BRPI0717601A2

BRPI0717601A2 - Materiais e métodos para imunoglicoproteínas melhoradas

Info

Publication number: BRPI0717601A2
Application number: BRPI0717601-5A
Authority: BR
Inventors: Peter Robert Baum; Erik Stephen Espling; Peter Armstrong Thompson
Original assignee: Trubion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2013-10-22
Also published as: CN101646688A; US20130280240A1; MX2009004170A; AU2007308983A1; CA2663536A1; EP2076538A2; JP2010507394A; US20100150948A1; AU2007308983B2; WO2008052030A3; WO2008052030A2

Description

"MATERIAIS E MÉTODOS PARA IMUNOGLICOPROTEÍNAS MELHORADAS" Referência cruzada a Pedido Relacionado

Este pedido reivindica o benefício anterior ao pedido provisional dos Estados Uni- dos n°. 60/853.944 depositado em 24 de outubro de 2006, por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A invenção se refere à imunoglicoproteínas, incluindo anticorpos, que têm proprie- dades melhoradas, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo e padrões de glicosilação, métodos de cultura celular e meios para produzir tais imunoglicoproteínas, e o uso de tais imunoglicoproteínas no tratamento da doença.

Antecedentes

A eliminação de populações de célula alvejada com imunofarmacêuticos é uma im- portante intervenção terapêutica em diversas indicações. Os mecanismos de ação empre- gados por imunofarmacêuticos para efetuar tal eliminação das células alvejadas podem in- cluir Iise celular mediada por complemento, ativação de séries de reações de sinalização apoptóticas, bloqueio de séries de reações de sinalização requerida à sobrevivência, e cito- toxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), da mesma forma referida como citotoxi- cidade celular dependente de Fe. A ADCC é um potente mecanismo que é acreditado ser importante para a eficácia de muitos imunofarmacêuticos.

O mecanismo para ativação da ADCC envolve a ligação de receptores Fc às molé- culas imunofarmacêuticas que são ligados à superfície da célula alvo. A ligação de recepto- res Fc aos imunofarmacêuticos pode ser mediada por domínios na região constante de imu- noglobulinas, tais como os domínios CH2 e/ ou CH3. Diferentes tipos de regiões constantes podem ligar-se a diferentes receptores Fc. Exemplos incluem a ligação de domínios Fc de IgGI aos receptores Fc cognatos CD16 (FcyRIII), CD32 (FcyRII-BI e -B2), e CD64 (FcyRI), domínios Fe de IgA ao receptor Fc cognato CD89 (FcoRI), e domínios IgE aos receptores Fc cognatos FceRI e CD23.

Composições imunofarmacêuticas com ligação de receptor Fc realçada pode exibir maior potência em ADCC. Métodos relatados de obtenção, deste modo, com domínios Fc de IgG incluem a introdução de mudanças de aminoácido e a modificação de estruturas de car- boidrato. Modificação de estruturas de carboidrato pode ser preferível como mudanças de aminoácido no domínio Fc podendo realçar a imunogenicidade de uma composição farma- cêutica. Para moléculas de imunoglobulina foi demonstrado que a ligação de carboidrato ligado por η a Asn-297 do domínio CH2 é crítico para a atividade de ADCC. Sua remoção enzimaticamente ou através da mutação do local de consenso ligado por η resulta em pouca a nenhuma atividade de ADCC. Alguns estudos têm relatado que o nível de atividade de ADCC. Alguns estudos têm relatado que o nível de atividade ADCC para uma molécula de imunoglobulina é da mesma forma dependente na estrutura do carboidrato, mas as porções de carboidrato atuais ou estrutura responsável pela ADCC não foi ainda elucidada. Ainda menos é conhecido sobre a estrutura (s) de carboidrato ideal para a ADCC de proteínas de fusão Fc de não imunoglobulina.

Em glicoproteínas, os carboidratos podem ligar-se ao átomo de nitrogênio de amida

na cadeia lateral de uma asparagina em um em um motivo de tripeptídeo Asn-X-Thr/Ser. Este tipo de glicosilação, denominado glicosilação ligada a N, começa no retículo endoplás- mico (ER) com a adição de múltiplos monossacarídeos a um dolicol fosfato para formar um complexo de carboidrato ramificado de resíduo 14. Este complexo de carboidrato é em se- guida transferido à proteína pelo complexo de oligossacaril transferase (OST). Antes da gli- coproteína deixar o lúmen do ER1 três moléculas de glicose são removidas do oligossacarí- deo de resíduo 14. As enzimas ER glicosidase I, ER glicosidase Il e ER manosidase estão envolvidas no processamento de ER.

Subseqüentemente, os polipeptídeos são transportados para o complexo de Golgi, em que as cadeias de açúcar ligadas por N são modificadas de muitos modos diferentes. Nos compartimentos eis e mediai do complexo de Golgi, o complexo ligado por N de 14- sacarídeo original pode ser enfeitado através da remoção dos resíduos de manose (Man) e alongado através da adição de resíduos de fucose (Fuc) e/ ou N-acetilglicosamina (GIcNac). As várias formas de carboidratos ligadas por N de modo geral têm em comum um núcleo de pentasacarídeo consistindo em três manose e dois resíduos de N-acetilglicosamina. Final- mente, no trans Golgi, outros resíduos de GIcNac podem ser adicionados, seguido por ga- Iactose (GaI) e um ácido siálico terminal (Sial). O processamento do carboidrato no comple- xo de Golgi é chamado "glicosilação terminal" para distingui-lo de "núcleo glicosilação," o qual toma lugar no ER. As unidades de carboidrato complexo final podem assumir muitas formas e estruturas, algumas das quais têm dois, três ou quatro ramificações (denominadas bi-antenário, tri-antenário ou tetra-antenário). Um número de enzimas está envolvido no pro- cessamento de Golgi, incluindo Golgi manosidase IA, IB e IC, GlcNAc-transferase I, Golgi manosidase II, GlcNAc-transferase II, Galactosil transferase e Sialil transferase.

Um relato tem sugerido que um carboidrato crucial determinante de atividade de ADCC mediada pelo receptor FcYRIIIa é a falta de uma porção de alfa-1,6-fucose adicionado à estrutura N-Iigada de núcleo (Shinkawa e outros, J Biol Chem., 31 de janeiro de 2003;278(5):3466-73; veja, também, Shields e outros, J Biol Chem., 26 de julho de 2002;277(30):26733-40). O nível de outra glicoforma, carboidrato ligado por N bi-dividido, tem também sido proposto ser capaz de conceder ADCC aumentada (Umana e outros, Nat Biotechnol., 17 de fevereiro de 1999; 17(2): 176-80) porém também existe da mesma forma evidência contraditória (Shinkawa e outros, J Biol Chem., 31 de janeiro de 2003;278(5):3466-73). Uma solução potencial para esta evidência contraditória tem sido sugerida pela descoberta de modo que a GnTIII aumentada em células hospedeiras produz imunoglobulina não apenas com açúcar bi-dividido aumentado porém da mesma forma po- rém também necessitando de modificação de fucose núcleo (Ferrara e outros, Biotechnol Bioeng., 5 de abril de 2006;93(5):851-61). Isto concorda com a sugestão de que a fucose somente tem o papel chave na alteração da potência ADCC e a associação com açúcar bi- dividido veja por outras considerações uma ligação nas duas modificações nas células hos- pedeiras. Entretanto, outro relato em que o tratamento in vitro de anticorpos Rituxan e Her- ceptin com GnTIII1 para aumentar o açúcar bi-dividido, resultou em ADCC aumentada suge- re um efeito direto no açúcar bi-dividido (Hodoniczky e outros, Biotechnol. Prog., 21 de dezembro de 2005(6):1644-52). Entretanto, a sobre-expressão de Gnt Ill em vários níveis elevados podem ser tóxico à célula (Umana e outros, Biotechnol Prog., abril e março de 1998;14(2):189-92).

Alguns métodos propostos para a produção de imunoglobulinas com teor de fucose inferior têm desvantagens significantes para a fabricação de uma droga biofarmacêutica com uma atividade de ADCC ideal para a indicação terapêutica. Por exemplo, tratamento de i- munoglobulinas com enzimas que remove resíduos de fucose (fucosidases) envolve etapas de fabricação caras adicionais com riscos de consistência de fármaco e econômicos poten- cialmente significantes. Engenharia molecular das linhagens celulares para eliminar enzimas chaves envolvidas na síntese de glicoproteínas fucosiladas requer cepas hospedeiras espe- ciais e na prática corrente não levam em consideração a produção "sintonizável" de fármaco com variação da potência ADCC para otimizar a eficácia e a segurança a um uso terapêuti- co. A geração de uma comparação do produto de ADCC não realçado é dispendioso e de- morado. O tratamento de linhagens de célula com RNAi ou moléculas de anti-sentido para reduzir o nível destas enzimas chaves pode ter efeitos não alvejados imprevisíveis e seria caro se não impraticável para implementar em escala de fabricação.

Desse modo, continua a existir uma necessidade para métodos vantajosos de pre- paração de imunofarmacêuticos com ADCC realçada assim como para os imunofarmacêuti- cos melhorados produzidos por meio disso para uso terapêutico.

Sumário da invenção

A invenção fornece meio de cultura e métodos de cultura de célula em grande esca-

la para melhorar as propriedades de imunoglicoproteínas, incluindo funções efetoras tal co- mo ADCC, e/ ou padrões de glicosilação tal como redução no teor de fucose. A invenção da mesma forma fornece imunoglicoproteínas melhoradas produzidas por tais métodos, e uso de tais imunoglicoproteínas no tratamento da doença. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para aumentar a citoxi-

dade dependente de anticorpo (ADCC) de moléculas de imunoglicoproteínas produzidos por uma célula hospedeira, por cultivar a célula hospedeira no meio de cultura compreendendo castanospermina em uma concentração entre cerca de 25 e cerca de 800 μΜ, ou entre cer- ca de 100 e cerca de 500 μΜ, ou entre cerca de 100 e cerca de 400 μΜ, ou entre cerca de 100 e cerca de 300 μΜ. Nos exemplares das modalidades, a ADCC é aumentada pelo me- nos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes.

Nas modalidades relacionadas, a invenção fornece um método para aumentar a li-

gação de CD16 de moléculas de imunoglicoproteínas produzidas por uma célula hospedeira, por cultivar a célula hospedeira no meio de cultura compreendendo castanospermina em uma concentração entre cerca de 25 e cerca de 800 μΜ, ou entre cerca de 100 e cerca de 500 μΜ, ou entre cerca de 100 e cerca de 400 μΜ, ou entre cerca de 100 e cerca de 300 μΜ. Nos exemplares das modalidades, a ligação CD16 é aumentada por pelo menos 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% ou 200%.

Nos métodos da invenção, densidade, viabilidade e/ ou crescimento celular não é significantemente afetado (por exemplo, restam pelo menos 80% ou maior de células não tratadas). O nível de produção de imunoglicoproteína no meio de cultura pode ser de pelo menos 100 μg/mL, 125 μg/mL, ou 150 μg/mL.

Em quaisquer das modalidades anteriores o meio de cultura pode ser essencial- mente sem soro, e pode incluir um segundo modificador de carboidrato.

A invenção da mesma forma considera as composições compreendendo moléculas de imunoglicoproteínas produzidas pelos métodos descritos aqui, opcionalmente com a dilu- ente ou portador farmaceuticamente aceitável estéril. Tais composições podem ser adminis- tradas nos métodos de neutralização ou inibição de crescimento de células de câncer a qual expressa em sua superfície uma molécula ligada pelas referidas moléculas de imunoglico- proteínas, ou em métodos de depleção de células que expressa em sua superfície uma mo- lécula ligada pelas referidas moléculas de imunoglicoproteínas. Métodos da invenção, de modo geral, envolvem células hospedeiras de cultura pro-

duzindo as imunoglicoproteínas no meio de cultura contendo uma concentração adequada de modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, e fornece uma vantagem de função efetora melhorada sem significantemente afetar o crescimento celular ou os níveis de produção de proteína. Exemplares imunoglicoproteínas que podem ser fabricadas empre- gando os métodos da invenção incluem imunoglobulinas e produtos imunofarmacêuticos modulares (SMIP™), pequenos. Tais moléculas de ligação preparadas de acordo com os métodos da invenção vantajosamente retém substancialmente as mesmas propriedades de ligação para alvejar e resultando da atividade biológica direta, porém exibem funções medi- adas por efetores melhoradas. Em um aspecto, a invenção fornece um método para melhorar a citoxidade depen-

dente de anticorpo (ADCC) e/ ou a ligação de receptor Fc de imunoglicoproteínas produzi- das por uma célula hospedeira. Tais métodos envolvem cultivar a célula hospedeira em um volume de pelo menos 750 ml_, 1L, 2L, 3L, 4L, 5L, 10L, 15L, 20L ou mais de meio de cultura compreendendo um modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, em uma concentração que aumenta a atividade de ADCC e/ ou ligação de receptor Fc de uma com- posição de moléculas de imunoglicoproteínas produzida pela célula hospedeira. Ao mesmo tempo que a concentração ideal de tal modificador de carboidrato, por exemplo, castanos- permina, depende da potência do modificador de carboidrato e a modulação relativa da ADCC desejada, exemplares das concentrações finais de modificadores de carboidratos no meio de cultura são menores do que 800 μΜ, ou menores do que 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ou 10 μΜ. O efeito relativo na ADCC pode ser modulado por alterar a concentração ou dura-

ção do modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, aplicado à cultura de célula, fornecendo uma vantagem adicional comparada aos métodos convencionais de ADCC de melhora por alterar a glicosilação. A atividade de ADCC pode ser medida e ex- pressada empregando ensaios conhecidos na técnica e nos exemplares das modalidades aumentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes ou 20 ve- zes.

