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む抗体は、滲出型AMD、萎縮型AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼瞼炎、ドライアイ、および葡萄膜炎、1つの好ましい態様において、滲出型AMD、萎縮型AMD、眼瞼炎、およびドライアイ、1つの好ましい態様において、CME、DME、NPDR、およびPDR、1つの好ましい態様において、眼瞼炎およびドライアイ、特に、滲出型AMDおよび萎縮型AMD、特に、滲出型AMDの防止および処置において有用である。

いくつかの態様において、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性症(滲出型AMD)、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、および糖尿病性網膜症からなる群より選択される。

角膜血管新生に関連したその他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、コンタクトレンズ過剰装用、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原生動物感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺変性、周辺角質溶解、慢性関節リウマチ、全身性ループス、多発動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンズ・ジョンソン病、類天疱瘡、放射状角膜切開、および角膜移植片拒絶が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

網膜/脈絡膜血管新生に関連した疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎/硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫(黄斑浮腫を含む)、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭小窩、シュタルガルト病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後合併症が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

他の疾患には、ルベオーシス(隅角の血管新生)に関連した疾患、および増殖性硝子体網膜症のすべての型を含む、血管結合組織または線維組織の異常増殖によって引き起こされた疾患が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

未熟児網膜症(ROP)は未熟児に影響する眼の疾患である。それは、瘢痕および網膜剥離をもたらす網膜血管の無秩序な成長によって引き起こされると考えられている。ROPは、軽症であり得、自然に消散する場合もあるが、重篤な症例においては失明に至ることもある。そのため、すべての未熟児がROPのリスクを有しており、極低出生体重は、追加のリスクファクターである。酸素毒性および相対低酸素の両方が、ROPの発症に寄与し得る。

黄斑変性症は、網膜の黄斑部として公知の眼の内側の裏打ちの中心が、薄くなり、委縮し、いくつかの症例においては、出血する、高齢の成人において主に見出される医学的状態である。これは、中心視の喪失をもたらすことができ、それは、細かい細部を見る能力、読む能力、または顔を認識する能力の喪失を伴う。American Academy of Ophthalmologyによると、それは、今日、米国において、50歳を超える者についての中心視喪失(盲目)の主要な原因である。より若い個体に影響するいくつかの黄斑ジストロフィーは、時に黄斑変性症と呼ばれるが、この用語は、一般に、加齢黄斑変性症(AMDまたはARMD)を指す。

加齢黄斑変性症は、黄斑(中心窩と呼ばれる詳細な中心視を提供する網膜の中央部)における網膜色素上皮とその下にある脈絡膜との間のドルーゼンと呼ばれる特徴的な黄色沈着物から開始する。(加齢黄斑症と呼ばれる)これらの初期変化を有する大部分の人々は良好な視覚を有する。ドルーゼンを有する人々は、続いて進行AMDを発症する場合がある。ドルーゼンが大きく、多数であり、黄斑下の色素細胞層の妨害に関連している場合、リスクは相当に高くなる。大きく柔らかいドルーゼンは、コレステロール沈着上昇に関連しており、コレステロール低下剤またはレオ手技(Rheo Procedure)に応答する場合がある。

重度の失明の原因となる進行AMDは2つの型:萎縮型および滲出型を有する。中心の地図状委縮、萎縮型の進行AMDは、眼の中央部における光受容体(桿体および錐体)の喪失を通して失明を引き起こす、網膜下の網膜色素上皮層への委縮に起因する。この状態のために利用可能な処置は存在しないが、高用量の抗酸化剤、ルテイン、およびゼアキサンチンを含むビタミンサプリメントが、萎縮型黄斑変性症の進行を遅くし、一部の患者においては、視力を改善することが、National Eye Instituteおよびその他によって証明されている。

色素性網膜炎(RP)は、遺伝性の眼状態の群である。RPの症状の進行においては、一般に、夜盲症が、数年またはさらには数十年、トンネル状視野に先行する。RPを有する多くの人々が、40代または50代までは法的盲にならず、一生、ある程度の視界を保持する。RPから全盲となる者もおり、いくつかの症例においては、早くも小児期にそれが起こる。RPの進行は、各症例において異なる。RPは、網膜の光受容体(桿体および錐体)または網膜色素上皮(RPE)の異常が進行性の失明に至る遺伝性障害の群、遺伝性網膜ジストロフィーの1種である。影響された個体は、まず、暗順応の欠陥または夜盲(夜盲症)を経験し、続いて、(トンネル状視野として公知の)末梢視野の低下、時には、疾患の経過の後期に中心視の喪失を経験する。

黄斑浮腫は、網膜の黄色の中心部である眼の黄斑の上下に液体およびタンパク質の沈着物が蓄積し、肥厚および腫脹が引き起こされた場合に起こる。黄斑は、眼球の後ろの網膜の中心に近いため、腫脹は中心視を歪めることがある。この部分は、人間が直接視線内にある形、色、および詳細を見ることを可能にするため、鮮明な明瞭な中心視を提供する密に充填された錐体を保持している。嚢胞性黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の1種である。

C.本発明
一方のFc領域ポリペプチドにおける片側の1つの変異が、結合に有意に影響を及ぼすのに十分であることが見出された。Fc領域へ導入される変異が多くなるほど、ブドウ球菌プロテインAおよび/またはFcRnとの結合がより多く変化する、すなわち、弱くなるかまたは強化される。

ノブイントゥーホール(KiH)二重特異性抗体の作製において発生するホール-ホール誤対合副産物をCH2ドメイン設計によって枯渇させる方法が、本明細書において報告される。

CH2ドメイン中のアミノ酸位置L251、I253、H310、L314は、プロテインAおよびヒト新生児型Fc受容体(FcRn)と相互作用する。

KiH二重特異性抗体のいわゆるホール鎖のこれらの位置のうちの1つまたは複数に、A、G、またはDへのアミノ酸交換を導入することによって、プロテインAおよびFcRnとの結合特性を静めることができる。

1つの好ましい態様において、CH2ドメインは、変異(i)I253AまたはI253Gおよび(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dを含む。

この設計によって、ホール-ホール誤対合副産物は、もはやプロテインAおよびFcRnに結合することができない(両方の重鎖によって可能な相互作用がない)。したがって、ホール-ホール誤対合副産物は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムおよび/またはFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合しないであろう。したがって、ホール-ホール誤対合副産物は、少なくとも、初期に、すなわち、分離された離れたピークにおいて溶出するか、またはプロテインAアフィニティーカラムもしくはFcRnアフィニティーカラムに全く結合せず、素通り画分に見出されるであろう。

損なわれたFcRn結合特性を補償するため、単独で、または1つ、2つ、もしくは3つを組み合わせて、T250Qおよび/またはT256Eおよび/またはT307H変異をホール側に導入することによって、周囲のアミノ酸を改善することができる。

FcRn結合操作についての概要は、以下の表において提供される。

本明細書において報告される1つの局面は、
N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチドと、N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドであり、
第1のポリペプチドは、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み(ホール鎖)、かつ第2のポリペプチドは、変異S354CおよびT366Wを含み(ノブ鎖)、
かつ、
第1のポリペプチド(ホール鎖)は、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D
を含み、
かつ、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび第2のポリペプチドのCH3ドメインは、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)。

1つの態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは完全長抗体である。1つの態様において。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチド(変種ヒトIgGクラスFc領域)を含む抗体である。

本明細書において報告されるFc領域(ヘテロ二量体ポリペプチド)は、完全長抗体に含有される場合、前記の特徴を分子に付与する。

抗体、例えば、完全長抗体またはCrossMabは、本明細書において報告される変種(ヒト)ヒトIgGクラスFc領域を含むことができる。

ヘテロ二量体ポリペプチドは、変異のため、一方の鎖(ホール鎖)においては、ブドウ球菌プロテインAに結合しない特性を有し、他方の鎖(ノブ鎖)においては、ブドウ球菌プロテインAに結合する特性を有する。

したがって、これらの抗体は、MabSelectSureのような従来のプロテインAアフィニティー材料を使用することによって、不要のホール鎖二量体副産物から精製、すなわち、分離され得る。例えば、κサブクラスの軽鎖を含む抗体でのみ使用可能であるKappaSelectのような、高度に精巧であるが種限定的なアフィニティー材料を使用することは、必要とされない。さらに、軽鎖サブクラスの修飾/交換がなされた場合に、精製法を採用することは、必要とされない。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを作製する方法である:
(a)本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)培養培地からヘテロ二量体ポリペプチドを回収する段階、および
(c)プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってヘテロ二量体ポリペプチドを精製し、それによって、二量体ポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための変異(i)I253AまたはI253Gおよび(ii)L314AまたはL314GまたはL314Dの組み合わせの使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、示差的に修飾された免疫グロブリン重鎖Fc領域を含む、単離/精製の容易さを提供する二重特異性抗体であり、修飾のうちの少なくとも1つは、(i)プロテインAに対する二重特異性抗体の示差的な親和性をもたらし、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、プロテインAに対する親和性に基づき、破壊された細胞から、培地から、または抗体の混合物から単離可能である。

