JP2004515230A - ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト配列の項体を産生可能な新規トランスジェニック非ヒト哺乳動物、ならびにかかる抗体を作製および使用する方法を提供するものである。

Description

【０００１】
関連出願の引照
本出願は、２０００年１１月３０日に出願された米国仮出願第６０／２５０，３４０号の優先権を主張するものであり、その開示の全体を本明細書中に組込むものとする。
【０００２】
技術分野
本発明はトランスジェニック動物、分子免疫学および医学の技術分野に属する。
【０００３】
発明の背景
抗体とは、移植、心臓血管性疾患、感染性疾患、癌および自己免疫を含む多数の異なる領域に用途を有する一種の治療分子を意味する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒ． ２１：３０９−３１８； Ｐｒｅｓｅｎｔ， Ｄ．ら， １９９９， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０：１３９８−１４０５； Ｔａｒｇａｎ， Ｓ．ら， １９９７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３７：１０２９−１０３５； Ｄａｖｉｓ， Ｔ．ら， １９９９， Ｂｌｏｏｄ ９４：８８ａ； Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ， Ｘ．ら， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １７：７８７−７９１； Ｂｅｒａｒｄ， Ｊ．ら， １９９９， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １９：１１２７−１１３７； Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｍ．ら， ２０００， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２１：４０３−４１０； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．， １９８２， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０６：５１７−５２２； Ｍａｉｎｉ， Ｒ．ら， １９９９， Ｌａｎｃｅｔ ３５４：１９３２−１９３９）。ハイブリドーマ技術の発達は候補治療分子としての齧歯動物モノクローナル抗体（ＭＡｂとも称する）の単離を可能とした（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）。 しかし、ｉｎ ｖｉｖｏヒト治療のための非ヒトモノクローナル抗体の使用を含む初期の研究は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答によりそのような作用物質の使用が制限されうることを示した（Ｓｃｈｒｏｆｆ， Ｒ．ら， １９８５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５， ８７９−８８５； Ｓｈａｗｌｅｒ， Ｄ．ら， １９８５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：１５３０−１５３５）。このように、治療抗体の免疫原性の減少が望ましいことが認識されている。非ヒト抗体の免疫原性を減少させるために組換えＤＮＡ技術が用いられてきた（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ， Ｇ．ら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６４３−６４６； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．ら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−６８５５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：３２３−３２７； Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．ら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５； Ｑｕｅｅｎ， Ｃ．ら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１００２９−１００３３）。しかし、完全なヒトモノクローナル抗体は、ヒト疾患を治療するための低免疫原性治療剤の潜在的な供給源であるということもまた認識されている（Ｌｉｔｔｌｅ， Ｍ．ら， ２０００， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−７０）。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を生殖細胞系配置中に担持するトランスジェニックマウスの使用は、種々の標的（正常なヒト免疫系はそれに対して寛容であるヒト自己抗原を含む）に向けられた高親和性で完全なヒトモノクローナル抗体の単離を提供する（Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．ら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−９； Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．ら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１； Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：４８３−９５； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ， Ｄ．， １９９５， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．ら， １９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：１３２３−１３２６； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ．ら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：８４５−８５１； Ｍｅｎｄｅｚ， Ｍ．ら， １９９７， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：１４６−１５６； Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１： １１−２３； Ｙａｎｇ， Ｘ．ら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：１２３６−１２４３； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．およびＴａｕｓｓｉｇ， Ｍ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８：４５５−４５８， １９９７）。ヒト抗体は軽鎖（κおよびλ）および重鎖（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ） に基づいて種々の異なるクラスに分類される。これらの異なるクラスは異なる治療用途を潜在的に提供する。例えば、異なる重鎖アイソタイプは補体と、および細胞に基づくＦｃ受容体と異なる相互作用をする。重鎖クラスのいくつか（ＩｇＭおよびＩｇＡ）はまた多量体を形成することができ、その結果、ＦｃおよびＶ領域相互作用の結合価を増大させる。したがって、全アイソタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するためのプラットフォームをもつことが望ましい。しかし、ヒト遺伝子座の大きいサイズ（１〜２ Ｍｂ）は、非常に多様なヒト抗体レパートリーを再構成するために遺伝子座全体をトランスジェニックマウスに導入するにあたっての主要な障害であった。なぜなら、完全なヒトＩｇ遺伝子座を包含するメガベースを上回る大きさのＤＮＡ断片のクローニングは酵母人工染色体を用いてもなお困難だったからである。最近、遺伝子導入用ベクターとしてヒト染色体自体を用いる新規な方法が、ＤＮＡ断片を人工ＤＮＡベクター中にクローン化する必要なしに、完全なＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座をトランスジェニックマウスに導入することを容易にした（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １６：１３３−１４３； Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７：７２２−７２７）。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：７２２−７２７）は、一方が免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖遺伝子座（ＩｇＨ、約１．５ Ｍｂ）を含み、そして他方がκ軽鎖遺伝子座（Ｉｇκ、約２ Ｍｂ）を含む２つの遺伝させることができる（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｂｌｅ）ヒト染色体断片（ｈＣＦ）のトランスジェニックマウス系統（内因性ＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座は不活性化されている）への導入を示した。得られた二重染色体導入（Ｔｃ）／二重ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいては、体細胞のかなりの部分が両方のｈＣＦを保持していた。そして、マウス重鎖およびκ軽鎖の不存在下で、ヒトＩｇ重鎖およびκ軽鎖の高レベル発現によってＩｇ産生欠陥のレスキューが示された。さらに、４つのＩｇγサブクラスの血清発現プロフィールはヒトに見られるプロフィールに類似していた。上記トランスジェニックマウスはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いた免疫後、抗原特異的ヒト抗体応答を発生させた。そして、種々のアイソタイプを有するＨＳＡ特異的ヒトモノクローナル抗体がそれらのマウスから得られた。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（同文献）の研究はまた、Ｉｇκ遺伝子座を含むｈＣｈｒ．２由来ｈＣＦ（ｈＣＦ（２−Ｗ２３））のマウス中における不安定性をも示した。κ導入染色体の観察された不安定性は、最適ヒトκ軽鎖発現およびヒトκ陽性ハイブリドーマの作製への障害となり得た。実際、二重Ｔｃ／ＫＯマウスから得た抗ＨＳＡハイブリドーマの２／３はマウスλ陽性（ｍλ＋）であり、そしてＩｇＧ／ｍλハイブリドーマの大部分（８３％）はｈＣＦ（２−Ｗ２３）を喪失していることが判明した。したがって、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（同文献）によって記述された導入染色体により付与された特徴を保持するトランスジェニック動物、特にヒト重鎖アイソタイプの実質的に完全なレパートリーを発現し、かつまた導入されたヒト配列の向上した安定性を示し、その結果、完全なヒト抗体を得る効率の増大を可能とする動物が必要とされている。
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ該２つの遺伝子座のうち一方のみが導入染色体に存在する該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該導入染色体は自律性である。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該導入染色体はヒト染色体１４の断片を含む。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該ヒト軽鎖遺伝子座は内因性哺乳動物染色体と結合している。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該ヒト重鎖遺伝子座は導入染色体に存在し、かつ該ヒト軽鎖遺伝子座は内因性哺乳動物染色体と結合している。このようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該ヒト軽鎖遺伝子座の少なくとも一部はＹＡＣベクター中にクローン化されている。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該ヒト重鎖遺伝子座はｈＣＦ（ＳＣ２０）に含まれており、また該ヒト軽鎖遺伝子座はヒトκ軽鎖遺伝子座トランスジーンＫＣｏ５に含まれている。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該ヒト軽鎖遺伝子座は導入染色体に存在し、かつ該ヒト重鎖遺伝子座は内因性哺乳動物染色体と結合している。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。トランスジェニック非ヒト哺乳動物において、該内因性哺乳動物重鎖遺伝子座および少なくとも１つの哺乳動物軽鎖遺伝子座は不活性化されている。このようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいては、該内因性哺乳動物重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座は不活性化されている。
【０００５】
別の態様においては、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させる。トランスジェニック非ヒト哺乳動物のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【０００６】
本発明はさらに、ヒト抗体配列を発現する複数のＢ細胞を作製する方法を提供する。この方法は、２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ該２つの遺伝子座のうち一方のみが導入染色体に存在するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意し、そして該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫してヒト抗体配列を発現する複数のＢ細胞を作製することを含む。このような方法のあるものにおいて、該導入染色体はヒト染色体１４の断片である。このような方法のあるものにおいて、該ヒト導入染色体はヒト染色体断片ＳＣ２０ （ｈＣＦ（ＳＣ２０））である。このような方法のあるものは、ヒト抗体を発現する配列を発現する複数のＢ細胞を回収することをさらに含む。このような方法のあるものは、該複数のＢ細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを形成することをさらに含む。このような方法の他のものは、該ハイブリドーマからヒト抗体配列を回収することをさらに含む。このような方法のあるものにおいて、該ヒト抗体配列は精製される。そのような方法のあるものは、ヒト抗体をコードする該配列を回収することをさらに含む。このような方法のあるものにおいて、ヒト抗体をコードする該配列は全長の配列である。幾つかの方法において、ヒト抗体をコードする該配列はトランスフェクトした細胞中で発現される。そのような方法のあるものにおいて、該ヒト軽鎖遺伝子座は天然のヒトκ軽鎖遺伝子座由来の再配列されていない配列を含む。そのような方法のあるものにおいて、該ヒトκ軽鎖遺伝子座は挿入されたＫＣｏ５トランスジーンである。そのような方法のあるものにおいて、該複数のＢ細胞は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択される第１のアイソタイプである抗体をコードする少なくとも１個の第１のＢ細胞を含む。幾つかの方法において、ＩｇＡアイソタイプはＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。幾つかの方法において、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。幾つかの方法において、該複数のＢ細胞は、第１のアイソタイプとは異なる、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択される、第２のアイソタイプである抗体をコードする少なくとも１個の第２のＢ細胞をさらに含む。幾つかの方法において、該複数のＢ細胞は、各々アイソタイプが異なる抗体をコードする少なくとも５個のＢ細胞を含み、該抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。別の態様においては、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【０００７】
本発明はさらに、所定の抗原に結合するヒト配列の抗体を作製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、所定の抗原を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫し、ここで該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ該２つの遺伝子座のうち一方のみが導入染色体に存在し；そして、免疫した該非ヒト哺乳動物からヒト配列の抗体を回収する工程である。別の態様においては、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗体に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【０００８】
本発明のヒト配列の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ等の種々の抗体アイソタイプまたはそれらの混合物を包含しうる。上記ヒト配列の抗体は全長であるか（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２抗体）、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＦｄフラグメント）のみを含むことができる。ヒト配列の抗体のあるものは組換えヒト配列の抗体である。本発明のヒト配列の抗体は典型的には所定の抗原に少なくとも１０８ Ｍ−１、１０９ Ｍ−１、１０１０ Ｍ−１、１０１１ Ｍ−１ および１０１２ Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で結合することができる。本発明のヒト配列の抗体のあるものはモノクローナル抗体である。本発明のヒト配列の抗体のあるものは抗原特異的である。
【０００９】
本発明はさらに、ヒト配列の抗体を分泌する抗原特異的ハイブリドーマを作製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、所定の抗原を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫し、ここで該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ該２つの遺伝子座のうち一方のみが導入染色体に存在し；該トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来のリンパ球を不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成し；そして該ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体の所定の抗原との結合を確認する工程である。このような方法のあるものにおいては、５０％を上回る抗原特異的ハイブリドーマクローンがヒト重鎖およびヒト軽鎖を有する抗体を分泌する。別の態様においては、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１０】
本発明はさらに、所定の抗原に結合するヒト配列の抗体を作製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、所定の抗原を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫し、ここで該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、一方の遺伝子座のみが導入染色体に存在し；そして、形成されたハイブリドーマ細胞を抗原に反応性のある抗体の存在についてスクリーニングする工程である。そのような方法のあるものにおいて、上記ハイブリドーマ細胞は２０％を上回る効率でサブクローン化される。そのような方法のあるものにおいて、抗原に反応性のある抗体は培養中のハイブリドーマから分泌される。そのような方法のあるものにおいて、上記抗原に反応性のある抗体は実質的に純粋である。幾つかの方法において、上記実質的に純粋な抗体は治療用に製剤化される。別の態様においては、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１１】
本発明はさらに、再配列された免疫グロブリン配列を作製する方法を提供する。この方法は、２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ一方の遺伝子座のみが導入染色体に存在するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意し、そして該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から再配列されたヒト免疫グロブリン配列を取得することを含む。幾つかの方法において、該取得工程は、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から再配列されたヒト免疫グロブリン配列を含有するＢ細胞リンパ球を回収することを含む。そのような方法において、該取得工程はＢ細胞リンパ球からｍＲＮＡを単離および増幅させてｃＤＮＡを作製することを含む。そのような方法のあるものは、該ｃＤＮＡから重鎖および軽鎖可変領域配列を単離し、増幅させることをさらに含む。本発明はさらに、該ｃＤＮＡ由来のこれらの増幅された重鎖可変領域配列をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、該ｃＤＮＡ由来の増幅された軽鎖可変領域配列をコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１２】
別の態様において、本発明は本発明のヒト配列の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。したがって、本発明の抗体をコードする核酸を含む組換え発現ベクター、およびそのようなベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞（またはこれら宿主細胞の子孫）もまた本発明に包含される。同様に、これらの宿主細胞を培養することによって本発明の抗体を作製する方法も本発明に包含される。そのような方法のあるものは、上記核酸が発現される条件下で宿主細胞を培養し、そして培養された宿主細胞またはその培養培地から該核酸を回収することを含む。宿主細胞のあるものは真核細胞である。そのような発現ベクターのあるものは、本発明の重鎖および軽鎖可変領域配列をコードする核酸を含み、該重鎖および軽鎖可変領域配列は宿主細胞中で該核酸の発現を制御する調節配列に機能しうる形で結合されている。
【００１３】
本発明はさらに、ヒト抗体ディスプレイライブラリーを作製する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫原を導入し（ここで、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ一方の遺伝子座のみが導入染色体に存在する）；該非ヒトトランスジェニック哺乳動物のリンパ系細胞からヒト抗体鎖をコードする一群の核酸を単離し；そして、上記抗体鎖を提示するディスプレイパッケージライブラリーを形成する（ここで、ライブラリーのメンバーは抗体鎖をコードする核酸を含有し、該抗体鎖は該パッケージにより提示される）工程を含む。そのような方法のあるものにおいて、該非ヒトトランスジェニック哺乳動物は単離工程を実施する際に、免疫原に対する検出可能な力価を欠く。そのような方法のあるものにおいて、上記免疫原は核酸である。そのような方法のあるものにおいて、該核酸は膜結合受容体をコードする。別の態様において、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１４】
本発明はさらに、所定の抗原に結合するヒト配列の抗体またはそのフラグメントを作製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、所定の抗原を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫し（ここで、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち一方はヒト重鎖遺伝子座でもう一方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ一方の遺伝子座のみが導入染色体に存在する）；該免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体Ｖ領域配列を回収し；回収した可変領域をＤＮＡベクター中にクローン化して発現ライブラリーを作製し；そして該ライブラリーを発現させ、所定の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＶ領域配列を同定する工程を含む。別の態様において、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１５】
本発明はさらに、所定の抗原に結合するヒト配列の抗体またはそのフラグメントを作製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、所定の抗原を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫し（ここで、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は少なくとも２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のうち１つはヒト重鎖遺伝子座で他方はヒト軽鎖遺伝子座であり、かつ少なくとも１つの遺伝子座が導入染色体に存在する）；該免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物のＢ細胞から、または該Ｂ細胞と不死化細胞との融合により作製したハイブリドーマから少なくとも１つのヒト抗体Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを単離し；該ｃＤＮＡを発現ベクター中にクローン化し；該ベクターを宿主細胞に導入し；該宿主細胞を培養し；そして、該宿主細胞またはその培養培地から該ヒト配列の抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む。そのような方法のあるものにおいて、上記単離工程はＰＣＲによって実施される。そのような方法のあるものにおいて、上記単離工程は少なくとも１つのＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリースクリーニングによって実施される。そのような方法のあるものにおいて、上記単離工程はファージディスプレイライブラリースクリーニングによって実施される。そのような方法のあるものにおいて、上記ｃＤＮＡは全長のヒト抗体配列をコードする。幾つかの方法において、回収されたヒト配列の抗体アイソタイプは、免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の抗体産生細胞のアイソタイプとは異なる。別の態様において、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は遺伝子変異をさらに含み、該変異は自己抗原に対する免疫応答を増大させるものである。そのような方法のあるものにおいて、該変異はＦｃ−γ ＩＩＢ遺伝子の不活性化である。
【００１６】
本発明はさらに、所定の抗原に対して反応性のあるヒト抗体を発現する染色体導入マウスハイブリドーマ細胞の安定性を向上させる方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。すなわち、導入染色体上に第１のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む第１のマウスを、内因性マウス染色体内に挿入された第２のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む第２のマウスと交配させ；該交配により第１および第２のヒト免疫グロブリン遺伝子座の両方を含む第３のマウスを得て；所定の抗原で第３のマウスまたはその子孫を免疫し；免疫したマウスからＢ細胞を回収し；そして、該Ｂ細胞を不死化細胞と融合させて所定の抗原と反応性のあるヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞を取得する工程を含む。そのような方法のあるものは、該ハイブリドーマ細胞を培地中で培養し；所定の抗原と反応性のあるヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞の存在を同定するために該培地を試験して；該ハイブリドーマ細胞を希釈し；そして、希釈したハイブリドーマ細胞を培養して所定の抗原と反応性のあるモノクローナルヒト抗体を発現するクローン化した細胞系を得る工程をさらに含む。そのような方法のあるものにおいては、クローン化した細胞系は特定したハイブリドーマ細胞の少なくとも５０％から得られる。
【００１７】
別の態様において、本発明は少なくとも１０１０ Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で特定の抗原に結合するＩｇＡアイソタイプのヒト配列の抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は少なくとも１０１０ Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で特定の抗原に結合するＩｇＡアイソタイプのヒト配列の抗体を提供する。
【００１９】
発明の詳細な説明
「導入染色体」という用語は、非ヒト哺乳動物の細胞中に導入することが可能な染色体またはその断片を意味する。導入染色体を導入する細胞の例としては、ＥＳ細胞が挙げられる。導入染色体は選択マーカーを含むことができ、また非ヒト哺乳動物の異なる種に由来することができる。導入染色体はヒト染色体の一部を含むことができる。「染色体導入の」または「導入染色体の」という用語は、「導入染色体を保持している」または「導入染色体に存在する」ことを意味する。
【００２０】
本発明のヒト配列の抗体を、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えを受けることにより、および非ＩｇＭ／非ＩｇＤ抗体についてはアイソタイプスイッチによって、種々の抗原に対するヒト（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル）抗体の複数のアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）を産生することができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、トランスジェニックマウス）において産生することができる。したがって、本発明の種々の態様は抗体および抗体フラグメント、およびそれらの医薬組成物、ならびにそのようなモノクローナル抗体を作製するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物、およびＢ細胞およびハイブリドーマを含む。
【００２１】
別途注記しない限り、「患者」または「被験者」という用語は互換性をもって用いられ、そしてヒト患者および非ヒト霊長類等の哺乳動物、ならびにウサギ、ラット、マウスおよび他の動物等の実験動物を意味する。
【００２２】
「治療する」という用語は、疾患の症状、合併症または生化学的兆候の発生を阻止または遅延させるために本発明の化合物または作用物質を投与して、症状を軽減させる、または疾患、病態もしくは障害（例えば、自己免疫疾患）のさらなる進展を止める、もしくは抑制することを含む。治療は予防的でもよいし（疾患の発症を阻止または遅延させるため、または疾患の臨床的もしくは潜在的症状の発現を阻止するため）、または疾患発現後における症状の治療的な抑制もしくは軽減であってもよい。
【００２３】
一般に、「よく許容された（ｗｅｌｌ−ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）」という表現は、治療の結果として起こる、そして治療決定に影響を及ぼすであろう健康状態に不都合な変化が存在しないことを意味する。
【００２４】
本明細書に用いる「リンパ球」という用語は当技術分野における標準的な意味を有し、そして血液、リンパ、およびリンパ組織に見いだされる単核、非食作用性白血球のうち任意のもの、すなわちＢおよびＴリンパ球を意味する。
【００２５】
「Ｔリンパ球のサブ集団」または「Ｔ細胞サブセット」という表現は、特定の細胞表面マーカーの発現によって特徴づけられるＴリンパ球またはＴ細胞を意味する（Ｂａｒｃｌａｙ， Ａ．Ｎ．ら（編）、１９９７， Ｔｈｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ参照；この参照文献はあらゆる目的のため参照により本明細書に組み入れる）。
【００２６】