Conteúdo de carboidrato e glicosilação são conhecidos por afetar uma variedade de funções mediadas por imunoglobulina efetora, incluindo ADCC, CDC e meia vida circulante. Os dados descritos aqui mostram que os métodos da invenção são surpreendentemente capazes de fornecer imunoglicoproteínas que exibem ADCC melhorada sem afetar a CDC ou a meia vida. Desse modo, nos exemplares das modalidades, ADCC da composição de molécula de imunoglicoproteína é aumentada, porém outras funções efetoras tipo imunoglo- bulina, tal como citoxidade dependente do complemento (CDC) e/ ou meia vida circulante prolongada, permanece similar ou não são significantemente afetadas (por exemplo, aumen- to ou diminuição menor do que 2 vezes, ou aumento ou diminuição menor do que 50%, 40%, 30%, 20% ou 10%).

A ligação de receptor Fc da composição das moléculas de imunoglicoproteínas po- de ser determinada como uma relação relativa de moléculas de imunoglicoproteínas trata- das com modificador de carboidrato, versus moléculas de imunoglicoproteínas não tratadas, que se liga a CD16. Exemplares dos ensaios são descritos abaixo nos exemplos. A ligação de receptor Fc nos exemplares das modalidades aumenta em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 6 vezes. Uma composição de imunoglicoproteína produzida pelas células hospedeiras tratadas com modi- ficador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, de acordo com a invenção deve ligar- se a CD16 (formas de alta e baixa afinidade, isto é, V ou F em aminoácido 158) e/ ou CD32 a ou b e/ ou CD64 com maior afinidade na ensaios de ligação FcR de composições de imu- noglicoproteína produzidas por células hospedeiras não tratada desse modo. Este aumento na afinidade de ligação de receptor Fc é mostrado aqui para correlacionar a um aumento na atividade de ADCC.

A invenção da mesma forma fornece métodos para alterar o conteúdo de carboidra- to/ padrão de glicosilação e/ ou diminuir o teor de fucose de imunoglicoproteínas por cultivar a célula hospedeira em um volume de pelo menos 750 mL, 1L, 2L, 3L, 4L, 5L, 10L, 15L, 20L ou mais do meio de cultura compreendendo um modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, em uma concentração que diminui o teor de fucose total e/ ou altera o padrão de glicosilação de uma composição das moléculas de imunoglicoproteínas produzi- das pela célula hospedeira. Exemplares das concentrações finais de modificadores de car- boidratos, por exemplo, castanospermina, no meio de cultura são menores do que 800 μΜ, ou menores do que 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ou 10 μΜ.

O efeito relativo no teor de fucose pode da mesma forma ser modulado por alterar a concentração ou duração do modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, aplicado à cultura de célula. O teor de fucose total de uma composição pode ser expressada como a relação relativa ou porcentagem de moléculas de imunoglicoproteínas de não fucosi- Iada ao número total de moléculas de imunoglicoproteínas em uma composição. Exemplares das composições contem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais moléculas não fucosiladas. O teor de fucose de uma composição de i- munoglicoproteína produzida por células hospedeiras tratadas com modificador de carboi- drato, por exemplo, castanospermina, de acordo com a invenção será reduzida pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes ou mais comparado às composições produzidas por células hospedeiras não tratadas desse modo. Em quaisquer dos métodos anteriores, as células hospedeiras podem exibir níveis

elevados de crescimento durante exposição a modificadores de carboidratos, por exemplo, castanospermina. Por exemplo, um tempo de duplicação de população exemplar de células CHO produzindo imunoglicoproteínas é de cerca de 24 horas; uma concentração de modifi- cador de carboidrato de acordo com a invenção (por exemplo, uma concentração eficaz para aumentar a ADCC) não é esperada diminuir tal tempo de duplicação. Idealmente, uma con- centração eficaz de modificador de carboidrato, por exemplo, castanospermina, não reduz o crescimento celular em mais do que 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70% em um ponto de tempo 72 horas após a adição do modificador de carboidrato.

Em quaisquer dos métodos anteriores métodos, as células hospedeiras podem exi- bir níveis elevados de produção de proteína durante exposição aos modificadores de carboi- dratos, por exemplo, castanospermina. Por exemplo, níveis de produção de proteína na pre- sença de uma concentração eficaz de modificador de carboidrato, por exemplo, castanos- permina, pode ser de cerca de 50 //g/mL ou mais elevado, ou cerca de 75, 100, 125, ou 150 //g/mL, ou mais elevado. Preferivelmente as células hospedeiras exibem ambos os níveis elevados de crescimento e níveis elevados de produção de proteína.

Qualquer meio de cultura conhecido na técnica, incluindo essencialmente meio de cultura sem soro, pode ser empregado. Batelada de alimento, alimento contínuo, e outros tipos de métodos de cultura conhecidos na técnica podem, da mesma forma, ser emprega- dos com os métodos da invenção. Os modificadores de carboidratos podem ser adicionados à série de semente, para o meio de cultura de batelada inicial, após uma fase de crescimen- to rápida, ou continuamente com o meio de cultura (por exemplo, durante alimentação contí- nua). Por exemplo, o modificador de carboidrato pode ser adicionado a uma série de semen- te inicial ou matéria-prima de alimentação em uma concentração de 10X ou 100X, tal que as adições subseqüentes do meio de cultura diluem a concentração de modificador de carboi- drato para um nível que é ainda eficaz na obtenção da ADCC melhorada dos produtos re- combinantes. Alternativamente, o modificador de carboidrato em uma concentração eficaz é incluído no meio de cultura total adicionado às células, evitando a necessidade para diluição. Em ambos os casos, o modificador de carboidrato é adicionado relativamente inicial no pro- cesso de cultura célula e uma concentração eficaz é mantido através do processo de cultura a fim de otimizar a homogeneidade da imunoglicoproteína. O efeito dos modificadores de carboidratos é acreditado ser de longa duração, e pode continuar a ser observado pelo me- nos 11-12 dias após a um tempo de adição de modificador de carboidrato.

Exemplares de modificadores de carboidratos incluem inibidores de núcleo glicosi- lação, inibidores de glicosilação terminal, inibidores de manosidase, e/ ou fase inicial de mo- dificadores de carboidratos, e opcionalmente inclui ou exclui inibidores específicos de fucosi- lação, e são descritos de forma mais detalhada abaixo. A invenção considera que as combi- nações de dois ou mias, ou três ou mais modificadores de carboidratos podem fornecer be- nefícios adicionados. Castanospermina é um modificador de carboidrato especificamente considerado.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições compreendendo as moléculas de imunoglicoproteínas produzidas por quaisquer dos métodos anteriores, que preferivel- mente têm uma afinidade de ligação Kd de pelo menos 107 M"1, ou pelo menos 108 M"1, ou 109 M1 a uma molécula alvo. Tais composições podem compreender um ou mais diluentes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis estéreis.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos envolvendo admi- nistração de tais composições para pacientes que se beneficiariam de tal administração, por exemplo, sofrendo de um distúrbio mediado por células expressando a molécula alvo, ou sofrendo de um tipo de câncer no qual as células de câncer expressam a molécula alvo em sua superfície. A invenção da mesma forma considera o uso de tais composições nos méto- dos de depleção de células expressando a molécula alvo em sua superfície. Onde o alvo é CD37, a invenção especificamente considera um método de inibição do crescimento da cé- lula de câncer ou de destruição das células de câncer compreendendo a etapa de adminis- trar a um paciente uma composição compreendendo produtos SMIP anti-CD37 produzidos de acordo com os métodos da invenção. Similarmente, onde o alvo é CD20, uma invenção especificamente considera um método de inibição do crescimento da célula de câncer ou de destruição das células de câncer compreendendo a etapa de administrar a um paciente uma composição compreendendo produtos SMIP anti-CD20 produzidos de acordo com os méto- dos da invenção. Nas modalidades relacionadas, os métodos de tratamento de câncer en- volvendo interrupção ou reversão da progressão do câncer são considerados. A invenção ainda fornece métodos de tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes por adminis- trar produtos SMIP anti-CD20 ou anti-CD37 produzidos de acordo com os métodos da in- venção. Nos aspectos relacionados, a invenção considera o uso das composições de glico- proteína da invenção, opcionalmente compreendendo um diluente ou portador estéril, na preparação de um medicamento para tratar quais das doenças ou distúrbios descritos aqui.

Imunoglicoproteínas

O termo "imunoglicoproteína" se refere a um polipeptídeo glicosilado que se liga a uma molécula alvo e contem seqüência de aminoácido suficiente derivada de uma região constante de uma imunoglobulina para fornecer uma função efetora, preferivelmente ADCC e/ ou CDC. Exemplares das moléculas devem conter uma seqüência derivada de um domí- nio CH2 de uma imunoglobulina, ou domínios CH2 e CH3 derivados de uma ou mais imuno- globulinas. Subgrupos específicos de imunoglicoproteínas consideradas para a produção de acordo com a invenção incluem proteínas de cadeia única as quais opcionalmente dimeriza através de associações covalentes ou não covalentes na articulação e/ ou domínios CH3. Este subgrupo de proteínas de cadeia única exclui uma conformação tetramérica típica de imunoglobulinas (devido à ausência de cadeias leves), porém incluem fusões de receptor ligando Fc ou solúvel em Fc. Exemplos específicos de proteínas de cadeia única incluem produtos SMIP.

Produtos SMIP e métodos para produzi-los têm sido descritos previamente na co- propriedade de Pedido dos Estados Unidos n° 10/627.556, e Publicações de Patente dos Estados Unidos 2003/133939, 2003/0118592, e 2005/0136049, cada uma das quais são incorporado aqui por referência em sua totalidade. Proteínas de Ligação Multivalente de Cadeia Única com Função Efetora são descritas em Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US07/71052, depositado em 12 de junho de 2007 (reivindicando o benefício de U.S.S.N. 60/813.261, depositado 12 de junho de 2006 e 60/853.287, depositado em 20 de outubro de 2006), cada uma das quais são incorporados aqui por referência em sua totali- dade. Produtos SMIP são novas proteínas de fusão de imunoglobulina-domínio de ligação que caracteriza um domínio de ligação a uma estrutura cognata tal como um antígeno, um contador receptor ou similares; um polipeptídeo de região de articulação de lgG1, IgA ou IgE ou um polipeptídeo de região de articulação de IgGI mutante tendo ou zero, um ou dois re- síduos de cisteína; e imunoglobulina CH2 e domínios CH3. Em uma modalidade, a molécula domínio de ligação tem um ou dois resíduos de cisteína. Em uma modalidade relacionada, é considerada em que a molécula de domínio de ligação compreende dois resíduos de cisteí- na, a primeira cisteína, a qual é tipicamente envolvida na ligação entre as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada, não é deletada ou substituída por um aminoácido. Produtos SMIPs são capazes de ADCC e/ ou CDC, porém podem ser comprometidos em sua capaci- dade para formar multímeros ligado por dissulfeto. Exemplares de produtos SMIP podem ter uma ou mais regiões de ligação, tal como uma região de ligação de um membro da super- família de imunoglobulina de uma região de ligação de cadeia pesada variável e/ ou de ca- deia leve variável derivada de uma imunoglobulina. Nos exemplares das modalidades des- tas regiões são separadas por peptídeos ligadores, os quais podem ser qualquer peptídeo Iigador conhecido na técnica sendo compatível com integração de região ou domínio. Exem- plares de ligadores são ligadores com base no motivo de Iigador Gly4Ser, tal como (Gly4Ser)n, em que n=3-5. Exemplares de produtos SMIP que podem ser produzidos de acordo com a invenção incluem produtos que se ligam a CD20 ou CD37. Produtos SMIP que se liga a CD20 ou CD37 e que compreende seqüências de ligação específica e/ ou mo- dificações de aminoácido são descritas em co-propriedade de co-pendente de Pedido dos Estados Unidos nos. 10/627.556 e 11/493.132, cada uma por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.