1つの態様において、二重特異性抗体は、pH4.0超のpH値で溶出する。

1つの態様において、二重特異性抗体は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、および塩の添加を含むpH勾配またはpHステップを使用して単離される。具体的な態様において、塩は、約0.5モル濃度〜約1モル濃度の濃度で存在する。1つの態様において、塩は、酢酸のリチウム塩、ナトリウム塩、およびカリウム塩;重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム;炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、および炭酸カリウム;塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化マグネシウム;フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウム;硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、および硝酸カルシウム;リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム;ならびに硫酸カルシウムおよび硫酸マグネシウムからなる群より選択される。1つの態様において、塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のハロゲン化物塩である。1つの好ましい態様において、塩は、塩化ナトリウムである。

1つの局面において、二量体ポリペプチドは、ヘテロ二量体ポリペプチドを形成するため、本明細書において報告されるように修飾された第1のポリペプチドと、プロテインAまたはFcRnとの結合に関して修飾されていない第2のポリペプチドとを含み、示差的な修飾は、示差的な修飾を欠く対応する二量体ポリペプチドより0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、または1.4pH単位だけ高いpHでのプロテインAアフィニティー材料からの二量体ポリペプチドの溶出をもたらす。1つの態様において、示差的に修飾された二量体ポリペプチドは、4またはそれ以上のpHで溶出し、未修飾の二量体ポリペプチドは、3.5またはそれ以下のpHで溶出する。1つの態様において、示差的に修飾された二量体ポリペプチドは、約4のpHで溶出し、未修飾の二量体ポリペプチドは約2.8〜3.5、2.8〜3.2、または2.8〜3のpHで溶出する。これらの態様において、「未修飾」とは、ポリペプチドの両方における修飾(i)I253AおよびI253Gならびに(ii)L314AおよびL314GおよびL314Dの欠如を指す(Kabat EU指標番号付与システム)。

クロマトグラフィーの実行のため、0.5モル濃度〜1モル濃度の塩(例えば、NaCl)の添加は、特に、ヒトIgG1サブクラスに由来する場合、ホモ二量体ポリペプチドとヘテロ二量体ポリペプチドとの分離を改善することができる。pH値を増加させる溶出溶液への塩の添加は、溶出のためのpH範囲を広げることができるため、例えば、pHステップ勾配が2つの種を成功裡に分離し得るようになる。

したがって、1つの態様において、一方の鎖が本明細書において報告される変異を含むヘテロ二量体IgG Fc領域を含む二重特異性抗体を分離する方法は、塩の存在下でpH勾配を用いる段階を含む。1つの態様において、塩は、IgG Fc領域ホモ二量体とIgG Fc領域ヘテロ二量体との間のプロテインAクロマトグラフィー材料からの溶出のpH差を最大限にするのに十分な濃度で存在する。1つの態様において、塩は、約0.5モル濃度〜約1モル濃度の濃度で存在する。1つの態様において、塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属とハロゲンとの塩である。1つの態様において、塩は、例えば、NaCl、KCl、LiCl、CaCl₂、またはMgCl₂のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩化物塩である。1つの態様において、pH勾配は約pH 4から約pH 5までである。1つの態様において、勾配は直線勾配である。1つの態様において、pH勾配はステップ勾配である。1つの態様において、方法は、平衡化されたプロテインAアフィニティーカラムに、約pH 4の溶液を適用する段階を含む。1つの態様において、本明細書において報告される修飾に関してヘテロ二量体IgG Fc領域を含む二重特異性抗体は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料から、非ヘテロ二量体二重特異性抗体を実質的に含まない1つまたは複数の画分において溶出する。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、組換え手段によって作製される。したがって、本発明の1つの局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸であり、さらなる局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。

組換え作製のための方法は、当技術分野において広く公知であり、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現、その後のヘテロ二量体ポリペプチドの単離を含み、一般的には、薬学的に許容される純度への精製も含む。宿主細胞における前記のヘテロ二量体ポリペプチドの発現のため、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをそれぞれコードする核酸が、標準的な方法によって発現ベクターへ挿入される。発現が、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌（E.coli）細胞のような適切な原核生物または真核生物の宿主細胞において実施され、ヘテロ二量体ポリペプチドが、細胞(培養上清または溶解後の細胞)から回収される。

抗体の組換え作製のための一般法は、当技術分野において周知であり、例えば、Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880の概説論文に記載されている。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの作製のための方法である:
(a)本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸分子を含む1つまたは複数のベクターによって宿主細胞を形質転換する段階、
(b)ヘテロ二量体ポリペプチドを発現させるため、宿主細胞を培養する段階、および
(c)培養物からヘテロ二量体ポリペプチドを回収し、それによって、ヘテロ二量体ポリペプチドを作製する段階。

1つの態様において、(c)の回収段階は、免疫グロブリンFc領域に特異的なキャプチャー試薬の使用を含む。1つの態様において、このFc領域に特異的なキャプチャー試薬は、結合および溶出モードで使用される。そのようなFc領域に特異的なキャプチャー試薬の例は、例えば、大きい規模で、高い流速および低い背圧を可能にする高度に頑強なアガロースベースマトリックスに基づく、ブドウ球菌プロテインAに基づくアフィニティークロマトグラフィーカラムである。それらは、ヘテロ二量体ポリペプチド、すなわち、そのFc領域に結合するリガンドを特色とする。リガンドは、標的分子との結合に容易に利用可能であるよう、長い親水性スペーサーアームを介してマトリックスに付着させられる。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、例えば、プロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手法によって、培養培地から適切に分離される。

モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは、従来の手法を使用して容易に単離され配列決定される。単離されると、DNAは、発現ベクターへ挿入され得、次いで、それが、宿主細胞における組換えモノクローナルヘテロ二量体ポリペプチドの合成を入手するため、そうでなければヘテロ二量体ポリペプチドを産生しないHEK 293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトされる。

抗体の精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他のものを含む標準的な技術によって、細胞構成要素またはその他の混入物質、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質を排除するために実施される(Ausubel,F.,et al.,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)を参照されたい)。微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)、および混合型交換)、(例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドによる)チオフィリック(thiophilic)吸着、(例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック(aza-arenophilic)樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸による)疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは芳香族吸着クロマトグラフィー、(例えば、Ni(II)アフィニティー材料およびCu(II)アフィニティー材料による)金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに(ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動のような)電気泳動法(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)のような種々の方法が十分に確立され、タンパク質精製のために広範に使用されている。

本発明の1つの局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む薬学的製剤である。本発明の別の局面は、薬学的製剤の製造のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。本発明のさらなる局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む薬学的製剤の製造のための方法である。別の局面において、本発明は、薬学的担体と共に製剤化された、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含有している製剤、例えば、薬学的製剤を提供する。

本明細書において報告される製剤は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なる。ある種の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物の不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングすること、または化合物の不活性化を防止するための材料と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。例えば、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤中に入れて、化合物を対象に投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射液剤または分散剤を用時調製するための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体および作用物質を使用することは、当技術分野において公知である。

限定されるわけではないが、眼内適用または局所適用を含む、多くの実施可能な送達様式を使用することができる。1つの態様において、適用は眼内であり、結膜下注射、前房内(intracanieral)注射、耳側輪部(termporai limbus)を介した前房中への注射、基質内注射、角膜内注射、網膜下注射、眼房水注射、テノン嚢下(subtenon)注射、または持続的送達器具、硝子体内注射(例えば、前部硝子体注射、中央部硝子体注射、または後部硝子体注射)を含むが、それらに限定されるわけではない。1つの態様において、適用は局所的であり、角膜への点眼剤を含むが、それに限定されるわけではない。

1つの態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは本明細書において報告される薬学的製剤は、硝子体内適用によって、例えば、硝子体内注射によって投与される。これは、当技術分野において公知の標準手順に従って実施することができる。例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; およびWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照されたい。

いくつかの態様において、本発明の治療用キットは、本明細書において説明する薬学的製剤中に存在する本発明において報告されるヘテロ二量体ポリペプチド1回量または複数回量の(二重特異性)抗体、薬学的製剤の硝子体内注射のための適切な器具、ならびに注射を実施するための適切な対象およびプロトコールを詳述している取扱い説明書を含み得る。これらの態様において、典型的には、製剤は、硝子体内注射による治療を必要とする対象に投与される。これは、当技術分野において公知の標準手順に従って実施することができる(例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; およびWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照されたい)。

製剤はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤も含んでよい。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などを含めることの両方によって徹底することができる。また、糖および塩化ナトリウムなどの等張化剤を製剤中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な薬剤形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質を含めることによって実現することができる。