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」および「ＣＤ１５２」（例えば、Ｍｕｒａｔａ， １９９９， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５５：４５３−４６０参照）という用語は互換性をもって用いられ、そしてヒトＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、種相同体、およびＣＴＬＡ−４との少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体（例えば、Ｂａｌｚａｎｏ， １９９２， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ． ７：２８−３２）を含む。
【００２７】
ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ１５００６を有する。アミノ酸第１−３７位の領域はリーダーペプチドである；第３８−１６１位の領域は細胞外Ｖ様ドメインである；第１６２−１８７位の領域は膜貫通領域である；そして第１８８−２２３位の領域は細胞質ドメインである。第４９位におけるＧからＡへの転位、第２７２位におけるＣからＴへの転位、および第４３９位におけるＡからＧへの転位を含む、上記ヌクレオチド配列の変異体が報告されている。マウスＣＴＬＡ−４の完全なＤＮＡ配列はＥＭＢＬ登録番号Ｘ０５７１９を有する（Ｂｒｕｎｅｔら， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７−２７０）。アミノ酸第１−３５位の領域はリーダーペプチドである。
【００２８】
「エピトープ」という用語は、抗体と特異的結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常はアミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面グループから成り、そして通常特異的な三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。コンホメーション性エピトープと非コンホメーション性エピトープとは、変性作用を有する溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われないという点で区別される。
【００２９】
完全な「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互結合された少なくとも２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。各重鎖は１つの重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および１つの重鎖定常領域からなる。この重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は１つの軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および１つの軽鎖定常領域からなる。この軽鎖定常領域は１つのドメイン、すなわちＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられたより保存された領域を点在させる、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで以下の順序で並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲη）等の細胞受容体および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を介して免疫グロブリンの宿主組織または因子（例えば、エフェクター細胞等の免疫系の種々の細胞を含む）との結合を仲介することができる。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持している、完全な抗体の抗原結合部分を含む。抗原結合部分の例としては、（ｉ） ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る１価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された ２個のＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ） １つのＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら， １９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、該ＶＬおよびＶＨ領域が対となって１価の分子を形成する１本のタンパク質鎖（１本鎖Ｆｖ （ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：５８７９−５８８３参照）となることを可能とする合成リンカーによってそれらを結合することができる。そのような１本鎖抗体は「抗体」という用語に言及することによりに含まれる。フラグメントは組換え技法または完全な抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって調製することができる。
【００３０】
「ヒト配列の抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（もし存在する場合は）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列の抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異によって導入された変異）を含みうる。しかし、本明細書に用いる「ヒト配列の抗体」という用語は、抗原特異性を付与するに十分であり、かつマウス等の別の哺乳動物の生殖細胞系に由来する全ＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列中にグラフトされている抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含むことを意図していない。
【００３１】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、１つの特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（もし存在する場合は）を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体はヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含む、不死化細胞に融合させたハイブリドーマによって産生される。
【００３２】
「ジクローナル（ｄｉｃｌｏｎａｌ）抗体」という用語は、１つの抗原に対する少なくとも２種の抗体からなる調製物を意味する。典型的には、異なる抗体は異なるエピトープに結合する。
【００３３】
「オリゴクローナル（ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ）抗体」という用語は、１つの抗原に対する３から１００種の異なる抗体からなる調製物を意味する。典型的には、このような調製物中の抗体はある範囲の異なるエピトープに結合する。
【００３４】
「ポリクローナル抗体」という用語は、１つの抗原に対する１種を上回る（２種以上の）異なる抗体からなる調製物を意味する。このような調製物は、ある範囲の異なるエピトープに結合する抗体を含む。
【００３５】
本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＨＳＡ、ヒトＣＤ４およびヒトＥＧＦＲに対するヒト抗体を含む、種々の抗原に対するヒト配列の抗体を提供する。本発明のヒト抗体は、細胞表面受容体（ヒトＣＴＬＡ−４受容体およびヒトＣＤ４コレセプター等）によって伝達されるシグナルを遮断する、またはこれに拮抗する抗体を含む。これらの抗体のうち幾つかは、ＣＴＬＡ−４とヒトＢ７カウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）との相互作用を抑制するようにヒトＣＴＬＡ−４上のエピトープに結合することができる。同様に、これらの抗体のうち幾つかはＣＤ４とヒトＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を抑制するようにヒトＣＤ４上のエピトープと結合することができる。ヒトＣＴＬＡ−４とヒトＢ７との相互作用はヒトＣＴＬＡ−４受容体を担持するＴ細胞の不活性化をもたらすシグナルを伝達するので、上記相互作用の拮抗作用はヒトＣＴＬＡ−４受容体を担持するＴ細胞の活性化を誘導し、増強し、または延長させ、それによって免疫応答を延長させるか、または増強する。「遮断抗体」という用語は、可溶性ヒトＣＴＬＡ−４と細胞に発現されるヒトＢ７リガンドとの結合を、抗体結合部位のヒトＣＴＬＡ−４リガンド結合部位に対する比が１：１より大きく、かつ抗体濃度が１０−８ Ｍより大きい条件下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または９９．９％減少させる抗体を意味する。
【００３６】
本発明はさらに種々のヒト抗原に対するヒト配列のＩｇＡ抗体を提供する。ＩｇＡ抗体の例としては、ＣＤ４、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４およびＥＧＦＲに対する抗体が挙げられる。ＩｇＡ抗体は二量体を形成できるので、そのようなＩｇＡ抗体は向上した架橋特性をもちうる。
【００３７】
他の抗体調製物（多価調製物と呼ばれることもある）は、ヒトＣＴＬＡ−４等の細胞表面受容体に同一細胞上の複数のヒトＣＴＬＡ−４受容体を架橋するような様式で結合する。
【００３８】
架橋は異なるエピトープ特異性を有する可溶性の２価の抗体を組合わせることによっても達成されうる。これらのポリクローナル抗体調製物は、抗体によって仲介される架橋の結果としてシグナルが伝達されうるように抗原上の異なるエピトープに結合する少なくとも２対の重鎖および軽鎖を含む。
【００３９】
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離される本発明の全てのヒト配列の抗体を含む。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えばマウス）（以下に詳述する）から単離される抗体；宿主細胞中にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを用いて発現される抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすること包含する他の任意の手段によって調製、発現、作製または単離される抗体等である。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（もし存在する場合は）を有する。しかし、そのような抗体にｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列を導入したトランスジェニック動物を用いる場合はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を起こすことが可能である。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、およびこれらに関連するものであるが、ヒト抗体生殖細胞系レパートリー内にｉｎ ｖｉｖｏで天然に存在しない場合もある配列である。
【００４０】
「異種抗体」という用語は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物との関連で定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物から成るのではない生物に見いだされ、そして一般には該トランスジェニック非ヒト動物以外の種に由来する抗体に対応するアミノ酸またはそれをコードする核酸を有する抗体を意味する。
【００４１】
「ヘテロハイブリッド抗体」という用語は、異なる生物を起源とする軽鎖および重鎖を有する抗体を意味する。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【００４２】
「実質的に純粋な」または「単離された」という用語は、対象種（例えば、本発明の抗体）が同定され、そして該対象種が優勢な種で存在するように（すなわち、モル基準で組成物中の他のいかなる種よりも豊富であるように）その天然環境の構成要素から分離および／または回収されたことを意味する。また「実質的に純粋な」または「単離された」組成物は、対象種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を構成する場合を意味する。実質的に純粋な、または単離された組成物は、組成物中に存在する全ての巨大分子種の約８０〜９０重量％以上を構成することもできる。単離された対象種（例えば、本発明の抗体）は、組成物が単一の巨大分子種の誘導体から本質的に成る、本質的に均質（通常の検出方法では組成物中に混在する種が検出できない）になるまで精製することも可能である。例えば、ヒトＣＴＬＡ−４に対する単離された抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４との結合を欠き、異なる抗原と結合する他の抗体を実質的に含まないことが可能である。しかしながらさらに、ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば他の種に由来する他の関連抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４種相同体）に対して交差反応性を有する場合がある。さらに、本発明の単離された抗体は他の細胞性物質（例えば、非免疫グロブリン関連タンパク質）および／または化学物質を実質的に含まないことができる。
【００４３】
「特異的結合」とは、他の非特定抗原と比較して特定抗原に対する抗体の優先的な結合を意味する。抗体に「特異的（または選択的）に結合する」という表現は、タンパク質および他の生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）からなる不均質集団における該タンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。典型的には抗体は少なくとも約１ｘ１０６ Ｍ−１ もしくは１０７ Ｍ−１、または約１０８ Ｍ−１〜１０９ Ｍ−１、または約１０１０ Ｍ−１〜１０１１ Ｍ−１またはそれより大きい会合定数（Ｋａ）で結合し、そして特定抗原とは該特定抗原またはそれと密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）と結合する場合の親和性の少なくとも２倍以上の親和性で結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という表現は、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と共に本明細書中で互換性をもって使用される。所定の抗原とは、該抗原に結合する抗体の選択に先だって選択される抗原である。
【００４４】
ペプチドに言及している場合、「特異的に結合する」という表現は、標的分子に対して排他的または優勢して中または高結合親和性を有するペプチド分子を意味する。「に特異的に結合する」という表現は、タンパク質および他の生物学的物質からなる不均質集団の存在下で標的タンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。したがって、指定されたアッセイ条件下で、特定された結合部分は特定の標的タンパク質に優先的に結合し、そして試験サンプル中に存在する他の成分とは有意な量で結合することはない。そのような条件下における標的タンパク質との特異的結合は、特定の標的抗原に対する特異性について選択された結合部分を必要とする場合がある。種々のアッセイフォーマットを用いて特定のタンパク質に対して特異的に反応性のあるリガンドを選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびウエスタンブロット法が抗原に特異的に反応するペプチドを同定するために用いられる。典型的には、特異的または選択的反応はバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そしてより典型的にはバックグラウンドの１０倍を上回る。
【００４５】
抗体について「高親和性」という用語は、少なくとも約１０７ Ｍ−１、少なくとも約１０８ Ｍ−１、少なくとも約１０９ Ｍ−１、少なくとも約１０１０ Ｍ−１、少なくとも約１０１１ Ｍ−１、または少なくとも約１０１２ Ｍ−１以上、例えば１０１３ Ｍ−１ もしくは １０１４ Ｍ−１まで、またはそれより大きい会合平衡定数（Ｋａ）を意味する。しかし、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプについては変動しうる。
【００４６】
本明細書に用いる「Ｋａ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数を意味することを意図している。この定数は１／Ｍという単位である。
【００４７】
本明細書に用いる「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味することを意図している。この定数はＭという単位である。
【００４８】
本明細書に用いる「ｋａ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の反応速度論的会合定数を意味することを意図している。この定数は１／Ｍｓという単位である。
【００４９】
本明細書に用いる「ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の反応速度論的解離定数を意味することを意図している。この定数は１／ｓという単位である。
【００５０】
「特定の抗体−抗原相互作用」とは、そのもとで平衡および反応速度論的定数が測定される実験条件を意味する。
【００５１】
「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラスを意味する。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、そして抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定される。さらなる構造的変異がＩｇＧ （例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ ）およびＩｇＡ （例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の別個のサブタイプを特徴づける。
【００５２】
「アイソタイプスイッチ」とは、それによって抗体のクラスまたはアイソタイプが１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスの１つへ変化する現象を意味する。
【００５３】
「スイッチされていない（ｎｏｎｓｗｉｔｃｈｅｄ）アイソタイプ」とは、アイソタイプスイッチが全く起こっていないときに産生される重鎖のアイソタイプクラスを意味する。スイッチされていないアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流に位置する第１のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチは古典的または非古典的アイソタイプスイッチに分類されてきた。古典的アイソタイプスイッチはトランスジーン中の少なくとも１つのスイッチ配列領域を含む組換え事象によって起こる。非古典的アイソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμとヒトΣμの相同組換え（δ関連欠失）によって起こりうる。別の非古典的アイソタイプスイッチ機構、例えばトランスジーン間および／または染色体間の組換え等が起こってアイソタイプスイッチを実現する場合がある。
【００５４】
「スイッチ配列」という用語は、スイッチ組換えに関与するＤＮＡ配列を意味する。「スイッチ供与」配列（典型的にはμスイッチ領域）は、スイッチ組換えの間に欠失されるべき構築物領域の５’側（すなわち上流）に位置する。「スイッチ受容」領域は欠失されるべき構築物領域と置換定常領域（例えば、γ、ε等）の間にある。組換えが常にそこで起こるという特定の部位はないので、典型的には最終遺伝子配列を該構築物から予測することは不可能である。
【００５５】
「グリコシル化パターン」とはタンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭水化物単位のパターンと定義される。当業者が異種抗体のグリコシル化パターンをトランスジーンのＣＨ遺伝子をそこから誘導した種のグリコシル化パターンよりもトランスジェニック非ヒト動物の種の該パターンにより類似していると認識する場合、異種抗体のグリコシル化パターンはトランスジェニック非ヒト動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンに実質的に類似していると特徴づけうる。
【００５６】
対象に適用される「天然に存在する」という用語は、対象が天然に見いだされうるという事実を意味する。例えば、天然の供給源から単離しうる生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列であって、人間によって実験室で意図的に改変されていない配列は、天然に存在する配列である。
【００５７】
「免疫グロブリン遺伝子座」という用語は、免疫グロブリンペプチドを発現するためにＢ細胞またはＢ細胞前駆体によって利用されうる情報を含む遺伝子エレメントまたは結合された遺伝子エレメントのセットを意味する。このペプチドは重鎖ペプチド、軽鎖ペプチドまたは重鎖および軽鎖ペプチドの融合物でありうる。再配列されていない遺伝子座の場合、Ｂ細胞前駆体によって遺伝子エレメントが組み立てられ、免疫グロブリンペプチドをコードする遺伝子が形成される。再配列された遺伝子座の場合、免疫グロブリンペプチドをコードする遺伝子は遺伝子座内に含有されている。
【００５８】
「再配列された」という用語は、それぞれ完全なＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードするコンホメーションをとったＤ−ＪまたはＪセグメントにＶセグメントが直に隣接して位置している重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を意味する。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定することができる；再配列された遺伝子座は少なくとも１つの組み換えられたヘプタマー／ノナマー相同エレメントを有する。
【００５９】
Ｖセグメントに関連して用いられる「再配列されていない」または「生殖細胞系配置」という用語は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントと直に隣接するように組み換えられていない配置を意味する。
【００６０】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、１本鎖または２本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。別途限定しない限り、これらの用語は天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる、天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。
【００６１】
抗体または抗原に結合する抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連して用いる「単離された核酸」という用語は、該抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が例えばＣＴＬＡ−４以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列（これらは天然においてはヒトゲノムＤＮＡ中で該核酸にフランキングしうる）を含まないことを意味する。
【００６２】
２つの核酸またはポリペプチドの背景において「実質的に同一」という用語は、最大限の対応をもとめて比較し、アラインメントした時、下記の配列比較法を用いて、および／または目視検査によって測定されるように少なくとも約８０％、約９０％、約９５％またはそれより高いヌクレオチドもしくはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を意味する。そのような「実質的に同一」な配列は典型的には相同であると考えられる。「実質的同一性」は、長さが少なくとも約５０残基の配列からなる領域、少なくとも約１００残基の領域、少なくとも約１５０残基の領域、または比較される２つの配列の全長に渡って存在しうる。以下に記述するように、任意の２つの抗体配列はＫａｂａｔのナンバリングスキームを用いることによって１つの方法でのみアラインメントすることができる。したがって抗体対する同一性パーセントは独特の、そしてよく規定された意義を有する。
【００６３】
免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域に由来するアミノ酸は、それぞれＨｘおよびＬｘと称する。ここでｘはＫａｂａｔ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９８７ および１９９１）のスキームに従ってアミノ酸の位置を指示する番号である。Ｋａｂａｔは各サブグループについて抗体のアミノ酸配列を多数列挙し、また該サブグループ内の各残基の位置について最も頻繁に存在するアミノ酸を列挙してコンセンサス配列を作製する。Ｋａｂａｔは列挙された配列中の各アミノ酸に残基番号を割当てる方法を用いている。そして、この残基番号を割当てる方法は当技術分野において標準となっている。Ｋａｂａｔのスキームは、保存されたアミノ酸を参照して対象の抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列の１つとアラインメントすることによって彼の一覧表に含まれていない他の抗体にも拡張することが可能である。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムの使用は、異なる抗体中の等価な位置に存在するアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体のＬ５０位にあるアミノ酸はマウス抗体のアミノ酸Ｌ５０位と等価な位置を占める。同様に、それぞれの核酸によってコードされるアミノ酸配列がＫａｂａｔのナンバリングの条件に従ってアラインメントされる時、抗体鎖をコードする核酸もまたアラインメントされる。別の構造的定義がＣｈｏｔｈｉａら， １９８７ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７； Ｃｈｏｔｈｉａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３；および Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６：６５１−６６３ （１９８９）（これらの文献はあらゆる目的のため参照により本明細書に組み入れる）によって提案された。
【００６４】
「に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という表現は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞もしくはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で分子が該特定のヌクレオチド配列と結合すること、二重構造となること（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイズすることを意味し、ここで該特定のヌクレオチド配列は少なくともバックグラウンドの約１０倍検出される。１つの実施形態において、核酸は別な方法で本発明の範囲内にあることが決定された核酸（本明細書に記述する代表的な配列等）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力によって本発明の範囲内にあると決定されうる。
【００６５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、プローブが典型的には核酸の複雑な混合物中に存在する標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列には有意な量でハイブリダイズしない条件を意味する（陽性シグナル（例えば、本発明の核酸の同定）はバックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である）。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして異なる環境中では異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについてのさらなる指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ（編）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）； Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｄ， Ｐａｒｔ Ｉ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｔｉｊｓｓｅｎ（編）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９３）に見いだされる。
【００６６】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン濃度（ｐＨ）における特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的であるプローブの５０％が平衡状態において標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン濃度（ｐＨ）および核酸濃度下で）である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは平衡状態においてプローブの５０％が占められる）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０ Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０ Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であって、かつ短いプローブ（例えば１０−５０ヌクレオチド）の場合は温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより大きい）の場合は少なくとも約６０℃であるような条件であろう。ストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（以下に引用）に記述されているように、ホルムアミド等の脱安定化剤の添加によっても達成することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。高ストリンジェンシーまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、４２℃でインキュベーション、または５ｘ ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳ中、６５℃でインキュベーションし、いずれも０．２ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中、６５℃で洗浄することが挙げられる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナル（例えば、本発明の核酸の同定）はバックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である。本発明の範囲内にある核酸を同定するために用いられるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含むバッファー中、４２℃でハイブリダイゼーション、または５ｘ ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳを含むバッファー中、６５℃でハイブリダイゼーションし、いずれも０．２ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中、６５℃で洗浄すること、が挙げられる。本発明においては、本発明の核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示する核酸配列を用いたストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロット法によって同定することができる。そのようなハイブリダイゼーション（本発明の範囲内にある核酸の同定を目的とする）のためのさらに別のストリンジェントな条件は、４０％ホルムアミド、１ ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを含むバッファー中、３７℃でハイブリダイゼーションすることを含む条件である。
【００６７】