Outros exemplos de imunoglicoproteínas incluem fusões de domínio de ligação-lg, em que o domínio de ligação pode ser um peptídeo de ocorrência não natural ou um frag- mento de um receptor ou ligando de ocorrência não natural. No caso de receptores, frag- mentos do domínio extracelular são preferidos. Exemplares de fusões com regiões Fc ou imunoglobulina inclui: etanercepte o qual é uma proteína de fusão de sTNFRIl com a região Fc (Patente dos Estados Unidos N0. 5.605.690), alefacepte a qual é uma proteína de fusão de LFA-3 expressada no antígeno exibindo células com a região Fc (Patente dos Estados Unidos N0. 5.914.111), uma proteína de fusão de antígeno 4 associado ao linfócito T cito tóxico (CTLA-4) com a região Fc [J. Exp. Med., 181, 1869 (1995)], uma proteína de fusão de interleucina 15 com a região Fc [J. Imunol., 160, 5742 (1998)], uma proteína de fusão de fator Vll com a região Fc [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98, 12180 (2001)], uma proteína de fusão de interleucina 10 com a região Fc [J. Imunol., 154, 5590 (1995)], uma proteína de fusão de interleucina 2 com a região Fc [J. Imunol., 146, 915 (1991)], uma proteína de fusão de CD40 com a região Fc [Surgery, 132, 149 (2002)], uma proteína de fusão de Flt-3 (tirosi- na cinase tipo fms) com a região Fc do anticorpo [Acta. Haemato., 95, 218 (1996)], uma pro- teína de fusão de 0X40 com a região Fc do anticorpo [J. Leu. Biol., 72, 522 (2002)], outras moléculas CD [por exemplo, CD2, CD30 (TNFRSF8), CD95 (Fas), CD106 (VCAM-1), CD137], moléculas de adesão [por exemplo, ALCAM (molécula de adesão celular de leucó- cito ativado), caderinas, ICAM (molécula de adesão intercelular)-1, ICAM-2, ICAM-3], recep- tores de citosina [por exemplo, interleucina-4R, interleucina-5R, interleucina-6R, interleucina- 9R, interleucina-10R, interleucina-12R, interleucina-13Ra1, interleucina-13Ra2, interleucina- 15R, interleucina-21R], quimiocinas, moléculas de sinal indutor de morte celular [por exem- plo, B7-H1, DR6 (Receptor de morte 6), PD-1 (Morte 1 programada), TRAIL R1], moléculas co-estimuladas [por exemplo, B7-1, B7-2, B7-H2, ICOS (induzível co-estimulador)], fatores de crescimento [por exemplo, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HGFR], fatores de indução por diferen- ciação (por exemplo, B7-H3), fatores de desativação (por exemplo, NKG2D), moléculas de transferência de sinal (por exemplo, gp130).

Ainda outros exemplos de imunoglicoproteínas incluem anticorpos. O termo "anti- corpo" aqui é definido para incluir anticorpos completamente agrupados, anticorpos mono- clonais, anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos bi- específicos), fragmentos de anticorpos que podem ligar-se ao antígeno (por exemplo, anti- corpos de cadeia única Fab', F'(ab)2, Fv, diacorpos), e peptídeos recombinantes compreen- dendo a renúncia uma vez que exibem a atividade Iigadora de antígeno desejada. Multíme- ros ou agregados de fragmentos e/ ou moléculas intactas, incluindo anticorpos quimicamen- te derivados, são considerados. Anticorpos de qualquer classe ou subclasse de isótipo, in- cluindo IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2, são considerados. Diferentes isótipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, isótipos de IgGI e lgG3 têm atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

Uma "imunoglobulina" ou "anticorpo natural" é uma glicoproteína tetramérica com- posta de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo (duas cadeias "leves" e duas "pe- sadas"). A porção de terminal de amino de cada cadeia inclui uma região "variável" ("V") de cerca de 100 a 110 ou mais amínoácidos primariamente responsável pelo reconhecimento do antígeno. Nesta região variável, a região "hipervariável" ou "região de determinação de complementaridade" (CDR) consiste em 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) resíduos no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por Kabat e outros, Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] e/ ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (isto é, 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91- 96 (L3) resíduos no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por [Chothia e outros, J. Mol.Biol. 196: 901-917(1987)].

A porção de terminal de carbóxi de cada cadeia contém uma região constante. Ca- deias leves têm um domínio único na região constante. Desse modo, as cadeias leves têm um domínio de região variável e uma região constante. As cadeias pesadas têm diversos domínios na região constante. As cadeias pesadas em anticorpos de IgG, IgA1 e IgD têm três domínios de região constante, as quais são designadas CH1, CH2, e CH3, e as cadeias pesadas nos anticorpos de IgM e IgE têm quatro domínios de região constante, CH1, CH2, CH3 e CH4. Desse modo, as cadeias pesadas têm uma região variável e três ou quatro re- giões constantes.

As cadeias pesadas de imunoglobulinas podem da mesma forma ser dividida nas três regiões funcionais: a região Fd (um fragmento compreendendo VH e CH1, isto é, dois domínios no terminal de N da cadeia pesada), a região de articulação, e a região Fc (a regi- ão de "fragmento cristalizável", derivada de regiões constantes e formada após digestão de pepsina). A região Fd em combinação com a cadeia leve forma um Fab (o "fragmento Iiga- dor de antígeno"). Porque um antígeno deve reagir estereoquimicamente com a região Iiga- dora de antígeno no terminal de amino de cada Fab1 a molécula de IgG é bivalente, isto é, pode ligar-se a duas moléculas de antígeno. A região Fc contém os domínios que interagem com receptores de imunoglobulina nas células e com os elementos iniciais da cascata de complemento. Desse modo, o fragmento Fc é de modo geral considerado responsável pelas funções efetoras de uma imunoglobulina, tal como fixação de complemento e ligando se aos receptores Fc.

O termo "anticorpo monoclonal" como empregado aqui se refere a um anticorpo ob-

tido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural ou alternativas modificações pós-translacionais que podem estar presen- tes em quantidades menores, ou produzidas por técnicas de DNA recombinante ou hibrido- mas. Exemplos não limitados de anticorpos monoclonais incluem anticorpos humanos, hu- manizados, quiméricos ou de murino, ou variantes ou derivados destes.

Seqüência de anticorpo de modificação ou humanização deve ser mais do tipo hu- mano é descrita em, por exemplo, Jones e outros, Nature 321:522 525 (1986); Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Imunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer e outros, Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Imunol. 31(3):169 217 (1994); e Kettleborough, C.A. e outros, Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., e outros (1994), J. Imunol. 152, 2968- 2976); Studnicka e outros, Protein Engineering 7: 805-814 (1994); cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Um método de isolamento de anticorpos humanos monoclonais é o uso de tecnolo-

gia de exibição de fago. Exibição de fago é descrita em, por exemplo, Dower e outros, WO 91/17271, McCafferty e outros, WO 92/01047, e Caton e Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6450-6454 (1990), cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Outro método de isolamento de anticorpos humanos monoclonais emprega animais transgênicos que não têm produção de imunoglobulina endógena e são planejadas para conter imunoglo- bulina humana local. Veja, por exemplo, Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits e outros, Nature1 362:255-258 (1993); Bruggermann e outros, Year in Immuno., 7:33 (1993); WO 91/10741, WO 96/34096, WO 98/24893, ou publicação de pedido de patente dos Estados Unidos nos. 20030194404, 20030031667 ou 20020199213; cada uma incorporada aqui por referência.

Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinan- te ou por clivagem química ou enzimática de anticorpos intactos. "Fragmentos de anticor- pos" compreendem uma porção de um anticorpo de tamanho natural intacto, preferivelmente a ligação do antígeno ou região variável do anticorpo intacto, e inclui anticorpos multi- específicos (bi-específico, tri-específico, etc.) formados de fragmentos de anticorpos. Exem- plos não limitados de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv [região variá- vel], anticorpo de domínio (dAb) [Ward e outros, Nature 341:544-546, 1989], fragmentos de região de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv) [Bird e outros, Science 242:423-426, 1988, e Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988, opcionalmente incluindo um Iigador de polipeptídeo; e opcionalmente multi-específicos, Gruber e outros, J. Imunol. 152: 5368 (1994)], fragmentos de anticorpos de cadeia única, diacorpos [EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger e outros, Proc. Natl. A- cad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)], triacorpos, tetracorpos, minicorpos [Olafsen, e outros, Protein Eng Des Sei. 2004 Apr;17(4):315-23], anticorpos lineares [Zapata e outros, Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)]; anticorpos recombinante de quelação [Neri e outros, J Mol Biol. 246:367-73, 1995], tricorpos ou bicorpos [Schoonjans e outros, J Imunol. 165:7050-57, 2000; Willems e outros, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei. 786:161-76, 2003], intracorpos [Biocca, e outros, EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 101:17616-21, 2004], nanocorpos [Cortez-Retamozo e outros, Câncer Research 64:2853-57, 2004], uma proteína de fusão de imunoglobulina de ligação de antígeno, um anticorpo camelizado [Desmyter e outros, J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001; Ewert e ou- tros, Biochemistry 41:3628-36, 2002; Publicação de Patente dos Estados Unidos Nos. 20050136049 e 20050037421], um anticorpo contendo VHH, mimeticorpos [Publicação de Patente dos Estados Unidos Nos. 20050095700 e 20060127404; WO 04/002424 A2; WO 05/081687 A2], ou variantes ou derivados destes, e polipeptídeos que contém pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação do antígeno espe- cífica para o polipeptídeo, tal como uma seqüência CDR, uma vez que o anticorpo retém a atividade Iigadora de antígeno desejada.

O termo "variante" quando empregado em conexão com anticorpos se refere à se- quência de polipeptídeo de um anticorpo que contem pelo menos uma substituição de ami- noácido, deleção, ou inserção na região variável ou a equivalente porção para a região vari- ável, com a condição de que a variante retém a afinidade de ligação alvo desejada ou ativi- dade biológica. Além disso, os anticorpos da invenção podem ter modificações de aminoáci- do na região constante para modificar a função efetora do anticorpo, incluindo meia vida ou purificação, atividade ADCC e/ ou CDC. Tais modificações podem realçar farmacocinéticos ou realça a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer, por exemplo. No caso de IgGI, as modificações para a região constante, particularmente a articulação ou região CH2, podem aumentar ou diminuir a função efetora, incluindo atividade ADCC e/ ou CDC. Em outras mo- dalidades, uma região constante de lgG2 é modificada para diminuir a formação agregada anticorpo-antígeno. No caso de lgG4, as modificações para a região constante, particular- mente a região de articulação, pode reduzir a formação de meios anticorpos.

O termo "derivado" quando empregado em conexão com anticorpos se refere a an- ticorpos covalentemente modificados por conjugar agentes terapêuticos ou diagnósticos, de rotulação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), de ligação de polímero co- valente tal como pegilação (derivação com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos não naturais. Derivados da invenção devem reter as propri- edades de ligação das moléculas não derivadas da invenção. Conjugação de anticorpos de alvejamento de câncer a agente citotóxico, por exemplo, isótopos radioativos (por exemplo, 1131, 1125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos, ou toxinas, podem realçar a destrui- ção de células cancerosas.

Uma imunoglicoproteínas que é "específica" a uma molécula alvo se liga àquele al- vo com uma maior afinidade do que qualquer outro alvo. Imunoglicoproteínas da invenção podem ter afinidades para seus alvos de uma kA de pelo menos cerca de 104 M1, ou alter- nativamente de pelo menos cerca de 105 M"1, 106 M"1, 107 M"1, 108 M"1, 109 M"1, ou 1010 M"1. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas empregando técnicas convencionais, tal como por empregar um instrumento BIAcore ou por radioimunoensaio empregando antígeno de alvo radiorrotulado. Dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard e outros, Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949). Modificadores de carboidratos

Um "modificador de carboidrato" é um pequeno composto orgânico, preferivelmente de peso molecular < 1000 daltons, que inibem a atividade de uma enzima envolvida na adi- ção, remoção, ou modificação de açúcares que são parte de um carboidrato ligado a um polipeptídeo. Glicosilação é um processo extremamente complexo que toma lugar no retícu- Io endoplásmico ("núcleo glicosilação") e nos corpos de Golgi ("glicosilação terminal").

Outros repressores com base em polipeptídeo ou com base em polinucleotídeo de enzimas de glicosilação, incluindo RNAi ou de anti-sentido que inibem a atividade de modifi- cadores de carboidratos de fase inicial, são úteis de acordo com a invenção porém são ex- cluídos da definição de "modificador de carboidrato."

Como empregado aqui, "modificador de carboidrato de fase inicial" se refere a um inibidor de uma ou mais das etapas de glicosilação antes da adição de N-acetilglicosamina a manose, incluindo ER glucosidase I, ER glucosidase II, ER manosidase, Golgi manosidase IA, Golgi manosidase IB, Golgi manosidase IC e GlcNAc-transferase I.

Etapas de glicosilação subseqüentes incluem Golgi manosidase II, GlcNAc- transferase II, Galactosil transferase e Sialil transferase, fucosil transferase, e fucocinase.

Exemplares de modificadores de carboidratos incluem quaisquer dos seguintes. Castanospermina é acreditada ser um inibidor de glicosidase I e II. Deoxifuconojirimicina é um inibidor de fucosidase. 6-Metil-tetraidro-piran-2H-2,3,4-triol tem sido relatado in vitro para inibir a fosforilação de L-fucose, a primeira etapa em biossíntese de GDP-L-Fucose. 6,8a — diepi-castanospermina é um inibidor de fucosiltransferase. 1-N-iminoaçúcares AeB (tam- bém conhecido como hidrocloreto de 1-Butil-5-metil-piperidina-3,4-diol e hidrocloreto de 5- Metil-piperidina-3,4-diol, respectivamente) têm sido relatados serem inibidores de fucosil- transferase. Deoximanojirimicina (DMJ) é um inibidor de ER manosidase I. Quifunensina (Kf) é um inibidor de ER manosidase I. Suainsonina (Sw) é um inibidor de ER manosidase II. Monensina (Mn) é um inibidor de transporte de proteína intracelular entre ER e Golgi que interfere com prolongamento de núcleo oligossacarídeo. Dados descritos aqui mostram que uma variedade de inibidores de manosidase e/

ou glicosidase fornece uma ou mais dos efeitos desejados de aumento da atividade de ADCC, aumento da ligação de receptor Fc1 e alteração do padrão de glicosilação.

Nos exemplares das modalidades, castanospermina (MW 189.21) é adicionada ao meio de cultura para uma concentração final de cerca de 200 μΜ (correspondendo a cerca de 37,8 //g/mL), ou faixas de concentração maiores do que cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150μΜ, e até cerca de 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, ou 50//g/mL. Por exemplo, faixas de 10-50, ou 50-200, ou 50-300, ou 100-300, ou 150-250 μΜ são consideradas.

Em outros exemplares de modalidades, DMJ, por exemplo DMJ-HCI (MW 199.6) é adicionada ao meio de cultura para uma concentração final de cerca de 200 μΜ (correspon- dendo a cerca de 32,6 μg DMJ/mL), ou concentração de faixas maiores do que cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150 μΜ, e até cerca de 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, ou 50 ^g/mL. Por exemplo, faixas de 10-50, ou 50-200, ou 50-300, ou 100-300, ou 150-250 μΜ são consideradas. Em outros exemplares de modalidades, quifunensina (MW 232.2) é adicionada ao

meio de cultura para uma concentração final de cerca de 10 μΜ (correspondendo a cerca de 2,3 μg/mL), ou faixas de concentração maiores do que cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 //Μ, e até cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, ou 11 μΜ. Por exemplo, faixas de 1-10, ou 1-25, ou 1-50, ou 5-10, ou 5-25, ou 5-15 μΜ são considera- das.

Células, construções recombinantes e métodos de cultura Como empregado aqui, "célula hospedeira" especificamente exclui hibridomas de

roedores porém inclui qualquer outra célula que é capaz de glicosilação (isto é, adição de carboidrato a um aminoácido de um polipeptídeo) e que sido modificado através de meios recombinantes para expressar níveis aumentados de um produto de proteína. Progênie de células hospedeiras, que retém a modificação recombinante e a capacidade para expressar o produto de proteína são incluídas no termo "célula hospedeira".

Exemplares de elementos de vetores de expressão ou seqüências reguladoras po- dem incluir uma origem de replicação, um promotor, um operador, ou outros elementos que mediam a transcrição e translação. Promotores podem ser constitutivos ou ativos e podem, além disso, ser tipo de célula específica, tecido específico, célula individual específica, even- to específico, temporariamente específica ou induzível. Promotores de evento específico são ativos ou super regulado apenas na ocorrência de um evento. Além do promotor, seqüên- cias repressoras, reguladores negativos, ou silenciadores específicos de tecido podem ser inseridos para reduzir a expressão não específica. Outros elementos incluem sítios de liga- ção de ribossoma interno, uma seqüência terminadora de transcrição, incluindo uma se- quência de poli-adenilação, sítios receptores e doadores de união, e um realçador, um mar- cador selecionável e outros mais.

O meio de cultura pode incluir quaisquer ingredientes desejáveis ou necessários conhecidos na técnica, tal como carboidratos, incluindo glicose, aminoácidos essenciais e/ ou não essenciais, lipídeos e precursores de lipídeo, precursores de ácido nucléico, vitami- nas, sais inorgânicos, elementos de traço incluindo metais raros, e/ ou fatores de crescimen- to celular. O meio de cultura pode ser quimicamente definido ou pode incluir soro, planta hidrolisada, ou outras substâncias derivadas. O meio de cultura pode ser essencialmente ou totalmente sem soro ou sem componente animal. "Essencialmente sem soro" significa que o meio precise de qualquer soro ou contenha uma quantidade insignificante de soro. Exempla- res de aminoácidos suplementares esvaziadas durante a cultura de célula incluem asparagi- na, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptofano, e valina.

Precursores de lipídeo e/ ou lipídeos comercialmente disponíveis incluem colina, etanolamina, ou fosfoetanolamina, colesterol, ácidos graxos tais como ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolênico, ésteres de metila, D-alfa-tocoferol, por exemplo, na forma de ace- tato, ácido esteárico; ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoléico; ou ácido araquidô- nico. Aminoácidos essenciais incluem Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metio- nina, Fenilalanina, Treonina, Triptofano e Valina. Aminoácidos não essenciais incluem Alanina, Asparagina1 Aspartato, Cisteína, Glutamato, Glutamina1 Glicina1 Prolina1 Serina1 e Tirosina. Elementos de traço ou inorgânico comercialmente disponíveis, fornecido com sais adequados, incluem sódio, cálcio, potássio, magnésio, cobre, ferro, zinco, selênio, molibdênio, vanádio, manganês, níquel, silício, estanho, alumínio, bário, cádmio, cromo, cobalto, germânio, potássio, prata, rubídio, zircônio, fluoreto, brometo, iodeto e cloreto. O meio pode, da mesma forma, opcionalmente incluir um agente tensoativo ou tensoativo não iônico para proteger as células da misturação ou aeração. O meio de cultura pode da mes- ma forma compreender tampões tais como bicarbonato de sódio, fosfatos monobásicos e bibásicos, HEPES e/ ou Tris. O meio de cultura pode da mesma forma compreender induto- res de produção de proteína, tal como butirato de sódio, ou cafeína.

A invenção da mesma forma fornece métodos para produzir uma imunoglicoproteí- na compreendendo cultivar uma célula hospedeira em quaisquer dos meios de cultura ou sob quaisquer das condições descritas aqui. Tais métodos podem além disso incluir a etapa de recuperar a imunoglicoproteína das células hospedeiras ou meio de cultura. O modifica- dor de carboidrato pode ser incluído no meio de cultura inicial, ou pode ser adicionado du- rante a fase de crescimento inicial ou em fases posteriores. Quando a proteína recombinan- te é secretada no meio, o meio pode ser colhido periodicamente e substituído por novo meio através de diversos ciclos de colheita.

Se bem que as células CHO, as quais são amplamente empregadas para produção de proteína terapêutica, são preferidas, quaisquer células hospedeiras conhecidas na técni- ca para produzir proteínas glicosiladas pode ser empregadas, incluindo células de levedura, células de plantas, plantas, células de inseto, e células de mamífero. Exemplares de células de levedura incluem Pichia, por exemplo, P. pastoris, e Saccharomyces, por exemplo, S. cerevisiae, assim como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, K. Zactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, e K. marxianus; K. yarrowia; Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occi- dentalis, Neurospora, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus, A. nidulans, A. niger, Hanse- nula, Candida, Kloeckera1 Torulopsis, e Rhodotorula. Exemplares de células de inseto inclu- em Autographa californica e Spodoptera frugiperda, e Drosophila. Exemplares de células de mamífero incluem variedades de CHO, BHK, HEK-293, NSO, YB2/3, SP2/0, e células huma- nas tais como PER-C6 ou HT1080, assim como VERO, HeLa, COS, MDCK1 NIH3T3, Jurkat, Sãos, PC-12, HCT 116, L929, Ltk-, WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT1 uma linhagem de célula leucêmica, célula-tronco embriônica ou célula de ovo fertilizado.

As células podem ser cultivadas em qualquer sistema de cultura e de acordo com qualquer método conhecido na técnica, incluindo T-frascos, frascos agitadores e de centrifu- gação, garrafas rolantes e bio-reatores de tanque agitado. Células dependentes de ancora- gem podem, da mesma forma, ser cultivadas no microportador, por exemplo, esferas poli- méricas, que são mantidas em suspensão nos bio-reatores de tanque agitado. Alternativa- mente, as células podem ser cultivadas na suspensão de célula única. O meio de cultura pode ser adicionado em um processo de batelada, por exemplo, em que o meio de cultura é adicionado uma vez às células em uma batelada única, ou em um processo de batelada de alimento no qual as bateladas pequenas do meio de cultura são periodicamente adiciona- das. O meio pode ser colhido ao término da cultura ou diversas vezes durante a cultura. Processos de produção continuamente perfundidos são, da mesma forma, conhecidos na técnica, e envolvem alimentação contínua de novo meio na cultura, ao mesmo tempo que o mesmo volume é continuamente retirado do reator. As culturas perfundidas, modo geral, obtêm densidades de células mais elevadas do que culturas batelada e podem ser mantidas por semanas ou meses em colheitas repetidas.

Emprego de imunoglicoproteínas

As imunoglicoproteínas da invenção são úteis como produtos terapêuticos para tra- tar doenças mediadas pela molécula alvo, ou, por exemplo, como agentes citolíticos para matar as células de câncer que têm a molécula alvo expressada ou associada com a super- fície celular.

"Tratamento" ou "tratando" se refere a ou um tratamento terapêutico ou tratamentos preventivos ou profiláticos. Um tratamento terapêutico pode melhorar pelo menos um sinto- ma da doença em um indivíduo recebendo tratamento ou pode retarda a piora de uma do- ença progressiva em um indivíduo, ou previne o início de doenças adicionais associadas. Uma resposta melhorada é avaliada por avaliação de critérios clínicos bem conhecidos na técnica para o estado da doença.

Uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" de uma imunoglicoproteína se refere àquela quantidade do composto suficiente para resultar a melhora de um ou mais sintomas da doença sendo tratada. Quando aplicado a um indivíduo o ingrediente ativo, ad- ministrando somente uma dose terapeuticamente eficaz se refere àquele ingrediente somen- te. Quando aplicado a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz se refere às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, ou ad- ministradas em combinação, consecutivamente ou simultaneamente. As doses podem ser administradas com base no peso do paciente, por exemplo, em uma dose de 0,01 a 50 mg/kg, e podem ser administradas em uma base diária ou semanal, ou a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, ou uma vez por mês.

Para administrar as imunoglicoproteínas da invenção a humanos ou animais de tes- te, é preferível formular a molécula em uma composição compreendendo um ou mais diluen- tes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis, preferivelmente diluentes ou portadores estéreis se a composição é para administração parenteral. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" se refere a composições e entidades moleculares que não produz outras reações adversas, ou alérgicas quando administradas empregando rotinas bem conhecidas na técnica, como descritas abaixo. "Portadores farmaceuticamente aceitá- veis" incluem quaisquer e todos os solventes clinicamente úteis, meio dispersão, revesti- mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotôni- cos e outros mais. De modo geral, as composições são, da mesma forma, essencialmente livres de pirogênios, assim como outras impurezas que pode ser nocivo ao recipiente.

As imunoglicoproteínas podem ser administradas oralmente, topicamente, trans- dermicamente, parenteralmente, por spray de inalação, vaginalmente, retalmente, ou por injeção intracraniana. O termo parenteral como empregado aqui inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisternal, ou técnicas de infusão. Administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implante cirúrgico em um sítio particular é considerado tam- bém.

Em uma modalidade, a administração é realizada no sítio de um câncer ou tecido afetado necessitando de tratamento por injeção direta no sítio ou através de uma liberação prolongada ou mecanismo de liberação prolongado, o qual pode liberar a formulação inter- namente. Por exemplo, cápsulas ou microesferas biodegradáveis ou outras configurações de polímero biodegradáveis capazes de liberação prolongada de uma composição (por e- xemplo, um anticorpo, polipeptídeo solúvel, ou pequena molécula) pode ser incluída nas formulações da invenção implantada próxima ao câncer.

As composições terapêuticas podem, da mesma forma, ser liberada ao paciente em sítios múltiplos. As administrações múltiplas podem ser produzidas simultaneamente ou po- dem ser administradas durante um período contínuo de tempo.

A injeção de soluções aquosas é preferida. Composições aquosas podem ser Iiofili- zadas para armazenamento e reconstituídas em um portador adequado antes do uso. Esta técnica tem sido mostrada se eficaz com imunoglobulinas convencional. Qualquer liofilização adequada e técnicas de reconstituição podem ser empregadas. Deve ser apreciado por a- queles versados na técnica que a liofilização e a reconstituição podem induzir a graus varia- dos de perda de atividade e que emprega níveis pode ter que ser ajustado para compensar. Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser líquida para a extensão que

existe facilmente na seringabilidade. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo emprego de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partí- cula requerido no caso de dispersão e pelo emprego de tensoativos. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e pode ser preservada com a ação de conta- minação de microorganismos, tal como bactérias e fungos. A prevenção da ação dos micro- organismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exem- plo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e outros mais. Em muitos ca- sos, deve ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de só- dio.

Além disso, as propriedades de hidrofilicidade e hidrofobicidade das composições consideradas para emprego na invenção são bem equilibradas, por meio disso realçando sua utilidade para ambos os usos in vitro e especialmente in vivo, ao mesmo tempo que ou- tras composições precisam de tal equilíbrio são de utilidade substancialmente menor. Espe- cificamente, as composições consideradas para emprego na invenção tem um grau adequa- do de solubilidade em meio aquoso o qual permite a absorção e bioavailcapacidade no cor- po, ao mesmo tempo que da mesma forma tem um grau de solubilidade em lipídeos, o qual permite aos compostos atravessar a membrana da célula a um sítio putativo de ação.

Da mesma forma considerada na presente invenção é a administração de uma composição de imunoglicoproteína em conjunção com um segundo agente.

Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits ou artigos de fabricação a qual compreende um ou mais compostos ou composições embaladas de um modo que facilita seu emprego para praticar os métodos da invenção. Em uma modalidade, um tal kit inclui uma imunoglicoproteína descrita aqui, opcionalmente com um segundo agente terapêutico, embaladas em um recipiente tal como um vaso ou garrafa lacrada, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluído na embalagem que descreve o emprego do composto ou composição na prática do método. Preferivelmente1 o composto ou composição é embalado em uma unidade de forma de dosagem. O kit pode, além disso, incluir um dispositivo adequado para administrar a composição de acordo com uma rotina específica de administração ou para a prática de um ensaio de filtragem. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o emprego da composição.

A invenção, além disso, considera o emprego das imunoglicoproteínas da invenção na fabricação de um medicamento para a inibição ou prevenção ou tratamento de uma do- ença, condição, ou distúrbio em um paciente caracterizado ou mediado pelo alvo ao qual a imunoglicoproteína se liga.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 representa o crescimento celular de células CHO expressando TRU-016 cultivado em meio celular com várias concentrações de castanospermina, como mostrado pelas contagens de células de células/ ml.

A figura 2 representa viabilidade da célula de células CHO expressando TRU-016 cultivado em meio celular com várias concentrações de castanospermina, como mostrado pela % das células vivas.

A figura 3 representa a ligação CD16 de TRU-015 produzidos por células cultivadas na presença de concentrações de variação de castanospermina e mostra meio geométrico de intensidade fluorescente versus concentração de castanospermina. A figura 4 representa a ligação CD16, como mostrado pelo meio geométrico de in- tensidade fluorescente, de TRU-016 produzido pelas células cultivadas na presença de vá- rias concentrações de 6,8a-diepicastanospermina, suainsonina, ou deoximanojirimicina (DMJ).

A figura 5 representa a ligação CD16, como mostrado pelo meio de intensidade flu- orescente, de TRU-016 produzido pelas células cultivadas na presença de concentrações de variação de quifunensina.

A figura 6 representa a ligação CD16, como mostrado pelo meio de intensidade flu- orescente, de TRU-016 purificado por Proteína A produzida pelas células cultivadas na pre- sença de concentrações de variação de castanospermina.

As figuras 7 e 8 representam ADCC de TRU-015 medidas empregando PBMC de doadores de alta afinidade e baixa afinidade, respectivamente, e plota a concentração de TRU-015 adicionada versus % de neutralização específica.

A figura 9 representa ADCC de TRU-016 produzido por células cultivados na pre- sença de concentrações de variação de castanospermina, e plota a % de neutralização es- pecífica versus a concentração de TRU-016 adicionado.

A figura 10 representa ADCC de TRU-016 produzido por células cultivadas na pre- sença de vários modificadores de carboidratos, e plota a % de neutralização específica ver- sus a concentração de TRU-016 adicionado.

A figura 11 representa dados farmacocinéticos em camundongo administrado com TRU-016 produzido por células cultivadas na presença de vários modificadores de carboi- dratos.

A figura 12 representa a ligação CD16 de TRU-016 em soros de camundongo ad- ministrado com TRU-016 produzido por células tratadas com vários modificadores de car- boidratos.

A figura 13 representa tumor de volume relativo em 8 dias em camundongo implan- tado com células de tumor e administrado com TRU-016 produzido de células tratadas com vários modificadores de carboidratos, ou células não tratadas.

A figura 14 representa % de sobrevivência de camundongo implantado com células de tumor e administrado com TRU-016 produzido de células tratadas com vários modificado- res de carboidratos, ou células não tratadas.

A figura 15 representa CDC de TRU-015 produzido por células cultivadas na pre- sença de castanospermina, e plota a % de iodeto de propídio positivo (células mortas) ver- sus a concentração de TRU-015 de proteína de teste.

A figura 16 representa CDC de TRU-016 produzido por células cultivadas na pre- sença de vários modificadores de carboidratos, e plota a % de iodeto de propídio positivo (células mortas) versus a concentração de TRU-016 da proteína de teste. A figura 17 representa produção de proteína específica relativa de TRU-016 sobre uma faixa de concentrações de castanospermina.

A figura 18 representa os resultados de um ensaio para ligação simultânea de TRU- 016 a CD37 e FcYRIIIa (CD16) sobre uma faixa de concentrações de castanospermina.

A figura 19 representa a resposta da dosagem das curvas de ligação de TRU-016 a

CD37 expressando as células para uma faixa de concentrações de castanospermina.

A figura 20 representa as curvas da atividade de ADCC de TRU-016 sobre uma fai- xa de concentrações de castanospermina.

Descrição Detalhada da Invenção Exemplo 1

Produção de Produtos SMIP

TRU-016

SMIPs de CD37 específico são descritos na co-propriedade de Pedido dos Estados Unidos N0. 10/627.556 e Publicação de Patente dos Estados Unidos Nos. 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049, cada um incorporado aqui por referência em sua totalidade. Um exemplar de SMIP, TRU-016, é produzido como descrito abaixo.

TRU-016 [G28-1 scFv VH11S (SSC-P) H WCH2 WCH3] é uma proteína de cadeia única recombinante que se liga ao Antígeno CD37. As seqüências de nucleotídeo e aminoá- cido de TRU-016 são respectivamente iniciadas na SEQ ID Nos: 1 e 2. O domínio de ligação foi com base na seqüência de anticorpo G28-1 previamente descrito nas publicações de patente listadas no parágrado anterior, cuja descrição é incorporada aqui por referência. O domínio de ligação está conectado ao domínio de efetores, os domínios CH2 e CH3 de IgGI humana, através de uma região de articulação modificada. TRU-016 existe como um dímero na solução.

TRU-016 é produzido por tecnologia de DNA recombinante em um sistema de ex-

pressão de célula de mamífero de ovário de hamster chinês (CHO). SMIPs de TRU-016 são purificados por cultura de CHO de sobrenadantes por Proteína A de cromatografia por afini- dade. Empregando dPBS, a coluna de sefarose FF de 50 mL de rProteina A (GE Healthcare rProtein A Sepharose FF1 Catalog # 17-0974-04) é equilibrada em 5,0 mis/ min (150 cm/hr) por 1,5 volumes de coluna (CV). O sobrenadante de cultura é carregado à coluna FF de se- farose de rProteina A em uma taxa de fluxo de 1,7 mis/ min empregando o AKTA Explorer 100 Air (GE healthcare AKTA Explorer 100 Air, Catalog # 18-1403-00), capturando o TRU- 016 recombinante. A coluna é lavada com dPBS com 5 volumes de coluna (CV), em seguida 1,0 M de NaCI, 20mM de Fosfato de Sódio, pH 6,0, e em seguida com 25 mM deNaCI, 25mM de NaOAc, pH 5,0. Estas etapas de lavagem removem as proteínas de célula hospe- deira de CHO ligado não especificamente com a coluna rProteina A que contribui para a precipitação do produto após a eluição. O TRU-016 recombinante é eluído da coluna com IOOmM de Glicina, pH 3,5. 10mL de frações do produto eluído foram recuperados e o produto eluído foi em seguida produzido para pH 5,0 com 20% do volume eluído de 0,5 M de ácido 2-(N-Morfolino)etanesulfônico (MES) de pH 6,0. Este produto eluído é concentrado para aproximadamente 25 mg/mL de TRU-016 e esterilizado em filtro.

A proteína purificada é em seguida submetida à GPC de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para obter, além disso, a purificação da molécula TRU-016 (dímero) de agregados pesos moleculares mais elevados. Empregando dPBS, uma coluna XK 50/100 (GE healthcare XK 50/100 empty chomatografy column, Catalog # 18-8753-01) contendo 1 L de sefarose FF de Superdex 200 é equilibrada em 12,6 mis/ min (38cm/hr) por 1,5 volumes de coluna (CV). Um volume máximo de 54 mis ( 3% CV) da amostra é aplicado à coluna. A coluna permanece a executar em 12,6 ml/ min e a proteína eluída é fracionada em 40 mL de frações. Cada fração é analisada para qualidade do produto empregando um HPLC analíti- co, e as frações eluídas são reunidas a >95% POI (não agregada) de TRU-016. Esta mistura resultante é esterilizada em filtro em 0,22pm. O material é em seguida concentrado e formu- lada com 20 mM de Fosfato de Sódio e 240 mM de sucrose, em pH 6,0.

Um método alternativo para purificação da glicovariante é como segue. TRU-016 é purificado por cultura de CHO sobrenadante por cromatografia por afinidade de Proteína A. Empregando dPBS, uma coluna de cromatografia por afinidade de 1 mL de MabSeIect (GE Healthcare Hitrap MabSeIect1 catalog #28-4082-53) é equilibrada em 1,0 mL/ min por 7 vo- lumes de coluna (CV). O sobrenadante de cultura é carregado na coluna MabSeIect em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/ min empregando o Akta Explorer 100 Air (GE Healthcare, Akta Ex- plorar 100 Air, catalog # 18-1403-00) capturando o TRU-16 recombinante. A coluna é lavada com dPBS por 20 CV, em seguida com 20mM de Fosfato de Sódio, 1,0 M de NaCI1 pH 7,0 por 5 CV e em seguida com dPBS por 3 CV.

O TRU-016 recombinante é eluído da coluna com 10 mM de Citrato, pH 3,5 e a co- luna é extraída com 10 mM de Citrato 3.0 por 8 CV. Seguinte a extração a coluna é re- equilibrada por 5 CV com dPBS. A proteína é coletada nas frações durante a eluição as quais são reunidas com base na absorvência e este material reunido é produzido para pH 5,0 com uma adição de aproximadamente 400 μί de 0,55 M de ácido 2-(N- Morfolin)etanesulfônico (MES) de pH 6,0 por 5 mL de eluição. Este eluído neutralizado é esterilizado em filtro e submetido a ambos os ensaios de atividade assim como ensaios de processo analíticos.

Os experimentos podem ser realizados para confirmar que a especificidade da Iiga- ção do anticorpo origem ao receptor da superfície celular de CD37 é preservada em TRU- 016. PBMCs humanos são isolados durante os gradientes de densidade LSM e incubados com TRU-016 não conjugado e CD19 anti-humano de PE conjugado. As células são lavadas e incubadas com 1:100 FITC GAH de IgG (Fc específica) durante 45 minutos no gelo. As células são lavadas e analisadas por citometria de fluxo de duas cores em um instrumento FACsCaIibur empregando software Cell Quest. As células são controladas por linfócitos B ou linfócitos não B por manchamento CD19.

Com concentrações aumentadas de TRU-016, o sinal FITC no linfócito B (entrada positiva de CD19) aumenta rapidamente de 0,01-1.0 //g/ml, até saturação alcançada em aproximadamente 1 //g/mL ou um meio de intensidade fluorescente (MFI) de 1000. Em comparação, o manchamento da população de linfócito não B é detectável, porém muito baixa, e aumenta lentamente com a concentração aumentada de scFvIg.

TRU-015

Os SMIPs de CD20 específicos são preparados similarmente. Os SMIPs de CD20 específicos são descritos em co-propriedade de Publicações de Patente dos Estados Unidos 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049, cada uma incorporado por referência aqui em sua totalidade. Um exemplar de SMIP, TRU-015, é descrito abaixo.

TRU-015 é uma proteína de cadeia única recombinante que se liga ao antígeno CD20. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de TRU-015 são respectivamente inicia- das na SEQ ID Nos: 3 e 4. O domínio de ligação foi com base na seqüência de anticorpo de CD20 humano publicamente disponível. O domínio de ligação é conectado ao domínio de efetores, os domínios CH2 e CH3 de IgGI humana, através de uma região de articulação CSS modificada. TRU-015 existe como um dímero na solução.

TRU-015 compreende a seqüência de clonagem de peptídeo líder 2e12 de aminoá- cidos de 1-23 de SEQ ID No: 4; a região variável de cadeia leve de CD20 anti-humano de murino 2H7 com uma Iisina para substituição de aminoácido de serina (VHL11S) em resíduo 11 na região variável, a qual é refletida na posição 34 na SEQ ID No: 4; um Iigador asp-gly3- ser-(gly4ser)2, começando no resíduo 129 na SEQ ID NO: 4; a região variável de cadeia pe- sada de CD20 anti-humano de murino 2H7, a qual falta um resíduo de serina ao término da região de cadeia pesada, isto é, alterada de VTVSS a VTVS; um domínio FC de IgGI hu- mana, incluindo uma região de articulação modificada compreendendo a (CSS) seqüência, e domínios CH2 e CH3 de tipo selvagem.

Exemplo 2

Células hospedeiras de cultura com Modificador de carboidrato

Células CHO transfectadas com CDNA de TRU-016 ou TRU-015 foram cultivadas em frascos de sacudidela ou sacos de onda com concentrações de variação de vários modi- ficadores de carboidratos de modo geral de acordo com os procedimentos descritos abaixo.

Para o frasco de sacudidela executar, células hospedeiras de fase Iog foram seme- adas em frascos de sacudidela em 100.000 células/ ml com modificador de carboidrato na concentração a ser testada, e opcionalmente com metotrexato (MTX) @ 50 nM As células foram semeadas em 3 χ 10E6/mL em 1350 mL de Ex-Cell 302 meio de cultura (SATC Biosciences; com aminoácidos não essenciais adicionados, pirucato, L- glutamina, pen/strep, HT Supplement e insulina, todas da Invitrogen) em t=0 e produzidas para 5L de total volume em T>= 72 horas. As células foram incubadas a 37 0C e 5% de dió- xido de carbono e monitoradas para crescimento e viabilidade diária partindo em 6-7 dias. Os sobrenadantes foram tipicamente colhidos em 10-12 dias quando a viabilidade da célula burifada abaixo de 60%.

Na-Azida foi adicionado a 0,02%, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi esterilizado em filtro através de um filtro de 0,22 uM. Alguns ensaios des- critos em outros exemplos aqui foram realizados nos sobrenadantes como indicado, ao mesmo tempo que outros ensaios foram realizados no material que suportou, além disso, a purificação da proteína A. Para saco de onda executar células hospedeiras de fase Iog fo- ram semeadas em 5L de sacos de onda em 100.000-200.000 células/ ml em 10-20% de meio de Ex-Cell 302 condicionada (SATC Biosciences; com aminoácidos não essenciais adicionados, pirucato, L-glutamina, pen/strep, HT Supplement e insulina, todas da Invitro- gen) com modificador de carboidrato na concentração sendo testada. As células foram incu- badas a 37 0C e 5% de dióxido de carbono e monitoradas diariamente para crescimento e viabilidade. Os sobrenadantes foram tipicamente colhidos em 11-12 dias ou quando a viabi- lidade da célula burifada abaixo de 50%. As células foram removidas por centrifugação em um Sorvall Legend a 3000 rpm

(1932 rcf) durante 20 minutos, o sobrenadante foi esterilizado em filtro. Alguns ensaios des- critos em outros exemplos aqui foram realizados nos sobrenadantes como indicado, ao mesmo tempo que outros ensaios foram realizados no material que suportou, além disso, a purificação de proteína.

TRU-016 produzido por células cultivadas com concentrações de variação de vários

modificadores de carboidratos é analisado para ligação CD16, ADCC, CDC, parâmetros farmacocinéticos e atividade in vivo como descrito abaixo.

As figuras 1 e 2 são representativas e mostra que o tratamento com castanosper- mina modificadora de carboidrato em concentrações até 1000 μΜ não afetaria as contagens de células ou percentagem de viabilidade da célula durante todos os períodos de tempo a- mostrados (até 144 horas).

Exemplo 3

Ligação a FcRs

As imunoglicoproteínas produzidas de acordo com o exemplo 2 foram analisadas in vitro para ligação a versões de fusão solúvel em Ig de receptores Fcy1 na qual o domínio extracelular de um receptor é fundido ao Fc da lgG2a do murino.

Os materiais de receptores solúvel em Fcy foram gerados por fusão do domínio ex- tracelular de Receptores I Fcy (Genbank Acc. No. BC032634), Ila (Genbank Acc. No. NM_021642), Ilb (Genbank Acc. No. BC031992), e III-V158 (alelo de alta afinidade) (Gen- bank Acc. No. X07934) e III-F158 (alelo de baixa afinidade), respectivamente, a um Fc de lgG2a de murino com uma mutação Pro a Ser em resíduo 238 (MlgG2aP238S). Para ambas as formas de Fcy Rlll (CD16), um líder HE4 foi clonado nos aminoácidos CD16 de 1-178 e em seguida fundida a MlgG2aP238S.

Os ensaios foram executados como segue. 500.000 células WIL2-S (uma linhagem de célula de Iinfoma B que expressa CD37 assim como CD20 nesta superfície) foram incu- badas em gelo em uma placa Costar de 96 cavidades com 5 //g/ml de ou TRU-015 ou TRU-

016 durante 45 minutos em salina tamponada por fosfato (PBS) com 1% de soro bovino fetal (FBS). TRU-015 ou TRU-016 não ligado foi removido por girar as células, lavando com dilu- ente (PBS + 1%FBS) e giradas novamente a 1200 rpm em um Sorvall Legend RT durante 2 minutos. As células foram em seguida incubadas com a fusão FcyR-MIg desejada no mes- mo diluente em uma concentração de 1 //g/ml no gelo durante 45 minutos.

Os complexos (células WIL2-S/ SMIP/ FcyR-MIg) foram em seguida incubados com

IgG anti-camundongo de cabra de AffiniPure F(Ab')2 de PE conjugado [Jackson Imunorese- arch] (um anticorpo de Fc específico de camundongo com reatividade cruzada mínima com Fc humano) em um diluição de 1:100. As células foram analisadas por citometria de fluxo de uma cor em um FACsCaIibur empregando software CeIIQuest (Becton Dickinson).

Se os sobrenadantes de TRU-016 de Exemplo 2 foram empregados neste ensaio

ao invés de proteína TRU-016 purificadas, a concentração de SMIP no sobrenadante foi quantificada por manchamento direto de células WIL2-S com sobrenadante diluídos junto com um padrão TRU-016. TRU-016 foi detectado por manchamento com FITC conjugado de F(Ab')2 de Cabra Anti-Humano (gama) [Caltag H10101] em uma diluição de 1:50.

Ligação de qualquer dos dois alelo de baixa afinidade e alelo de alta afinidade fo-

ram determinados para correlacionar similarmente a atividade de ADCC. Um aumento em ligação CD16 (alelo de baixa ou alta afinidade) foi correlacionado a um aumento na atividade de ADCC.

Resultados representativos são exibidos nas Figuras 3-6.

A proteína TRU-015 purificada produzida por células CHO cultivadas em meio con-

tendo 0, 2, 5, 10, 30 ou 100 /vg/mL de castanospermina foi testado para ligação CD16 (alelo de baixa afinidade). Resultados representativos de intensidade fluorescente por meio geo- métrico são exibidos na Figura 3 e mostram um aumento dependente da dose na ligação CD16 em concentrações de aumento de castanospermina no meio de cultura.

TRU-016 sobrenadante produzido por células CHO cultivadas em meio contendo

6,8a-diepicastanospermina em uma concentração de 50 ou 250 μΜ, Suainsonina em uma concentração de 50 ou 250 μΜ, ou deoximanojirimicina (DMJ) em uma concentração de 50 ou 250 μΜ foi testada para ligação CD16. Resultados representativos de meio de intensida- de fluorescente são exibidos na Figura 4 e mostra que ambas as concentrações de ligação CD16 de DMJ aumentada. Se bem que nenhum efeito foi observado para 6,8a- diepicastanospermina ou suainsonina nestas concentrações, além disso, testes com proteí- na purificadas são executadas para determinado efeito.

TRU-016 sobrenadante produzido por células CHO cultivadas em meio contendo quifunensina em uma concentração de 0, 0,5, 1, 3, 5, ou 10 μΜ foi testado para ligação CD16. Resultados representativos de meio de intensidade fluorescente são exibidos na Fi- gura 5 e mostra que a quifunensina foi muito mais potente do que DMJ em ligação CD16 aumentada e ligação CD16 grandemente aumentada até mesmo na concentração mais bai- xa, 0,5 μΜ.

TRU-016 purificado por Proteína A produzida por células CHO cultivadas em meio contendo 0, 10, 25, 50, 100 ou 200 μΜ de castanospermina foi testada para ligação CD16. Resultados representativos de meio de intensidade fluorescente são exibidos na Figura 6 e mostram um aumento dependente da dose em ligação CD16 em concentrações aumenta- das de castanospermina no meio de cultura.

Exemplo 4

Atividade de ADCC

Para determinar a atividade de ADCC de TRU-016 purificado, células B de BJAB rotulado B foram empregados como células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e alvos como células efetoras. Células B de BJAB B (células 107) foram rotuladas com 500 //Ci/mL de 51Cr de cromato sódico durante 2 horas a 37°C em IMDM/ 10%FBS. PBMCs foram isolados de sangue total humano, heparinizado, por fracionamento sobre gra- dientes de Meio de Separação de Linfócito (LSM, ICN Biomedical). Amostras de reagentes foram adicionadas para meio de RPMI com 10% de FBS e diluições em série de cada um reagente foram preparados. O BJAB rotulado 51Cr foi adicionado a células/ cavidades de 2x104. Os PBMCs foram em seguida adicionados em células/ cavidades de 5x105 a uma relação final de 25:1 efetoras (PBMC):alvos (BJAB). As reações foram determinadas em cavidades quadruplicata de uma placa de 96 cavidades. As diluições em série de TRU-016 foram adicionadas as cavidades em uma concentração final variando de 10 ng/mL a 20 μ- g/mL como indicado nas figuras. As reações foram deixadas para prosseguir durante 6 ho- ras a 37°C em 5% de CO2 antes de colhetagem e contagem. CPM liberada foi medida em um Packard TopCounNXT de 50 μ\ de sobrenadante de cultura seco. Porcentagem de neu- tralização específica foi calculada por subtrair (cpm [meio de amostras quadruplicata] de amostra - liberação espontânea de cpm)/ (liberação máxima de com - liberação espontânea de cpm) χ 100, e os dados foram plotados como % de neutralização específica versus con- centração de TRU-016. Resultados representativos são exibidos nas Figuras 7-10.

Proteína de TRU-015 purificada por células CHO cultivadas no meio contendo 0, 2, 5, 10, 30 ou 100 //g/mL de castanospermina foi testada para ADCC medida empregando PBMC de doadores CD16 de alta afinidade (V/V158) e baixa afinidade (F/F158). Resultados representativos de % de neutralização específica são exibidos nas Figuras 7 e 8 (doadores de alta afinidade e baixa afinidade, respectivamente) e mostra um aumento dependente da dose na atividade de ADCC em concentrações aumentadas de castanospermina no meio de cultura.

Proteína de TRU-016 purificada produzida por células CHO cultivadas no meio con- tendo 0, 10, 25, 50, 100 ou 200 μΜ de castanospermina foi testada para ADCC. Resultados representativos de % de neutralização específica são exibidos na Figura 9 e mostra um au- mento dependente da dose na atividade de ADCC em concentrações aumentadas de casta- nospermina no meio de cultura.

Proteína de TRU-016 purificada produzida por células CHO cultivadas em meio contendo 200 μΜ de DMJ, 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina foi testado para ADCC. Resultados representativos de % de neutralização específica são exibidos na Figura 10 e mostra que todas estas concentrações dos modificadores de carboidratos de ADCC melhorada das imunoglicoproteínas produzidas pelas células CHO.

Exemplo 5 Atividade CDC

Para determinar a atividade CDC de proteína TRU-016 purificada de acordo com o Exemplo 2, células B Ramos foram suspensas em Iscoves (Gibco/lnvitrogen, Grand Island, NY) em células/ cavidades de 5x105 em 75 μ\. TRU-016 (75 μ\) foi adicionado as células em duas vezes as concentrações indicadas. Reações de ligação foram deixadas prosseguir durante 45 minutos antes da centrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As células fo- ram re-suspensas em Iscoves com soro humano (contendo complemento) em várias con- centrações. As células foram incubadas por 60 minutos a 37°C. As células foram lavadas por centrifugação e re-suspensas em meio de manchamento com 0,5 /vg/ml de iodeto de propídio. As amostras foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro antes da análise por citometria de fluxo empregado um software FACsCaIibur e CeIIQuest (Becton Dickinson).

Proteína TRU-015 purificada produzida por células CHO não tratadas, ou células CHO tratadas com 30 //g/ml de castanospermina foi testada para atividade CDC. Os resul- tados são exibido na Figura 15. Proteína TRU-016 purificada produzida por células CHO não tratadas, ou células

CHO cultivadas em meio contendo 200 μΜ de DMJ, 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina, foi testado para atividade CDC. Resultados são exibidos na Figura 16. Estes resultados mostram que CDC para TRU-015 ou TRU-016 modificado por car- boidrato foi similar à CDC de proteína correspondente produzida por células CHO não trata- das, indicando que a presença de modificador de carboidrato no meio de cultura das células hospedeiras não tem efeito significante na CDC da imunoglicoproteína produzida pelas célu- Ias hospedeiras.

Exemplo 6

Perfil Farmacocinético

Camundongos BALB/c fêmeas foram injetados intravenosamente com 200 /yg de proteína de teste TRU-016 (TRU-016 produzido por células CHO não tratadas com 200 μΜ de DMJ1 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina) em tempo 0. Amostras de soro foram coletadas (3 camundongos por ponto de tempo) em 15 minutos, 2, 6, 24, 48, 72, 96, e 192 horas pós injeção.

A concentração de soro de cada amostra de teste de TRU-016 foi determinada no ensaio de ligação com base em FACS empregando a linhagem de célula humana Ramos de CD37+. Células Ramos de CD37+ (células/ cavidade 5x105) foram incubadas nas placas de fundo plano de 96 cavidades junto com a amostra de soro ser testada. Amostras alcançadas de soro foram empregadas às curvas padrão. As células foram incubadas a 4°C durante uma hora e lavada antes da adição do anticorpo de detecção. Ligação de proteína de teste de TRU-016 para células Ramos de CD37+ Ramos foi detectada empregando anticorpo específico de fragmento FcV de IgG de cabra anti-humana conjugada por fluoresceína. Cur- vas padrão foram empregadas para construir uma curva de ligação como uma função de concentração de antígeno. Resumidamente, curvas padrão consistidas de várias concentra- ções conhecidas na proteína de teste de TRU-016 alcançada no soro de camundongo nor- mal diluído em 1:20 em tampão FACS. As curvas padrão foram executas em duplicata em cada placa. Meios de intensidades de fluorescência (MFI) da análise FACS foram importa- das do software Softmax Pro e foram empregadas para calcular as concentrações de soro da proteína de teste TRU-016.

Resultados do estudo farmacocinético mostraram que TRU-016 produzido por célu- las CHO cultivadas no meio contendo 200 μΜ de DMJ, 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina (exibidos na Figura 11) quando administrados a camundongos exibindo um perfil farmacocinético similar para TRU-016 produzido por células CHO não tratadas, indicando que o modificador de carboidrato no meio de cultura das células hospedeiras não têm efeito significante na meia vida ou outros parâmetros farmacocinéticos.

Repetindo os ensaios CD16 em soros contendo TRU-016 obtido do camundongo em 48, 72, 96 e 192 horas após a administração de TRU-016 mostrando que os soros reti- dos aumentam a atividade de ligação CD16 em todos os pontos de tempo testados. Os re- sultados são mostrados na Figura 12. Exemplo 7

Atividade de imunoglicoproteína modificada por carboidrato in vivo

Camundongos nus são administrados por células Ramos de 5 χ 106 subcutanea- mente no dia O e injetas intravenosamente com 200 /vg de IgG de controle humano ou prote- ína de teste TRU-016 produzida por células CHO tratadas com 200 μΜ de DMJ1 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina nos dias 0, 2, 4, 6, e 8. Camundongos tipica- mente desenvolvem tumores nos dias 6 e morrem dentro em pouco depois disso. Tumores são medidos três vezes semanalmente com calibre digital e software LabCat1 e volume de tumor é calculado como /4[tamanho χ (largura)]2. O peso do corpo é, da mesma forma, de- terminado uma vez por semana.

Os camundongos são sacrificados quando o tumor alcança 1500 mm3 em tamanho (1200 mm3 nas sextas-feiras). Os camundongos são, da mesma forma, sacrificados se ulce- ração de um tumor ocorrer, o tumor inibe a mobilidade de animal, ou se a perda de peso for igual ou exceder a 20%.

Resultados de ínterim para volume de tumor relativo em 8 dias após o estudo ser i-

niciado são mostrados na Figura 13. Os dados na % de sobrevivência após a iniciação do estudo são mostrados na Figura 14 e abaixo na Tabela 1.

Tabela 1

Grupo Tempo Médio de Sobrevivência (Dias)* valor ρ HuIgG 8 — TRU-016 de CS 13 0,0054 TRU-016 de DMJ 13,5 0,0005 TRU-016 de Kifu 10 0,0084

"Valores de cada TRU-016 modificado por carboidrato são significantemente dife-

rente daquele do grupo de controle tratado com hulgG.

Os resultados deste estudo in vivo mostrou que TRU-016 produzido por células CHO tratada com 200 μΜ de DMJ, 10 μΜ de kifenunsine ou 200 μΜ de castanospermina foi capaz de reduz o volume do tumor e aumentar o meio de tempo de sobrevivência em um modelo animal de câncer. Exemplo 8

Efeito de Castanospermina em Concentrações de Variação na Produção de Proteí- na.

Além disso, os experimentos foram realizados para determinar o efeito da concen- tração de castanospermina na viabilidade da célula, densidade e produção de proteína es- pecífica de TRU-016.

Antes da iniciação dos experimentos, as células CHO transfectadas com TRU-016 foram cultivadas em frascos de sacudidela em meio de Ex-Cell™ 302 CHO sem soro (SAFC Biosciences) suplementadas com 1x de aminoácidos não essenciais (MediaTech)1 1x piruva- to de sódio (MediaTech)1 4 mM de L-glutamina (MediaTech)1 500 nM de metotrexato (MP Biomedicals) e 1 mg/L de insulina recombinante (Recombulin - GIBCO/Invitrogen Corp.) a 37 0C e 5% de dióxido de carbono em um incubador umidificado. Uma concentração de es- toque de 200 mM de castanospermina (Alexis Biochemicals) foi preparada por diluição da castanospermina em água estéril, destilada/ desionizada (MediaTech) e filtração através de um Acrodisc® de 13 mm com uma membrana HT Tuffryn de 0,2 μιη (Pall Corporation). A solução de estoque foi aliquotada na estéril, O-anelada, 0,5 mL de tubos de microcentrífuga (Fisherbrand, Fisher Scientific) e congelada a -20°C. Aproximadamente 1 hora antes da ini- ciação dos experimentos, as alíquotas necessárias foram descongeladas em temperatura ambiente e os conteúdos de cada frasco pequeno bem misturado por turbilhonamento.

Para cada experimento, as células em fase de crescimento Iog foram semeadas no meio acima em um volume total de 60 mL em 250 mL de frascos agitadores em uma densi- dade de 200.000 células/ mL e CS adicionada na concentração a ser testada. As concentra- ções finais de CS de 800 μΜ, 400 μΜ, 200 μΜ, 100 μΜ, 50 μΜ, 25 μΜ e 0 μΜ foram cada uma testada em frascos de duplicata. Todas as culturas foram incubadas a 37 0C e 5% de dióxido de carbono em um incubador umidificado e monitoradas pelo menos dia sim, dia não para densidade de célula viável e viabilidade de célula global.

As culturas foram colhidas no dia 8 quando a viabilidade da célula global foi de 50- 70% (Expt. 1) e 30-50% (Expt. 2). As células e detritos das células foram removidos por cen- trifugação em um Sorvall Super T21 a 3000 rpm durante 20 minutos após os quais o sobre- nadante foi filtrado estéril através de uma unidade de Millipore Steriflip com uma membrana Millipore Expressa Plus de 0,22 μηη e armazenado a 2-8 0C até que purificação.

Se bem que a viabilidade da célula e o crescimento não parecia ser significante- mente afetado como indicado por cada área da célula integral da amostra (ICA), Tabela 2, concentrações aumentadas de castanospermina apresentou-se reduzir a produção de imu- noglicoproteína. Os resultados são mostrados na Figura 17 e na Tabela 2 abaixo. As con- centrações de 400 μιη e 800 μπι de CS são mostradas para reduzir a produção de proteína TRU-016 por aproximadamente 40%-55% respectivamente. Tabela 2

CS Cone. Viabilidade na Média de TRU-016 ICAa Produtividade13 (μΜ) Colheita (%) Produzido 106 células * Específica (ug/mL) ± SD d ias/m L (pg/ célula/ dia) 800 70,6 99,65 ±6,1 23,9 3,99 800 65,2 23,8 4,36 400 68,2 124,93 ± 1,4 22,4 5,53 400 65,7 23,0 5,48 200 55,5 143,53 ± 1,4 21,9 6,60 200 51,1 22,0 6,47 100 54,4 161,83 ±0,1 21,6 7,48 100 54,6 21,6 7,49 50 49,4 176,63 ± 1,0 21,6 8,15 50 50,0 21,4 8,27 53.9 180,31 ±6,6 21,4 8,22 54,5 21,1 8,78 0 65,1 208,24 ± 0,3 22,4 9,29 0 62,6 21,7 9,62

aArea de Célula Integral (ICA) ICA = ((VCCn + VCCn+i)/2) χ (Urtn)

Onde

VCCn = densidade de célula viável em tempo η VCCn+i = densidade de célula viável em tempo n+1

unidades: 106 células * dias/ mL

bProdutividade Específica = quantidade total produzida (ug/ml_)/ICA unidades: pg/ célula/ dia Exemplo 9

Ensaio para ligação simultânea de TRU-016 a CD37 e FcYRIIIa (CD16)

Os experimentos foram realizados para determinar o efeito da concentração de cas- tanospermina na atividade funcional de TRU-016 como medido por sua ligação a FcYRIIIa e sua ligação para alvejar antígeno CD37.

TRU-016 produzido como descrito no Exemplo 8 foi testado no seguinte ensaio, o qual simultaneamente avalia a capacidade do domínio de ligação TRU-016 para ligar-se a uma célula alvo expressando CD37 e a capacidade da porção Fc do SMIP de TRU-016 para ligar-se a proteína de fusão de Fc de IgG de CD16 humano e de murino.

A célula alvo utilizada é a linhagem de célula Daudi (ATCC CRL-213). As células Daudi são uma linhagem de célula de limfoblastóide B humana derivada de um Iinfoma de Burkitt e expressa níveis elevados de CD37. O CD16 solúvel sob medida: proteína de fusão MuIgGFc é CD16 humano CD16 (polimorfismo de baixa afinidade) ligado a um Fc de IgG de murino.

O número adequado de células Daudi (350.000/ cavidade vezes o número de cavi- dades) é aliquotada e centrifugada em 250 χ g durante 5 minutos a 15°C. O sobrenadante é removido. Uma porcentagem paraformaldeído frio é preparada por diluir o estoque de 4% de USB (USB US19943) 1:4 com FACS Buffer. O FACS Buffer é preparado por adicionar 2% de FBS (Gibco) ao Dulbecco's PBS (Invitrogen) (v/v) e filtrado em estéril com um filtro de 0,22 μιτι filter. O FACS Buffer é armazenado e empregado a 4°C. As células são re- suspensas em 1% de paraformaldeído (um volume igual a 50 μΙ_/ cavidade vezes o número de cavidades) e semeado em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo. As células são incubadas durante 30 minutos a 4°C. Seguinte a esta incubação as células são lavadas por adição de 150 μΐ de FACS Buffer para cada cavidade, centrifugadas a 250 χ g durante 3 minutos a 15°C e o sobrenadante removido. As células são re-suspensas em 50 //L de FACS Buffer. TRU-016 é diluído em FACS Buffer, em concentrações variando de saturação para níveis antecedentes (24 pg/mL - 0.011 pg/mL), adicionadas as cavidades adequadas, 50 ;uL/well, e as células incubadas durante 25 minutos a 4°C. A proteína de fusão CD16:MulgGFc é diluida em FACS Buffer a um nível de saturação (20 Mg/ml) e adicionada ao ensaio (50 μΥJ cavidades) e incubadas durante um adicional de 30 minutos a 4°C para formar um complexo com o TRU-016 que tem se ligado a superfície celular. Quaisquer rea- gentes não ligados são removidos da cavidade por centrifugação a 250 χ g durante 3 minu- tos a 15°C, removendo o sobrenadante e em seguida lavados 3 vezes com 200 //L/ cavida- des de FACS Buffer. As células são em seguida incubadas com um anticorpo F(ab')2 rotu- lado fluoróforo (R-phycoerythrin, Jackson 115-116-071), específicas para Fc de murino (e selecionadas serem minimamente reativa ao Fc humano). Este anticorpo deve se ligar a porção MuIgGFc da proteína de fusão CD16:MulgGFc. O anticorpo é diluído 1:200 em FACS Buffer e 100μΙ_ é adicionada a cada cavidade. A placa é incubada a 4°C no escuro durante 45 minutos. Qualquer R-PE não ligado é removido por adição de 150 μ!_ de FACS Buffer a cada cavidade e centrifigada a 250 χ g durante 3 minutes a 15°C seguido por remo- ção de sobrenadante. Isto é seguido por uma segunda lavagem com FACS Buffer de 200 μυ cavidades, centrifugada a 250 χ g durante 3 minutos a 15°C e removida de sobrenadan- te. As células são re-suspendidas com 200//L7 cavidades de 1% de paraformaldeído e arma- zenada a 4°C durante a noite.

Cada fluorescência ligado da amostra é medida em um sistema de citometria de fluxo BD FACSCaIibur e analisada com software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, ver 5.2). A intensidade de fluorescência GeoMean para cada amostra é plotada relativa à concentra- ção TRU-016. Uma resposta a dose é gerada e combinada a uma curva logística de 4 pa- râmetros (4-PL) empregando sotfware SoftMax Pro (Molecular Devices, ver 5.0.1). Titula- ções de TRU-016 são utilizadas ára criar uma curva de resposta a dose de teste e material de referência para comparação. O parâmetro "D" (curva máxima assíntota) é empregada como referência para comparação de amostras tratadas e não tratadas. Um aumento no valor de "D" representa um aumento na atividade de ligação para a amostra correspondente sample.

Os resultados do experimento são exibidos na Figura 18 e mostram um resposta de lição dependente da dose relativa a concentração de CS até 400 μΜ, na qual o ponto de parece igualar-se.

Para demonstrar que a ligação realçada de amostras de TRU-016 tratado com CS para CD16 não foi em parte devido a ligação realçado das moléculas para CD37, o ensaio acima foi repetido exceto aquele após a adição e incubação de amostras TRU-016 tratadas ou não tratados na placa de ensaio, TRU-016 não é removida da cavidade por centrifugação a 250 χ g durante 3 minutos a 15 0C1 removendo o sobrenadante e em seguida lavado 3 vezes com 200 //L/ cavidades de FACS Buffer. As células são em seguida incubadas com um anticorpo específico de Fc de IgG de cabra anti-humana de conjugadas por FITC (Caltag H10501). Este anticorpo deve ligar-se à região Fc de cadeia IgG humana de TRU-016 ligado as células. O anticorpo é diluído a 1:50 em FACS buffer e 100 μΙ_ é adicionado a cada cavi- dade. A placa é incubada a 4 0C no escuro durante 45 minutos. Qualquer anticorpo rotulado por FITC não ligado é removido por adição de 100 μί. de FACS buffer a cava cavidade, cen- trifugação a 250 χ g durante 3 minutos a 15 0C seguido por remoção de sobrenadante. Isto é seguido por uma segunda lavagem com FACS buffer de 200 μΙ_/ cavidades. As células são re-suspensas com 200 yt/l_/cavidade de 2% de paraformaldeído e armazenadas a 4 0C duran- te a noite. Cada fluorescência ligado da amsotra é medida no sistema de citometria de fluxo de BD FACSCaIibur e analisada empregando o software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, ver 5.2). A intensidade de fluorescência de GeoMean para cada amostra é plotada relativa a concentração de TRU-016. Uma curva de resposta a dose é gerado e ajustada a uma curva logística de 4 parâmetros (4-PL) empregadndo o software SoftMax Pro (Molecular Devices, ver 5.0.1). As titulações de TRU-016 são utilizadas para criar uma curva de resposta a dose do controle não tratado e amostras tratados com CS para comparação.

Como mostra a Figura 19, as curvas de ligação de resposta a dose para células ex- pressando CD37 para todas as amostras tratadas com CS foram essencialmente idênticas para cada uma outra e ára a amostra TRU-016 não tratada, indicando que o tratamento com CS não alteraria a ligação de TRU-016 a seu antígeno alvo específico.

Exemplo 10

Ensaio de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo (ADCC)

Os experimentos foram realizados para determinar o efeito da concentração de cas- tanospermina na atividade funcional de TRU-016 como medida pela atividade de ADCC.

TRU-016 produzido como descritos no Exemplo 8 é incubado com a linhagem de célula B de câncer Daudi expressando CD37 em conjunção com células efetoras linfócitos de snague periférico humano primário (PBL's) para avaliar a atividade de ADCC.

As células Daudi alvo (5 χ 10*6) são adicionadas a um tubo cônio de 15 ml e em seguida centrifugada a 250 χ g durante 5 minutos a 20°C e o sobrenadante removido. O pé- Iete de células é re-suspenso pela adição de 0,3 mCi de Cromo-51 (51Cr, GE Healthcare, CJ51). As células são incubadas durante 75 minutos a 37°C com 5% de CO2, permitindo as células incorporar o isótopo radioativo. As células são em seguida lavadas três vezes para remover qualquer 51Cr não incorporado. É feito por adição de 10 mL de meio completo - IMDM (Gibco) com 10% de FBS (Gibco) - para o tubo, centrifugando a 250 χ g durante 5 minutos a 20°C seguido por remoção do sobrenadante. A re-suspensão final é em 11,5 mL do meio completo. TRU-016 é diluído em meio completo, em concentrações que são capa- zes de gerar máximo para níveis antecedentes de Iise celular (500 ng/mL - 0,005 ng/mL). Estas titulações sãosemeadas, 50 μΙ_/ cavidades, um placa de 96 cavidades de fundo re- dondo. As células alvo rotuladas 51Cr são adicionada a titulações de dose de TRU-016 em 50 //L/ cavidades e as cavidades de controle (meio de controle sem TRU-016). PBL's são isoladas do sangue total heparinizado fresco por centrifugação gradiente de densidade em- pregando Lymphocyte Separation Media como por protocolo (LSM, MP Biomedical, 50494/36427). As células efetores PBL são adicionadas, 100 //L/ cavidades, para as cavida- des em uma relação entre 25:1-30:1 (efetor: alvo). O ensaio é incubado durante 4,5 - 5 ho- ras em 37°C, 5% de CO2. As células efetoras Iise os células alvo relativas a concentração de TRU-016, realçando uma quantidade proporcional de 51Cr no ensaio sobrenadante. Seguin- te a incubação a placa é centrifugada a 250 χ g durante 3 minutos a 20 °C. Um volume de //L de sobrenadante livre de célula é removida de todas as cavidades para uma placa de cintilação (Perkin Elmer 6005185) e seco durante a noite. A quantidade de isotopo de 51Cr em cada cavidade da placa de cintilação é medida empregando uma placa leitora Topcount (Perkin Elmer1 C9904VO). Os dados são expressadas como percentagem da liberação es- pecífica. A liberação específica é calculada como:

(Valor da amostra - valor espontâneo) / (Valor máximo - Valor Espontâneo) * 100% Espontânea = quantidade de 51Cr liberado por célula alvo apenas Liberação máxima = quantidade de 51Cr liberada por alvos tratados com agente de Iise de detergente

Controle de antecedentes = quantidade de 51Cr liberada por células alvo + células efetoras (No TRU-016)

Uma resposta a dose é gerada e ajusta-se a uma curva logística de 4 parâmetros empregando software SoftMax Pro (Molecular Devices, ver 5.0.1). As titulações de TRU-016 são utilizadas para gerar curvas de resposta a dose de teste e de material de referência para comparação. Os valores de EC50 para os artigos tratados são comparados ao controle não tratado (nenhum CS) para determinar a porcentagem do aumento na atividade de ADCC. A Tabela abaixo resume os dados exibidos na Figura 20. Os dados indicam que a atividade de ADCC de TRU-016, tratada com CS sobre uma faixa de 100 μΜ - 800 μΜ de concentração final, é significantemente aumentada relativa a TRU-016 não tratado. Tabela 3 ID da amostra Doador de Q elevado 1:17 Doador N baixo 1:17 Doador de AF Heterozigoto 1:25 Doador de AF Heterozigoto 1:13 CS de Controle 0//M 1,24 2,60 0,23 0,37 CS de 100//M 0,25 (502%) 0,70 (370%) 0,03 (728%) n/a CS de 200//M 0,21 (589%) 0,54 (479%) n/a 0,06 (579%) CSde 400μΜ 0,24 (515%) 0,53 (492%) n/a 0,08 (440%) CS de 800//M 0,25 (492%) 0,63 (414%) n/a 0,08 (451%) Relação :X = Alvo para Efetores (PBMC recentemente isolado do sangue total)

Doadores são homozigoto de alta afinidade (High), homozigoto de baixa afinidade (Low), ou Heterozigoto para alelo CD16.

Ao mesmo tempo que as composições e métodos desta invenção foram descritos nos termos dos exemplares descritos acima, deve ser aparente para aqueles de versatilida- de na técnica que as variações podem ser aplicadas às composições e/ ou métodos e nas etapas ou na seqüência das etapas do método descrito aqui sem afastar-se do coneito, espítio e escopo da invenção. Mais especificamente, deve ser aparente que certos agentes os quais são ambos quimicamente e ficiologicamente relacionado podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmo tempo que o mesmo ou resultado similar seria obti- do. Todos tais substitutos similares e modificações aparentes para aqueles versados na téc- nica são julgados no espírito, escopo e conceita da invenção como descrito pela reivindica- ções anexas.

As referências citadas aqui através de, para a extensão que fornece exemplares suplementares detalhados para aqueles apresentados aqui, são todos especificamente in- corporado aqui por referência.

Claims

1. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que aumenta a citoxidade dependente de anticorpo (ADCC) de moléculas de imunoglicoproteínas produzidas por uma célula hos- pedeira, compreendendo a etapa de: desenvolvimento da referida célula hospedeira em um volume de pelo menos 1 litro do meio de cultura compreendendo castanospermina em uma concentração entre cerca de25 e cerca de 800 μΜ que aumenta a ADCC das moléculas de imunoglicoproteínas produ- zidos pela referida célula hospedeira.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a ADCC é aumentada pelo menos 2 vezes.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a ADCC é aumentada pelo menos 5 vezes.

4. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que aumenta a ligação CD16 das molé- culas de imunoglicoproteínas produzidas por uma célula hospedeira, compreendendo a eta- pa de: desenvolvimento da referida célula hospedeira em um volume de pelo menos 1 litro do meio de cultura compreendendo castanospermina em uma concentração entre cerca de25 e cerca de 800 μΜ que aumenta a ligação CD16 das moléculas de imunoglicoproteínas produzidas pela referida célula hospedeira.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação CD16 é aumentada em pelo menos 50%.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação CD16 é aumentada pelo menos 2 vezes (200%).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de produção de imunoglicoproteína no meio de cultura é pelo menos 100//g/mL.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que a castanospermina está presente em uma concentra- ção entre cerca de 100 a 400 μΜ.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de cultura é essencialmente sem soro.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de que as células hospedeiras são cultivados em uma cultura de batelada de alimento.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de que as células hospedeiras são cultivadas em uma cultura de alimento continuamente.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de cultura compreende um segundo modificador de carboidrato.

13. Composição compreendendo moléculas de imunoglicoproteínas produzidas pe- Io processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-12, CARACTERIZADA pelo fato de ser um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável estéril.

14. Método de neutralização ou inibição do crescimento das células de câncer compreendendo a etapa de administrar à um paciente a composição, de acordo com a rei- vindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer expressam em sua superfície uma molécula ligada pelas referidas moléculas de imunoglicoproteínas.

15. Método de depleção de células compreendendo a etapa de administrar à um paciente a composição, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que as células esvaziadas expressam em sua superfície uma molécula ligada pelas referi- das moléculas de imunoglicoproteínas.