選択された投与経路に関わらず、適切な水和型で使用され得る本明細書において報告される化合物、および/または本明細書において報告される薬学的組成物は、当業者に公知である従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。

本明細書において報告される薬学的製剤中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、個々の患者、組成物、および投与様式にとって望ましい治療応答を達成するのに有効である量の活性成分を得られるように、変更することができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排出速度、治療の継続期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野で周知である同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。

製剤は、無菌でなければならず、注射器によって製剤を送達できる程度に流動性でなければならない。水のほかには、1つの好ましい態様における担体は、好ましくは、等張性の緩衝生理食塩水である。

適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散系の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。

製剤は、結膜下投与のための活性物質を含む眼用デポー製剤を含むことができる。眼用デポー製剤は、本質的に純粋な活性物質、例えば本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの微粒子を含む。本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容されるポリマーまたは脂質カプセル化物質中に埋め込むことができる。デポー製剤は、長期間に渡って、実質的にすべての活性材料を残さず放出するように適合させることができる。ポリマーまたは脂質マトリックスが存在する場合、すべてまたは実質的にすべての活性物質を放出した後、投与部位から輸送されるのに十分な程度に分解するようにそれらを適合させることができる。デポー製剤は、薬学的に許容されるポリマーおよび溶解または分散された活性物質を含む液体製剤であることができる。注射すると、ポリマーは、例えば、ゲル化(gelifying)または沈殿することによって、注射部位にデポーを形成する。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本発明の1つの態様は、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置において使用するための薬学的製剤である。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの使用である。

本発明の別の局面は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを、そのような処置を必要とする患者に投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置の方法である。

本明細書において使用される「含む(comprising)」という用語は、「からなる(consisting of)」という用語を含むことを、ここにはっきりと言明する。したがって、「含む(comprising)」という用語を含む局面および態様はすべて、「からなる(consisting of)」という用語を用いて同様に開示される。

D.修飾
さらなる局面において、上記の態様のいずれかによるヘテロ二量体ポリペプチドは、下記のセクション1〜6において説明する特徴のうちのいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み入れてよい。

1.抗体親和性
1つの態様において、Kdは、BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて測定される。例えば、BIACORE(登録商標)2000またはBIACORE(登録商標)3000(GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を用いたアッセイ法を、約10レスポンスユニット(RU)の固定化結合パートナーCM5チップを用いて25℃で実施する。1つの態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、GE Healthcare Inc.)を、供給業者の取扱い説明書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。結合パートナーを10mM酢酸ナトリウム、pH4.8で5μg/mL(約0.2μM)に希釈した後、結合タンパク質のレスポンスユニット(RU)が約10に達するように流速5μl/分で注入する。結合パートナーの注入後、反応しなかった基をブロックするために1Mエタノールアミンを注入する。動態測定のために、25℃、流速約25μL/分で、融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドまたは抗体の2倍段階希釈物(0.78nM〜500nM)を0.05％ポリソルベート20(TWEEN-20(商標))界面活性剤含有PBS(PBST)に注入する。結合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2)を用いて、結合速度(k_on)および解離速度(k_off)を算出する。平衡解離定数(Kd)は、k_off/k_on比として算出する(例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照されたい)。上記の表面プラズモン共鳴アッセイ法による結合速度が10⁶M^-1 s^-1を上回る場合、ストップフローを備えた分光光度計(Aviv Instruments)または撹拌キュベットを用いる8000シリーズSLM-AMINCO(商標)分光光度計(ThermoSpectronic)などの分光計で測定されるように、漸増濃度の抗原の存在下にてpH7.2のPBS中20nM抗抗原抗体(Fab型)の25℃での蛍光発光強度(励起=295nm;発光=340nm、帯域16nm)の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって、結合速度を測定することができる。

2.キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、キメラ抗体中に含まれる。いくつかのキメラ抗体が、例えば、US4,816,567;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。

特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。通常、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR(またはその一部分)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部分)がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域についての少なくとも1つの部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるか、または向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)に由来する対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、例えば、Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US5,821,337、US7,527,791、US6,982,321、およびUS7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34(特異性決定領域(SDR)グラフティングを説明); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498(「リサーフェシング」を説明); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60(「FRシャッフリング」を説明); Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; およびKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260(FRシャッフリングに取り組む「導かれた選択」アプローチを説明)においてさらに説明されている。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法(例えば、Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照されたい)を用いて選択されたフレームワーク領域;特定のサブグループの軽鎖可変領域または重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびPresta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照されたい);ヒト成熟(体細胞性に変異した)フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい);およびFRライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域(例えば、Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684およびRosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

3.ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ヒト抗体由来である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において一般的に説明されている。

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してヒトインタクト抗体またはヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。典型的には、このような動物は、内在性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいて、通常、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSE(商標)技術を説明するUS6,075,181およびUS6,150,584;HUMAB(登録商標)技術を説明するUS5,770,429;K-M MOUSE(登録商標)技術を説明するUS7,041,870、ならびにVELOCIMOUSE(登録商標)技術を説明するUS2007/0061900も参照されたい。このような動物によって産生されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによって、さらに修飾することができる。

ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株は説明されている(例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63;およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照されたい)。また、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製したヒト抗体が、Li, J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562において説明されている。その他の方法には、例えば、US7,189,826(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の作製を説明)およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268(ヒト-ヒトハイブリドーマを説明)において説明されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191においても説明されている。

ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと結合させてよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。

4.ライブラリー由来の抗体
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、ライブラリー由来の抗体中に含まれる。ライブラリー由来の抗体は、所望の1種または複数種の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132においてさらに説明されている。

特定のファージディスプレイ法では、VH遺伝子のレパートリーおよびVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換え、次いで、Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455で説明されているとおりに、抗原結合ファージについてそれらをスクリーニングすることができる。典型的には、ファージは、単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734によって説明されているように、未処置のレパートリーを(例えばヒトから)クローニングして、まったく免疫化せずに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388によって説明されているように、幹細胞由来の再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むPCRプライマーを用いて可変性に富むCDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、US5,750,373、およびUS2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、およびUS2009/0002360が含まれる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。

5.多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体に含まれている。多重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の一方は、第1の抗原に対するものであり、他方は、異なる第2の抗原に対するものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、同一の抗原の2種の異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、抗原のうちの少なくとも1種を発現する細胞へ細胞傷害性物質を局在化するためにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。

多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組み換え同時発現(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照されたい)および「ノブインホール(knob-in-hole)」操作(例えばUS5,731,168を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電気的操縦(electrostatic steering)効果を操作すること(WO2009/089004);2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、US4,676,980およびBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照されたい);二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを用いること(例えば、Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照されたい);二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい);および単鎖Fv(scFv)二量体を用いること(例えば、Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照されたい);ならびに例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69で説明されているとおりに、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。

「オクトパス抗体(Octopus antibody)」を含む、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる(例えば、US2006/0025576を参照されたい)。

また、本明細書の抗体または断片には、「二重作用性Fab」または「DAF」が含まれる(例えば、US2008/0069820を参照されたい)。

本明細書の抗体または断片にはまた、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793において説明されている多重特異性抗体も含まれる。

6.抗体変種
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは抗体中に含まれる。さらなる態様において、抗体のアミノ酸配列変種が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、ならびに/または残基中への挿入、および/もしくは残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って、最終構築物を得てもよい。

(a)置換変種、挿入変種、および欠失変種
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が、提供される。対象となる置換変異誘発部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、下記の表の「好ましい置換」という項目の下に示す。より実質的な変更は、以下の表の「例示的置換」という項目の下に提供し、アミノ酸側鎖のクラスに関してさらに後述する。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、その作製物を所望の活性、例えば、保持された/向上した抗原結合、低下した免疫原性、または改善したADCCもしくはCDCについてスクリーニングすることができる。

（表）

アミノ酸は、側鎖の共通特性に基づいてグループ分けされ得る:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

置換変種の1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、その後の研究のために選択される得られた変種は、親抗体を基準としていくつかの生物学的特性の変化(例えば改善)(例えば、増大した親和性、低下した免疫原性)を有しており、かつ/または親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変種は、例えば、本明細書において説明するもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作製することができる、親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、変種抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。

例えば、抗体親和性を向上させるために、HVR中に改変(例えば置換)がなされてよい。このような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を経験するコドンにコードされる残基(例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照されたい)中、および/または抗原と接触する残基中になされてよく、得られた変種VHまたは変種VLを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において説明されている。親和性成熟のいくつかの態様において、様々な方法(例えば、誤りがちなPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変種を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのHVR残基(例えば、同時に4〜6個の残基)がランダム化される、HVRを対象とするアプローチを伴う。抗原結合に関与しているHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的とされる。