しかし、ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は決定的に重要ではない。核酸が本発明の範囲内にあるか否かを決定する条件を規定するのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内にある核酸を同定するために用いられる洗浄条件としては、例えば、ｐＨ ７で約０．０２モルの塩濃度および少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度；または約０．１５ Ｍ ＮａＣｌの塩濃度、７２℃、約１５分間；または約０．２Ｘ ＳＳＣの塩濃度、少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度、約１５〜約２０分間；またはハイブリダイゼーション複合体を、塩濃度が約２Ｘ ＳＳＣで０．１％ ＳＤＳを含む溶液を用いて室温で１５分間２回洗浄し、次に０．１％ ＳＤＳを含む０．１Ｘ ＳＳＣを用いて６８℃で１５分間２回洗浄する；または等価な条件が挙げられる。ＳＳＣバッファーおよび等価な条件の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎおよび Ａｕｓｕｂｅｌを参照されたい。
【００６８】
「配列同一性」という用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の類似性の程度を意味し、以下に記述する方法、等の当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。
【００６９】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して用いられる「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大限の対応をもとめて比較し、アラインメントした場合、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手作業のアライメントおよび目視検査によって測定される、特定された領域にわたって同一であるか、または特定された百分率の同一アミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００７０】
２つの核酸またはポリペプチドに関連して用いられる「実質的に同一」という用語は、最大限の対応をもとめて比較し、アラインメントした場合、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定される少なくとも６０％、しばしば少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、または少なくとも９５％ヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的同一性は長さが少なくとも約５０塩基または残基の配列からなる領域、より好ましくは少なくとも約１００塩基または残基からなる領域にわたって存在する。そして最も好ましくは、上記配列は少なくとも約１５０塩基または残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態においては、上記配列はコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００７１】
配列比較のためには、典型的には１つの配列が参照配列の役を務め、試験配列はこの配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を設定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを設定する。デフォルトプログラムパラメータを用いることが可能である。または、別のパラメータを設定することも可能である。次に、配列比較アルゴリズムはプログラムパラメータに基づいて試験配列の参照配列に対する配列同一性パーセントを計算する。核酸およびタンパク質の配列比較のためには、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムならびに以下に考察するデフォルトパラメータを用いることができる。
【００７２】
本明細書に用いる「比較ウインドウ」とは、２０から６００、通常は約５０から約２００、より普通には約１００から約１５０個のポジションから成る群より選択される任意の数の連続ポジションからなるセグメントへの言及を含む。２つの配列が最適にアラインメントされた後、そのセグメント内で試験配列を同数の連続ポジションからなる参照配列と比較することができる。比較のための配列のアライメント方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所ホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施［ＦＡＳＴＤＢ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ］、または手作業によるアライメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７ （１９９９補遺）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．参照）によって行うことができる。
【００７３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの好ましい例はＦＡＳＴＡアルゴリズムであり、これはＰｅａｒｓｏｎ， Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４に記述されている。Ｗ．Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２２７−２５８も参照されたい。同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントに用いられる好ましいパラメータは最適化されている：ＢＬ５０ Ｍａｔｒｉｘ １５： −５、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝ ２、連結ペナルティ＝ ４０、最適化＝ ２８、ギャップペナルティ−１２、ギャップ長ペナルティ＝ −２、および幅＝ １６。
【００７４】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの別の好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌら， １９７７， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０にそれぞれ記述されている。本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記述するパラメータを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムが使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによる高スコア配列ペア（ＨＳＰ）の初期同定を包含する。これらのワードは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントを行った時、一致するか、または正の数である閾値スコアＴを満たす。Ｔは近接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近接ワードヒットは、ワードを含むより長いＨＳＰを見いだす検索を開始するためのシーズの役割を果たす。累積アライメントスコアを増大させられる限り、各配列に沿ってワードヒットの検索を両方向に伸ばす。累積スコアはヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（一致する残基ペアに対する報償スコア；常に＞０）およびＮ（一致しない残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの検索は以下の場合に停止される。すなわち、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１つ以上の負にスコアリングされる残基アライメントの累積によって累積スコアがゼロまたはそれ以下になる場合；または各配列の末端に到達した場合である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸはアライメントの感受性および速度を決定する。ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）＝３および期待値（Ｅ）＝１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）アライメント（Ｂ）＝５０、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
【００７５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小総計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小総計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、試験核酸は参照配列に類似していると見なされる。
【００７６】
有用なアルゴリズムの別な例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは段階的なペアワイズアライメントを用いて１群の関連配列からマルチプル配列アライメントを作製して、配列間の関係および配列同一性パーセントを示す。ＰＩＬＥＵＰはまた、アライメントを作製するために用いられるクラスター形成関係（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を示すツリーまたは系統樹を描く。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０の段階的アライメント法の単純化を用いる。用いられる方法はＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ， １９８９， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３によって記述されている方法に類似している。そのプログラムは、それぞれの最大の長さが５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である３００個までの配列をアラインメントすることができる。マルチプルアライメント法は最も類似した２つの配列のペアワイズアライメントから始まり、２つのアラインメントされた配列のクラスターを作製する。次に、このクラスターを次に最も関連している配列、またはアラインメントされた配列のクラスターにアラインメントする。２つの配列クラスターが、２つの個々の配列のペアワイズアライメントの単純な伸長によってアラインメントされる。最終アライメントは、一連の段階的ペアワイズアライメントによって達成される。このプログラムは、特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの配列比較領域のための座標を指定することによって、そしてプログラムパラメータを設定することによって実施される。ＰＩＬＥＵＰを用いて、以下のパラメータ、すなわちデフォルトギャップウエイト（３．００）、デフォルトギャップ長ウエイト（０．１０）、およびウエイテド末端ギャップを用いて、参照配列を他の試験配列と比較して配列同一性パーセントを決定する。ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの例えばバージョン７．０ （Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら， １９８４， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５）から得ることができる。
【００７７】
ＤＮＡおよびアミノ酸配列のマルチプルアライメントに適したアルゴリズムの別の好ましい例はＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．ら， １９９４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：４６７３−４６８０）である。ＣＬＵＳＴＡＬＷは配列群の間のペアワイズな多重比較を実施し、そしてそれらの配列を相同性に基づいたマルチプルアライメントに組み立てる。ギャップ挿入ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティはそれぞれ１０および０．０５であった。アミノ酸アライメントについては、タンパク質ウエイトマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを用いることができる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）。
【００７８】
本発明の核酸は全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ密度勾配法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技法（例えば、本明細書で議論され、あらゆる目的のために参照により組み入れられているＳａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌ参照）を含む標準的技法によって精製されて他の細胞成分または他の不純混合物（例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質）から分離された場合、「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。ＲＮＡであれ、ｃＤＮＡであれ、ゲノムＤＮＡであれ、またはそれらのハイブリッドであれ、本発明の核酸配列および本発明を実施するために用いられる他の核酸配列は種々の供給源から単離し、遺伝子操作し、増幅し、および／または組換えにより発現させることができる。細菌の組換え発現系に加えて、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物系などの任意の組換え発現系を用いることができる。または、これらの核酸はｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に合成することができる。核酸操作のための技法、例えば、発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識化、配列決定およびハイブリダイゼーション等は科学文献および特許文献に十分記述されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。核酸は当業者に周知の多数の一般的手段のうち任意のものによって分析および定量することができる。それらの手段には、例えば、ＮＭＲ、分光測定、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および超拡散クロマトグラフィー等の分析的な生化学的方法；流体またはゲル沈降反応、免疫拡散法（単純拡散または二重拡散）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法等の種々の免疫学的方法；サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性標識、シンチレーションカウンティングおよびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【００７９】
本発明の核酸組成物はしばしばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの混合物に由来する天然配列（改変された制限酵素部位などを除いて）の形をとるが、遺伝子配列を提供する標準的な技法に従って変異させることが可能である。コード配列については、これらの変異は所望通りにアミノ酸配列に影響を及ぼすことができる。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチと実質的に相同な、またはそれらに由来するＤＮＡ配列および本明細書に記述する他のそのような配列が考慮されている（ここで「由来する」とは、ある配列が他の配列と同一であるか、またはそれから改変されたことを示す）。
【００８０】
ある核酸が他の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、それは「機能しうる形で連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼしている場合は、それらは該配列に機能しうる形で連結されている。転写調節配列に関して、「機能しうる形で連結されている」とは連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、そして２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合には、連続していてかつ読み枠が合っていることを意味する。そしてスイッチ配列については、「機能しうる形で連結されている」とは該配列がスイッチ組換えを実施可能であることを意味する。
【００８１】
「ベクター」という用語は、自身がそこに連結された他の核酸分子を運ぶことができる核酸分子をいうものである。ベクターの１種はプラスミドであり、これは付加的ＤＮＡセグメントをそこに連結することができる環状２本鎖ＤＮＡループをいう。別種のベクターはウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは導入された宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は宿主細胞に導入された後に該細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、そしてそれによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、自身がそこに機能しうる形で連結された遺伝子の発現を指令することが可能である。そのようなベクターを本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技法に有用な発現ベクターはしばしばプラスミド形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」という用語は互換性をもって用いる場合がある。なぜならプラスミドは最もよく用いられる形態のベクターだからである。しかし、本発明は等価の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等の他の形態の発現ベクターをも含むことを意図している。
【００８２】
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞をいう。そのような用語は特定の被験細胞のみでなく、該細胞の子孫をもさすことが理解されねばならない。突然変異または環境的影響によって後続世代にはある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でないかもしれないが、それでもなお本明細書に用いる「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００８３】
「標識」とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては３２Ｐ、蛍光色素、電子高密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般に使用される酵素等）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンもしくはタンパク質（例えば、本発明のポリペプチドを、放射性標識の該ペプチドへの組み込み等によって検出可能とし、そして該ペプチドに特異的に反応する抗体の検出に用いることができる）が含まれる。
【００８４】
細胞に関連して本明細書中で用いられる「ソーティング」という用語は、蛍光活性化細胞ソーター等を用いて達成することができる細胞の物理的ソーティング、ならびに細胞表面マーカーの発現に基づく細胞の分析（例えば、ソーティングの不存在下におけるＦＡＣＳ分析）の両方をいう。
【００８５】
「免疫細胞応答」という用語は、免疫細胞の遊走、標的細胞の殺害、食作用、抗体の産生および免疫応答の他の可溶性エフェクターの産生、等をもたらす生化学的変化を免疫細胞中にもたらす外部または内部刺激（例えば、抗原、サイトカイン、ケモカインおよび他の細胞）に対する免疫系細胞の応答をいう。
【００８６】
「Ｔリンパ球応答」および「Ｔリンパ球活性」という用語は、本明細書中ではＴリンパ球に依存する免疫応答の構成要素（すなわち、Ｔリンパ球の増殖および／またはヘルパー、細胞傷害性キラー、またはサプレッサーＴリンパ球への分化、ヘルパーＴリンパ球によるＢリンパ球への抗体産生を引き起こすまたは阻止するシグナルの提供、細胞傷害性Ｔリンパ球による特定標的細胞の殺害、および他の免疫細胞の機能をモジュレートするサイトカイン等の可溶性因子の放出）をさして互換性をもって用いられる。
【００８７】
「免疫応答」という用語は、侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌にかかった細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊、またはそれらの人体からの排除をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗原、サイトカインおよび補体を含む）の協調した作用をいう。
【００８８】
免疫応答の構成要素は、当業者に周知の種々の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球を放射性標識した標的細胞と共にインキュベートし、そして放射活性の放出によってこれら標的細胞の溶解を検出することができる；（２）ヘルパーＴリンパ球を抗原および抗原提示細胞と共にインキュベートし、そしてサイトカインの合成および分泌を標準的な方法により測定することができる（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ， Ａ．ら， １９９５， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：３７３−８０； （３）抗原提示細胞を全タンパク質抗原と共にインキュベートし、そしてＴリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法によってＭＨＣ上の該抗原の提示を検出することができる（Ｈａｒｄｉｎｇら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：４２３０−６）； （４）マスト細胞を該細胞のＦｃ−ε受容体を架橋する試薬と共にインキュベートし、そして酵素免疫検定法によってヒスタミンの放出を測定することができる（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎら， １９８３， ＴＩＰＳ ４：４３２−４３７）。
【００８９】
同様に、モデル生物（例えばマウス）またはヒト患者中の免疫応答の生成物もまた当業者に周知の種々の方法によって検出することができる。例えば、（１）ワクチン接種に応答する抗体の産生は臨床実験室で現在使われている標準的方法（例えばＥＬＩＳＡ）によって容易に検出できる；（２）免疫細胞の炎症部位への遊走は、皮膚の表面を掻き取り、遊走細胞を捕捉するための滅菌容器を掻き取った部位の上に置くことによって検出することができる（Ｐｅｔｅｒｓら， １９８８， Ｂｌｏｏｄ ７２： １３１０−５）； （３）マイトジェンまたは混合リンパ球反応に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖は３Ｈ−チミジンを用いて測定することができる；（４） ＰＢＭＣ中の顆粒球、マクロファージおよび他の食細胞の食細胞能は、ＰＢＭＣを標識化粒子と共にウエルに入れることによって測定することができる（Ｐｅｔｅｒｓら， １９８８）；および（５）免疫系細胞の分化は、ＣＤ４およびＣＤ８等のＣＤ分子に対する抗体を用いてＰＢＭＣを標識し、そしてこれらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することによって測定することができる。
【００９０】
本明細書に用いる「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達現象」という用語は、細胞と刺激性化合物または作用物質との相互作用から生じる少なくとも１つの、より一般的には一連の、生化学的反応をいう。このように、刺激性化合物と細胞との相互作用はシグナル伝達経路を介して伝えられる「シグナル」を生成し、最終的に細胞応答（例えば上述の免疫応答）をもたらす。
【００９１】
シグナル伝達経路とは、細胞の一部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的な関係をいう。本明細書に用いる「細胞表面受容体」という用語は、シグナルを受け取り、そしてそれを細胞の原形質膜の向こう側へ伝達することができる分子または分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例はＣＴＬＡ−４のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ７リガンドである。
【００９２】
細胞中のシグナル伝達経路は、細胞と該細胞の内側または外側に存在する刺激物質との相互作用によって開始されうる。外部（すなわち、細胞の外側）の刺激物質（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ−抗原複合体）が細胞表面受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）と相互作用するならば、シグナル伝達経路は細胞膜を横切って（すなわち細胞の原形質を介して）、そしてある場合には細胞核内にシグナルを伝えることができる。内部（すなわち、細胞の内側）の刺激物質が細胞内シグナル伝達分子と相互作用するならば、シグナル伝達経路は細胞の原形質を介した、そしてある場合には細胞核内へのシグナル伝達をもたらすことができる。
【００９３】
シグナル伝達は、例えば、分子のリン酸化；非共有結合性アロステリック相互作用；分子の複合体化；分子のコンホメーション変化；カルシウム放出；リン酸イノシトール産生；タンパク質分解開裂；環状ヌクレオチド産生およびジアシルグリセリド産生によって起こりうる。典型的には、シグナル伝達はシグナル伝達分子のリン酸化によって起こる。
【００９４】
「非特異的Ｔ細胞活性化」という用語は、Ｔ細胞をそれらの抗原特異性と無関係に刺激することをいう。
【００９５】
総論
ヒトκ軽鎖遺伝子座の安定性の向上を達成するため、導入染色体技術をトランスジェニック動物を作製するためのより以前の前核マイクロインジェクション技術と組合わせた。ヒトκ軽鎖遺伝子座トランスジーンＫＣｏ５ （Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ．ら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：８４５−８５１； 米国特許第５，７７０，４２９号）はヒトκ遺伝子座のかなりの部分を含み、そしてマウス生殖細胞系において、および該トランスジーン由来のヒトκ鎖を発現するＢ細胞およびハイブリドーマにおいて安定に維持される。このトランスジーンを、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の機能不活性化変異と共に安定な導入染色体ｈＣＦ（ＳＣ２０）と組合わせて、多数のヒト重鎖アイソタイプを含む広範なヒト抗体レパートリーを発現する動物を作製した。その結果、二重ＴＣ／ＫＯマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：７２２−７２７）と比較して向上した軽鎖トランスジーンの安定性は、各融合からのより多数のハイブリドーマの回収を提供する。
【００９６】
本発明は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭを含む重鎖アイソタイプのうち、所望の任意のアイソタイプの完全なヒト抗体の単離を提供する。特に、所定の抗原に対する高い親和性を有するいくつかの異なる抗体が単一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されうる。
【００９７】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスまたは他の齧歯動物であり、寄託された材料を用いて作製することも可能である。ｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持するニワトリＤＴ４０細胞はブダペスト条約に基づいて２００１年５月９日に３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１中央第６、産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託された。寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−７５８３である。該細胞系の名称はＳＣ２０と定められた。
【００９８】
ｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持するニワトリＤＴ４０細胞は１９９９年８月１８日にＦｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＦＩＲＤＩ）、Ｔａｉｗａｎにも寄託されている。寄託番号はＣＣＲＣ ９６００９９である。該細胞系の名称はＴａｉｗａｎへの寄託時にＳＣ２０（Ｄ）と定められた。ニワトリＤＴ４０細胞中に保持されているｈＣＦ（ＳＣ２０）をＷＯ ００／１０３８３ （ＥＰ １１０６０６１）に記述されているようにマウスＥＳ細胞に導入することが可能である。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞からミクロセルを作製し、ＣＨＯ細胞と融合させる。次に、Ｇ４１８耐性に基づいてｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持するＣＨＯ細胞を選択することができる。ｈＣＦ（ＳＣ２０）の保持は、市販のヒトＣＯＴ１ ＤＮＡまたはヒト染色体１４特異的プローブを用いたＰＣＲまたはＦＩＳＨ分析によって確認することができる。その後、ｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持するＣＨＯ細胞からミクロセルを作製し、これをマウスＥＳ細胞と融合させる。ｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持するＥＳ細胞は、ＣＨＯ細胞の場合と同じ方法で選択することができる。
【００９９】
ＫＣｏ５トランスジーンＤＮＡを保持する細胞は２００１年１１月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９にブダペスト条約に基づいて寄託され、下記の受託番号を与えられた：ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＰＴＡ−３８４２を割当てられた酵母中の１７Ｅ１ （ＹＡＣ ｙ１７， Ｍｅｄａｒｅｘ ＫＣｏ５）（遺伝物質はヒト免疫グロブリンκ可変領域遺伝子座というインサートを含む酵母人工染色体である）；ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＰＴＡ−３８４３を割当てられた大腸菌中のｐＫＶ４ （Ｍｅｄａｒｅｘ ＫＣｏ５）（ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子を含むプラスミド）；ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＰＴＡ−３８４４を割当てられた大腸菌中のｐＫＣＩＢ （Ｍｅｄａｒｅｘ ＫＣｏ５） （ヒト免疫グロブリンＪκおよびκ定常領域遺伝子を含むプラスミド）。
【０１００】
ＫＣｏ５トランスジーンのＤＮＡを保持する細胞は２００１年１１月２２日にＦｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＦＩＲＤＩ）、Ｔａｉｗａｎにも寄託されている。ｐＫＶ４、 ＹＡＣｙ１７およびｐＫＣＩＢの寄託番号はそれぞれＣＣＲＣ ９４０３８３、ＣＣＲＣ ９４０３８５、およびＣＣＲＣ ９４０３８６である。
【０１０１】
トランスジーンＫＣｏ５は以前に記述されているようにマウス細胞に導入することができる（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ．同文献、米国特許第５，７７０，４２９号の実施例３８も参照；下記の実施例２も参照）。
【０１０２】
免疫グロブリンの一般的特徴
基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の同一な２つの対から成り、各対は１本の「軽」鎖（約２５ ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は約１００から１１０個またはそれ以上のアミノ酸から成る、抗原認識に主として関与する可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端は、エフェクター機能に主として関与する定常領域を形成する。
【０１０３】
軽鎖はκまたはλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、そして抗体のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸から成る「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は１〜１０個またはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域をも含む。（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｐａｕｌ， Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）、第７章を全般的に参照；あらゆる目的のために参照によりその全体を本明細書に組み入れる。）