特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、このような改変によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に低下しない限り、1つまたは複数のHVR内に存在してよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書において提供される保存的置換)がHVR中になされてよい。このような改変は、例えば、HVRにおける抗原接触残基の外側でもよい。上記で提供した変種VH配列および変種VL配列の特定の態様において、各HVRは、未改変であるか、またはわずか1個、2個、もしくは3個のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。

変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって説明されている。この方法では、残基または標的残基群(例えば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluなどの荷電残基)を同定し、中性アミノ酸または負電荷を持つアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうか判定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してよい。あるいはまたはさらに、抗体と抗原の接触点を特定するための抗原-抗体複合体の結晶構造を用いることができる。このような接触残基および隣接残基を、置換の候補として標的とするか、または除去してよい。変種をスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかどうかを判定してよい。

アミノ酸配列挿入には、長さが残基1個から100個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、(例えばADEPTのための)酵素または抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。

(b)グリコシル化変種
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を大きくするか、または小さくするように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作製されるかまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に達成することができる。

抗体がFc領域を含む場合、それに結合する炭水化物を改変してよい。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「軸(stem)」中のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様において、いくつかの特性が改善した抗体変種を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えてよい。

1つの態様において、Fc領域に(直接的にまたは間接的に)結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変種が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であってよい。フコースの量は、例えばWO2008/077546において説明されているように、MALDI-TOF質量分析法によって測定して、Asn297に結合した糖構造物(glycostructure)すべて(例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、および高マンノース構造物)の合計に対するAsn297における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Asn297は、Fc領域中の297位あたり(Fc領域残基のEU番号付与)に位置するアスパラギン残基を意味する;しかしながら、Asn297は、抗体の軽微な配列変異が原因で、297位からアミノ酸±約3個だけ上流または下流に、すなわち、294位と300位の間に位置してもよい。このようなフコシル化変種は、ADCC機能が向上している場合がある。例えば、US2003/0157108; US2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化された」または「フコースを欠く」抗体変種に関連した刊行物の例には、US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249;Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠陥があるLec13 CHO細胞(Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545;US2003/0157108;およびWO2004/056312、特に実施例11)およびノックアウト細胞株、例えば、α-1,6-フコシル基転移酵素遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688;およびWO2003/085107を参照されたい)が含まれる。

抗体変種は、分岐したオリゴ糖と共にさらに提供され、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐型オリゴ糖は、GlcNAcによって分岐している。このような抗体変種は、フコシル化が減少し、かつ/またはADCC機能が向上している場合がある。このような抗体変種の例は、例えば、WO2003/011878;US6,602,684;およびUS2005/0123546において説明されている。Fc領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変種もまた、提供される。このような抗体変種は、CDC機能が向上している場合がある。このような抗体変種は、例えば、WO1997/30087;WO1998/58964;およびWO1999/22764において説明されている。

(c)Fc領域変種
特定の態様において、1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチド中に導入し、それによってFc領域変種を作製することができる。Fc領域変種は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換/変異)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)に由来し得る。

特定の態様において、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有するヘテロ二量体ポリペプチドを企図する。このことにより、その抗体は、インビボでの二量体ポリペプチドの半減期が重要ではあるが、ある種のエフェクター機能(CDCおよびADCCなど)が不必要または有害である用途に対する望ましい候補となる。インビトロおよび/またはインビボの細胞障害性アッセイ法を行って、CDC活性および/またはADCC活性の減少/消失(depletion)を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイ法を行って、ヘテロ二量体ポリペプチド抗体はFcγR結合を欠く(したがって、ADCC活性を欠く可能性が高い)がFcRn結合能を保持していることを確実にすることができる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロのアッセイ法の非限定的な例は、US5,500,362(例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照されたい);US5,821,337(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照されたい)において説明されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(Promega, Madison, WI)を参照されたい)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656で開示されているもののような動物モデルにおいて評価してもよい。また、C1q結合アッセイ法を実施して、二量体ポリペプチドがC1qに結合することができず、したがって、CDC活性を欠くことを確認することもできる。例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ法を実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照されたい)。FcRn結合およびインビボのクリアランス/半減期の測定はまた、当技術分野において公知の方法を用いて実施することもできる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照されたい)。

エフェクター機能が低下しているヘテロ二量体ポリペプチドには、Fc領域残基238位、265位、269位、270位、297位、327位、および329位のうちの1つまたは複数が置換されたものが含まれる(US6,737,056)。このようなFc領域変種には、残基265位および297位がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc領域変異体を含む、アミノ酸265位、269位、270位、297位、および327位のうちの2つまたはそれ以上における置換を有するFc領域が含まれる(US7,332,581)。

FcRへの結合が改善されているか、または減弱している特定の抗体変種が説明されている。(例えば、US6,737,056;WO2004/056312、およびShields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照されたい。)

特定の態様において、ヘテロ二量体ポリペプチド変種は、ADCCを向上させる1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298位、333位、および/または334位(残基のEU番号付与)の位置における置換を有するFc領域を含む。

例えば、US6,194,551、WO99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184において説明されているように、いくつかの態様において、C1q結合および/または補体依存性細胞障害性(CDC)の変化(すなわち、向上または減弱のいずれか)をもたらす改変がFc領域中になされる。

胎児への母親のIgGの移行に関与する、半減期が長くなり新生児型Fc受容体(FcRn)への結合が向上した抗体(Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)は、US2005/0014934において説明されている。これらの抗体はFcRnへのFc領域の結合を向上させる1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。このようなFc領域変種には、Fc領域残基:238位、256位、265位、272位、286位、303位、305位、307位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、413位、424位、または434位のうちの1つまたは複数における置換、例えばFc領域残基434位の置換を有するものが含まれる(US7,371,826)。

Fc領域変種の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740;US5,648,260;US5,624,821;およびWO94/29351も参照されたい。

(d)システインで操作された抗体変種
特定の態様において、システインで操作されたヘテロ二量体ポリペプチドを、例えば、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb」に類似して作製することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換される残基は、ヘテロ二量体ポリペプチドの接近可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、その結果、ヘテロ二量体ポリペプチドの接近可能な部位に位置づけられ、本明細書においてさらに説明するように、薬物部分またはリンカー-薬物部分などの他の部分にヘテロ二量体ポリペプチドをコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の態様において、次の残基の任意の1つまたは複数をシステインで置換してよい:軽鎖のV205(Kabat番号付与);重鎖のA118(EU番号付与);および重鎖Fc領域のS400(EU番号付与)。システインで操作されたヘテロ二量体ポリペプチドは、例えば、US7,521,541において説明されているとおりに作製することができる。

(e)誘導体
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、当技術分野において公知であり、容易に入手可能である付加的な非タンパク性部分を含むようにさらに修飾され得る。ヘテロ二量体ポリペプチドの誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるがそれに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものでよく、分枝状または非分枝状でよい。二量体ポリペプチドに結合されるポリマーの数は変動してよく、複数のポリマーが結合される場合、それらは同じ分子または異なる分子でよい。通常、誘導体化のために使用されるポリマーの数および/またはタイプは、限定されるわけではないが、改善しようとする二量体ポリペプチドの特定の特性または機能、その二量体ポリペプチド誘導体が所定の条件下で治療法において使用されるかどうかなどを含む考慮すべき事柄に基づいて決定することができる。

別の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドと放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。1つの態様において、非タンパク性部分はカーボンナノチューブである(Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。放射線は、任意の波長のものでよく、普通の細胞には害を与えないが、二量体ポリペプチド-非タンパク性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を加熱する波長が含まれるが、それに限定されるわけではない。

(f)ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を強いるためのCH3修飾にはいくつかのアプローチが存在し、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291において十分に説明されている。典型的には、このようなアプローチのいずれにおいても、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは両方とも、各CH3ドメイン(またはそれを含む重鎖)がそれ自身とはもはやホモ二量体化できないが、操作された相補的な他方のCH3ドメインとヘテロ二量体化することを余儀なくされるように、相補的な様式で操作される(その結果、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインがヘテロ二量体化し、第1のCH3ドメイン2つのホモ二量体も第2のCH3ドメイン2つのホモ二量体も、形成されない)。重鎖のヘテロ二量体化を改善するためのこれらの様々なアプローチは、軽鎖が誤対合したベンス・ジョーンズ型副産物を減少させる、本発明による多重特異性抗体における重鎖-軽鎖修飾(1つの結合アームにおけるVHおよびVLの交換/置換、ならびにCH1/CL境界面における、反対電荷による荷電アミノ酸の置換の導入)と組み合わせた様々な代替手段として企図される。

本発明の1つの好ましい態様(多重特異性抗体が重鎖中にCH3ドメインを含む場合)において、本発明による前記ヘテロ二量体ポリペプチド体のCH3ドメインは、例えば、WO 96/027011、Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;およびMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; WO 98/ 050431においていくつかの例を用いて詳細に説明されている「ノブイントゥーホール」技術によって改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面を改変して、これら2つのCH3ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させる。(2本の重鎖の)2つのCH3ドメインのそれぞれが「ノブ」となることができ、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体はさらに安定し (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)、収率は増加する。

したがって、本発明の1つの態様において、(各重鎖中にCH3ドメインを含む、および)前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、
(a)の抗体の第1の重鎖の第1のCH3ドメインと(b)の抗体の第2の重鎖の第2のCH3ドメインとが、抗体CH3ドメイン間の元の境界面を含む境界面でそれぞれ接する
ことをさらに特徴とし、
該境界面は、多重特異性抗体の形成を促進するように改変されており、この改変は、
(i)一方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面と接する、一方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面内で、
あるアミノ酸残基が、側鎖の体積が大きいアミノ酸残基で置換され、それによって、他方の重鎖のCH3ドメインの境界面内のくぼみに配置可能である、一方の重鎖のCH3ドメインの境界面内の隆起が生じるように、改変されること、
および
(ii)他方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の境界面と接する第2のCH3ドメインの元の境界面内で、あるアミノ酸残基が、側鎖の体積が小さいアミノ酸残基で置換され、それによって、第1のCH3ドメインの境界面内の隆起を内部に配置可能である、第2のCH3ドメインの境界面内のくぼみが生じるように、改変されること
を特徴とする。

好ましくは、側鎖の体積が大きい前記アミノ酸残基は、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)からなる群より選択される。

好ましくは、側鎖の体積が小さい前記アミノ酸残基は、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)からなる群より選択される。

本発明の1つの局面において、両方のCH3ドメインは、両方のCH3ドメイン間のジスルフィド架橋が形成され得るように、各CH3ドメインの対応位置のアミノ酸としてシステイン(C)を導入することによってさらに改変される。

1つの好ましい態様において、前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、「ノブ鎖」の第1のCH3ドメインにアミノ酸変異T366W、ならびに「ホール鎖」の第2のCH3ドメインにアミノ酸変異T366S、L368A、Y407Vを含む。また、例えば、「ホール鎖」のCH3ドメイン中へのアミノ酸変異Y349Cおよび「ノブ鎖」のCH3ドメイン中へのアミノ酸変異E356Cまたはアミノ酸変異S354Cの導入による、CH3ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)。

1つの好ましい態様において、(各重鎖中にCH3ドメインを含む)前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、2つのCH3ドメインのうちの一方にアミノ酸変異S354C、T366W、および2つのCH3ドメインのうちの他方にアミノ酸変異Y349C、T366S、L368A、Y407Vを含む(一方のCH3ドメイン中の追加のアミノ酸変異S354Cおよび他方のCH3ドメイン中の追加のアミノ酸変異Y349Cが、鎖間ジスルフィド架橋を形成する)(Kabatに基づく番号付与)。

ヘテロ二量体化を強いるCH3修飾のための他の技術は、本発明の代替手段として企図され、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291において説明されている。

1つの態様において、EP 1870459 A1で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。このアプローチは、両方の重鎖間のCH3/CH3ドメイン境界面の特定のアミノ酸位置における、反対電荷による荷電アミノ酸の置換/変異の導入に基づいている。前記ヘテロ二量体ポリペプチドに関する1つの好ましい態様は、多重特異性抗体の第1のCH3ドメイン中のアミノ酸変異R409D;K370Eおよび多重特異性抗体の第2のCH3ドメイン中のアミノ酸変異D399K;E357Kである(Kabatに基づく番号付与)。

別の態様において、前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異T366W、および「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異T366S、L368A、Y407V、ならびにさらに、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異R409D;K370E、および「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異D399K;E357Kを含む。

別の態様において、前記ヘテロ二量体ポリペプチドは、2つのCH3ドメインのうちの一方にアミノ酸変異S354C、T366W、および2つのCH3ドメインのうちの他方にアミノ酸変異Y349C、T366S、L368A、Y407Vを含むか、または前記多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にアミノ酸変異Y349C、T366W、および2つのCH3ドメインのうちの他方にアミノ酸変異S354C、T366S、L368A、Y407V、ならびにさらに、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異R409D;K370E、および「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸変異D399K;E357Kを含む。

1つの態様において、WO 2013/157953で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。1つの態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Kを含み、第2のCH3ドメインポリペプチドは、アミノ酸変異L351Dを含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、さらなるアミノ酸変異L351Kを含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、Y349E、Y349D、およびL368Eより選択されるさらなるアミノ酸変異(好ましくはL368E)を含む。

1つの態様において、WO 2012/058768で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。1つの態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異L351Y、Y407Aを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異T366A、K409Fを含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、例えば、(a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E、またはT411W、(b)D399R、D399W、D399Y、またはD399K、c S400E、S400D、S400R、またはS400K F405I、F405M、F405T、F405S、F405V、またはF405W N390R、N390K、またはN390D K392V、K392M、K392R、K392L、K392F、またはK392Eより選択される、T411、D399、S400、F405、N390、またはK392の位置のさらなるアミノ酸変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異L351Y、Y407Aを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異T366V、K409Fを含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異Y407Aを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異T366A、K409Fを含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、さらなるアミノ酸変異K392E、T411E、D399R、およびS400Rを含む。

1つの態様において、例えば、368および409からなる群より選択される位置のアミノ酸修飾を用いて、WO2011/143545で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。

1つの態様において、前述のノブイントゥーホール技術を同じく使用する、WO2011/090762で説明されているヘテロ二量体化アプローチを、別法として使用することができる。1つの態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Wを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異Y407Aを含む。1つの態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Yを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異Y407Tを含む。

1つの態様において、多重特異性抗体は、IgG2アイソタイプのものであり、WO2010/129304で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。

1つの態様において、WO2009/089004で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。1つの態様において、第1のCH3ドメインは、陰性荷電アミノ酸によるK392またはN392のアミノ酸置換(例えば、グルタミン酸(E)、またはアスパラギン酸(D)、好ましくはK392DまたはN392D)を含み、第2のCH3ドメインは、陽性荷電アミノ酸によるD399、E356、D356、またはE357のアミノ酸置換(例えば、リジン(K)またはアルギニン(R)、好ましくはD399K、E356K、D356K、またはE357K、ならびにより好ましくはD399KおよびE356K)を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、陰性荷電アミノ酸によるK409またはR409のアミノ酸置換(例えば、グルタミン酸(E)、またはアスパラギン酸(D)、好ましくはK409DまたはR409D)をさらに含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、陰性荷電アミノ酸(例えば、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D))によるK439および/またはK370のアミノ酸置換を、さらにまたは代わりに含む。

1つの態様において、WO2007/147901で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。1つの態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異K253E、D282K、およびK322Dを含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異D239K、E240K、およびK292Dを含む。

1つの態様において、WO2007/110205で説明されているヘテロ二量体化アプローチを別法として使用することができる。

E.組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え方法および組成物を使用して作製され得る。1つの態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、ヘテロ二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列および/または第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードしていてよい。さらなる態様において、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのそのような態様において、宿主細胞は、以下を含む(例えば、以下によって形質転換されている):(1)ヘテロ二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列およびヘテロ二量体ポリペプチドの第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)ヘテロ二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよびヘテロ二量体ポリペプチドの第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。1つの態様において、上述のヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ヘテロ二量体ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から抗体を回収する段階を含む、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを作成する方法が提供される。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの組換え作製のためには、例えば、上記のヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のため、1つまたは複数のベクターへ挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使用して(例えば、抗体の変種Fc領域ポリペプチドおよび重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離され配列決定され得る。

ヘテロ二量体ポリペプチドをコードするベクターのクローニングまたは発現のために適した宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない時、ヘテロ二量体ポリペプチドは細菌において作製されてもよい。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、米国特許第5,789,199号、および米国特許第5,840,523号を参照されたい(大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254も参照されたい)。発現の後、ヘテロ二量体ポリペプチドは、可溶性画分に細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。

原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトのグリコシル化パターンを有する二量体ポリペプチドの作製をもたらす、真菌および酵母の株を含む、糸状菌または酵母のような真核微生物も、ヘテロ二量体ポリペプチドをコードするベクターのための適したクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414;およびLi,H.et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照されたい。

グリコシル化ヘテロ二量体ポリペプチドの発現のために適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978、およびUS6,417,429(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい。

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(例えばGraham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74で説明されているHEK293または293細胞);仔ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252で説明されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(HepG2);マウス乳房腫瘍(MMT060562);例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている、TRI細胞;MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR^- CHO細胞(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。

F.併用治療
特定の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは本明細書において報告される薬学的製剤は、本明細書に記載された1つまたは複数の眼血管疾患の処置のため、単独で(追加の治療用物質なしに)投与される。

他の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチド抗体または薬学的製剤は、本明細書に記載された1つまたは複数の血管性眼疾患の処置のため、1種または複数種の追加の治療用物質または治療法と組み合わせて投与される。