各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって完全な抗体は２つの結合部位を有する。２価抗体または二重特異性抗体を除いて、これら２つの結合部位は同一である。鎖はすべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって連結された比較的保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）から成る同一の一般的構造を示す。各対の２本の鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によってアラインメントされ、特定エピトープへの結合を可能とする。Ｎ末端からＣ末端方向へ、軽鎖および重鎖の両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４というドメインを構成する。各ドメインへのアミノ酸の割当てはＫａｂａｔ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９８７ および１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７ （１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ （１９８９）の定義に従う。
【０１０４】
天然のヒト免疫グロブリン遺伝子座
ヒト免疫グロブリンは天然においては３つの別個な遺伝子座、すなわち重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖によってコードされている。これらの天然の遺伝子座はそれぞれ染色体１４、２および２２上に位置している。ヒト染色体１４の長腕のテロメア近傍の１４ｑ３２．３に位置する天然のヒト重鎖遺伝子座は約１．３メガベースにわたって伸び、そして約４５個の発現されるＶ遺伝子セグメント、２７個のＤ遺伝子セグメント、６個のＪ遺伝子セグメントおよび９個の定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントをコードする。染色体２上の２ｐ１１．１２に位置する天然のヒトκ軽鎖遺伝子座は約１．８メガベースにわたって伸び、そして約３４個の発現されるＶ遺伝子セグメント、５個のＪ遺伝子セグメントおよび１個のＣ領域遺伝子セグメントを含む。２２ｑ１１．２に位置する天然のヒトλ遺伝子座は約０．９メガベースにわたって伸び、そして約３０個のＶ遺伝子セグメントならびに各々が１個のＪ遺伝子セグメントおよび１個のＣ遺伝子セグメントを含む４個の機能的Ｊ−Ｃ対をコードする。これらの天然の遺伝子座のそれぞれは、欠失、挿入、および単一ヌクレオチド多型をも含みうる。
【０１０５】
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体の産生は、抗原（例えば、ＣＤ４、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＳＡ、ＥＧＦＲまたはＣＴＬＡ−４等のヒトタンパク質抗原、病原体にコードされる抗原、毒素、または他の抗原）を用いて動物を免疫する、等によって達成することができる。上記抗原を含むより長いポリペプチド、または上記抗原の免疫原性断片、または上記抗原の抗体に対するイディオタイプ抗体もまた用いることができる。Ｈａｒｌｏｗおよび Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ＣＳＨＰ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８）、ならびに ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ， Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９８０）（両文献はあらゆる目的のため参照により本明細書に組み入れる）を参照されたい。そのような免疫原は天然の供給源から、またはペプチド合成もしくは組換え発現によって得ることができる。場合により、免疫原は以下に記述するようにキャリアータンパク質に結合させて、または他の方法でそれと複合体化させて投与することができる。場合により、免疫原をアジュバントと共に投与することができる。以下に記述するように数種類のアジュバントを用いることができる。完全フロイントアジュバントおよび不完全アジュバントをこの順序で用いることが実験動物を免疫するのに好ましい。ポリクローナル抗体の作製にはウサギまたはモルモットが典型的に用いられる。モノクローナル抗体の作製には齧歯動物（例えば、マウス、ラットおよびハムスター）が典型的に用いられる。これらのマウスはトランスジェニックマウスであってもよく、そして以下に記述するようにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含みうる。免疫後、感作された動物は導入された免疫原に対する血清応答を生起させる。この血清応答は種々の異なるアッセイを用いて、回収した血清の滴定によって測定することができる。一般に用いられるアッセイの１例はＥＬＩＳＡである。血清応答の大きさは一般に力価と呼ばれる。例えば、１０００という力価は反応性抗体の存在が血清の１０００倍希釈物のアッセイによって検出可能であることを示す。典型的には、免疫感作は未感作動物に見いだされる血清応答よりも数桁大きい大きさの血清応答をもたらす。大きさが１桁または２桁にすぎない血清応答は弱いと見なされ、典型的には抗原に反応性のある抗体を発現するＢ細胞が少数しか存在しないことを示している。モノクローナル抗体はリンパ球を不死化細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合させてハイブリドーマ細胞と呼ばれるハイブリッド細胞を形成することによって常套的に得られる。新たに形成されたハイブリドーマ細胞は、抗体発現特性を親リンパ球から、そして増殖特性を親不死化細胞から得る。新たに形成されたハイブリドーマ細胞は、培養培地を含む培養皿（例えば、９６穴プレート）中で増殖させる。所望の重鎖および軽鎖アイソタイプの、抗原反応性抗体の存在について培養上清を試験する（典型的には融合の１〜２週間後）。次に、この一次培養物中の細胞を希釈し、そして再度播いて単一種のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の個々のクローンを単離する。この二次培養物をさらにサブクローン化して三次培養物、等を得ることができる。このサブクローニング法によりハイブリドーマクローンを得るために用いることができる抗原反応性一次培養物の画分は、サブクローニング効率の尺度を提供する。もし抗原陽性一次ハイブリドーマ培養物の全てがクローン化細胞系を得るために使用できるならば、サブクローニング効率は１００％である。発現される抗体をコードする免疫グロブリン遺伝子座が不安定である場合（例えば、細胞分化の間に染色体、染色体断片または導入染色体の喪失よって、または挿入されたアレイの欠失組換えによって、または他の何らかの機構によって容易に失われる場合）、サブクローニング効率は低下する（すなわち、１００％未満）。サブクローニング効率が高い場合（例えば、２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上または９５％）は、モノクローナル抗体を得るためのプラットフォームをもつことは特に有用である。抗体は抗原との特異的結合についてスクリーニングされる。場合により、抗体は抗原の特定領域との結合についてさらにスクリーニングされる。タンパク質抗原については、後者のスクリーニングは該抗原ペプチドが欠失した変異体の集団と抗体との結合を測定し、そしてどの欠失変異体が抗体に結合するかを突き止めることによって達成することができる。結合はウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ等によって評価することができる。抗体に対する特異的結合を示す最小の断片は、該抗体のエピトープを規定する。しかし、あるエピトープは実際のエピトープの外側に位置するエレメントを欠失させることによって失われる可能性がある不連続な構成エレメントから成る。または、試験抗体および参照抗体が抗原との結合を競合する競合アッセイによってエピトープ特異性を測定することができる。もし試験抗体および参照抗体が競合するならば、それらは同一のエピトープまたは複数の十分近位に位置するエピトープと結合し、一方の抗体の結合は他方の抗体の結合を妨げている。
【０１０６】
Ｂ細胞ハイブリドーマ由来の抗体をコードする核酸のクローニング
重鎖および軽鎖の少なくとも可変領域をコードする核酸を免疫された、またはまだ実験に使用されたことのないトランスジェニック動物からクローン化することができる。核酸はそのような動物のリンパ細胞からゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとしてクローン化することができる。免疫グロブリン配列のクローニングに先だって該細胞を不死化する必要はない。通常、ｍＲＮＡを単離し、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写によって増幅する。次に、ヒト免疫グロブリンの保存された領域に対するプライマーを用いて、得られたｃＤＮＡを増幅する。ライブラリーは非μ配列（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＡ）に特異的な３’プライマーを用いることによって非μアイソタイプを容易に富化することができる。典型的には、増幅された軽鎖の集団は少なくとも１００、１０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００個の異なる軽鎖を含む。同様に、増幅された重鎖の集団は少なくとも１００、１０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００個の異なる重鎖を含む。例えば、ＩｇＧプライマーを用いると、典型的には増幅された重鎖の少なくとも９０、９５または９９％がＩｇＧアイソタイプの重鎖である。重鎖および軽鎖の少なくとも可変領域をコードする核酸は上述のハイブリドーマから種々の周知の方法（ＰＣＲまたはヒト抗体の保存された領域に特異的なＤＮＡプローブによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、等）によってクローン化することも可能である。サブクローン化すべき抗体鎖をコードする核酸はフランキングする配列を制限酵素で消化することによって切り出すことができる。または、コード配列の両側を挟む部位に対するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ編， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ＮＹ， １９９２）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０）； Ｍａｔｔｉｌａら， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９６７； Ｅｃｋｅｒｔら， １９９１， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７， ＰＣＲ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）を全般的に参照されたい。これらの参照文献およびそこに引用されている文献はあらゆる目的のため本明細書に組み入れる。
【０１０７】
抗体の組換え発現
場合により定常領域に連結されている軽鎖および重鎖の可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。この軽鎖および重鎖は同一の、または異なる発現ベクター中にクローン化することができる。抗体鎖をコードするＤＮＡセグメントは、発現ベクター中の抗体鎖の発現を確実なものとする制御配列に機能しうる形で連結される。このような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結配列を含む。発現ベクターは典型的にはエピソームとして、または宿主染色体に組み込まれた１部分として、宿主生物中で複製可能である。
【０１０８】
大腸菌は本発明の抗体を発現するために特に有用な原核生物宿主の１つである。使用に適する他の微生物宿主としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属細菌、サルモネラ属、セラチア属等の他の腸内細菌科細菌、および種々のシュードモナス属種が含まれる。これらの原核生物宿主を用いる場合にも、宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば、複製起源）および調節配列（ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系またはλファージ由来のプロモーター系など）を典型的に含む発現ベクターを作製することができる。
【０１０９】
酵母等の他の微生物もまた発現のために用いることができる。サッカロミセス属酵母は、プロモーター（３−ホスホグリセラートキナーゼおよび他の解糖酵素のプロモーターを含む）、複製起源、転写終結配列、等の発現制御配列を有する適切なベクターと共に用いると好ましい宿主である。
【０１１０】
哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明の抗体を発現させ、産生させるために用いることができる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ， Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８７参照）。真核細胞が好ましい。なぜなら、完全な抗体を分泌することができる多数の適切な宿主細胞系がすでに開発されているからである。本発明の免疫グロブリンをコードする核酸を発現するのに好ましい適切な宿主細胞は以下の物を含む。すなわち、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎細胞系（２９３）（Ｇｒａｈａｍら， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）； チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ （ＣＨＯ， ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， １９８０， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５１）；サル腎細胞 （ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）； アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら， １９８２， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−４６）；バキュロウイルス細胞である。
【０１１１】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列、ならびに発現制御配列）を含むベクターを宿主細胞に導入することができる。原核細胞に対しては塩化カルシウムトランスフェクションが一般に用いられ、他方、他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを用いることができる。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， 第２版， １９８９（あらゆる目的のため、その全体を本明細書に組み入れる）を全般的に参照されたい。）重鎖および軽鎖を別々の発現ベクターにクローン化する場合、該２つのベクターは完全な免疫グロブリンの発現およびアセンブリーを得るため共トランスフェクトされる。組換えＤＮＡの導入後、免疫グロブリン産物を発現する細胞系を選択する。安定した発現（すなわち、５０回継代後に発現レベルが低下しない）が可能な細胞系が好ましい。
【０１１２】
一旦発現されたならば、本発明の完全な抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を当技術分野の標準的方法に従って精製することができる。それらの方法には、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等が含まれる（Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｆｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．， １９８２を全般的に参照）。少なくとも約９０から９５％均質な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、さらに９８から９９％またはそれ以上の均質が最も好ましい。
【０１１３】
キメラおよびヒト化抗体
キメラおよびヒト化抗体は、キメラまたはヒト化抗体構築の出発材料を提供したマウスまたは他の非ヒト抗体と同一の、またはそれに類似した結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体とは、その軽鎖および重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから典型的には遺伝子操作によって構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４等のヒト定常（Ｃ）セグメントに連結することができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。このように、典型的なキメラ抗体はマウス抗体由来のＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来のＣまたはエフェクタードメインから成るハイブリッドタンパク質である。
【０１１４】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（受容抗体と称する）に由来する可変領域フレームワーク残基および実質的にマウス抗体（供与免疫グロブリンと呼ばれる）に由来する相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎらの１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３およびＷＯ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、第５，５３０，１０１号、ならびにＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号（あらゆる目的のため、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）を参照されたい。存在する場合、定常領域もまた実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト可変ドメインは通常、フレームワーク配列が上記ＣＤＲをそこから得たマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選択される。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は同一のまたは異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であることができる。または、数個のヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。ＣａｒｔｅｒらのＷＯ ９２／２２６５３を参照されたい。ＣＤＲコンホメーションおよび／または抗原との結合に対する考えうる影響に基づいて、ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸が置換のために選択される。このような考えうる影響の調査は、特定位置のアミノ酸の特徴のモデリング検査によるか、または特定アミノ酸の置換または変異の効果の経験的考察による。
【０１１５】
例えば、１個のアミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、該ヒトフレームワークアミノ酸が：
（１）抗原と直接非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）別の方法でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域から約６Ａ以内に存在する）、または
（４）ＶＬ−ＶＨ境界面に関与する、
と合理的に予測されるならば、通常は該ヒトフレームワークアミノ酸をマウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸と置換する必要がある。
【０１１６】
置換の他の候補は、当該位置ではヒト免疫グロブリンにとって異例な受容ヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウス供与抗体の等価な位置に由来するアミノ酸、またはより典型的なヒト免疫グロブリンの等価な位置に由来するアミノ酸と置換することができる。置換の他の候補は、当該位置ではヒト免疫グロブリンにとって異例な受容ヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは通常、ヒト可変領域フレームワーク配列またはそのような配列のコンセンサス配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を示す。
【０１１７】
ヒト抗体
特定の抗体に向けられたヒト抗体は以下に記述する種々の技法によって提供される。あるヒト抗体は、競合結合実験または他の方法によって特定のマウス抗体（実施例に記載のマウスモノクローナルの１つ等）と同一のエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体はまた、免疫原として抗原の断片のみを用いることによって、および／または、タンパク質抗原の場合は該抗原の欠失変異体の集団に対して抗体をスクリーニングすることによって、特定のエピトープ特異性についてスクリーニングすることができる。
【０１１８】
トリオーマ法
基本的なアプローチおよびこのアプローチに用いる細胞融合パートナーの一例であるＳＰＡＺ−４はＯｅｓｔｂｅｒｇら， １９８３， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７； Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号に記述されている（各文献はあらゆる目的のためにその全体を本明細書に組み入れる）。この方法によって得られる抗体産生細胞系はトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）と呼ばれる。なぜなら、それらは３つの細胞（すなわち２つのヒト細胞および１つのマウス細胞）の子孫だからである。最初にマウス骨髄腫細胞系をヒトＢリンパ球と融合させて、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ（前出）に記述されているＳＰＡＺ−４細胞系等の非抗体産生異種間ハイブリッド細胞を得る。次に、この異種間細胞を免疫したヒトＢリンパ球に融合させて抗体産生トリオーマ細胞系を得る。トリオーマはヒト細胞から作製された通常のハイブリドーマよりも安定に抗体を産生することが見出されている。
【０１１９】
トリオーマは遺伝子的には安定であるが、非常な高レベルで抗体を産生するものではない。トリオーマ由来の抗体遺伝子を１つ以上の発現ベクターにクローン化し、そして該ベクターを標準的な哺乳動物、細菌または酵母細胞系中に形質転換することによって発現レベルを増大させることができる。
【０１２０】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物
種々の抗原に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物から産生させることも可能である。典型的には、これらの免疫グロブリン遺伝子座は、好ましくは９５％以上ヒト配列と同一の、より好ましくは９８−９９％以上ヒト配列と同一の、そして最も好ましくは１００％同一の実質的ヒト配列抗体をコードすることができる。これらの免疫グロブリン遺伝子座は再配列された、または再配列されていないものでありうる。そして天然のヒト免疫グロブリン遺伝子座と比較して欠失または挿入を含みうる。これらの遺伝子座は、二次レパートリー（非ＩｇＭ）抗体のコード部分に実質的に寄与しない、他の種または非免疫グロブリン遺伝子座に由来する遺伝子エレメント（例えば、エンハンサー、プロモーターおよびスイッチ配列等の非コードエレメント、またはμ定常領域遺伝子セグメント等のコードエレメント）を含みうる。好ましいヒト免疫グロブリン遺伝子座は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物のリンパ系細胞および／またはリンパ系細胞前駆体中でＶ（Ｄ）Ｊ連結、重鎖クラススイッチおよび体細胞変異を含むＤＮＡ配列変更を受け、その結果、所定の抗原に対する高親和性ヒト抗体を生じる。これらのトランスジェニック哺乳動物に含有されるヒト免疫グロブリン遺伝子座は、好ましくは天然のヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の再配列されていない配列を含む。通常、このようなトランスジェニック哺乳動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化されている（米国特許第５，５８９，３６９号；Ｔａｋｅｄａ， Ｓら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２ ２３２９−２３６６ ： Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ．ら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５； Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｄ．およびＲａｊｅｗｓｋｙ， Ｋ．， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５４−１５６； Ｇｕ， Ｈ．ら， １９９１， Ｃｅｌｌ ６５：４７−５４； Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：８２１−８３０； Ｓｕｎ， Ｗ．ら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：６９５−７０４； Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら， １９９３， Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６； Ｚｏｕ， Ｘ．ら， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：２１５４−２１６２； Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら， １９９３ Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６； Ｂｏｕｄｉｎｏｔ， Ｐ．ら， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：２４９９−２５０５； Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：４５２８−４５３２； Ｒｏｓｅｓ， Ｊ．および Ｒａｊｅｗｓｋｙ， Ｋ．， １９９１， Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：１３６７−１３７１； Ｇｕ， Ｈ．ら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７３：１１５５−１１６４； Ｔａｋｉ， Ｓ．ら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１２６８−７１； Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｄ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４２３−６； Ｌｕｔｚ， Ｃ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７９７−８０１； Ｚｏｕ， Ｙ．ら， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１０９９−１１０３； Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：４６３５−４６４５； Ｓｅｒｗｅ， Ｍ．およびＳａｂｌｉｔｚｋｙ， Ｆ．， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：２３２１−２３２７； Ｓａｎｃｈｅｚ， Ｐ．ら， １９９４， Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：７１１−７１９； Ｚｏｕ， Ｙ．ら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：８１１−８２０）。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化は、好ましくは例えばターゲッティングされた相同組換えによって達成することができる。外因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座は内因性マウス染色体と結合していることができる；または、導入された導入染色体の例えば一部であるか、そこに挿入されているか、またはそれと結合していることができる。導入染色体は、非内因性染色体または１つのセントロメアおよび２つのテロメアを有する染色体断片として細胞中に導入される。これらの導入染色体は一般にテロメアおよびセントロメア配列を含み、そして完全な親染色体と比較して欠失を含みうる。導入染色体はまたさらなる挿入配列を含みうる。例えば、２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座は、第１の免疫グロブリン遺伝子座の配列（例えば、ＹＡＣクローン、導入染色体、または完全な染色体に由来するもの）を第２の免疫グロブリン遺伝子座を含む導入染色体に挿入することにより、１つの導入染色体に組合わせることができる。このプロセスを、３つのヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てを１つの導入染色体に組合わせるまで反復することもできる。２または３個の異なる免疫グロブリン遺伝子座を含む１個の導入染色体はこれらの遺伝子座の遺伝的連鎖を提供し、それはヒト抗体の作製に有用なトランスジェニック子孫の画分を増大させる。導入染色体の好ましい形態は、Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：７２２−７２７、Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１３３−１４３ならびにＷＯ ９７／０７６７１、ＷＯ ９８／３７７５７およびＷＯ ００／１０３８３に詳述されている形態である（これらの文献のそれぞれは、あらゆる目的のために参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。導入染色体はまた、組み込まれた選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）および完全な親染色体には見出されない他の配列をも含むことができる。導入染色体と内因性マウス染色体との組換え現象においては、導入染色体由来の配列は内因性マウス染色体に挿入されるか、またはこれに付加される。導入染色体はＷＯ ９８／３７７５７、ＥＰ ０９７２４４５およびＷＯ ００／１０３８３（これらはあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れる）に記述されているように欠失、転座、置換、等によって改変することができる。例えば、導入染色体はマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入する途中で自然に断片化され、テロメアにより誘起される末端切断により断片化され、および／またはＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えまたは類似の方法によって転座されうる。そのような組換えまたは転座現象は、組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ配列およびその他）を特異的に挿入することによって促進することができる（例えば、Ａｂｕｉｎ， Ａ．およびＢｒａｄｌｅｙ， Ａ． １９９６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：１８５１−１８５６； Ｍｉｔａｎｉ， Ｋ．ら， １９９５， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２１：２２１−２３１； Ｌｉ， Ｚ．Ｗ．ら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：６１５８−６１６２； Ｓｍｉｔｈ， Ａ．Ｊ．ら， １９９５， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ９：３７６−３８５； Ｔｒｉｎｈ， Ｋ．Ｒ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４４：１８５−１９３； Ｓｕｎａｇａ， Ｓ．ら， １９９７， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４６： １０９−１１３； Ｄｙｍｅｃｋｉ， Ｓ．Ｍ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：６１９３−６１９６； Ｚｏｕ， Ｙ．Ｒ．ら， １９９４， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ４：１０９９−１１０３； Ｒｕｄｏｌｐｈ， Ｕ．ら， １９９３， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ２：３４５−３５５； Ｒｉｃｋｅｒｔ， Ｒ．Ｃ．ら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：１３１７−１３１８参照）。ｌｏｘＰ部位を導入した場合、ｃｒｅリコンビナーゼをコードするトランスジーンの発現は２個のｌｏｘＰ部位の間の組換えを促進するであろう。導入染色体は、上記の転座の結果、異なる染色体断片から成る融合染色体でありうる。導入染色体は自律性でありうる。自律性導入染色体は内因性マウス染色体とは異なっており、それらと不連続であり、そしてそれらの中に挿入されない。これらの自律性導入染色体は、自律複製を可能とするテロメアおよびセントロメア配列を含む。または、導入染色体配列はマウス細胞核への導入後、マウス染色体に転座させられる場合がある。内因性マウス染色体は１９の常染色体対ならびにＸおよびＹ染色体を含む。
【０１２１】
外因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入は、半日胚前核マイクロインジェクション、胚性幹細胞のトランスフェクション、または胚性幹細胞の酵母スフェロプラストもしくは導入染色体を含む微小核との融合、等を含む種々の方法によって達成することができる。上記のプロセスから得られるトランスジェニック哺乳動物は、導入された外因性免疫グロブリン構成要素配列を機能性に再配列し、そして内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。これらの特性を有する哺乳動物の作製およびその特性については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら， ＷＯ ９３／１２２２７ （１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号、５，８７４，２９９号、５，８１４，３１８号、 ５，７８９，６５０号、５，７７０，４２９号、５，６６１，０１６号、５，６３３，４２５号、５，６２５，１２６号、 ５，５６９，８２５号、５，５４５，８０６号； Ｎａｔｕｒｅ ４８：１５４７−１５５３ （１９９４）； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ， ＷＯ ９１／１０７４１ （１９９１）， ＷＯ ９４／０２６０２ （１９９３）， ＷＯ ９６／３４０９６ （１９９５）， ＷＯ ９６／３３７３５ （１９９６）， ＷＯ ９８／２４８９３ （１９９７）， 米国特許第５，９３９，５９８号、６，０７５，１８１号、６，１１４，５９８号； Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：７２２−７２７、Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１３３−１４３ならびにＴｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．， ＷＯ ９７／０７６７１、ＷＯ ９８／３７７５７、ＷＯ ００／１０３８３およびＪＰ ２０００−４２０７４（これらの文献のそれぞれは、あらゆる目的のため参照により本明細書にその全体を組み入れる）に詳述されている。齧歯動物等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が特に適切である。モノクローナル抗体は、従来のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を用いて、そのような哺乳動物由来のＢ細胞を適切な不死細胞系に融合させることによって 調製することができる。モノクローナル抗体は 培地から単離した個々のＢ細胞からＶ領域のＰＣＲ増幅を用いて直接入手することもできる（Ｓｃｈｒａｄｅｒら、１９９７、米国特許第５，６２７，０５２号）。または、ＦＡＣＳによって選別した、もしくは他の方法で富化したＢ細胞調製物を、Ｖ領域配列のＰＣＲ増幅用のＲＮＡまたはＤＮＡの供給源として用いることができる。ファージディスプレイ法（以下に記述する）もまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む、免疫されたトランスジェニックマウスからヒト抗体配列を得るために用いることができる。次に、これらの方法によって得られたヒト抗体Ｖ領域配列を用いて、もとの親抗体の結合特性を保持する完全な抗体を作製することができる。このプロセスを以下に記述する。
【０１２２】
ファージディスプレイ法
ヒト抗体を得るためのさらなるアプローチはＢ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを、Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に概略が記載されている一般的プロトコールに従ってスクリーニングすることである。そのようなＢ細胞は、所望の抗原、断片、該抗原または断片を含むより長いポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体を用いて免疫したヒトから得ることができる。場合により、そのようなＢ細胞は該抗原に暴露されたことのない個体から得られる。Ｂ細胞はまた、ヒト免疫グロブリン配列を発現するトランスジェニック非ヒト動物から得ることもできる。トランスジェニック非ヒト動物は１つの抗原または抗原の集団を用いて免疫することができる。該動物を免疫しないでおくこともできる。ヒト抗体をコードするＢ細胞ｍＲＮＡ配列を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製する。次に、このｃＤＮＡ配列のＶ領域コードセグメントを、抗体Ｖ領域の発現を指令するＤＮＡベクター中にクローン化する。典型的にはクローン化に先だってＰＣＲによりＶ領域配列を特異的に増幅する。また、典型的にはＶ領域配列は、該Ｖ領域が融合タンパク質として発現されるように構築されたＤＮＡベクター内の部位にクローン化される。そのような融合タンパク質の例は、ｍ１３大腸菌ファージ遺伝子３および遺伝子８融合タンパク質を含む。次にクローン化Ｖ領域配列の集団を用いて抗体Ｖ領域の発現ライブラリーを作製する。発現ライブラリーを作製するため、クローン化Ｖ領域配列を含むＤＮＡベクターを用いて真核または原核宿主細胞を形質転換する。Ｖ領域に加えて、該ベクターは場合によりウイルスゲノムの全部または一部をコードすることができ、かつウイルスパッケージング配列を含むことができる。ある場合には、該ベクターはウイルスゲノムの全体は含まず、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルスＤＮＡ配列と共に用いられる。発現された抗体Ｖ領域は、形質転換細胞または該細胞由来のウイルス粒子の中もしくは表面に見出される。次に、細胞またはウイルス粒子からなるこの発現ライブラリーを用いて、所定の抗原に反応性の抗体または抗体フラグメントをコードするＶ領域配列を同定する。これらのＶ領域配列を同定するため、発現されたＶ領域の所定の抗原との反応性について発現ライブラリーをスクリーニングまたは選択する。クローン化Ｖ領域配列を含み、かつ発現されたＶ領域を有する上記細胞またはウイルス粒子は、所定の抗原に応答性（例えば、結合会合または触媒活性）のＶ領域を有する細胞またはウイルス粒子を同定または富化する方法によってスクリーニングまたは選択される。例えば、発現されたＶ領域に結合する放射性または蛍光標識化抗原を検出し、これを用いて細胞またはウイルス粒子を同定または選別することができる。固相マトリックスまたはビーズに結合させた抗原もまた、表面に反応性Ｖ領域を有する細胞またはウイルス粒子を選択するために用いることができる。次に、このようにして発現ライブラリーから同定されたＶ領域配列を用いて、形質転換宿主細胞中で、所定の抗原に対して反応性を有する抗体またはそのフラグメントの発現を指令することができる。Ｈｕｓｅによって記述されたプロトコールはファージディスプレイ技術と組合わせるとより効率的になる。例えば、Ｄｏｗｅｒら， ＷＯ ９１／１７２７１および ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， ＷＯ ９２／０１０４７， 米国特許第５，８７１，９０７号、５，８５８，６５７号、５，８３７，２４２号、５，７３３，７４３号および５，５６５，３３２号を参照されたい（これらの文献のそれぞれは、あらゆる目的のため参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。これらの方法においては、メンバー（ディスプレイパッケージ）が異なる抗体を外側表面に提示するファージのライブラリーが作製される。抗体は通常ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、該抗原またはその断片に対する親和性富化によって選択することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する免疫したトランスジェニック非ヒト動物と組合わせたファージディスプレイは、抗原に対する免疫応答が弱い場合でも、抗原特異的抗体を得るために用いることができる。
【０１２３】
ファージディスプレイ法の変法においては、選択されたマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を産生させることができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ、ＷＯ ９２／２０７９１を参照されたい。この方法においては、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域が出発材料として用いられる。例えば、もし軽鎖可変領域が出発材料として選択される場合は、メンバーが同一の軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発材料）および異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリーが構築される。再配列されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから重鎖可変領域が得られる。ＣＴＬＡ−４に対して強い特異的結合（例えば、少なくとも１０８および好ましくは１０９ Ｍ−１）を示すファージが選択される。次に、このファージ由来のヒト重鎖可変領域が、さらなるファージライブラリー構築のための出発材料として役立つ。このライブラリーにおいては、各ファージは同一の重鎖可変領域（すなわち、第１のディスプレイライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。再配列されたヒト軽鎖可変領域のライブラリーから軽鎖可変領域が得られる。選択された抗原に対して強い特異的結合を示すファージが再び選択される。ランダムまたは統合的な配列を例えばＣＤＲ領域に組み込んだファージディスプレイライブラリーから、ヒト抗体に類似した人工抗体を得ることができる。
【０１２４】
定常領域の選択
キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、様々な公知の方法によってヒト定常領域の少なくとも一部に結合させることができる（Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６： １００２９−１００３３および国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号参照；これらの文献およびこれらにおいて引用されている参考文献はあらゆる目的のために本明細書中に参照として組込むものとする）。定常領域の選択は、抗体依存性の補体および／または細胞介在性の傷害性が所望のものであるか否かに一部依存する。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のアイソタイプは通常ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプより強い補体結合活性を有している。アイソタイプの選択はまた、脳内への抗体の通過にも影響を与え得る。軽鎖定常領域はλまたはκ鎖のものであってよい。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する４量体として、分離した重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーを介して結合している一本鎖抗体として発現させることができる。
【０１２５】
用途によっては、ＩｇＧ以外の抗体が有用である場合がある。例えば、多価抗体複合体が望ましい場合は、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体を利用するとよい。
【０１２６】
完全な抗体を発現させるための部分抗体配列の使用
抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。このために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間の多様性がＣＤＲ以外の配列に比べて高い。ＣＤＲの配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異種の抗体に由来するフレームワーク配列上に移植した天然に存在する特定の抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に存在する特定の抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら、１９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２７； Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． ら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５２５； およびＱｕｅｅｎ， Ｃ．ら、１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６： １００２９−１００３３参照のこと）。このようなフレームワーク配列は、生殖系列の抗体遺伝子配列を含む公衆に公共のＤＮＡデータベースから取得することができる。これらの生殖系列の配列は、Ｂ細胞の成熟の際にＶ（Ｄ）Ｊ結合により形成される完全な形に集合した可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖系列の遺伝子配列はまた、体細胞変異により、個々のヌクレオチドにおいて高親和性の二次レパートリー抗体の配列とも異なる。しかし、可変領域を超えてまで体細胞変異が存在することはない。例えば、体細胞変異はフレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分には出現頻度が比較的低い。さらに、多くの体細胞変異により、抗体の結合特性が有意に変化することはない。かかる理由により、元の抗体と同様の結合特性を有する完全な組換え抗体を再生するために特定の抗体の全長のＤＮＡ配列を得る必要はない（１９９９年３月１２日に出願のＰＣＴ／ＵＳ／０５５３５号参照のこと。該出願明細書は、あらゆる目的において参照として本明細書中に組込むこととする）。具体的には、この目的には、重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を含む部分配列で十分である。該部分配列は、生殖系列の可変部および結合部の遺伝子断片が組換え抗体の可変部の遺伝子に寄与するかどうかを決定するために用いられる。該生殖系列の配列は、その後、可変領域の欠損部分を補うために用いられる。重鎖および軽鎖のリーダー配列は、タンパク質の成熟化の際に切断され、最終的な抗体の特性には寄与しない。かかる理由から、発現構築物には対応する生殖系列のリーダー配列を使用する必要がない。欠損配列を補うために、クローニングしたｃＤＮＡ配列を結合反応またはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと結合させることが可能である。あるいは、全長可変領域を、重複部分を有する短いオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、それをＰＣＲ増幅により結合させて可変領域の完全な合成クローンを作製することができる。この工程は、特定の制限酵素部位を排除もしくは付与すること、または特定のコドンを最適化するなどの利点を有している。
【０１２７】
天然の配列と同一のアミノ酸をコードし得る合成Ｖ配列を作製するための重複部分を有する合成オリゴヌクレオチドのセットを設計するには、ハイブリドーマ由来の重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を用いる。合成した重鎖およびκ軽鎖の配列は、以下の３点において天然の配列と異なり得る：
オリゴヌクレオチドの合成およびＰＣＲ増幅を容易にするために反復ヌクレオチド塩基の列が途中に挿入されていること；Ｋｏｚａｋの法則に従って最適翻訳開始部位が組込まれていること（Ｋｏｚａｋ、１９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６： １９８６７−１９８７０）；および、翻訳開始部位の上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を遺伝子操作により組込まれていること。
【０１２８】
重鎖および軽鎖の両方の可変領域では、最適化コード鎖および対応する非コード鎖の配列は３０〜５０ヌクレオチドの断片に切断され、それにより対応する非コードオリゴヌクレオチドの真ん中あたりでコード鎖の配列に対するヌクレオチド間の切断が起こる。したがって、それぞれの鎖について、オリゴヌクレオチドは重複部分を有する、所望の配列の全長に渡る二本鎖のセットとして構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドは１５０〜４００ヌクレオチド断片に渡る集合にまとめられる。該集合をその後、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を作製するための鋳型として使用する。典型的には、可変領域のオリゴヌクレオチドの１つのセットを、別々に増幅される２つのプールに分割し、重複部分を有する２種のＰＣＲ産物を作製する。これらの重複部分を有する産物をその後、ＰＣＲ増幅により結合させて完全な可変領域を形成させる。発現ベクター構築物中に容易にクローニングできる断片を生成するために、重鎖または軽鎖の定常領域の重複部分を有する断片（κ軽鎖のＢｂｓＩ部位、またはγ重鎖であればＡｇｅＩ部位）がＰＣＲ増幅の際に含まれることが望ましい場合もある。
【０１２９】
そして、この再構築した重鎖および軽鎖の可変領域を、クローン化したプロモーター、翻訳開始領域、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位、および転写終結部位の配列と結合して、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖の発現構築物は単一のベクターに結合させてもよく、コトランスフェクションもしくは連続的なトランスフェクションも可能であり、また、個別に宿主細胞にトランスフェクトした後に該宿主細胞を融合させて重鎖および軽鎖の両方を発現する宿主細胞を作製することもできる。
【０１３０】
ヒトＩｇＧκに対する発現ベクターの構築物に用いるプラスミドは、下記の通りである。ＰＣＲで増幅させたＶ重鎖およびＶκ軽鎖のｃＤＮＡ配列を完全な重鎖および軽鎖のミニジーンを再構築するために用いることができるように、プラスミドを構築した。かかるプラスミドを用いて、完全な、ヒトまたはキメラＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κ抗体を発現することができる。他の重鎖のアイソタイプの発現のための、またはλ軽鎖を含有する抗体の発現のための同様のプラスミドを構築することも可能である。
【０１３１】
開始メチオニンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’プライマーを用いて増幅させたκ鎖の配列をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｂｓＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｂｓＩで消化したｐＣＫ７−９６にクローニングしてポリアデニル化部位を有する完全な軽鎖コード配列を再構築することができるので、下記に記載のκ軽鎖プラスミド、ｐＣＫ７−９６（配列番号１）は、κ鎖定常領域およびポリアデニル化部位を含む。このカセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片として単離して転写プロモーター配列に結合し、細胞にトランスフェクトするための機能的ミニジーンを作製することができる。
【０１３２】
開始メチオニンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’プライマーを用いて増幅させたγ鎖の配列をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化したｐＣＧ７−９６にクローニングしてポリアデニル化部位を有する完全なγ１重鎖コード配列を再構築することができるので、γ１重鎖プラスミドであるｐＣＧ７−９６（配列番号２）は、ヒトγ１定常領域およびポリアデニル化部位を含む。このカセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片として単離して転写プロモーター配列に結合し、細胞にトランスフェクトするための機能的ミニジーンを作製することができる。
【０１３３】
開始メチオニンの上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’プライマーを用いて増幅させたγ鎖の配列をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化したｐＧ４ＨＥにクローニングしてポリアデニル化部位を有する完全なγ４重鎖コード配列を再構築することができるので、γ４重鎖プラスミドであるｐＧ４ＨＥ（配列番号３）は、ヒトγ４定常領域およびポリアデニル化部位を含む。このカセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片として単離して転写プロモーター配列に結合し、細胞にトランスフェクトするための機能的ミニジーンを作製することができる。
【０１３４】
再構築した重鎖および軽鎖の遺伝子の発現には、多種多様なプロモーター（ＣＭＶ、ユビキチン、ＳＲαおよびβアクチンのプロモーターを含むがこれらに限定されない）を用いることができる。例えば、ｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ、ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩのいずれかとを用いて切断し、上述のκ鎖、γ１鎖またはγ４鎖カセットのいずれかと結合させて、哺乳動物細胞に直接トランスフェクション可能な発現ベクターを作製することができる。
【０１３５】
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組換え抗体の発現
キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体は典型的には、組換え体の発現により産生される。組換え型ポリヌクレオチド構築物は典型的には、抗体鎖のコード配列に機能可能な形で結合されている発現制御配列を含む。該配列には天然に結合しているプロモーター領域または異種プロモーター領域が含まれる。該発現制御配列は、真核宿主細胞に形質転換またはトランスフェクション可能なベクター中の真核生物プロモーター系であることが好ましい。該ベクターが適切な宿主に組込まれると、該宿主は、該ヌクレオチド配列の高レベルでの発現、ならびに交差反応抗体の回収およびその精製に適切な条件下で維持される。
【０１３６】
典型的には、このような発現ベクターは、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡを構成する（ｉｎｔｅｇｒａｌ）一部分として宿主細胞内で複製可能である。通常、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性マーカーなど）を含んでいるため、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出が可能である。
【０１３７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために極めて有用な原核宿主生物の１つである。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい宿主酵母菌であり、所望の発現制御配列、複製起点および終結配列などを有する好適なベクターが存在する。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖系酵素のプロモーターが挙げられる。酵母の誘導性プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームＣならびにマルトースおよびガラクトースの代謝を担っている酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
【０１３８】
免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチド断片を発現するための好ましい宿主は、哺乳動物細胞である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ著、「遺伝子からクローンまで（ＦＲＯＭ ＧＥＮＥＳ ＴＯ ＣＬＯＮＥＳ）」（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ， １９８７）を参照のこと。完全な形で異種タンパク質を分泌することが可能な適切な宿主細胞株は多数のものが当技術分野において開発されており、その例としてはＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞およびミエローマ細胞株が挙げられる。ヒト以外の細胞が好ましい。このような細胞に用いる発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー （Ｑｕｅｅｎら、１９８６、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９： ４９）、およびプロセシング情報に不可欠な部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等） などの発現制御配列を含む。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏら、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９を参照のこと。
【０１３９】
あるいは、トランスジェニック動物のゲノムに導入して該トランスジェニック動物の乳中に発現させるためにトランスジーンに抗体のコード配列を組込むことも可能である（米国特許第５，７４１，９５７号、米国特許第５，３０４，４８９号、米国特許第５，８４９，９９２号などを参照のこと）。軽鎖および／または重鎖のコード配列を含み、これらが乳腺特異的遺伝子（例えば、カゼイン遺伝子またはβラクトグロブリン遺伝子など）由来のプロモーターおよびエンハンサーと機能し得る形で結合されているトランスジーンが適切である。
【０１４０】
対象とするＤＮＡ断片を含むベクターを、宿主細胞の種類に応じて公知の方法により宿主細胞に転移させることができる。例えば、一般的に原核細胞には、塩化カルシウムトランスフェクション法が使用されるが、他の宿主細胞には、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、バイオリスティック法またはウイルスを用いたトランスフェクション法を用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換に用いる他の方法は、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、リポソーム法、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法を用いる方法が挙げられる（概説として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲を参照のこと）。トランスジェニック動物を作製するために、受精卵母細胞にトランスジーンをマイクロインジェクションするか、または胚性幹細胞のゲノムにトランスジーンを導入して、これらの細胞の核を脱核卵母細胞に移入するこができる。
【０１４１】
発現された抗体は、ＨＰＬＣ精製法、カラムクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法などをはじめとする当技術分野における標準的手法により精製することができる（概説としては、Ｓｃｏｐｅｓ著、「タンパク質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ， １９８２）を参照のこと）。
【０１４２】
改変抗体
本発明は改変抗体をも包含する。「改変抗体」という用語は、例えば欠失、付加または置換により抗体の一部が改変されている抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体など）を包含する。例えば、抗体の定常領域を欠失させ、抗体の半減期（例えば、血清の半減期）、安定性または親和性などを増大するような定常領域と置換することにより抗体を改変することができる。
【０１４３】
本発明の抗体複合体を用いて、所定の生物学的応答を改変するか、または生物学的応答（例えば、エフェクター細胞の動員など）を誘起することができる。その薬剤部分は、従来の治療用化学物質に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドを含んでもよい。かかるタンパク質の例としては、例えば酵素活性を有する毒素（アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌外毒素、またはジフテリア毒素など）またはその活性を有する断片；腫瘍壊死因子またはインターフェロンαなどのタンパク質；または生物学的応答性調節物質（例えばリンホカイン、インターロイキンー１（ＩＬ−１）、インターロイキンー２（ＩＬ−２）、インターロイキンー６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはその他の増殖因子）などがある。
【０１４４】
かかる治療用物質部分を抗体に結合させるための技法は公知である（例えば、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８５）中のＡｒｎｏｎら著、「癌治療における薬剤の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」ｐｐ．２４３−５６； Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、「薬物送達制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」（第２版； Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８７）中のＨｅｌｌｓｔｏｒｍら著、「薬物送達のための抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」ｐｐ６２３−５３； Ｐｉｎｃｈｅｒａら編「モノクローナル抗体 ’８４： 生物学的応用と臨床応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９８５）」中のＴｈｏｒｐｅ著「癌治療における細胞傷害性薬剤の抗体担体：総説（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ）」ｐｐ．４７５−５０６； Ｂａｌｄｗｉｎら編、「癌の検出および治療のためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）中の「癌治療における放射性標識抗体の治療用途の分析、結果および将来的展望（Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」ｐｐ．３０３−１６；およびＴｈｏｒｐｅら著、「抗体毒素複合体の調製とその細胞傷害特性（Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．， ６２： １１９−５８， １９８２）など参照のこと。
【０１４５】
処方
本発明は、モノクローナル抗体（完全な形態またはその結合能を有する断片）を１種もしくは複数種組合わせて含み、薬学的に許容し得る担体と共に製剤された医薬組成物を提供する。該組成物には、複数種（例えば、２種以上）の本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を組み合わせて含むものもあり、該組成物中のそれぞれの抗体またはその抗原結合部分は、抗原内の予め選択しておいた識別可能なエピトープに結合するモノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
【０１４６】
予防的な適用においては、疾患または疾病症状（例：免疫疾患）の疑いまたはリスクのある患者に、該リスクの消去もしくは低減、症状の緩和、または該疾患（該疾患の生化学的、組織学的および／または行動学的徴候を含む）、該疾患の進行の際に認められる合併症および中間的病理学的表現型の発症の遅延に十分な量の医薬組成物または薬物を投与する。治療的な適用においては、かかる疾患に羅患した疑いのある患者またはすでに羅患している患者に、該疾患の進行の際に認められる合併症および中間的病理学的表現型を含む該疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動学的徴候）を治癒するか、または少なくとも部分的には抑制するのに十分な量の組成物または薬物を投与する。治療または予防的処置を実施するのに適切な量は、治療的有効量または予防的有効量として定義される。予防的処方および治療的処方の双方とも、薬剤は通常、十分な免疫応答が得られるまで複数回投与される。具体的には、免疫応答をモニターして、免疫応答が弱い場合は、投与を繰り返す。
【０１４７】
有効量
本明細書中に記載の免疫関連症状および疾患の治療における本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与する他の薬剤、および処置が予防的なもの治療的なものかなどをはじめとする多くの様々な要因に応じて異なる。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。安全性および効果を最適化するために処方用量を滴定測定する必要がある。
【０１４８】
抗体を投与する場合、用量は、宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、およびさらに一般的には体重１ｋｇあたりは０．０１〜５ｍｇの範囲内である。例えば、体重１ｋｇあたりにつき、１ｍｇもしくは１０ｍｇ、または１〜１０ｍｇとすることができる。典型的な処方は、２週間に一度、または１ヶ月に一度、または３〜６週間に一度の投与である。方法によっては、結合特異性の異なる２種以上のモノクローナル抗体を同時に投与するが、このような場合は投与する抗体それぞれの用量が上記範囲内になるようにする。通常、抗体は複数回投与される。それぞれの投与の間隔は、週単位でも月単位でも年単位でもよい。患者の抗体の血中レベルを測定することによって投与時期を判断して不定期な投与間隔で投与してもよい。方法によっては、血漿の抗体濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌとなるように投与量を調節する場合もあり、、２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調節する場合もある。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与することもでき、このような場合は、必要とされる投与頻度が低減される。投与量および頻度は、患者体内での抗体の半減期によって異なる。一般的には、ヒト抗体が、その半減期が最も長く、続いてヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト動物の抗体である。投与量および投与頻度は、その処置が予防的なものか治療的なものかによっても異なり得る。予防的な適用では、相対的に低頻度かつ低用量にて長期に渡って投与する。患者によっては死ぬまで処置を続けることもある。治療的な適用の場合は、疾患の進行が抑制または停止するまで、好ましくは患者の疾患の症状が部分的または完全な回復が認められるまで、相対的に短い間隔でかつ相対的に高用量にて投与することが必要とされる場合がある。その後、その患者は予防的処方による投与を受ける場合もある。
【０１４９】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者１個体あたりＤＮＡが１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇの範囲内である。感染性のウイルスベクターの用量は様々であり、１回あたり１０〜１００ビリオンまたはそれ以上である。
【０１５０】
投与経路
予防的および／または治療的処置のために、免疫応答を誘起するための薬剤を、非経口投与、局所投与、静脈投与、経口投与、皮下投与、動脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与または筋肉内投与手段により投与することができる。免疫原性薬剤の最も典型的な投与経路は、皮下投与であるが、他の経路も同等に有効であり得る。その次に最も一般的な投与経路は、筋肉内注射である。この形態の注射は腕または足の筋肉に施すのが最も典型的である。方法によっては、沈殿物が沈積している所定の組織に直接薬剤を注射する（例えば、脳内注射などである）。静脈注入の際の筋肉注射が抗体の投与には好ましい。方法によっては、特定の治療用抗体を頭蓋内に直接注射する。方法によっては、抗体を徐放性組成物またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）デバイスなどの徐放性デバイスとして投与する。
【０１５１】
本発明の薬剤を、場合によっては、種々の免疫関連疾患を含む様々な疾患の治療に少なくとも部分的には有効である他の薬剤と組合わせて投与することもできる。脳内にアミロイドの沈積が起こるアルツハイマー病およびダウン症などの場合、本発明の薬剤は、本発明の薬剤の血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を増大させるための他の薬剤と組合わせて投与することもできる。
【０１５２】
剤形
本発明の薬剤は、活性のある治療薬剤を含む医薬組成物として、即ち、薬学的に許容され得る様々なほかの成分と共に投与される場合が多い。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの製薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｕｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， １９８０）参照のこと。好ましい形態は、意図する投与形式および治療用途に応じて異なる。上記組成物は、所望する剤形に応じて、薬学的に許容され得る、毒性のない担体または希釈剤を含んでもよい。これらは、動物またはヒトに投与するための医薬組成物の製剤に一般的に用いられるビヒクルとして定義されるものである。希釈剤は、その混合物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例としては、蒸留水、生理的リン酸緩衝化塩類溶液、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液などが挙げられる。さらに、上記医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤等をも含む場合がある。
【０１５３】
医薬組成物はまた、代謝の遅い大型の巨大分子を含んでもよい。該巨大分子は、タンパク質、キトサン、ポリ酪酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス官能化セファロース（商標）、アガロース、セルロース等）などの多糖類、ポリマー化アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム等）などである。さらに、これらの担体が免疫刺激剤（即ちアジュバント）として機能することもある。
【０１５４】
非経口投与には、本発明の薬剤を、医薬担体を含む生理学的に許容され得る希釈剤（水、油、生理的食塩水、グリセロールまたはエタノールなどの殺菌された液体でよい）の薬剤溶液または薬剤懸濁液として注射可能な用量で投与することができる。さらに、補助的な物質（湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ調整物質など）も、該組成物中に含まれていてもよい。医薬組成物中の他の成分は、石油、動物、植物に由来するものまたは合成物質（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油など）の成分である。一般的には、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類が、液体担体、特に注射溶液として好ましい。抗体は、デポー注射剤または移植用調製物の形態で投与投与され得る。これらは、活性成分の徐放性を具備するような形態に製剤化され得る。一例として挙げる組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ＨＣｌでｐＨを６．０に調整した緩衝水溶液中に５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含むものである。
【０１５５】
典型的には、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射可能な組成物として調剤される。または、注射の前に液体ビヒクル中に溶かすかまたは懸濁するのに適切な固体として調剤され得る。かかる調剤は、上述のようにリポソームまたはマイクロ粒子（ポリラクチド、ポリグリコリド、またはアジュバント効果を増強するためのコポリマーなど）で乳化させてもよく、またはこれらにカプセル化してもよい（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０ ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： １５２７およびＨａｎｅｓ， １９９７， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８： ９７−１１９を参照のこと）。本発明の薬剤を、デポー注射剤または移植用調製物の形態で投与することも可能であり、これらは活性成分の徐放性または周期パルス性（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ）放出を可能とするような形態で製剤することができる。
【０１５６】
他の投与様式に適したさらなる製剤は、経口投与製剤、鼻腔投与製剤、肺内投与製剤、坐剤、および経皮適溶剤を含む。
【０１５７】
坐剤は、結合剤および担体に、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどを含み、かかる坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲内の活性成分を含有する混合物から製剤することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、およびカルボン酸マグネシウムなどの賦活剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末の形態をなしてよく、活性成分を１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％含有する。
【０１５８】
局所適用により、経皮送達または皮内送達を達成することができる。局所投与は、コレラ毒素またはその解毒化誘導体もしくはサブユニットまたは同様の他の細菌毒素と一緒に該薬剤を投与することにより容易に実施することができる（Ｇｌｅｎｎら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ８５１を参照のこと）。これらの成分の混合物を用いるか、またはこれらの成分を化学的架橋もしくは融合タンパク質として発現させることにより得られる結合した分子として用いることにより、一緒に投与することが可能である。
【０１５９】
あるいは、経皮送達は、皮膚パッチまたはトランスフェロソームを用いて達成され得る（Ｐａｕｌら、１９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５， ３５２１−２４； Ｃｅｖｃら、１９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６８， ２０１−１５）。
【０１６０】
医薬組成物は一般に、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の優良製造規則（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ； ＧＭＰ）の全ての規定を十分に満たし、かつ、殺菌済みで実質的に等張となるように製剤される。
【０１６１】
【実施例】
実施例１： Ｃ μターゲットマウスの作製
ＣＭＤターゲッティングベクターの構築。プラスミドｐＩＣＥμは、Ｂａｌｂ／Ｃゲノムのλファージライブラリーから得られたμ遺伝子（Ｍａｒｃｕら、１９８０， Ｃｅｌｌ ２２： １８７）に及ぶ、マウスのＩｇ重鎖遺伝子座のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を含む。このゲノム断片はプラスミドｐＩＣＥＭＩ９ＨのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされた（Ｍａｒｓｈら、１９８４， Ｇｅｎｅ ３２： ４８１−４８５）。ｐＩＣＥμに含まれる重鎖配列は、μイントロン内エンハンサーのすぐ３’側に位置するＥｃｏＲＩ部位の下流から、μ遺伝子の最後の膜貫通エキソンの約１ｋｂ下流に位置するＸｈｏＩ部位に及ぶが、μスイッチリピート領域の多くは大腸菌での継代によって欠失された。
【０１６２】
ターゲッティングベクターは以下のように構築された（図１参照）。１．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＩＣＥμから切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）にサブクローニングした。このｐＩＣＥμ断片は、Ｃμ１の約１ ｋｂ ５’側に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位から、Ｃμ１内に位置するＳｍａＩ部位に及ぶ。その結果生じたプラスミドをＳｍａＩ／ＳｐｅＩで消化し、Ｃμ１ ３’側のＳｍａ Ｉ部位から最後のＣμエキソンのすぐ下流に位置するＸｂａＩ部位に及ぶ、ｐＩＣＥμからの約４ ｋｂのＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片を挿入した。その結果生じたプラスミドｐＴＡＲ１は、ＳｍａＩ部位で線状にそ、ｎｅｏ発現カセットに挿入した。このカセットは、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター（ＸｂａＩ／ＴａｑＩ断片；Ａｄｒａら、１９８７． Ｇｅｎｅ ６０：６５−７４）の転写制御下にあり、ｐｇｋポリアデニル化部位（ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片；Ｂｏｅｒら、１９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２９９−３０８）を含む、ｎｅｏ遺伝子で構成されている。このカセットは、プラスミドｐＫＪ１（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら、１９９１， Ｃｅｌｌ ６５： １１５３−１１６３によって記載された）から得られるが、そこからｎｅｏカセットをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ （＋） にサブクローニングして、ｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）を作製した。ｎｅｏカセットは、ｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）からＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化によって切り出し、平滑末端化し、プラスミドｐＴＡＲ１のＳｍａＩ部位にゲノムＣμ配列とは逆方向にサブクローニングした。その結果生じたプラスミドをＮｏｔ Ｉで線状にし、Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２に記載されているように、相同組換えを有するＥＳクローンの増加を可能にするために、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）カセットに挿入した。このカセットは、Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら、１９９１． Ｃｅｌｌ ６５： １１５３−１１６３に記載されているように、マウスｐｇｋプロモーターおよびポリアデニル化部位によって挟まれたｔｋ遺伝子のコード配列で構成されている。その結果生じたＣＭＤターゲッティングベクターは、重鎖遺伝子座に対して相同な部分を合計約５．３ ｋｂ含み、最初のＣμエキソン固有のＳｍａＩ部位にｎｅｏ発現カセットを挿入した、変異μ遺伝子を作製するために設計されている。ターゲッティングベクターは、ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションの前に、プラスミド配列内で切断するＰｖｕＩで線状にした。
【０１６３】
ターゲットＥＳ細胞の作製と解析。ＡＢ−１ ＥＳ細胞（ＭｃＭａｈｏｎ， Ａ． Ｐ．およびＢｒａｄｌｅｙ， Ａ．， １９９０， Ｃｅｌｌ ６２：１０７３−１０８５）は、有糸分裂不活性なＳＮＬ７６／７細胞フィーダー層（同上）上で、原則的に（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． （１９８７） Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， 編） Ｏｘｆｏｒｄ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ． ７１−１１２で）記載されているように培養した。線状にしたＣＭＤターゲッティングベクターは、Ｈａｓｔｙらに記載された方法（Ｈａｓｔｙ， Ｐ． Ｒ．ら、１９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５０：２４３−２４６）によってＡＢ−１細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞は、１−２×１０６細胞／ディッシュの密度で１００ ｍｍディッシュ中で平板培養した。２４時間後に、Ｇ４１８（２００マイクログラム／ｍｌの活性成分）およびＦＩＡＵ（５×１０−７ Ｍ）を培地に添加し、薬剤耐性クローンを８−９日間増殖させた。クローンを選抜し、トリプシン処理して２つに分け、さらに増殖した。その後、各々のクローンから分けた細胞の半分を冷凍し、他の半分はベクターと標的配列との間の相同組換えについて解析した。
【０１６４】
ＤＮＡ解析はサザンブロットハイブリダイゼーションによって行った。ＤＮＡは、クローンから、Ｌａｉｒｄら（Ｌａｉｒｄ， Ｐ． Ｗ．ら、１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ ：４２９３）に記載されたようにして単離した。単離したゲノムＤＮＡは、ＳｐｅＩで消化し、μイントロン内エンハンサーとμスイッチ領域との間の配列にハイブリダイズするための９１５ ｂｐのＳａｃＩ断片である、プローブＡ（図１）によって検出した。プローブＡは、野生型遺伝子座由来の９．９ ｋｂのＳｐｅＩ断片、および、ＣＭＤターゲッティングベクター（ｎｅｏ発現カセットはＳｐｅＩ部位を含む）によって相同的に組み換えられたμ遺伝子座由来の７．６ ｋｂの診断用バンドを検出する。サザンブロット解析によって選別した１１３２のＧ４１８およびＦＩＡＵ耐性クローンのうち、３つはμ遺伝子座での相同組換えを示す７．６ ｋｂのＳｐｅ Ｉバンドを示した。これらの３つのクローンは、さらに、ベクターがμ遺伝子に相同的に組み込まれたことを確認するために、酵素ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、およびＥｃｏＲＩで消化した。プローブＡとハイブリダイスした時、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、またはＥｃｏＲＩで消化した野生型ＤＮＡのサザンブロットは、各々１５．７、７．３、および１２．５ ｋｂの断片を生じ、一方、ターゲッティングされたμ対立遺伝子の存在は、各々７．７、６．６、および１４．３ ｋｂの断片によって示唆される。ＳｐｅＩ消化によって検出された３つの陽性クローンはすべて、Ｃμ１エキソンへのｎｅｏカセットの挿入の分析から予測されるＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、およびＥｃｏＲＩ制限断片を示した。
【０１６５】
変異μ遺伝子を有するマウスの作製。番号２６４、２７２、および４０８と称される、３つのターゲッティングされたＥＳクローンは、解凍し、Ｂｒａｄｌｅｙによって（Ｂｒａｄｌｅｙ， Ａ．， １９８７， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． （Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編） Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ． １１３−１５１）記載されたように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に注入した。注入された胚盤胞は、注入されたＥＳ細胞および宿主胚盤胞に由来する細胞の混合物である、キメラマウスを作製するために、擬似妊娠しているメスの子宮に移入された。キメラへのＥＳ細胞の貢献度は、黒色のＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上で、ＥＳ細胞株由来の野性色になった毛皮の量によって視覚的に評価しうる。クローン２７２および４０８は低い割合のキメラ（すなわち、野性色の割合が低い）しか形成しかなったが、２６４は高い割合のオスキメラを形成した。これらのキメラはＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスと交配され、野性色の子孫が作製され、ＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系列への伝達が示唆された。ターゲッティングされたμ遺伝子のスクリーニングは、（ＥＳ細胞ＤＮＡの解析のために上述したように）ＢｇｌＩ消化された尾部生検由来ＤＮＡのサザンブロット解析によって行った。野性色の子孫の約５０％が、１５．７ ｋｂの野生型のバンドに加えて７．７ ｋｂのＢｇｌＩバンドとのハイブリダイズを示し、ターゲッティングされたμ遺伝子の生殖細胞系列への伝達が実証された。
【０１６６】
μ遺伝子の機能的不活性化についてのトランスジェニックマウスの解析。Ｃμ１内へのｎｅｏカセットの挿入がＩｇ重鎖遺伝子を不活性化したかを決定するため、クローン２６４キメラは、ＪＨ遺伝子分節の欠失の結果として重鎖の発現が不活性化されている（Ｃｈｅｎら、１９９３， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：６４７−６５６）、ＪＨＤ変異のホモ接合型マウスと交配した。灰色の子孫４匹が生じた。１ヶ月齢のこれらの動物から血清を得て、マウスＩｇＭの存在をＥＬＩＳＡによって検定した。４匹の子孫のうち２匹はＩｇＭが完全に欠如していた（表１）。ＢｇｌＩ消化とプローブＡ（図１）を用いたハイブリダイゼーション、およびＳｔｕＩ消化と４７５ ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ断片（同上）を用いたハイブリダイゼーションによる、尾部生検由来のＤＮＡのサザンブロット解析による４匹の子孫の遺伝子型決定から、血清ＩｇＭを発現しない動物は、重鎖遺伝子座の一方の対立遺伝子にＪＨＤ変異を持ち、他方の対立遺伝子にＣμ１変異を持つものであることが実証された。ＪＨＤ変異のヘテロ接合型マウスは野生型の血清Ｉｇレベルを示す。これらのデータは、Ｃμ１変異がμ遺伝子の発現を不活性化することを実証している。
【０１６７】
【表１】
Figure 2004515230
表１は、ＥＬＩＳＡによって検出される、ＣＭＤとＪＨＤ変異の両方を持つマウス（ＣＭＤ／ＪＨＤ）、ＪＨＤ変異のヘテロ接合型マウス（＋／ＪＨＤ）、野生型（１２９Ｓｖ ｘ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ１マウス（＋／＋）、およびＪＨＤ変異のホモ接合型Ｂ細胞欠損マウス（ＪＨＤ／ＪＨＤ）の血清ＩｇＭレベルを示す。
【０１６８】
実施例２：ヒトκ軽鎖トランスジーン ＫＣｏ５
ヒトκ軽鎖トランスジェニックマウス系統ＫＣｏ５−９２７２の作製は、以前にＫＣｏ５と記載されている（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ．ら、１９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ８４５−８５１；米国特許第５，７７０，４２９号の実施例３８）。この系統は、人工的なヒトκ軽鎖遺伝子座および複数のヒトＶκ分節を含むＹＡＣクローンの共注入によって作製された。ＹＡＣクローンのＤＮＡは、ヒトＶκ遺伝子座部分を含む（ＩＣＲＦ ＹＡＣライブラリー指定番号４ｘ１７Ｅ１）、４５０ ｋｂの酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む酵母菌株から単離された。ＹＡＣ ＤＮＡから増幅されたＶ遺伝子分節のＤＮＡ配列解析は、このクローンが約３２の異なるＶκ分節を含むヒトの遠位Ｖκ領域の大部分を包含することを実証した。このクローンの異なる単離物の解析 （Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ， Ｊ．，ら， １９９７， Ｇｅｎｅ １９１： １７３−１８１） からその結果を確認し、また、このクローンが、遠位Ｖクラスターの５’部分が近位Ｖクラスターの相同領域に類似しているヒトκ遺伝子座Ｃハプロタイプの例を示すことをも実証した。従って、５’ＯファミリーＶ遺伝子分節は、相同な近位ＯｐファミリーＶ分節の配列と類似している。
【０１６９】
胚前核へのマイクロインジェクション用に精製したＹＡＣ ＤＮＡを得るため、全ゲノムＤＮＡはアガロースゲルでサイズ分画した。ＹＡＣ ４ｘ１７Ｅ１を含む酵母細胞は、溶菌前にアガロースに包埋し、ＹＡＣ ＤＮＡはパルスフィールドゲル電気泳動によって酵母染色体ＤＮＡから分け、単離し、半日の胚前核にマイクロインジェクションした。
【０１７０】
ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析から、ヒトＶｋＡ １０遺伝子（Ｃｏｘ， Ｊ，ら、１９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７−８３６； Ｓｃｈａｂｌｅ， Ｋ．およびＺａｃｈａｕ． Ｈ．， １９９３， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４： １００１−１０２２）がＫＣｏ５−９２７２マウスのゲノム内に組み込まれていることが実証された。ＶκＯ１の５’領域（ｍ２１７−１， Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ７６０７１； ＡＢ１２９， ｃｃａｃｃｃｃａｔａａａｃａｃｔｇａｔｔｃ （配列番号４）； ＡＢ１３０， ｔｔｇａｔｇｃａｔｃｃｔａｃｃｃａｇｇｇｃ （配列番号５）、および、ＶκＬ２４とＬ２５との遺伝子間の領域（ｍ１３８−１３， Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ７２８２４； ＡＢ１２７， ｃｃｔｇｃｃｔｔａｃａｇｔｇｃｔｇｔａｇ （配列番号６）； ＡＢ１２８， ｇｇａｃａｇｃａａｃａｇｇａｃａｔｇｇｇ （配列番号７）に特異的なプローブを用いたＰＣＲ解析から、ＹＡＣクローン４ｘ１７Ｅ１由来のＶκクラスターの５’および３’領域がＫＣｏ５−９２７２トランスジーンの組込みに包含されていることが示された。その後、ＫＣｏ５−９２７２系統マウスは、内因性の重鎖およびκ軽鎖遺伝子座を破壊したホモ接合型であり、かつ、ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２もしくはＨＣｏ７（米国特許第５，７７０，４２９号）およびヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ５のヘミ接合体またはホモ接合体であるマウスを得るために、内因性の免疫グロブリン遺伝子座変異体の、ヒト重鎖トランスジェニックマウスと交配した。内因性の重鎖およびκ軽鎖遺伝子座を破壊したホモ接合体であり、かつ、ヒト重鎖およびκ軽鎖トランスジーンのヘミ接合体またはホモ接合体である動物は、二重トランスジェニック／二重欠失マウスと表される。
【０１７１】
ＫＣｏ５二重トランスジェニック／二重欠失マウスまたはこれらの動物から作製されたハイブリドーマから直接得られたｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列解析から、次のＶκ遺伝子、すなわち、Ｌ６、Ａ２７、Ｏ１２、Ｏ４／Ｏ１４、Ａ１０、Ｌ１５、Ｌｌ８、Ｌｌ９、およびＬ２４の発現が示された。
【０１７２】
実施例３：交雑育種
１４番染色体断片ｈＣＦ（ＳＣ２０）を含むヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖トランスジーンは、交雑育種によって単一の系統に統合した。ｈＣＦ（ＳＣ２０）トランスジェニックマウス系統は、内因性重鎖遺伝子座（ＣＭ２Ｄ）および内因性κ軽鎖（ＣＫＤ）の不活性化変異体のホモ接合型であった。この系統はまた、（低）λ１変異体（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）のホモ接合型でもあった。ＣＭ２Ｄ変異体は、Ｃμ２、Ｃμ３−Ｃμ４、ならびにＭμｌおよびＭμ２の部分に及ぶ３．７ ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片の欠失を含む。ＣＫＤ変異体は、Ｃκエキソンに及ぶ２ ｋｂのＳａｃＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片の欠失を含む。両変異体は既に報告されている（Ｔｏｍｉｚｕｋａ． Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）。これらのマウスは、ＫＣｏ５−９２７２ヒトκトランスジーン挿入のホモ接合型であって、かつ、内因性の重鎖およびκ鎖遺伝子座をそれぞれ破壊したＣＭＤおよびＪＫＤのホモ接合型マウスと交配した。ＣＭＤ変異体は、実施例１で上述されている。ＪＫＤ変異体は、米国特許第５，７７０，４２９号、およびＣｈｅｎら、１９９３． ＥＭＢＯ Ｊ． １２：８２１−８３０）に記載されている。これらの交配による、ｈＣＦ（ＳＣ２０）導入染色体陽性である子孫（ＳＣ２０／ＫＣｏ５マウス、または交雑育種されたマウス）は、６つの異なる遺伝的改変、すなわち、ＳＣ２０、ＫＣｏ５、ＣＭＤ、ＣＨＤ、ＪＫＤ、およびＣＫＤ２のヘミ接合型である。しかし、内因性重鎖遺伝子座のＣＭＤおよびＣＭ２Ｄ変異の両方がマウスμ遺伝子の発現を妨げ、内因性κ遺伝子座のＪＫＤおよびＣＫＤ変異の両方がマウスκの発現を妨げるため、これらのＳＣ２０／ＫＣｏ５マウスはこれらの２つの遺伝子座の各々を破壊されたホモ接合型となる。従って、このマウスは、抗体を含むκ軽鎖の発現をＳＣ２０およびＫＣｏ５トランスジーンに依存している。内因性のマウスλ軽鎖遺伝子座が機能を残しているため、それらはまたヒト／マウス抗体のハイブリッドをも形成しうる。そのマウスはまた、ヒト重鎖Ｖ領域およびマウスの非μ重鎖アイソタイプの定常領域配列を含むキメラヒト／マウス抗体をも発現しうる。これらのキメラ抗体は、クラススイッチングによって仲介されるマウスＩｇＨ遺伝子座へのヒトＳＣ２０ ＩｇＨ遺伝子座の染色体転座によって形成されうる。このような「トランススイッチング」の事象は、ミニ遺伝子座の重鎖トランスジーンを有するマウスで起こることが既に見いだされている（Ｔａｙｌｏｒ， Ｌ．ら、１９９４， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５７９−５９１）。４０匹のオスＫｃｏ５／ＣＭＤ／ＪＫＤマウスと９８匹のメスｈＣＦ（ＳＣ２０）／ＣＭ２Ｄ／ＣＫＤマウス間での交雑育種は、３０５匹の仔を生じた。これらの仔から調製した血清サンプルのＥＬＩＳＡ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）は、３０５匹の仔のうち１２５匹（４１％）がヒトＩｇμ鎖の発現について陽性であることを示した。ヒトＩｇκ鎖を検出する更なる解析は、すべてのｈμ陽性個体はまたｈκ陽性でもあることを示し、ＫＣｏ５トランスジーン（実施例２参照）を保持していることを示した。ｈＣＦ（ＳＣ２０）の検出のための、Ｄ１４Ｓ１４１９およびＤ１４Ｓ１４２０プライマー対（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７， ７２２− ７２７）を用いた、尾部ＤＮＡのＰＣＲ解析は、すべてのｈμ陽性個体がｈＣＦ（ＳＣ２０）を保持し、すべてのｈμ陰性個体がｈＣＦ（ＳＣ２０）について陰性であることを示した。メスｈＣＦ（ＳＣ２０）／ＣＭ２Ｄ／ＣＫＤからのｈＣＦ（ＳＣ２０）の伝達効率（４１％）は、以前に報告されたデータと一致した（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）。
【０１７３】
実施例４：交雑育種マウスの血清におけるヒト Ｉｇ の発現
６−１２週齢の交雑育種マウスから調製した血清サンプルは、ヒトＩｇμ、γ、κおよびマウスλ鎖の濃度を決定するためにＥＬＩＳＡによって検査した（図２）。 内因性Ｃμ欠失のヘミ接合型マウスと比較して、同様の条件下に置かれた場合、ヒトＩｇμおよびＩｇγの平均レベルは、それぞれ、マウスμ鎖レベル（２７３ ｍｇ／ｌ）よりも高く、マウスγ鎖レベル（５９０ ｍｇ／ｌ）の３分の１であった。これらの重鎖の発現レベルは、二重Ｔｃ／二重ＫＯマウス（ｈＣＦ（ＳＣ２０）／ｈＣＦ（２−Ｗ２３）／ＣＭ２Ｄ／ＣＫＤ Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）のそれと同様である。交雑育種マウスの第１世代はこの変異のヘテロ接合型であったため、オスとメスの交雑育種間での交配によって産生した、Ｆ２世代の子孫の４分の１は、ｍλＣ１（低λ）変異体のホモ接合型であると期待された。ヒトＩｇκおよびマウスＩｇλ軽鎖の血清濃度は、以前の報告に記載されたように（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）、２１匹のＦ２交雑育種マウスでＥＬＩＳＡによって測定された。調べられた２１匹のマウスのうち、６匹のマウスは、低λ変異のホモ接合型マウスの特徴である（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）、低い（＜０．１）マウスλ／ヒトκ比を示した。従って、これらの６匹の交雑育種マウスは、（低）λ変異のホモ接合型の可能性があり、これはヒトＩｇ重鎖およびκ軽鎖を持つ抗体を分泌するハイブリドーマの効率的な産生に有用でありうる。
【０１７４】
実施例５：抗ヒト ＣＤ４ ヒトモノクローナル抗体の産生
抗原の免疫法。交雑育種マウスおよび二重Ｔｃ／ＫＯマウス（ｎ＝５）は、０日目に、１００μｇの可溶性ヒトＣＤ４（ｓＣＤ４）を含む完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）の皮下注射によって免疫し、次いで９、１９および２７日目に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）で免疫した。最終的なＰＢＳ中４０μｇのｓＣＤ４の静脈注射は３７日目に行った。
【０１７５】
マウスにおける体液性応答。血清は０、１６、２６、３４および４０日目に採取した。抗原特異的なヒトＩｇγおよびＩｇκは、ｓＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）作製のため、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＥＬＩＳＡの詳細なプロトコールは実施例４に記載されている。抗原特異的なプレートは、１μｇ／ｍｌの抗原を含む炭酸水素塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で一晩コートした。抗原特異的なＩｇγおよびＩｇκは、抗原特異的なヒトモノクローナルＩｇＧの１つを標準として定量した。その結果を図３、４，５および６に示す。ヒトγあるいはκの応答は、交雑育種マウスおよび二重Ｔｃ／二重ＫＯマウスにおいて、免疫開始後３４日目から観察した。
【０１７６】
ハイブリドーマの作製。免疫したマウス由来の脾臓細胞は、４０日目に、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞と融合した。細胞懸濁液は、ウェル当たり２万の脾臓細胞で、３８４ウェルプレート中で培養した。その結果生じたハイブリドーマは、ｓＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生に基づいて選抜した。その結果を下表２に示す。
【０１７７】
【表２】
ＣＤ４ モノクローナル抗体の産生
Figure 2004515230
交雑育種マウスからの親ハイブリドーマは、２回の限界希釈法によって高い効率でサブクローニングされた。交雑育種マウスからのハイブリドーマはすべて、ヒトγ／ヒトκ抗ＣＤ４ＭＡｂを分泌し、ヒトγ／マウスλ抗ＣＤ４ＭＡｂを分泌するハイブリドーマはなかった。これらのデータは、交雑育種マウスが抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の作製のための二重ＴＣ／ＫＯ系統より優れていることを示した。さらに、これらのサブクローニングされたハイブリドーマより分泌されるＭＡｂのアイソタイプを、多数のＥＬＩＳＡによって調べた。７ウェルはｈγ１＋、７ウェルはｈγ４＋であった。
【０１７８】
小規模培養における、成長曲線および抗ＣＤ４ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の分泌レベル。抗ＣＤ４ヒトＩｇＧ１κを産生するハイブリドーマクローンの１つ（ＫＭ２−３）を、小規模培養における成長曲線およびヒトモノクローナル抗体の分泌レベルの測定のために用いた。ＫＭ２−３ハイブリドーマ細胞を、０日目に１×１０５細胞／ｍｌで４リットルのスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ）に接種した。培養には、ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および１％の低ＩｇＧ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給した１リットルのＥＲＤＦ培地を用いた。毎日１ｍｌの培地を採取し、細胞数およびＩｇＧ１κ濃度を、以前の報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）に記載されているように、ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果を図７に示した。測定した産生速度は２４．６ ｐｇ／細胞／日であり、これらの条件下で優れたマウスハイブリドーマに期待されるのと同様の範囲であった。
【０１７９】
実施例６：抗ヒト Ｇ−ＣＳＦ ヒトモノクローナル抗体の作製
抗原の免疫法。交雑育種マウスおよび二重Ｔｃ／ＫＯマウス（ｎ＝５）は、０、９、１９、２７日目に、１００ ｇの可溶性ヒトＧ−ＣＳＦを含む ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄアジュバント（ＣｙｔＲｘ）の皮下注射によって免疫した。最終的なＰＢＳ中２０ ｇのＧ−ＣＳＦの静脈注射は、交雑育種マウスおよび二重Ｔｃ／ＫＯマウスに対して３７日目に行った。
【０１８０】
各系統のマウスにおける体液性応答。血清は０、１６、２６、３４および４０日目に採取した。抗原特異的なヒトＩｇｓの濃度は、ＥＬＩＳＡによって定量した。抗原特異的なプレートは、炭酸水素塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中の１μｇ／ｍｌの抗原で一晩コートした。抗原特異的なＩｇγおよびＩｇκは、Ｇ−ＣＳＦに特異的なヒトモノクローナルＩｇＧの１つを標準として定量した。その結果を図８、９、１０および１１に示した。交雑育種マウスの血清中の抗原特異的ｈγおよびｈκの濃度は、二重Ｔｃ／ＫＯマウスのそれより約１０倍高かった。
【０１８１】
ハイブリドーマの産生。免疫したマウス由来の脾臓細胞は、４０日目に、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞と融合し、その結果生じたハイブリドーマは、Ｇ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生に基づいてＥＬＩＳＡにより選抜した。その結果を下表３に示す。
【０１８２】
【表３】
Ｇ−ＣＳＦ モノクローナル抗体の産生
Figure 2004515230
抗Ｇ−ＣＳＦ ＩｇＧ産生ハイブリドーマの半分は、ヒトγ／ヒトκ抗Ｇ−ＣＳＦ ＭＡｂを分泌し、残りのハイブリドーマはヒトγ／マウスλ抗Ｇ−ＣＳＦ ＭＡｂを分泌した。ｈγ／ｈκ抗体を産生しているハイブリドーマは、２回の限界希釈法によってサブクローニングした。さらにＥＬＩＳＡ実験を行ったところ、５、３および３ウェルがそれぞれｈγ１＋、ｈγ２＋およびｈγ４＋であることが示された。
【０１８３】
実施例７：抗ヒト血清アルブミンヒトモノクローナル抗体の作製
交雑育種マウスは、０日目に、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の５０μｇのヒト血清アルブミンの腹腔内注射によって免疫し、次いで７、１４および２１日目に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）で免疫した。
【０１８４】
ハイブリドーマの作製。免疫したマウス由来の脾臓細胞は、２４日目に、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞と融合し、その結果生じたハイブリドーマは、抗原に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生に基づき、ＥＬＩＳＡにより選抜した。１０ウェルのハイブリドーマを、抗アルブミンｈγ産生ハイブリドーマから任意に選択し、サブクローニングした。すべてのハイブリドーマはヒトγ／ヒトκ抗アルブミンを分泌した。二重Ｔｃ／二重ＫＯマウスから得られた抗アルブミンＩｇＧハイブリドーマの３分の２はｍλ＋であった（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ら、２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｒｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：７２２−７２７）ので、このデータから、抗原特異的な完全にヒトのモノクローナル抗体を産生するためには、交雑育種マウスが二重Ｔｃ／二重ＫＯマウスよりも優れていることが示された。
【０１８５】
実施例８：抗ヒト ＣＴＬＡ−４ モノクローナル抗体の作製
抗原。ヒトＣＴＬＡ−４およびマウスＣＤ３ζ遺伝子由来の配列を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片は、架橋合成オリゴヌクレオチドとともにｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅することによって構築した。コードされる融合タンパク質は、以下の配列を含む。すなわち、ｉ．）ヒトＣＴＬＡ−４をコードしているアミノ酸１−１９０（シグナルペプチド、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインおよびヒトＣＴＬＡ−４の推定膜貫通配列全体を含む）とｉｉ．）アミノ酸５２からカルボキシ末端までのマウスＣＤ３ζである。増幅されたＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。クローニングしたインサートは、その後、ｐＢＡＢＥ−ｈｕＣＴＬＡ−４／ＣＤ３ζを作出するために、ｐＢＡＢＥベクター（ピューロマイシン耐性をコードする遺伝子を持つ（Ｍｏｒｇａｎｓｔｅｒｎ， ＪＰおよびＬａｎｄ， Ｈ， １９９０ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：３５８７−９６）にサブクローニングした。ｐＢＡＢＥ−ｈｕＣＴＬＡ−４／ＣＤ３ζをレトロウイルスパッケージング細胞株、Ψ−２にトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性細胞のプールを選択した。これらの細胞はマウスＴ細胞ハイブリドーマＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ−４７）と共培養した。共培養の２日後、非接着ＢＷ５１４７細胞を除去し、ピューロマイシンへの耐性によって選択した。ピューロマイシン耐性細胞プールは限界希釈法によってサブクローニングし、ＦＡＣＳによってヒトＣＴＬＡ−４の表面での発現を検定した。細胞表面で高レベルのヒトＣＴＬＡ−４を発現しているクローンを選択した（ＢＷ−ｈｕＣＴＬＡ−４ＣＤ３ζ−３＃１２）。ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含む可溶性組換え抗原は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｔ． ＃３２５−ＣＴ−２００）から購入した。
【０１８６】
免疫法。３匹のＳＣ２０／ＫＣｏ５交雑育種マウス（識別＃は、２２２２７、２２２３０、および２２２３１）はそれぞれ、ヒトＣＴＬＡ−４細胞外ドメインを発現している、１０ｅ７の洗浄した全ＢＷ−ｈｕＣＴＬＡ−４ＣＤ３ζ−３＃１２の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって免疫した。 この免疫操作は、マウス＃２２２２７および２２２３０には、約１ヶ月間隔でさらに２回くり返した。３ヶ月目に、マウス＃２２２３１は、洗浄した全細胞の３回目のｉ．ｐ． 注射を行ったが、一方、マウス＃２２２２７および２２２３０はそれぞれ、２０μｇの可溶性組換え抗原を含むＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ． ＃ Ｍ６５３６）を、ｉ．ｐ．および皮下（ｓ．ｃ．）注射した。その後、マウスは１０日間静置し、ハイブリドーマ融合のための脾臓細胞採取２日前に、マウス＃ ２２２２７および２２２３０をそれぞれ、２０μｇの可溶性組換え抗原を含むＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントのｉ．ｐ． 注射とともに、２０μｇの可溶性組換え抗原の尾静脈（ｉ．ｖ．）注射をした。脾臓細胞採取１日前に、これらのマウスはさらに２０μｇの可溶性組換え抗原のｉ．ｖ．した。マウス＃２２２３１は、脾臓細胞の採取３日前に、１０ｅ７の洗浄したＢＷ−ｈｕＣＴＬＡ−４ＣＤ３ζ−３＃１２を含むＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをｉ．ｐ．注射し、次いで融合の２日前に、アジュバントなしの１０７の洗浄したＢＷ−ｈｕＣＴＬＡ−４ＣＤ３ζ−３＃１２細胞をｉ．ｐ．注射した。
【０１８７】
融合。マウス＃２２２２７、２２２３０、および２２２３１由来の脾臓細胞は、３回の独立した実験において、標準的な方法（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｋｅｎｎｅｔｔら、１９８０， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｐｌｅｎｕｍ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ＯｉおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ， １９８０， Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， ｉｎ ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、ｐｐ． ３５７−３７２． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｈａｌｋ， １９８４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、ｐｐ． ７６６−７８０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ）によって、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３ Ｘ６３ Ａｇ８．６．５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０、またはＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１系統）と融合した。細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、ＯＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ｏ−５００３）、ＢＭＥ（Ｇｉｂｃｏ ２１９８５−０２３）および３％ Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｉｇｅｎ ＩＧ５０−０６１５）中で培養した。ＨＡＴまたはＨＴ補給剤は、初期の増殖および選択培地に添加した。
【０１８８】
ハイブリドーマスクリーニング。抗原反応性のヒトＩｇＧ抗体を分泌するハイブリドーマを同定するため、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）は、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中０．２ μｇ／ｍｌのヒトＣＤ１５２ Μ−Ｉｇ融合物（Ａｎｃｅｌ ＃ ５０１−８２０）で一晩コートした。プレートは１００μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄およびブロッキングした。５０μｌの細胞培養上清を添加し、その後１−２時間インキュベートした。プレートは洗浄した後、１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトγ重鎖（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｇａｍｍａ （ｆｃ） ＡＰ Ｊａｃｋｓｏｎ ＃ １０９−０５６−０９８）とともに１時間インキュベートした。プレートは各段階でＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。γ陽性の、抗原反応性抗体を分泌する７６のハイブリドーマが確認された。これらのクローンは、その後さらに、γ重鎖または軽鎖アイソタイプならびに混入しているＩｇＭ分泌細胞の存在を決定するために解析した（表４）。
【０１８９】
【表４】
抗原反応性のヒト ＩｇＧ 抗体を含む １ °ハイブリドーマウェルからの重鎖アイソタイプの分析
Figure 2004515230
ハイブリドーマ上清は、初めに抗原反応性のヒトＩｇＧの存在を検査した。その後、７６の陽性の上清は抗原反応性のヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、Ｉｇκ、およびマウスＩｇλを検査した。捕獲試薬：ヒトＣＤ１５２ μ−Ｉｇ ｆｕｓｉｏｎ（Ａｎｃｅｌ ＃ ５０１−８２０）。検出試薬：抗ヒトγ（ｆｃ）ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＃ １０９−０３６−０９８）；抗ヒトκＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ ＃ Ａ８０−１１５Ｐ）；抗ヒトγ１ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃９０５０−０５）；抗ヒトγ２ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃９０７０−０５）；抗ヒトγ３ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃９２１０−０５）；抗ヒトγ４ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃９２００−０５）；抗ヒトμ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１０６０−０５）。
【０１９０】
７６のＩｇＧ抗原陽性ウェルのうち７５は、ヒトκ軽鎖抗原反応性の抗体に対しても陽性だったが、一方、７つのウェルはハイブリッド抗体を含むマウスλに対して陽性であった。しかし、７つのλ陽性ウェルのうちの６つはκ軽鎖も含み、これらの６つのウェルのうちの３つは、ＩｇＭ抗原反応性の抗体の混入に対して陽性であった。これらの混入しているＩｇＭ抗体がλ軽鎖の含有に寄与する可能性があるため、計７６個のＩｇＧクローンのうち、３つから７つのＩｇＧλクローンがある。従って、内因性のマウスλは、ＩｇＧ陽性の、抗原反応性のハイブリドーマのわずか４から９％に寄与するだけと思われる。その後、７６の陽性ハイブリドーマウェルのうち２２のウェルの細胞は、個々のモノクロナール抗体分泌ハイブリドーマをサブクローニングするために、限界希釈法で再培養した。安定な抗原反応性を示す、ヒトＩｇＧサブクローンは、２２の１°ハイブリドーマのうち１９から得られた（下表５参照）。
【０１９１】
【表５】
抗 ＣＴＬＡ−４ ハイブリドーマのサブクローニング
Figure 2004515230
かくして、８６％のサブクローニング効率が得られた。サブクローニングにおいて、１つの１°ハイブリドーマは、異なるＩｇＧアイソタイプを持つ２つの異なるクローンを含むことが、確認された（下表６参照）。
【０１９２】
【表６】
ヒト ＩｇＧ κ抗 ＣＴＬＡ−４ サブクローンのアイソタイプ解析
Figure 2004515230
かくして、２０個の異なるサブクローンが得られた。２０クローンはすべてヒトκ軽鎖を用いており、完全にヒト抗体である。
【０１９３】
モノクロナール抗体は、５つのサブクローニングされたハイブリドーマ（１Ｈ５、４Ａ９、４Ｃ１、８Ｈ４、および１０Ｅ１）から単離され、Ｂ７．２へのＣＴＬＡ−４の結合を遮断する、それらの能力について検査した（図１２および１３）。
【０１９４】
つまり、ＥＬＩＳＡプレートを、０．７μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）のＢ７．２ Ｉｇ融合タンパク質でコートした（すべての目的のために参照によりその全体が組み入れられるＷＯ ０１／１４４２４を参照）。プレートは洗浄し、３０分間ＰＢＳ−Ｔ ＋ ｌ％ ＢＳＡ中でブロッキングした。抗体は、等量の０．２μｇ／ｍｌのビオチン標識したＣＴＬＡ−４ Ｉｇ（Ａｎｃｅｌｌ ＃５０１−０３０）と混合し、室温で１時間、プレインキュベートした後、Ｂ７．２でコートしたＥＬＩＳＡプレートへ移し、１時間インキュベートした。プレートは洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ １５−３０−０）を添加し、１時間インキュベートした。プレートは、ｐｎｐｐ基質で発色させた。ビオチン標識したＣＴＬＡ−４のＢ７．２への結合の阻害は、４０５ｎｍでの吸光度に対する抗体濃度としてプロットされる。１０Ｄ１抗体は、ＣＴＬＡ−４特異的なヒトＩｇＧ１である（ＷＯ ０１／１４４２４参照）。抗体アイソタイプは、１Ｈ５．１（γ１）、４Ａ９．１（γ１）、４Ｃ１．１（γ４）、８Ｈ４．４（γ４）、１０Ｅ１．１（γ４）および１０Ｄ１（γ１）である。
【０１９５】
抗体のうち２つ（１Ｈ５および４Ａ９）は、遮断抗体であることが確認され、３つ（４Ｃ１、８Ｈ４、および１０Ｅ１）は非遮断抗体であることが確認された（図１２および１３）。
【０１９６】
抗ＣＴＬＡ−４の投与はＴ細胞を介した免疫応答を増強することができる（Ｋｒｕｍｍｅｌ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：４５９−４６５； Ｋｒｕｍｍｅｌら、１９９６， Ｉｎｔ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：５１９− ５２３）。従って、ＣＴＬＡ−４抗体は別の物質の免疫原性を増加させるアジュバントとして利用されうる。ＣＴＬＡ−４に対する抗体が別の物質とともに投与される場合、２つは順にまたは同時に投与されうる。本方法は、様々なワクチンおよび、増強された免疫反応が有益となる治療のために利用しうる。例えば、感染症あるいは、黒色腫、大腸癌、前立腺癌、および腎臓癌を含む癌である。
【０１９７】
ＣＴＬＡ−４抗体はまた、Ｔ細胞を介した免疫応答を抑制するためにも利用しうる。この活性は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の多価の製剤で得られる。例えば、（抗体の結合価を増加させるために）抗ＣＴＬＡ−４でコートされたラテックスミクロスフェアは、Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害できる。同一の抗体結合部位を持つ物質は、Ｆａｂまたは可溶性ＩｇＧとして存在した場合には、ＣＴＬＡ−４拮抗薬として、高度に架橋された場合には、ＣＴＬＡ−４作動薬として作用するかも知れない。このように、多価の形態の抗ＣＴＬＡ−４抗体は免疫抑制のための有用な治療薬となりうる。
【０１９８】
ラテックスミクロスフェアまたは他の不溶性の粒子への結合に加えて、抗体は互いに架橋させることができ、また、多量体を形成するために遺伝子操作しうる。架橋は、直接的な化学結合、または、抗体−ビオチン−アビジン複合体のような間接的な結合であってもよい。架橋は、化学結合基が用いられる共有結合、または、タンパク質−タンパク質もしくは他のタンパク質−リガンド相互作用が用いられる非共有結合であってもよい。結合に対する遺伝子工学的アプローチは、例えば、ＩｇＭ発現ベクターまたは任意のタンパク質成分（例えばポリリシンなど）での、高親和性ＩｇＧ抗体の可変領域の再発現を含む。高親和性ＩｇＧ抗体のＩｇＭ抗体への変換は、非常に高い親和力を持つ１０価の複合体を作出することができる。ＩｇＡ２発現ベクターもまた、多価抗体複合体を産生するために使用しうる。ＩｇＡ２はＪ鎖および分泌成分とともに重合体を形成できる。ＩｇＡ２は、好中球、マクロファージおよび単球で発現されるＩｇＡ受容体ＣＤ８９によってさらに架橋しうるという利点を持つかもしれない。あるいは、Ｃ２０／ＫＣｏ５の交雑育種マウスから作製されたハイブリドーマの約２％はＩｇＡであるので、これらの動物は直接ヒトＩｇＡアイソタイプ抗ＣＴＬＡ−４抗体を作製するために使用しうる。
【０１９９】
アゴニズムは、ＣＴＬＡ−４上の少なくとも２つの重複しないエピトープに対する抗体を含む、ＣＴＬＡ−４に対するいくつかのポリクローナル抗体製剤を用いても得られる。２つの結合部位を持つ、このような製剤中の１つの抗体は、２分子のＣＴＬＡ−４と結合することができ、小さなクラスターを形成する。異なる結合部位を持つ第二の抗体は、その後、これらの小さなクラスターを結合させ（凝集させ）、大きなクラスターを形成し、それによって、Ｔ細胞にシグナルを伝達する（細胞表面の）ＣＴＬＡ−４の複合体の形成し、ＣＴＬＡ−４を有する（発現する）Ｔ細胞を阻害、減少、またはその活性を妨げる。従って、いくつかのポリクローナル抗体製剤は、上述の多価の製剤と同様のアゴニズムを示す。
【０２００】
従って、抗ＣＴＬＡ−４抗体の多価またはポリクローナルの製剤は、ＣＴＬＡ−４受容体を抑制させるために有用であり、それによって、該製剤を用いなければＣＴＬＡ−４受容体を有するＴ細胞によって仲介される免疫応答を抑制する。このような抗体の多価またはポリクローナルの製剤を用いて治療しうる疾患のいくつかの例は、自己免疫疾患、移植臓器拒絶、および炎症を含む。
【０２０１】
実施例９：抗ヒト ＥＧＦＲ 抗体の作製
抗原。ヒトの癌Ａ４３１細胞由来の精製された可溶性上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ（Ｅ３６４１）から購入した。ヒトの癌Ａ４３１細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）から入手した。Ｒｉｂｉ ＭＰＬ ＋ ＴＤＭアジュバントはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ（Ｍ−６５３６）から購入した。
【０２０２】
免疫法。２匹のＳＣ２０／ＫＣｏ５交雑育種マウス（識別＃は、２２２３２、および２２２３９）はそれぞれ、１０７の洗浄したヒトの癌Ａ４３１細胞全体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって免疫した。この免疫方法は、両マウスで１ヶ月後に繰り返した。４ヶ月目に、マウス２２２３９は、２５μｇの可溶性ＥＧＦＲを含む ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントによってｉ．ｐ． で免疫し、１１日間静置し、その後、１０μｇのＥＧＦＲを含むＰＢＳをｉ．ｖ． で与え、１０μｇの可溶性ＥＧＦＲを含む ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントをｉ．ｐ． 注射した。２日後、マウス２２２３９は、もう一度１０μｇのＥＧＦＲを含むＰＢＳをｉ．ｖ．で与えられ、翌日、マウス２２２３９の脾臓細胞を融合のために採取した。最初の２回のＡ４３１細胞の注射の後、マウス２２２３２は３ヶ月静置し、その後、ＭＰＬ ＋ ＴＤＭアジュバントと混合された１０７のＡ４３１細胞をｉ．ｐ． 注射した。４日後、脾臓細胞がマウス２２２３２から融合のために採取された。
【０２０３】
融合。マウス＃２２２３２、および２２２３９からの脾臓細胞は、２回の独立した実験において、Ｐ３ Ｘ６３ Ａｇ８．６．５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０；マウス＃２２２３９）、またはＳＰ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１；マウス＃２２２３２）のいずれかのミエローマ細胞株と融合した。融合は、実施例８に概説された標準的方法によって行った。
【０２０４】
ハイブリドーマスクリーニング。ＥＧＦＲハイブリドーマのためのスクリーニング方法は、実施例８でＣＴＬＡ−４のために使用された方法と同様である。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）は、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中１ μｇ／ｍｌの可溶性ＥＧＦＲ抗原で一晩コートした。プレートは１００μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄およびブロッキングした。５０ μｌの細胞培養上清を添加し、次いで１−２時間インキュベートした。プレートは洗浄した後、１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトγ重鎖（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｇａｍｍａ （ｆｃ） ＡＰ Ｊａｃｋｓｏｎ ＃ １０９−０５６−０９８）とともに１時間インキュベートした。プレートは各段階の間にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。マウス２２２３２およびマウス２２２３９の融合体から、それぞれ、ヒトＩｇＧκ抗ＥＧＦＲ特異的抗体を分泌する５つおよび２つのハイブリドーマがサブクローニングされた。ＥＧＦＲ特異的抗体の重鎖および軽鎖のアイソタイプ解析は、４つのＩｇＧｌκ、１つのＩｇＧ２κおよび１つのＩｇＧ４κ抗体を含んでいた。
【０２０５】
実施例１０：精製されたヒト ＩｇＧ κモノクローナル抗体の速度および平衡定数
ハイブリドーマは１％ウシ胎仔血清を含むｅＲＤＦ（低ＩｇＧ）中で培養した。ヒトＭＡｂはプロテインＧカラムを用いて精製した。Ｇ−ＣＳＦおよび可溶性ＣＤ４に対する精製ＭＡｂの速度平衡結合定数は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器を用いて測定した。ヒトＧ−ＣＳＦ（１２０ ＲＵ）またはＣＤ４：Ｆｃ（１６００ ＲＵ）は、製品の使用説明書に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ）のセンサーチップ表面に、アミン基を介した共有結合によって固定化した。モノクローナル抗体は、抗原の上に流した。チップは、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ｌ．５）または４Ｍ ＭｇＣｌ２で再生し、それぞれ残った抗ヒトＧ−ＣＳＦ ＭＡｂまたは抗ＣＤ４ ＭＡｂを除去した。このサイクルを、異なる濃度のＭＡｂを用いて、繰り返した。抗原への結合および抗原からの解離は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを用いて測定した。Ｋａはｋａｓｓｏｃをｋｄｉｓｓｏｃで割ることによって導き出された。表７に示すように、これらの値は、マウス抗Ｇ−ＣＳＦ ＭＡｂ、クローン３３１６． １１１（Ｒ＆Ｄ）、または、マウス抗ヒトＣＤ４ ＭＡｂ、Ｌｅｕ３ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）について得られたそれに匹敵する。
【０２０６】
【表７】
精製されたヒト ＩｇＧ κ ＭＡｂ の速度および平衡定数
Figure 2004515230
実施例１１：交雑育種（ Ｆｃ ）マウスの作製
免疫寛容が自己抗原に対する反応性を回避することはよく知られており、通常、アミノ酸配列がマウスの対応物のそれと類似のまたは同一である、異種抗原に対するマウスモノクローナル抗体の作製を妨げる。タンパク質抗原の活性部位のアミノ酸配列はよく保存されている傾向があるため、ヒトの抗原とそのマウスの対応物との間で共通のエピトープに結合するマウスモノクローナル抗体は有用でありうる。さらに、これらの抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの投与によってもたらされるあらゆる効果はマウスモデルで容易に研究しうる。しかし、また、そのような共通のエピトープに対するマウスモノクロナール抗体を得ることは困難であった。上述のように、本発明の交雑育種マウスは、様々なヒト抗原に対するヒトモノクロナール抗体を得るために用いうる。しかし、ある状況では、よく保存されたヒト抗原と結合する能力を持つ、またはマウス対応物と交差反応する、ヒトモノクローナルを得ることは困難でありうる。そこで、本発明のもう一つの側面として、Ｆｃγ受容体ＩＩＢが不活性化された、本発明の追加の交雑育種マウスが供給される。本明細書で交雑育種（Ｆｃ）と称するこれらのマウスは、よく保存された抗原に結合する、またはそれらのマウス対応物と交差反応するモノクローナル抗体の作製を可能にする。生化学的および遺伝学的研究は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇに対するＩＩＢ型低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）が、抗体または免疫複合体を介して引き起こされる細胞活性化を阻害し、自己免疫の発生を妨げる重要な構成要素である可能性を示している（Ｔａｋａｉ， Ｔ．ら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３７９：３４６−３４９）。ＦｃγＲＩＩＢ、すなわち抑制Ｆｃ受容体の欠損動物は一般に、増強された抗体反応、および、すべての抗体に媒介される種類の高感受性反応において強められた炎症を引き起こす（Ｔａｋａｉ， Ｔ．ら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３７９：３４６−３４９）。例えば、ウシＩＶ型コラーゲン（Ｃ−ＩＶ）で免疫された変異マウスは、野生型マウスでは示されなかったが、マウスＣ−ＩＶへの高い自己抗体反応を示した（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ａ．ら、２０００， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：８９９−９０５）。しかし、ＦｃγＲＩＩＢ変異マウスが、自己反応性モノクロナール抗体の効率的な産生のために用いうるかについての、研究報告はなかった。さらに、マウスにおいて、ヒト抗原とマウス中での対応物との両方に結合するヒトモノクローナルの効率的な産生を実証する報告はなかった。
【０２０７】
以下に記載するように、ＦｃγＲＩＩＢ変異を、本発明の交雑育種マウスに導入した。その結果生じた交雑育種（Ｆｃ）マウスのウシＣ−ＩＶによる免疫は、ウシおよびマウスのＣ−ＩＶの両方に対するヒト抗体反応を誘導した。ウシおよびマウスのＣ−Ｉｖの両方に結合する、ヒトモノクローナルを分泌するハイブリドーマもまた作製しうる。従って、交雑育種（Ｆｃ）マウスは、免疫された異種抗原およびそれらのマウス対応物の両方に結合できるヒトモノクローナルの産生を可能にする。交雑育種（Ｆｃ）マウスはまた、よく保存された抗原に対するヒトモノクロナール抗体を得るためにも有用でありうる。ＦｃγＲＩＩＢノックアウト（Ｆｃ（−／−））のマウスホモ接合体（Ｔａｋａｉ， Ｔ．ら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３７９：３４６−３４９）は、Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ Ｔａｋａｉ博士（Ｔｏｈｏｋｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊａｐａｎ）より供与された。雄のＦｃ（−／−）マウスは、（実施例３に記載されたように）雌の交雑育種マウスとかけ合わせた。実施例３で記載したように、各Ｆ１個体におけるＫＣｏ５トランスジーンおよびｈＣＦ（ＳＣ２０）の保持は、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲによって検査した。ＦｃγＲＩＩＢノックアウトの遺伝子型は、以下の３つのプライマーを用いたＰＣＲ分析によって決定した。すなわち、
ｎｅｏ， ５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣ（配列番号８）；
５’ＥＣ１， ５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＧＴＧＧＡＴＣ（配列番号９）； および
３’ＥＣ１， ５’−ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＧＴＡＧ（配列番号１０）である。
【０２０８】
尾部生検から調製されたゲノムＤＮＡサンプルは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いたＰＣＲにかけた。上記の３つのプライマー（それぞれ０．５ｐＭ）を含む標準的な反応混合液中で、サンプルは、９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃３０秒で３５サイクル増幅した（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。野生型対立遺伝子およびホモ接合体対立遺伝子によって与えられるバンドサイズは、それぞれ１６１ｂｐおよび２３２ｂｐである。遺伝子型がＫＣｏ５／ＣＭＤまたはＣＭ２Ｄ（−／＋）／ＣＫＤまたはＪＫＤ（−／＋）／Ｆｃ（−／＋）であるＦ１の雄、および遺伝子型がｈＣＦ（ＳＣ２０）／ＫＣｏ５／ＣＭＤまたはＣＭ２Ｄ（−／＋）／ＣＫＤまたはＪＫＤ（−／＋）／Ｆｃ（−／＋）である雌を選択し、更なる育種に用いた。最終的に、遺伝子型がｈＣＦ（ＳＣ２０）／ＫＣｏ５／ＣＭＤまたはＣＭ２Ｄ（−／−）／ＣＫＤまたはＪＫＤ（−／−）／Ｆｃ（−／−）であるマウス（交雑育種（Ｆｃ））が得られた。交雑育種（Ｆｃ）マウスでのヒトＩｇμおよびκの血清発現量は、交雑育種マウスでのそれ（実施例４参照）に匹敵することが確認された。
【０２０９】
実施例 １２ ：抗マウス ＩＶ 型コラーゲンヒトモノクロナール抗体の作製
抗原の免疫。ウシＣ−ＩＶ（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＩＶ）はＮｉｔｔａ Ｇｅｌｌａｔｉｎ， Ｉｎｃ．から購入した。Ｃ−ＩＶ溶液（１ｍＭ ＨＣｌ中の３．０ ｍｇ／ｍｌ ｐＨ ３．０）は、フロイントアジュバントで乳化する前に、ｌ ｍＭ ＮａＯＨ（最終濃度）の添加によって中和した。交雑育種マウスおよび交雑育種（ＦＣ）マウスは、ヒト結核菌株Ｈ３７Ｒｖを含むＣＦＡ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）で乳化された１５０μｇのＣ−ＩＶを用いて、尾の基部に免疫した。マウスは、ＩＦＡ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を加えた１５０μｇのＣ−ＩＶを用いて、同じ部位に、２６および４８日後に追加抗原投与した（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ａ．ら、２０００， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：８９９−９０５）。
【０２１０】
マウスにおける体液性応答。血清は５８日目に採取した。血清中の抗原反応性ヒトｌｇγは、記載された方法に修正を加えて、ＥＬＩＳＡによって測定した（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ａ．ら、２０００， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１ ：８９９−９０５）。ウシＣ−ＩＶに対する抗体は、ウェルを５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌのウシＣ−ＩＶ溶液を用いて４℃で一晩コートした、９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ（Ｎｕｎｃ， ＭａｘｉＳｏｒｐ）で検出した。マウスＣ−ＩＶに対する抗体は、ＢＩＯＣＯＡＴ ｃｅｌｌｗａｒｅ ｍｏｕｓｅ Ｃ−ＩＶ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）を使用して検出した。希釈した血清（１：２０−１２８０）を、５０μｌ／ウェルで加え、４℃で一晩反応させた。ウェルを洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｓｉｇｍａ， Ａ０１７０）と４℃で２時間後、洗浄し、室温で３０分間５０μｌのＴＭＢ基質（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ， ＭＬ−１１２０Ｔ）で発色させた。４５０ｎｍのＯＤは、マイクロプレートリーダー（Ａｒｖｏ， Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｊａｐａｎ）を用いて読み取った。マウスＣ−ＩＶに対する特異的なヒトγ自己抗体反応は、交雑育種（Ｆｃ）マウスの血清で観察されたが、交雑育種マウスでは観察されなかった。ウシＣ−ＩＶに対する増強された反応は、交雑育種（Ｆｃ）マウスの血清において観察された（図１４）。
【０２１１】
融合およびハイブリドーマスクリーニング。マウスは、追加の１５０μｇ抗原の腹膜内注射（ＫＭ＃１：交雑育種、ＦＣ＃ １：交雑育種（Ｆｃ））、または、静脈注射（ＫＭ＃２：交雑育種、ＦＣ＃２：交雑育種（Ｆｃ））を６６日後に受け、脾臓細胞を６９日後に採取した。マウスからの脾臓細胞は、標準的な方法によって、マウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）と融合した。細胞懸濁液は、ウェルあたり２０万の脾臓細胞で、９６ウェルプレートに接種した。細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、インシュリン、ＩＬ−６中で培養した。ＨＡＴまたはＨＴ補給剤を、初期の増殖および選択の間、培地に添加した。ハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。マウスＣ−ＩＶを分泌しているハイブリドーマを同定するために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）は、４０μｇ／ｍｌのマウスＣ−ＩＶ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ０５３４）を含むＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）により４℃で一晩コートした。５０μｌの細胞培養上清を添加した。
【０２１２】
ｈγ陽性のマウスＣ−ＩＶ反応性抗体を分泌する２つのハイブリドーマは、交雑育種（Ｆｃ）マウスから得られ、限界希釈法によってうまくサブクローニングされた（下表８参照）。
【０２１３】
【表８】
抗 ＩＶ 型コラーゲンモノクロナール抗体の産生
Figure 2004515230
このデータは、交雑育種（Ｆｃ）マウスが、よく保存された抗原またはエピトープに対するヒトモノクロナール抗体の産生に有用であることを示す。
【０２１４】
本発明は、本発明の一面の例証を意図した例示的実施形態によって、その範囲に制限を受けることはなく、機能的に同等な任意のクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は本発明の範囲内である。実際、本明細書中で記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の記載および添付の図から、当業者にとっては明らかであろう。そのような変更は、添付の請求項の適用範囲に含まれることを意図している。また、ヌクレオチドに与えられたすべての塩基対サイズは概算であり、説明の目的で用いられていることも理解されるべきである。
【０２１５】
本明細書中で引用した刊行物および特許文献はすべて、それらが個々に記載される場合と同じとなることを目的として、参照によりその全体を本明細書中に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｃμターゲッティングベクターの設計を示す。Ａ） Ｃμ領域のマウスゲノムＤＮＡ。Ｂ） Ｃμターゲッティングベクター。Ｃ） Ｃμターゲッティングベクターによって相同組換えされたマウスゲノムＤＮＡ。
【図２】
図２は、二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおけるヒトＩｇμ、γ、κおよびマウスλ鎖の血清濃度を示す。
【図３】
図３は、免疫した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける３４日目の抗ＣＤ４ヒトＩｇγの血清濃度を示す。
【図４】
図４は、免疫した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける３４日目の抗ＣＤ４ヒトＩｇκの血清濃度を示す。
【図５】
図５は、３４日目に各群（Ｎ＝５）中で最高の血清力価を示した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける抗ＣＤ４ヒトＩｇγ応答の経時変化を示す。
【図６】
図６は、３４日目に各群（Ｎ＝５）中で最高の血清力価を示した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける抗ＣＤ４ヒトＩｇκ応答の経時変化を示す。
【図７】
図７は、ＫＭ２−３ハイブリドーマ細胞の増殖曲線および抗ＣＤ４ヒトモノクローナル抗体産生を示す。
【図８】
図８は、免疫した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける３４日目の抗ＧＣＳＦヒトＩｇγの血清濃度を示す。
【図９】
図９は、免疫した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける３４日目の抗ＧＣＳＦヒトＩｇκの血清濃度を示す。
【図１０】
図１０は、３４日目に各群（Ｎ＝５）中で最高の血清力価を示した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける抗ＧＣＳＦヒトＩｇγ応答の経時変化を示す。
【図１１】
図１１は、３４日目に各群（Ｎ＝５）中で最高の血清力価を示した二重ＴＣ／ＫＯマウスおよび交雑育種マウスにおける抗ＧＣＳＦヒトＩｇκ応答の経時変化を示す。
【図１２】
図１２は、抗ＣＴＬＡ−４ヒトモノクローナル抗体の遮断活性に関する用量反応曲線を示す。
【図１３】
図１３は、モノクローナル抗体を用いたＣＴＬＡ−４（ビオチン）のＢ７．２細胞との結合の抑制を示す。
【図１４】
図１４は、交雑育種（Ｆｃ）マウスの血清におけるウシＣ−ＩＶへの応答の増強を示す。

Claims (88)

  1. ２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該２つのヒト免疫グロブリン遺伝子座の一方はヒト重鎖の遺伝子座であり、もう一方はヒト軽鎖の遺伝子座であること；および
    これらの遺伝子座のうちの一方のみが導入染色体に存在することを特徴とする、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  2. 導入染色体が自律性であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  3. ヒト軽鎖遺伝子座が哺乳動物の内因性染色体に結合していることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  4. ヒト重鎖遺伝子座が導入染色体に存在し、かつヒト軽鎖遺伝子座が哺乳動物の内因性染色体に結合していることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  5. ヒト軽鎖遺伝子座が導入染色体に存在し、かつヒト重鎖遺伝子座が哺乳動物の内因性染色体に結合していることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  6. 哺乳動物の内因性重鎖遺伝子座および少なくとも１つの軽鎖遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  7. 哺乳動物の内因性重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする、請求項６記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  8. ヒト軽鎖遺伝子座の少なくとも一部をＹＡＣベクターにクローニングすることを特徴とする、請求項４記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  9. 非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  10. 導入染色体がヒト１４番染色体の断片を含むことを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  11. ヒト重鎖遺伝子座がｈＣＦ（ＳＣ２０）に含まれ、かつヒト軽鎖遺伝子座がヒトκ軽鎖の遺伝子座トランスジーンＫＣｏ５に含まれていることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  12. ヒト抗体配列を発現する複数のＢ細胞を作製する方法であって：
    請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意し；そして、
    該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫してヒト抗体配列を発現する複数のＢ細胞を作製すること、
    を含む、上記方法。
  13. ヒト抗体を発現させる配列を発現する複数のＢ細胞を回収することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
  14. 複数のＢ細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを作製することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
  15. ハイブリドーマからヒト抗体配列を回収することをさらに含む、請求項１４記載の方法。
  16. ヒト抗体配列を精製することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
  17. ヒト抗体をコードする配列を回収することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
  18. ヒト抗体をコードする配列が全長の配列であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
  19. トランスフェクトした細胞中で該配列を発現させることをさらに含む、請求項１８記載の方法。
  20. 導入染色体がヒト１４番染色体の断片であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  21. ヒト導入染色体がｈＣＦ（ＳＣ２０）であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  22. ヒト軽鎖遺伝子座が天然のヒトκ軽鎖遺伝子座由来の再配列されていない配列を含むことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  23. ヒトκ軽鎖遺伝子座が挿入されたＫＣｏ５トランスジーンであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  24. 複数のＢ細胞が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群より選択される第１のアイソタイプである抗体をコードする少なくとも１個の第１のＢ細胞を含有していることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  25. 複数のＢ細胞が、第１のアイソタイプとは異なる、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群より選択される第２のアイソタイプである抗体をコードする少なくとも１個の第２のＢ細胞をさらに含有していることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
  26. 複数のＢ細胞が、各々アイソタイプが異なる抗体をコードする少なくとも５個のＢ細胞を含有し、該抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである、請求項１２記載の方法。
  27. ＩｇＡのアイソタイプがＩｇＡ１またはＩｇＡ２であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
  28. ＩｇＧのアイソタイプがＩｇＧ１ 、ＩｇＧ２ 、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
  29. 所定の抗原に結合するヒト配列の抗体を作製する方法であって、以下の工程：
    所定の抗原で請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫すること；および
    免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物由来のヒト配列の抗体を回収すること；
    を含む、上記方法。
  30. ヒト配列の抗体が、少なくとも１０１０Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で所定の抗原に結合することを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  31. ヒト配列の抗体が、少なくとも１０９Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で所定の抗原に結合することを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  32. ヒト配列の抗体が、少なくとも１０８Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で所定の抗原に結合することを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  33. ヒト配列の抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  34. ヒト配列の抗体が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖまたはＦｄ断片であることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  35. ヒト配列の抗体が、抗原特異的であることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  36. ヒト配列の抗体を分泌する抗原特異的ハイブリドーマを作製する方法であって、
    所定の抗原で請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫すること；
    該トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来のリンパ系細胞を不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製すること；および
    該ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体の所定の抗原への結合性を測定すること；
    を含む、上記方法。
  37. 抗原特異的ハイブリドーマクローンの５０％を上回るクローンが、ヒト重鎖およびヒト軽鎖を含有する抗体を分泌することを特徴とする、請求項３６記載の方法。
  38. 所定の抗原に結合するヒト配列の抗体を作製する方法であって、以下の工程：
    所定の抗原で請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫すること；および
    作製したハイブリドーマ細胞を、抗原に反応性のある抗体の存在についてスクリーニングすること；
    を含む、上記方法。
  39. ハイブリドーマ細胞が２０％を上回る効率でサブクローニングされることを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  40. 抗原に反応性のある抗体が培養中のハイブリドーマから分泌されることを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  41. 抗原に反応性のある抗体が実質的に純粋であることを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  42. 実質的に純粋である抗体が治療用に調製されていることを特徴とする、請求項４１記載の方法。
  43. 再配列された免疫グロブリン配列を作製する方法であって、
    請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意し；そして、
    該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から再配列された免疫グロブリン配列を取得すること；
    を含む、上記方法。
  44. 取得工程が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から再配列された免疫グロブリン配列を含有するＢ細胞リンパ球を回収することを含む、請求項４３記載の方法。
  45. 取得工程が、Ｂ細胞リンパ球からｍＲＮＡを単離および増幅させてｃＤＮＡを作製することを含む、請求項４３記載の方法。
  46. ｃＤＮＡから重鎖および軽鎖の可変領域配列を単離して増幅させることをさらに含む、請求項４５記載の方法。
  47. 請求項４６記載の重鎖および軽鎖の可変領域配列をコードする単離された核酸。
  48. 請求項４６記載の重鎖の可変領域配列をコードする単離された核酸。
  49. 請求項４６記載の軽鎖の可変領域配列をコードする単離された核酸。
  50. 請求項４７記載の核酸を含むベクター。
  51. 請求項４７記載の核酸を含む発現ベクターであって、該ベクターにおいて、該核酸の重鎖および軽鎖の可変領域配列が宿主細胞内の核酸の発現を制御する制御配列に機能し得る形で連結されていることを特徴とする、上記ベクター。
  52. 請求項４７記載の核酸を含む宿主細胞またはその子孫細胞。
  53. 真核細胞である、請求項５２記載の細胞。
  54. 請求項４３記載の方法であって、さらに：
    核酸が発現される条件下で請求項５２記載の宿主細胞を培養すること；および
    培養宿主細胞またはその培養培地から核酸を回収すること；
    を含む、上記方法。
  55. ヒト抗体ディスプレイライブラリーを作製する方法であって：
    請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫原を導入すること；
    該トランスジェニック非ヒト動物のリンパ系細胞からヒト抗体鎖をコードする一群の核酸を単離すること；および
    抗体鎖を提示するディスプレイパッケージライブラリーを作製すること、但しライブラリーのメンバーは該パッケージから提示される抗体鎖をコードする核酸を含有する；
    を含む、上記方法。
  56. 非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、単離工程を実施する際に免疫原に対する検出可能な力価を有していないことを特徴とする、請求項５５記載の方法。
  57. 免疫原が核酸であることを特徴とする、請求項５５記載の方法。
  58. 核酸が膜結合受容体をコードするものであることを特徴とする、請求項５５記載の方法。
  59. 所定の抗原に結合するヒト配列の抗体またはその断片を作製する方法であって、以下の工程：
    所定の抗原で請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫すること；
    免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体の可変領域配列を回収すること；
    回収した可変領域配列をＤＮＡベクターにクローニングして、発現ライブラリーを作製すること；および
    該ライブラリーを発現させて、所定の抗原に結合する抗体またはその断片をコードする可変領域配列を特定すること；
    を含む、上記方法。
  60. 所定の抗原に結合するヒト配列の抗体またはその断片を作製する方法であって、以下の工程：
    所定の抗原で請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫すること；
    免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物のＢ細胞または該Ｂ細胞と不死化細胞とを融合させて作製したハイブリドーマから、少なくとも１個のヒト抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを単離すること；
    該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングすること；
    宿主細胞に該ベクターを導入すること；
    該宿主細胞を培養すること；および
    該宿主細胞またはその培養培地からヒト配列の抗体またはその断片を回収すること；
    を含む、上記方法。
  61. 単離工程をＰＣＲにより実施することを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  62. 単離工程を少なくとも１種のＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより実施することを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  63. 単離工程をファージディスプレイライブラリースクリーニングにより実施することを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  64. ｃＤＮＡが全長のヒト抗体配列をコードすることを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  65. 回収されるヒト配列の抗体のアイソタイプが免疫したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の抗体産生細胞の抗体のアイソタイプとは異なることを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  66. 所定の抗原に対して反応性のあるヒト抗体を発現する染色体導入マウスハイブリドーマ細胞の安定性を向上させる方法であって：
    導入染色体上に第１のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む第１のマウスを、内因性マウス染色体内に挿入された第２のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む第２のマウスと交配させること；
    上記交配により、第１および第２の免疫グロブリン遺伝子座の両方を含有する第３のマウスを得ること；
    所定の抗原で第３のマウスまたはその子孫を免疫すること；
    免疫したマウスからＢ細胞を回収すること；および
    該Ｂ細胞を不死化細胞と融合させて所定の抗原と反応性のあるヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を取得すること；
    を含む、上記方法。
  67. 請求項６６記載の方法であって、さらに：
    ハイブリドーマ細胞を培地中で培養すること；
    所定の抗原と反応性のあるヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞の存在を特定するために培地を試験すること；
    ハイブリドーマ細胞を希釈すること；および
    希釈したハイブリドーマ細胞を培養して、所定の抗原と反応性のあるヒト抗体を発現するクローン化した細胞株を得ること；
    を含む、上記方法。
  68. 特定したハイブリドーマ細胞の少なくとも５０％からクローン化した細胞株が得られることを特徴とする、請求項６７記載の方法。
  69. 少なくとも１０１０Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で所定の抗原に結合するＩｇＡアイソタイプのヒト配列の抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞。
  70. 少なくとも１０１０Ｍ−１の会合平衡定数（Ｋａ）で所定の抗原に結合するＩｇＡアイソタイプのヒト配列の抗体。
  71. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  72. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項７１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  73. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  74. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項７３記載の方法。
  75. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  76. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項７５記載の方法。
  77. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項３６記載の方法。
  78. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項７７記載の方法。
  79. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  80. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項７９記載の方法。
  81. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項４３記載の方法。
  82. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項８１記載の方法。
  83. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項５５記載の方法。
  84. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項８３記載の方法。
  85. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項５９記載の方法。
  86. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項８５記載の方法。
  87. 自己抗原に対する免疫応答を増大させる遺伝子変異をさらに含むことを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  88. 変異によりＦｃ−γＩＩＢ遺伝子が不活性化されることを特徴とする、請求項８７記載の方法。
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