他の態様において、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤は、本明細書に記載された1つまたは複数の血管性眼疾患の処置のため、1種または複数種の追加の治療用物質と組み合わせて製剤化されて、投与される。

特定の態様において、本明細書において提供される組み合わせ処置は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤が、本明細書に記載された1つまたは複数の眼血管疾患の処置のため、1種または複数種の追加の治療用物質と連続的に投与されることを含む。

追加の治療用物質には、トリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)、EyeOOl(抗VEGF PEG化アプタマー)、スクアラミン、RETAANE(商標)(デポー懸濁液のためのアネコルタブ酢酸エステル;Alcon,Inc.)、コンブレタスタチンA4プロドラッグ(CA4P)、MACUGEN(商標)、MIFEPREX(商標)(ミフェプリストン-ru486)、テノン嚢下トリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット(AG3340-合成マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、Pfizer)、フルオシノロンアセトニド(フルオシノロン眼内インプラント、Bausch & Lomb/Control Delivery Systemsを含む)、VEGFR阻害剤(Sugen)、VEGFトラップ(Regeneron/Aventis)、4-(4-ブロモ-2-フルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(l-メチルピペリジン-4-イルメトキシ)キナゾリン(ZD6474)のようなVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤、4-(4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ)-6-メトキシ-7-(3-ピロリジン-1-イルプロポキシ)キナゾリン(AZD2171)、バタラニブ(PTK787)およびSU11248(スニチニブ)、リノマイド(linomide)、およびインテグリンvβ3機能の阻害剤、およびアンジオスタチンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得るその他の薬学的治療には、ノンサーマルレーザーの使用によるVISUDYNE(商標)、PKC 412、Endovion(NeuroSearch A/S)、神経栄養因子、例えば、グリア由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子、ジアタゼム(diatazem)、ドルゾラミド、フォトトロプ(Phototrop)、9-シス-レチナール、ホスホリンヨウ化物またはエコチオパートまたは炭酸脱水酵素阻害剤を含む眼薬物治療(エコー治療を含む)、AE-941(AEterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(Sima Therapeutics,Inc.)、ペガプタニブ(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、ニューロトロフィン(例に過ぎないが、NT-4/5,Genentechを含む)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、インテグリンアンタゴニスト(Jerini AGおよびAbbott Laboratoriesのものを含む)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、(例えば、EntreMed,Inc.によって使用されるような)サリドマイド、カルジオトロフィン1(Genentech)、2-メトキシエストラジオール(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、テトラチオモリブデン酸(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微細藻類化合物(Aquasearch/Albany、Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc.)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGFβ2(Genzyme/Celtrix)、チロシンキナーゼ阻害剤(Allergan、SUGEN、Pfizer)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、網膜細胞神経節保護薬(Cogent Neurosciences)、N-ニトロピラゾール誘導体(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、シクロスポリンA、限局性網膜移動術、光線力学療法(例に過ぎないが、受容体標的型PDT、Bristol-Myers Squibb,Co.;PDTによる注射のためのポルフィマーナトリウム;ベルテポルフィン、QLT Inc.;PDTによるロスタポルフィン、Miravent Medical Technologies;PDTによるタラポルフィンナトリウム、Nippon Petroleum;モテクサフィンルテチウム、Pharmacyclics,Inc.)を含む)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、Novagali Pharma SAによって試験された生成物およびISIS-13650(Isis Parmaceuticalsを含む)、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー法、黄斑円孔手術、黄斑移動術、埋め込み型微小望遠鏡、ファイモーション血管造影法(Phi-Motion Angiography)(マイクロレーザー治療(Micro-Laser Therapy)および支持血管処置(Feeder Vessel Treatment)としても公知)、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離および硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱療法、光化学系I治療、RNA干渉(RNAi)の使用、体外レオフェレシス(rheopheresis)(メンブレンディファレンシャルフィルトレーション(membrane differential filtration)およびレオセラピー(Rheotherapy)としても公知)、マイクロチップ埋め込み、幹細胞治療、遺伝子置換治療、リボザイム遺伝子治療(低酸素応答因子のための遺伝子治療、Oxford Biomedica;Lentipak、Genetix;PDEF遺伝子治療、GenVecを含む)、視細胞/網膜細胞移植(移植可能網膜上皮細胞、Diacrin,Inc;網膜細胞移植、Cell Genesys,Inc.を含む)、ならびに鍼が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

CarmelietおよびJain(Nature 407(2000)249-257)によってリストされたものを含むが、それらに限定されるわけではない、抗血管新生剤も、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得る。特定の態様において、抗血管新生剤は、VEGF変種、可溶性VEGF受容体断片、VEGFまたはVEGFRを阻止することができるアプタマー、中和抗VEGFR抗体、VEGFRチロシンキナーゼの低分子量阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせのような、別のVEGFアンタゴニストまたはVEGF受容体アンタゴニストであり、これらには、抗VEGFアプタマー(例えば、ペガプタニブ)、可溶性組換えデコイ受容体(例えば、VEGFトラップ)が含まれる。特定の態様において、抗血管新生剤には、副腎皮質ステロイド、血管新生抑制ステロイド、アネコルタブ酢酸エステル、アンジオスタチン、エンドスタチン、VEGFRまたはVEGFリガンドの発現を減少させる低分子干渉RNA、チロシンキナーゼ阻害剤によるポストVEGFR阻止、MMP阻害剤、IGFBP3、SDF-1ブロッカー、PEDF、γセクレターゼ、δ様リガンド4、インテグリンアンタゴニスト、HIF-1α阻止、プロテインキナーゼCK2阻止、ならびに血管内皮カドヘリン(CD-144)およびストロマ由来因子(SDF)-I抗体を使用した血管新生部位への幹細胞(すなわち、内皮前駆細胞)ホーミングの阻害が含まれる。PTK787を含むVEGF受容体を標的とする低分子RTK阻害剤も使用され得る。必ずしも抗VEGF化合物でない、血管新生に対する活性を有する剤も使用され得、抗炎症薬、m-Tor阻害剤、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、シクロスポリン、抗TNF剤、抗補体剤、および非ステロイド性抗炎症剤を含む。「神経ステロイド」と呼ばれる薬物クラスのような、神経保護性であり萎縮型黄斑変性症の進行を低下させる可能性のある剤も、使用され得る。これらには、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)(商品名:Prastera(登録商標)およびFidelin(登録商標))、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、およびプレグネノロン硫酸のような薬物が含まれる。PDTと組み合わせられたベルテポルフィン、単独のまたは組み合わせられたペガプタニブナトリウム、亜鉛、または抗酸化剤を含むが、それらに限定されるわけではない、AMD(加齢黄斑変性症)治療用物質が、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得る。

G.薬学的製剤
本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのようなヘテロ二量体ポリペプチドを1種または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度において受容者に非毒性であり、限定されるわけではないが、以下が含まれる:リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリ(ビニルピロリドン)のような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような侵入型(interstitial)薬物分散剤、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を含む、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、US2005/0260186およびUS2006/0104968において説明されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

例示的な凍結乾燥抗体製剤が、US6,267,958において説明されている。水性抗体製剤には、US6,171,586およびWO2006/044908において説明されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。

本明細書における製剤はまた、治療される個々の適応症に対する必要に応じて複数の有効成分、好ましくは、補完的な活性を有しており、互いに悪影響を及ぼさないものも含んでよい。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせられて存在するのが適切である。

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリラート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込めることができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)で開示されている。

徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。

通常、インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌済みである。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜に通してろ過することによって、容易に実現することができる。

H.治療方法および組成物
本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドのいずれかを、治療法において使用することができる。

1つの局面において、医薬として使用するための本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドが提供される。さらなる局面において、眼血管疾患の処置において使用するためのヘテロ二量体ポリペプチドが提供される。特定の態様において、処置の方法において使用するためのヘテロ二量体ポリペプチドが提供される。特定の態様において、本発明は、有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法において使用するためのヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。1つのそのような態様において、方法は、例えば、上記セクションDに記載されたような少なくとも1種の追加の治療用物質の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、眼における血管新生の阻害において使用するためのヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。特定の態様において、本発明は、血管新生を阻害するために有効なヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む、個体における血管新生を阻害する方法において使用するためのヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」とは、1つの好ましい態様において、ヒトである。

さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製におけるヘテロ二量体ポリペプチドの使用を提供する。1つの態様において、医薬は眼血管疾患の処置のためである。さらなる態様において、医薬は、有効量の医薬を、眼血管疾患を有する個体に投与する段階を含む、眼血管疾患を処置する方法において使用するためである。1つのそのような態様において、方法は、例えば、上記の少なくとも1種の追加の治療用物質の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、医薬は血管新生を阻害するためである。さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するために有効量の医薬を個体に投与する段階を含む、個体における血管新生を阻害する方法において使用するためである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。

さらなる局面において、本発明は、血管性眼疾患を処置する方法を提供する。1つの態様において、方法は、有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドをそのような血管性眼疾患を有する個体に投与する段階を含む。1つのそのような態様において、方法は、下記のような少なくとも1種の追加の治療用物質の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。

さらなる局面において、本発明は、個体の眼における血管新生を阻害する方法を提供する。1つの態様において、方法は、血管新生を阻害するために有効量の本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを個体に投与する段階を含む。1つの態様において、「個体」はヒトである。

さらなる局面において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおいて使用するための、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。1つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドのいずれかと、例えば、下記のような少なくとも1種の追加の治療用物質とを含む。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、治療において単独で使用されてもよいかまたは他の作用物質と組み合わせて使用されてもよい。例えば、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、少なくとも1種の追加の治療用物質と同時投与され得る。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチド(および任意の追加の治療用物質)は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与され得、局所処置のために望まれる場合には、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。投薬は、一部分、投与が短期であるか慢性であるかに依って、任意の適切なルートによって、例えば、静脈内注射または皮下注射のような注射によってなされ得る。単回投与または様々な時点における複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、それらに限定されるわけではない、様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。

本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドは、優良医療規範(good medical practice)と一致する様式で、製剤化され、分量を決定され(dosed)、投与されるであろう。この状況で考慮すべき因子には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、作用物質の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知のその他の因子が含まれる。ヘテロ二量体ポリペプチドは、必ずしもではないが任意で、当該の障害を防止するかまたは処置するために現在使用されている1種または複数種の作用物質と共に製剤化される。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在するヘテロ二量体ポリペプチドの量、障害または処置のタイプ、および上述のその他の因子に依る。これらは、一般に、本明細書に記載されたのと同一の投薬量および投与ルートで、または本明細書に記載された投薬量の約1〜99％で、または経験的/臨床的に適切であると決定された投薬量およびルートで使用される。

疾患の防止または処置のための、(単独でまたは1種もしくは複数種の他の追加の治療用物質と組み合わせて使用される場合の)本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの適切な投薬量は、処置される疾患のタイプ、ヘテロ二量体ポリペプチドのタイプ、疾患の重症度および経過、ヘテロ二量体ポリペプチドが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、過去の治療、患者の病歴およびヘテロ二量体ポリペプチドに対する応答、ならびに主治医の裁量に依るであろう。ヘテロ二量体ポリペプチドは、単回で、または一連の処置により、患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依って、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.5mg/kg〜10mg/kg)のヘテロ二量体ポリペプチドが、例えば、1回もしくは複数回の別々の投与によるかまたは連続注入によるかに関わらず、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。典型的な1日投薬量は、上述の因子に依って、約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。状態によって、数日またはそれ以上にわたり繰り返し投与する場合、処置は、一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。ヘテロ二量体ポリペプチドの1つの例示的な投薬量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にあるであろう。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、または10mg/kg(またはそれらの組み合わせ)が、1回または複数回、患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または3週間毎に、(例えば、患者が、約2〜約20回、または、例えば、約6回、二量体ポリペプチドを受容するよう)投与され得る。より高い負荷量を初回に投与し、その後、より低い用量を1回または複数回投与することもできる。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。

III.製造品
本発明の別の局面において、上記の障害の処置、防止、および/または診断のために有用な材料を含有している製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような多様な材料から形成されていてよい。容器は、単独の組成物、または状態の処置、防止、および/もしくは診断のために有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1種の活性物質は、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドである。ラベルまたは添付文書は、選択の状態を処置するために組成物が使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む組成物を含有している第1の容器;および(b)さらなる他の治療用物質を含む組成物を含有している第2の容器を含み得る。本発明のこの態様において、製造品は、特定の状態を処置するために組成物が使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的にまたは付加的に、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2(または第3)の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的見地および使用者見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。

上記の製造品のいずれかは、本明細書において報告されるヘテロ二量体ポリペプチドの代わりに、またはそれに加えて、本明細書において報告されるイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。

IV.実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上記に提供した一般的説明を前提として、他の様々な態様が実施され得ることが理解される。

前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、これらの説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるあらゆる特許および科学文献の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。

方法
エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)
N-グリカナーゼplus(Roche)0.5μLおよびリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.1)を添加することによってタンパク質アリコート(50μg)を脱グリコシル化して、最終試料体積115μLを得る。この混合物を37℃で18時間インキュベートする。その後、還元および変性のために、4M塩酸グアニジン(Pierce)に溶かした0.5M TCEP(Pierce)60μLおよび8M塩酸グアニジン50μLを添加する。この混合物を37℃で30分間インキュベートする。サイズ排除クロマトグラフィー(セファロースG-25、均一勾配、2％ギ酸を含む40％アセトニトリル)によって試料を脱塩する。ナノESI供給源(TriVersa NanoMate、Advion)を装備されたQ-TOF機器(maXis、Bruker)を用いて、ESI質量スペクトル(+ve)を記録する。MSパラメーター設定は次のとおりである:移動:ファンネルRF、400Vpp;ISCIDエネルギー、0eV;多重極RF、400Vpp;四重極:イオンエネルギー、4.0eV;低質量、600m/z;供給源:乾燥ガス、8L/分;乾燥ガスの温度、160℃;コリジョンセル:衝突エネルギー、10eV;衝突RF:2000Vpp;イオンクーラー:イオンクーラーRF、300Vpp;移動時間:120μ秒;プレパルス蓄積、10μ秒;スキャン範囲m/z600〜2000。データを評価するために、施設内で開発したソフトウェア(MassAnalyzer)を使用する。

FcRn表面プラズモン共鳴(SPR)解析
FcRnに対する野生型抗体および変異体の結合特性を、BIAcore T100機器(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって解析する。この方式は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。これにより、リガンド/分析物結合を連続的にリアルタイムでモニタリングし、したがって、様々なアッセイ法設定において動態パラメーターを測定することが可能になる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと溶液中に注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が示唆される。分子が、表面の固定化されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、解離する場合は質量が減少する。本アッセイ法においては、400レスポンスユニット(RU)のレベルまで、アミンカップリングによってFcRn受容体をBIAcore CM5バイオセンサーチップ(GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)上に固定化する。アッセイ法は、PBS、0.05％ Tween20 pH6.0(GE Healthcare Bioscience)をランニング緩衝液および希釈用緩衝液として用いて室温で実施する。200nMの抗体試料を室温、流速50μL/分で注入する。結合時間は180秒である。解離相は360秒に及んだ。HBS-P、pH8.0を短時間注入することにより、チップ表面の再生を達成する。注入後180秒および注入後300秒における生物学的応答シグナルの高さを比較することによって、SPRデータの評価を行う。対応するパラメーターは、RU最大レベル(注入後180秒)および後期の安定性(注入終了後300秒)である。

プロテインA表面プラズモン共鳴(SPR)解析
このアッセイ法は、表面プラズモン共鳴分光法に基づいている。プロテインAを、SPRバイオセンサーの表面に固定化する。SPR分光計のフローセルに試料を注入することにより、それが、固定化されたプロテインAとの複合体を形成して、センサーチップ表面の塊が増大し、したがって、レスポンスが大きくなる(1RUは1pg/mm²と定義される)。その後、試料-プロテインA複合体を溶解することによってセンサーチップを再生する。次いで、得られたレスポンスを、レスポンスユニット(RU)の高いシグナルおよび解離挙動に関して評価する。

GE Healthcareのアミンカップリングキットを用いて、pH4.0で、CM5チップ(GE Healthcare)上に約3500レスポンスユニット(RU)のプロテインA(20μg/mL)を結合させる。

試料および系の緩衝液は、HBS-P+(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005% Surfactant P20滅菌ろ過、pH7.4)である。フローセル温度を25℃に、試料コンパートメント温度を12℃に設定する。ランニング緩衝液を系に流して準備する。次いで、試料構築物の5nM溶液を流速30μL/分で120秒間注入し、300秒間の解離相がそれに続く。次いで流速30μL/分でグリシン-HCl pH1.5を30秒間2回注射することによって、センサーチップ表面を再生する。各試料を三つ組として測定する。

本明細書において使用される「変異IHH-AAAを有している」という用語は、IgG1またはIgG4サブクラスの重鎖定常領域における変異I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)、およびH435A(His435Ala)の組合せ(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)を意味し、本明細書において使用される「変異HHY-AAAを有している」という用語は、IgG1またはIgG4サブクラスの重鎖定常領域における変異H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)、およびY436A(Tyr436Ala)の組合せ(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)を意味し、本明細書において使用される「変異P329G LALAを有している」という用語は、IgG1サブクラスの重鎖定常領域における変異L234A(Leu234Ala)、L235A(Leu235Ala)、およびP329G(Pro329Gly)の組合せ(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)を意味し、本明細書において使用される「変異SPLEを有している」という用語は、IgG4サブクラスの重鎖定常領域における変異S228P(Ser228Pro)およびL235E(Leu235Glu)の組合せ(Kabat EU指標番号付与システムに基づく番号付与)を意味する。

一般原則
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において示されている。抗体鎖のアミノ酸残基は、EU番号付与に従って番号付与され、参照される(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。

組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作する。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用する。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、所与の仕様に従ってGeneart(Regensburg, Germany)に注文する。

DNA配列決定
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)またはSequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)で実施された二重鎖配列決定によって決定される。

DNAおよびタンパク質の配列解析および配列データ管理
GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NT1 Advance suiteバージョン8.0を、配列の作製、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用する。

発現ベクター
前述の抗体を発現させるために、CMVイントロンAプロモーターを含むもしくは含まないcDNA構成、またはCMVプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく、(例えばHEK293-F細胞における)一過性発現のための発現ベクターを使用する。

抗体発現カセットのほかに、これらのベクターは、
-大腸菌におけるこのベクターの複製を可能にする複製起点、
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
-真核細胞における選択マーカーとしての、ハツカネズミ(Mus musculus)に由来するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
を含む。

抗体遺伝子の転写単位は、以下のエレメントから構成される:
-5'末端の独特な制限部位、
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-cDNA構成の場合、次に続くイントロンA配列、
-ヒト免疫グロブリン遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードする核酸、
-cDNAとして、または免疫グロブリンのエキソン-イントロン構成を有しているゲノム構成においてのいずれかで、ヒト抗体鎖 (野生型またはドメイン交換されたもの)をコードする核酸、
-ポリアデニル化シグナル配列を有している3'非翻訳領域、ならびに
-3'末端の独特な制限部位。

抗体鎖をコードする核酸をPCRおよび/または遺伝子合成によって作製し、公知の組換え法および組換え技術により、例えば、各ベクター中の独特な制限部位を用いて、一致する核酸セグメントを連結することによって、組み立てる。サブクローニングした核酸配列は、DNA配列決定によって確認する。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)からのベクター調製によって、より多量のベクターを調製する。

細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に説明されているように、標準的な細胞培養技術を使用する。

後述するように、懸濁状態で増殖するHEK29-F細胞において各発現ベクターを一過性に同時トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発現させる。

実施例1
発現および精製
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
製造業者の取扱い説明書に従ってHEK293-F系(Invitrogen)を用いて、(例えば、重鎖および修飾された重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾された軽鎖をコードする)各ベクターで一過性トランスフェクションすることによって、単一特異性抗体および二重特異性抗体を作製する。簡単に説明すると、振盪フラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて、無血清FreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)に懸濁した状態で増殖するHEK293-F細胞(Invitrogen)を、各発現ベクターおよび293フェクチン(商標)またはフェクチン(Invitrogen)の混合物を用いてトランスフェクトする。2L容振盪フラスコ(Corning)の場合、600mL中に1×10⁶細胞/mLの密度でHEK293-F細胞を播種し、120rpm、8%CO₂でインキュベートする。翌日、約1.5×10⁶細胞/mLの細胞密度の細胞を、A)それぞれ重鎖または修飾された重鎖、および等モル比の対応する軽鎖をコードする全ベクターDNA(1μg/mL)600μgを含むOpti-MEM(Invitrogen)20mLならびにB)293フェクチンまたはフェクチン(2μL/mL)1.2mLを含むOpti-MEM 20mlの混合物約42mLを用いてトランスフェクトする。グルコース消費に応じて、発酵の過程でグルコース溶液を添加する。分泌された抗体を含む上清を5〜10日後に回収し、抗体を上清から直接的に精製するか、または上清を凍結し、保存する。

精製
MabSelectSure-Sepharose(商標)、ブチルセファロースを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー(GE Healthcare, Sweden)、およびSuperdex 200(GE Healthcare, Sweden)サイズ排除クロマトグラフィーによって、二重特異性抗体を細胞培養上清から精製する。

簡単に説明すると、滅菌ろ過した細胞培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na₂HPO₄、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)を用いて平衡化したMabSelectSure樹脂(IHH-AAA変異以外および野生型抗体)上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH3.0の25mMクエン酸ナトリウムを用いて溶出させる。溶出された抗体画分を集め、2M Tris、pH9.0で中和する。1.6M硫酸アンモニウム溶液を最終濃度が0.8M硫酸アンモニウムとなるように添加することによって、抗体プールを疎水性相互作用クロマトグラフィーのために調製し、酢酸を用いてpHをpH5.0に調整する。ブチルセファロース樹脂を35mM酢酸ナトリウム、0.8M硫酸アンモニウム、pH5.0で平衡化した後、抗体を樹脂に添加し、平衡化緩衝液で洗浄し、35mM酢酸ナトリウムpH5.0までの直線勾配を用いて溶出させる。(単一特異性または二重特異性の)抗体を含む画分を集め、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、さらに精製した。(単一特異性または二重特異性の)抗体を含む画分を集め、Vivaspin限外ろ過装置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)を用いて必要とされる濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。

純度および抗体の完全性を、各精製段階の後に、マイクロ流体Labchip技術(Caliper Life Science, USA)を用いたCE-SDSによって解析することができる。5μLのタンパク質溶液を、製造業者の取扱い説明書に従ってHTタンパク質発現試薬キットを用いるCE-SDS解析のために調製し、HTタンパク質発現チップを用いてLabchip GXIIシステムにおいて解析する。データは、Labchip GXソフトウェアを用いて解析する。

抗体試料の凝集物含有量を、25℃で、2×PBS(20mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄、274mM NaCl、および5.4mM KCl、pH7.4)ランニング緩衝液を用いて、Superdex 200分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare, Sweden)を用いた高速SECによって解析することができる。タンパク質25μgを流速0.75mL/分でカラムに注入し、50分間に渡って均一勾配で溶出させる。

実施例2
FcRnクロマトグラフィー
ストレプトアビジンセファロースへの結合:
ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare)1gを、ビオチン標識し透析した受容体に添加し、振盪しながら2時間インキュベートする。受容体で誘導体化したセファロースを、1mL容XKカラム(GE Healthcare)に充填する。

FcRnアフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィー:

Claims

N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第1のポリペプチドと、N末端からC末端への方向に、1つまたは複数のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む、第2のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドであって、
該第1のポリペプチドが、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み(ホール鎖)、かつ該第2のポリペプチドが、変異S354CおよびT366Wを含み(ノブ鎖)、
かつ、
該第1のポリペプチド(ホール鎖)が、変異
(i)I253AまたはI253G、および
(ii)L314AまたはL314GまたはL314D
を含み、
かつ、
該第1のポリペプチドおよび該第2のポリペプチドが、1つまたは複数のジスルフィド架橋によって接続されており、
かつ、
該第1のポリペプチドのCH3ドメインおよび該第2のポリペプチドのCH3ドメインが、プロテインAに両方とも結合するかまたは両方とも結合しない(Kabat EU指標に基づく番号付与)、
ヘテロ二量体ポリペプチド。
変異
(i)I253AもしくはI253G、および
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、および
(iii)T250Q、および/または
(iv)T256EもしくはT256A
を含む、請求項1に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
変異
(i)I253AもしくはI253G、ならびに
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、ならびに
(iii)任意で(a)T250Qおよび/またはT256EもしくはT256A、ならびに
(iv)(a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、および/または(b)H310AもしくはH310G
を含む、請求項1または2に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
変異
(i)I253AもしくはI253G、ならびに
(ii)L314AもしくはL314GもしくはL314D、ならびに
(iii)(a)T250Qおよび/またはT256EもしくはT256A、ならびに
(iv)(a)L251AもしくはL251GもしくはL251D、および/または(b)H310AもしくはH310G、
(v)任意で、(a)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、および/または(b)Q311H、および/または(c)M252Y、および/または(d)S254T
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
変異
(i)T250Q、および/または
(ii)M252Y、および/または
(iii)S254T、および/または
(iv)T256EもしくはT256A、および/または
(v)T307AもしくはT307HもしくはT307QもしくはT307P、および/または
(vi)Q311H
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンCH2ドメイン、および前記免疫グロブリンCH3ドメインがヒトIgG1サブクラスのものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが変異L234AおよびL235Aをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが変異P329Gをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンCH2ドメイン、および前記免疫グロブリンCH3ドメインがヒトIgG4サブクラスのものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが変異S228PおよびL235Eをさらに含む、請求項1〜5および9のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが変異P329Gをさらに含む、請求項1〜5、9、および10のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
完全長二重特異性抗体である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
請求項1〜12のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドと、任意で、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
薬学的製剤の製造のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの使用。
眼疾患、好ましくは眼血管疾患の処置において使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチド。