JP2024504454A - 抗体－薬物コンジュゲート及びその医学的使用 - Google Patents

抗体－薬物コンジュゲート及びその医学的使用 Download PDF

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Abstract

抗BCMA抗体-薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒化合物、及びその医学的使用。具体的には、抗体-薬物コンジュゲートは、リンカーを使用することによって抗BCMA抗体又はその抗原結合断片とエキサテカン誘導体とを接続させることによって形成し、抗体-薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒化合物は有意な抗腫瘍効果及び良好な安全性を有する。

Description

本出願は、2021年1月29日に出願の特許出願第202110123809.3号の優先権を主張するものである。
本開示は、バイオ医薬の分野に関し、より詳細には、本開示は、抗BCMA抗体薬物コンジュゲート及びその医学的使用に関する。
B細胞は、適応液性免疫及び抗原を特異的に認識する抗体の産生において重要な役割を果たすリンパ球である。B細胞の3つの亜型は、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びプラズマ細胞である。VDJ組換えの過程中に、ゲノムライブラリから選択されるDNAの2つ又は3つの断片が組み換えられて、抗体可変ドメインのコンビナトリアルアレイが生じ、それにより、様々な系統のB細胞によってコードされている可変ドメインを更に改変させることによって最大で109個のユニークなB細胞系列が作製され、その結果、ユニークな標的に特異的な抗体がもたらされる。B細胞は多くの疾患に関与している。B細胞の悪性形質転換は、多発性骨髄腫及びホジキンリンパ腫等の一部のリンパ腫を含めた癌をもたらす。B細胞はまた、全身性エリテマトーデス(SLE)及びIgA腎症を含めた自己免疫疾患にも関与している。B細胞関連癌及び自己免疫疾患は、B細胞機能の異常とみなすことができ、したがって、そのような疾患を制御するための可能性のある一戦略は、病的B細胞を標的とする抗体を使用することである。
BCMAは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーであり、リガンドBAFF(B細胞活性化因子)及びAPRIL(増殖誘導性リガンド)の非グリコシル化内在性膜受容体である。BCMA及びその対応するリガンドは、液性免疫、B細胞発生、及び恒常性の様々な機能を調節することができる。BCMAは、扁桃腺メモリーB細胞及び胚中心B細胞によって発現され、脾臓、リンパ節、胸腺、副腎、及び肝臓において検出され、B細胞系列の様々な分析により、BCMAの発現レベルが成熟後に増加することが示されている。
J. Biol. Chem、243、3558頁(1968) Holliger及びHudson、2005、Nat. Biotechnol. 23: 1126～1136 Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、第5～8章及び第15章 ImmunoGeneTics (IMGT) ウェブサイト http://imgt.cines.fr The Immunoglobulin FactsBook、2001ISBN012441351 Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor
本開示の目的は、一般式(I)の抗体-薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物:
[式中、
Wは、-(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-であり、
Re又はRfは、独立して、水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、好ましくは、Re又はRfは、独立して、水素、重水素からなる群から選択され、より好ましくは、Re又はRfは水素であり、
X1又はX2は、独立して、N、H、O、及びSからなる群から選択され、好ましくは、X1又はX2は、独立してSから選択され、より好ましくは、X1又はX2は、独立してOから選択され、
g、u、又はhは、独立して、1、2、3、及び4からなる群から選択され、好ましくは、g、u、又はhは、独立して、1、2、3から選択され、より好ましくは、g、u、又はhは2であり、
yは1～20であり、好ましくは、yは4～10であり、より好ましくは、yは、4、6、8、又は10であり、
Abは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片である]
を提供することである。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、それぞれ配列番号3、配列番号4、及び配列番号5に記載のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号6、配列番号7、及び配列番号8に記載のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4、又はその変異体に由来する重鎖定常領域を更に含む。
好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4に由来する重鎖定常領域を更に含む。
より好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸突然変異後に増強されたADCC毒性を有するIgG1重鎖定常領域を更に含む、或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号22に示す重鎖定常領域を更に含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、ヒトκ鎖、λ鎖、又はその変異体に由来する軽鎖定常領域を更に含み、好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、ヒトκ鎖に由来する軽鎖定常領域を更に含み、より好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号23に示す軽鎖定常領域を更に含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11からなる群から選択される重鎖可変領域、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する重鎖可変領域を含む、
並びに/或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号12、配列番号13、及び配列番号14からなる群から選択される軽鎖可変領域、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される重鎖、又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する重鎖を含む、
並びに/或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片は、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20からなる群から選択される軽鎖、又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する軽鎖を含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号9に示す重鎖可変領域及び配列番号12に示す軽鎖可変領域を含む、又は
抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号10に示す重鎖可変領域及び配列番号13に示す軽鎖可変領域を含む、又は
抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号11に示す重鎖可変領域及び配列番号14に示す軽鎖可変領域を含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗BCMA抗体は、配列番号15に示す重鎖及び配列番号18に示す軽鎖を含む、又は
抗BCMA抗体は、配列番号16に示す重鎖及び配列番号19に示す軽鎖を含む、又は
抗BCMA抗体は、配列番号17に示す重鎖及び配列番号20に示す軽鎖を含む。
本開示の好ましい実施形態では、抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、一般式(II)に示した通り、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、若しくは混合物の形態である:
[式中、Abは、上記定義した抗BCMA抗体又は抗原結合断片であり、
yは、2～10から選択される数、好ましくは4～10から選択される数、より好ましくは4、6、8、又は10である]。
本開示の好ましい実施形態では、抗体薬物コンジュゲート又は薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、一般式(III)に示した通り、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である:
[式中、Abは、上記定義した抗BCMA抗体又は抗原結合断片であり、
yは、2～10から選択される数、好ましくは4～10から選択される数、より好ましくは4、6、8、又は10である]。
本開示の好ましい実施形態では、抗体薬物コンジュゲート又は薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、以下の構造からなる群から選択される:
[式中、yは、2～10から選択される数、好ましくは4～10から選択される数、より好ましくは4、6、8、又は10である]。
本開示はまた、以下の工程を含む、一般式(I)の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法も提供する:
Abを還元した後、これを一般式(F)とのカップリング反応に供して一般式(I)の化合物を得る工程
[式中、Wは、上記定義した通りであり、
Abは、上記定義した抗BCMA抗体又は抗原結合断片であり、
yは、1～20から選択される数、好ましくは4～10から選択される数、より好ましくは4、6、8、又は10である]。
別の態様では、本開示は、上述の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物と、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む、医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、BCMAに媒介される疾患又は状態を処置又は防止するための医薬の調製における、上述の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、或いは上述の医薬組成物の使用に関する。
好ましい実施形態では、BCMAに媒介される疾患又は状態は癌又は自己免疫疾患であり、癌は、好ましくはBCMAを発現する癌、より好ましくはリンパ腫、白血病、又は骨髄腫であり、自己免疫疾患は、好ましくは、エリテマトーデス、IgA腎症、及びリウマチ性関節炎からなる群から選択される。
本開示の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、有意な抗腫瘍効果及び良好な安全性を有しており、良好なin vivo代謝活性、長いin vivo薬物持続性、及び臨床応用において幅広い見通しを有している。
用語
本開示の理解をより容易にするために、特定の技術用語及び科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所に明確に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての他の技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示において使用するアミノ酸の三文字コード及び一文字コードは、J. Biol. Chem、243、3558頁(1968)によって記載されている。
本開示中に記載する用語「抗体」とは、鎖間ジスルフィド結合によって連結された2本の同一の重鎖及び2本の同一の軽鎖からなるテトラペプチド鎖構造である、免疫グロブリンをいう。免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸組成及び配置順序は異なるため、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのアイソタイプとしても知られる5つの型、すなわち、IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEへと分類することができ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、及びε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置の相違に応じて、同じ型のIgを異なるサブクラスへと分類することができる。たとえば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4へと分類することができる。軽鎖は、定常領域の相違に応じてκ鎖又はλ鎖へと分類される。Igの5つの型のそれぞれがκ鎖又はλ鎖を有することができる。
本開示では、本開示による抗体軽鎖は、ヒト又はマウスのκ、λ鎖、又はその変異体を含む軽鎖定常領域を更に含むことができる。
本開示では、本開示による抗体重鎖は、ヒト又はマウスのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、又はその変異体を含む重鎖定常領域を更に含むことができる。
抗体重鎖及び軽鎖のN末端付近の約110個のアミノ酸の配列は大きく変動し、可変領域(V領域)である。C末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定しており、定常領域(C領域)である。可変領域は、3つの超可変領域(HVR)及び比較的保存的な配列を有する4つのフレームワーク領域(FR)を含む。3つの超可変領域が抗体の特異性を決定し、これらは相補性決定領域(CDR)としても知られる。軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)のそれぞれは、3つのCDR領域及び4つのFR領域からなる。アミノ末端からカルボキシル末端への配置の順序は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4である。軽鎖の3つのCDR領域は、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3をいい、重鎖の3つのCDR領域は、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3をいう。本開示による抗体又は抗原結合断片のVL領域及びVH領域中のCDRアミノ酸残基の数及び位置は、既知のカバット付番基準及びカバット、AbM、又はIMGTの定義基準に従う(http://bioinf.org.uk/abs/)。
用語「抗原提示細胞」又は「APC」とは、その表面でMHCと複合体形成した外来抗原を提示する細胞である。T細胞は、そのような複合体を認識するためにT細胞受容体(TCR)を利用する。APCの例としては、それだけには限定されないが、樹状細胞(DC)、末梢血単核球(PBMC)、単球、Bリンパ芽球、及び単球由来樹状細胞が挙げられる。
用語「抗原提示」とは、APCによって抗原を捕捉し、それらがT細胞によって、たとえばMHC-I/MHC-IIコンジュゲートの成分として認識されることを可能にするプロセスをいう。
用語「BCMA」とは、細胞によって天然に発現されるBCMAの任意の変異体又はアイソフォームを含む。本開示の抗体は、非ヒト種に由来するBCMAと交差反応することができる。或いは、抗体はヒトBCMAに特異的であることもでき、他の種と交差反応性を示さない場合がある。BCMA又はその任意の変異体若しくはアイソフォームは、それを天然に発現する細胞若しくは組織から単離する、又は、当分野において一般的に使用されている技法及び本明細書中に記載されているものを使用して、組換え技法によって生成することができる。好ましくは、抗BCMA抗体は、正常なグリコシル化パターンを有するヒトBCMAを標的とする。
用語「組換えヒト抗体」とは、以下のもの等の、組換え方法によって調製、発現、作製、又は単離したヒト抗体を含み、関与する技法及び方法は当分野で周知である:
1.ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック及びトランス染色体動物(たとえばマウス)、又はそれから調製したハイブリドーマから単離した抗体、
2.トランスフェクトーマ等の、抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞から単離した抗体、
3.組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離した抗体、並びに
4.他のDNA配列を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングすること等の方法によって調製、発現、作製、又は単離した抗体。
そのような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされている特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する、可変領域及び定常領域を含むが、抗体成熟中に起こるもの等の、後の再編成及び突然変異も含む。
本開示中における用語「マウス抗体」とは、当分野における知識及び技術に従って調製した、ヒトBCMAに対するモノクローナル抗体である。調製中、試験対象にBCMA抗原を注射し、その後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい実施形態では、マウスBCMA抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含み得る、或いは、マウスIgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4、又はその変異体の重鎖定常領域を更に含み得る。
用語「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る(in vitroランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はin vivoで体細胞突然変異によって導入された突然変異等)。しかし、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種(マウス等)の生殖系列に由来するCDR配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体(すなわち「ヒト化抗体」)を含まない。
用語「ヒト化抗体」とは、CDR移植抗体としても知られ、マウスCDR配列をヒト抗体可変領域のフレームワーク内に移植することによって生成した抗体をいう。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘導される、強力な免疫応答の弱点を克服することができる。免疫原性の減少によって引き起こされる活性の減少を回避するために、ヒト抗体可変領域を最小限の逆突然変異に供して活性を維持することができる。
用語「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、マウス抗体によって誘導される免疫応答を緩和させることができる。キメラ抗体を確立することは、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、その後、マウスハイブリドーマ細胞からの可変領域遺伝子をクローニングし、その後、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結させてキメラ遺伝子を形成し、これをヒト発現ベクター内に挿入し、最後に、キメラ抗体分子を真核生物の工業用システム又は原核生物の工業用システムにおいて発現させることを必要とする。ヒト抗体定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4、又はその変異体の重鎖定常領域、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4の重鎖定常領域、或いはアミノ酸突然変異後に増強されたADCC(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害)を有するIgG1重鎖定常領域から選択することができる。
用語「抗原結合断片」とは、抗体及び抗体類似体の抗原結合断片をいい、通常は、親抗体の抗原結合領域又は可変領域の少なくとも一部(たとえば1つ又は複数のCDR)を含む。抗体断片は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。一般に、活性をモルベースで表す場合、抗体断片は親結合活性の少なくとも10%を保持する。好ましくは、抗体断片は、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも20%、50%、70%、80%、90%、95%、若しくは100%、又はそれより高くを保持する。抗原結合断片の例としては、それだけには限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、直鎖状抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、及び多特異性抗体が挙げられる。操作した抗体変異体は、Holliger及びHudson、2005、Nat. Biotechnol. 23: 1126～1136中に総説されている。
「Fab断片」は、1本の軽鎖と1本の重鎖のCH1及び可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Fc」領域は、CH2及びCH3ドメインを含む2つの抗体重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合によって及びCH3ドメインの疎水性相互作用を通じて、一緒に保たれている。
「Fab'断片」は、2つのFab'断片の2本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成され、それによってF(ab')2分子が形成され得るように、軽鎖と、VHドメイン、CH1ドメイン、及びCH1とCH2ドメインの間の領域を含む重鎖の一部とを含む。
「F(ab')2断片」は、2本の軽鎖と、CH1とCH2ドメインの間の定常領域の一部を含む2本の重鎖とを含み、それによって、2本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、F(ab')2断片は、2本の重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保たれる2つのFab'断片からなる。
「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
用語「多特異性抗体」とは、その最も広い意味で使用され、複数のエピトープに対する特異性を有する抗体を包含する。これらの多特異性抗体としては、それだけには限定されないが、重鎖可変領域VH及び軽鎖可変領域VLを含み、VH-VL単位が複数のエピトープに対して特異性を有する抗体、2つ以上のVL及びVH領域を有し、それぞれのVH-VL単位が同じ標的の異なる標的又は異なるエピトープと結合する抗体、2つ以上の単一可変領域を有し、それぞれの単一可変領域が同じ標的の異なる標的又は異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、ジアボディ、二重特異性ジアボディ及びトリアボディ、共有結合又は非共有結合した抗体断片等が挙げられる。
用語「単鎖抗体」とは、抗体の重鎖可変領域VHと軽鎖可変領域VLを、リンカーペプチドを通じて連結することによって形成される、単鎖組換えタンパク質である。これは、完全な抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。
用語「ドメイン抗体断片」とは、免疫学的機能を有する免疫グロブリン断片であり、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のどちらかを含む。一部の事例では、2つ以上のVH領域がペプチドリンカーによって共有結合されて二価ドメイン抗体断片を形成する。二価ドメイン抗体断片の2つのVH領域は、同じ抗原又は異なる抗原を標的とすることができる。
本開示中における用語「BCMAと結合する」とは、ヒトBCMAと相互作用することができることをいう。
本開示中における用語「抗原結合部位」とは、本開示の抗体又は抗原結合断片によって認識される三次元の部位をいう。
用語「エピトープ」とは、免疫グロブリン又は抗体と特異的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、隣接アミノ酸、又はタンパク質の三次の折り畳みが原因で並置されている非隣接アミノ酸によって形成することができる。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、通常は、変性溶媒への曝露後に維持される一方で、三次の折り畳みによって形成されるエピトープは、通常は、変性溶媒を用いた処理後に失われる。エピトープは、通常は、ユニークな空間的コンホメーションの少なくとも3～15個のアミノ酸を含む。どのエピトープが所定の抗体と結合しているかを決定する方法は、免疫ブロッティング、免疫沈降検出分析等を含めて、当分野で周知である。エピトープの空間的コンホメーションを決定する方法としては、当分野における技法及び本明細書中に記載の技法、たとえば、X線結晶分析、二次元核磁気共鳴等が挙げられる。
本開示において使用する用語「特異的に結合する」及び「選択的に結合する」とは、抗体の、事前に決定された抗原上のエピトープに対する結合をいう。一般に、組換えヒトBCMAを分析物として使用し、抗体をリガンドとして使用する場合、装置において表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって測定する際、抗体は、事前に決定された抗原と、約10-7M未満又は更に低い平衡解離定数(KD)で結合し、事前に決定された抗原に対するその結合親和性は、事前に決定された抗原又は密に関連する抗原以外の非特異的抗原(BSA等等)に対するその結合親和性の少なくとも2倍高い。本明細書中において、用語「抗原を認識する抗体」は、用語「と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用することができる。
用語「交差反応」とは、本開示の抗体の、異なる種に由来するBCMAと結合する能力をいう。たとえば、ヒトBCMAと結合する本開示の抗体は、別の種のBCMAとも結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ(たとえばSPR及びELISA)において、精製した抗原との特異的反応性、又はBCMAを生理的に発現する細胞との結合若しくは機能的相互作用を検出することによって、測定する。交差反応性を決定する方法としては、本明細書中に記載の標準の結合アッセイ、たとえば、表面プラズモン共鳴(SPR)分析又はフローサイトメトリーが挙げられる。
用語「阻害」又は「遮断」とは、互換性があるように使用することができ、部分的及び完全な阻害/遮断をどちらも包含する。リガンドの阻害/遮断は、好ましくは、阻害又は遮断なしにリガンド結合が起こる場合に起こる、正常なレベル又は活性の種類を低下又は変更させる。阻害及び遮断はまた、抗BCMA抗体と接触させないリガンドと比較して、抗BCMA抗体と接触させた場合のリガンドの結合親和性の任意の測定可能な低下も含むことを意図する。
用語(たとえば細胞の)「成長の阻害」とは、細胞成長の任意の測定可能な低下を含むことを意図する。
用語「誘導された免疫応答」及び「増強された免疫応答」とは、互換性があるように使用することができ、特異的な抗原によって刺激された(すなわち受動又は適応)免疫応答をいう。CDC又はADCCを誘導することにおける用語「誘導する」とは、特異的な直接細胞死滅機構を刺激することをいう。
本開示中における「ADCC」、すなわち抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とは、Fc受容体を発現する細胞が、抗体のFcセグメントを認識することによって、抗体をコーティングした標的細胞を直接死滅させることを意味する。抗体のADCC機能は、IgGのFcセグメントを修飾することによって増強させる、低下させる、又は排除することができる。修飾とは、抗体の重鎖定常領域中の突然変異をいう。
抗体及び抗原結合断片を生成及び精製する方法は周知であり、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、第5～8章及び第15章等の従来技術中に見つけることができる。たとえば、マウスをヒトBCMA又はその断片で免疫化することができ、得られた抗体を再生及び精製し、慣用方法を使用することによってアミノ酸配列決定に供することができる。また、抗原結合断片も、慣用方法を使用して調製することができる。本発明の抗体又は抗原結合断片を遺伝子操作して、1つ又は複数のヒトFR領域を非ヒトCDR領域に付加する。ヒトFR生殖系列配列は、ImmunoGeneTics (IMGT) ウェブサイト http://imgt.cines.frから、又はThe Immunoglobulin FactsBook、2001ISBN012441351から得ることができる。
本開示の操作した抗体又は抗原結合断片は、慣用方法によって調製及び精製することができる。対応する抗体のcDNA配列をクローニングし、GS発現ベクター内に組み換えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、CHO細胞に安定に形質移入することができる。より推奨される従来技術として、哺乳動物発現系は、特にFc領域の高度に保存的なN末端において、抗体のグリコシル化をもたらすことができる。ヒト抗原と特異的に結合する抗体を発現することによって安定クローンが得られる。陽性クローンをバイオリアクターの無血清培地中において拡大して、抗体を生成する。抗体がそれ内に分泌された培養液は、慣用技術によって精製及び収集することができる。抗体は、慣用方法によって濾過及び濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体も、慣用方法、たとえば分子ふるい及びイオン交換によって除去することができる。生じる生成物は、即座にたとえば-70℃で凍結する、又は凍結乾燥する必要がある。
本開示の抗体は、モノクローナル抗体をいう。本開示におけるモノクローナル抗体(mAb)は、真核生物、原核生物、又はファージのクローニングした細胞株に限定されない単一のクローニングした細胞株から得られた抗体をいう。モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、たとえば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術(CDR移植等)、又は他の既存の技術を使用して、組換えによって得ることができる。
「投与すること」、「与えること」、及び「処置すること」とは、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、又は生体液に適用した場合、外因性の医薬、治療剤、診断用薬剤、又は組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、又は生体液と接触させることをいう。「投与すること」、「与えること」、及び「処置すること」とは、たとえば、処置、薬物動態学、診断的、研究、及び実験の方法をいうことができる。細胞を処置することは、試薬を細胞と接触させること、及び試薬を液体と接触させ、液体が細胞と接触していることを含む。また、「投与すること」、「与えること」、及び「処置すること」とは、たとえば、細胞を、試薬、診断用薬剤、結合組成物、又は別の細胞と、in vitro及びex vivoで処置することもいう。「処置すること」とは、ヒト、獣医学、又は研究の対象に適用した場合、治療的、防止的、又は予防的な手段、研究、及び診断的応用をいう。
「処置」とは、内用又は外用治療剤、たとえば本開示の抗体のうちの任意の1つを含むものを、治療剤がそれに対して治療効果を有することが知られている1つ又は複数の疾患症状を有する患者に与えることをいう。一般に、治療剤は、処置した対象又は集団において1つ又は複数の疾患症状を緩和させるために有効な量で、任意の臨床的に測定可能な程度までそのような症状の回帰を誘導するため、又はそのような症状の発生を阻害するためのいずれかで与える。任意の具体的な疾患症状を緩和させるために有効な治療剤の量(「治療上有効な量」とも呼ばれる)は、様々な要因、たとえば、患者の病状、年齢、及び体重、並びに患者において所望の治療効果を生じる薬物の能力に応じて変動する場合がある。疾患症状が緩和されたかどうかは、医師又は他の保健医療の専門家によって症状の重篤度又は進行を評価するために一般的に使用されている、任意の臨床試験方法によって評価することができる。本開示の実施形態(たとえば処置方法又は生成物)は、それぞれの目的の疾患症状を緩和させることにおいて無効である場合があるが、これらは、スチューデントt検定、カイ二乗検定、マンホイットニーのU検定、クルスカル-ワリス検定(H検定)、ヨンキー-テルプストラ検定、及びウィルコクソン検定等の当分野で知られている任意の統計的検定方法によって決定される、統計的に有意な数の患者において目的の疾患症状を低下させるはずである。
明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用する用語「から本質的になる」又はその変形は、記載したすべての要素又は要素群を含み、所定の投薬レジメン、方法、又は組成物の基本的又は新しい特性を顕著に変化させない、記載した要素と性質が類似する又は異なる他の要素を任意選択で含むことを意味する。
本開示の特定の物体に適用する用語「天然に存在する」とは、その物体を自然で見つけることができるという事実をいう。たとえば、天然源から単離することができ、実験室において意図的に人工的に修飾されていない、生物(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「有効量」は、症状又は病状の状態を寛解させる又は防止するために十分な量を含む。有効量はまた、診断を可能又は容易にするために十分な量もいう。特定の患者又は獣医学的対象における有効量は、処置する状態、患者の全体的な健康状態、薬物投与の方法、経路、及び用量、並びに副作用の重篤度等の要因に応じて変動する場合がある。有効量は、顕著な副作用又は毒性効果を回避する最大の用量又は投薬レジメンであることができる。
「外因性」とは、背景に応じて生物、細胞、又は人体の外部で生成される物質をいう。
「内在性」とは、背景に応じて細胞、生物、又は人体の内部で生成される物質をいう。
「同一性」とは、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド間の配列類似度をいう。アラインメントした2つの配列中の位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットによって占有されている場合、たとえば2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有されている場合、分子はその位置で相同的である。2つの配列間の同一性の百分率は、2つの配列によって共有される一致する又は相同的な位置の数を比較する位置の数で除算した関数×100%である。たとえば、最適配列アラインメントでは、2つの配列中の10個のうち6個の位置が一致又は相同的である場合、2つの配列は60%相同的である。一般に、アラインメントは、最大の同一性の百分率が得られるように2つの配列をアライメントした際に成る。
本明細書中で使用する表現「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」は、互換性があるように使用することができ、すべてのそのような名称はその子孫を含む。したがって、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代試験細胞及び継代数にかかわらずそれに由来する培養物を含む。また、意図的又は意図的でない突然変異が原因で、すべての子孫がDNA内容(DNA content)に関して全く同じとなることはできないことも理解されたい。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。別の名称に言及する場合は、コンテキストから明確に見ることができる。
「任意選択の」又は「任意選択で」とは、続いて記載する事象又は状況が起こることができるが、必ずしも起こらないことを意味し、この記載は、事象又は状況が起こる事例又は起こらない事例を含む。たとえば、「任意選択で1～3個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在することができるが、存在する必要はないことを意味する。
「医薬組成物」とは、本明細書中に記載の抗体又は抗原結合断片のうちの1つ又は複数、並びに生理的/薬学的に許容される担体及び賦形剤等の他の成分を含むことを意味する。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることであり、これは、生物活性を示すために活性成分の吸収に貢献することである。
用語「薬学的塩」とは、本開示の抗体薬物コンジュゲートの塩をいう。そのような塩は、哺乳動物において使用した場合に安全かつ有効であり、所要の生物活性を保有する。本開示のリガンド薬物コンジュゲートは、1つのアミノ基を少なくとも含み、したがって酸と塩を形成し得る。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩(hydrophosphate)、リン酸二水素塩(dihydrophosphate)、サリチル酸塩、クエン酸水素塩(hydrocitrate)、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、及びp-トルエンスルホン酸塩が挙げられる。
用語「溶媒和物」とは、本開示の抗体-薬物コンジュゲート化合物と1つ又は複数の溶媒分子とによって形成された、薬学的に許容される溶媒和物をいう。溶媒分子の非限定的な例としては、水、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、酢酸エチルが挙げられる。
用語「細胞毒性薬物」とは、本開示において使用する場合、細胞の機能を阻害する及び/又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質をいう。
「チューブリン阻害剤」とは、チューブリンの重合を阻害する又はチューブリンの凝集を促進することによって細胞有糸分裂のプロセスに干渉し、それによって抗腫瘍効果を発揮する化合物のクラスをいう。その非限定的な例としては、メイタンシノイド、カリチアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、ドラスタチン/アウリスタチン/モノメチルアウリスタチンE(MMAE)/モノメチルアウリスタチンF(MMAF)が挙げられる。
「リンカー」とは、それによって抗体が薬物の共有結合又は原子鎖と共有結合している化学的部分をいう。リンカーの非限定的な例としては、アリーレン、ヘテロアリーレン、PEG、ポリメチレンオキシ、スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート、及びカプロアミドが挙げられる。
「薬物負荷」(DAR)はyによって表され、これは、式(A)中における、抗体1個あたりの細胞毒性薬物の平均数である。本発明における薬物負荷の範囲は、抗体1個あたり1～20個の細胞毒性薬物(D)であることができる。一般式(A)の抗体-薬物コンジュゲートは、特定の範囲(1～20)の細胞毒性薬物とコンジュゲートした抗体のコレクションである。カップリング反応からの抗体-薬物コンジュゲート中の薬物負荷(DAR)は、慣用の手段、たとえば、質量分析、HPLC、及びELISAによって特徴づけることができる。これらの手段によって、y値に対する抗体-薬物コンジュゲートの定量的分布を決定することができる。
本開示はまた、様々な重水素化形態の式(I)の化合物も含む。炭素原子に付着した利用可能な水素原子のそれぞれを、独立して重水素原子によって置き換えることができる。当業者は、関連文献を参照して、式(I)の化合物を重水素化形態で合成することができる。重水素化形態の式(I)の化合物は、市販の重水素化原材料を用いることによって調製することができる、又は、これらを、それだけには限定されないが、重水素化ボラン、テトラヒドロフラン中の三重水素化ボラン、重水素化水素化アルミニウムリチウム、重水素化ヨードエタン、重水素化ヨードメタン等を含めた重水素化試薬を用いた慣用技術によって合成することができる。
用語「医薬組成物」とは、本明細書中に記載の化合物のうちの1つ若しくは複数又はその生理的/薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと他の化学的成分と、生理的/薬学的に許容される担体及び賦形剤等の他の成分との混合物をいう。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることであり、これは、生物活性を示すために活性成分の吸収に貢献することである。慣用の医薬組成物の調製は、中国薬局方中に見つけることができる。
用語「薬学的に許容される塩」又は「薬学的塩」とは、哺乳動物において安全かつ有効であり、所望の生物活性を有する、本開示のリガンド-薬物コンジュゲートの塩又は本開示の化合物の塩をいう。本開示のリガンド-薬物コンジュゲートは少なくとも1つのアミノを含有するため、酸と塩を形成することができる。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素酸塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩が挙げられる。
用語「薬物負荷」とは、式(V)の化合物中のそれぞれの抗体又はその抗原結合断片に対してロードする細胞毒性薬物の平均数をいい、薬物数の抗体数に対する比としても表すことができる。薬物負荷は、リガンド1個あたり0～12個、好ましくは1～10個の細胞毒性薬物(D)の範囲であることができる。本発明の一実施形態では、薬物負荷はyとして表し、DAR値としても知られ、例示的な値は平均で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10であることができる。カップリング反応後のADC分子1個あたりの薬物の平均数は、UV/可視分光分析、質量分析、ELISA試験、及びHPLC等の慣用の同定方法によって決定することができる。
本発明の一実施形態では、細胞毒性薬物は、連結単位を介して、リガンドのN末端アミノ及び/又はリジン残基のε-アミノとコンジュゲートしている。本発明の一実施形態では、細胞毒性薬物は、連結単位を介してリガンドのスルフヒドリル基とコンジュゲートしている。典型的には、カップリング反応において抗体とコンジュゲートする薬物分子の数は、理論的な最大値よりも少なくなる。
以下の非限定的な方法を使用して、リガンド-細胞毒性薬物コンジュゲートのロードを制御することができる:
(1)連結試薬のモノクローナル抗体に対するモル比を制御すること、
(2)反応時間及び温度を制御すること、
(3)反応試薬を選択すること。
本開示の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的塩若しくは溶媒は、有意な抗腫瘍効果及び良好な安全性を有する。
本発明のさらなる説明のために実施例が以下に組み込まれているが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しない。本発明の実施例中において、条件が特定されていない実験方法は、一般に、Antibodies: A Laboratory Manual及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harborのもの等の慣用の条件に従う、又は原材料若しくは生成物の製造者によって推奨される条件に従う。
具体的な条件が示されていない、本開示の実施例中における実験方法は、慣用の条件又は材料若しくは生成物の製造者によって推奨される条件に従って実施した。具体的な供給源が示されていない試薬は、市場で購入した慣用の試薬である。
本開示の既知の原材料は、当分野で知られている方法によって若しくはそれに従って合成することができる、又はJiangsu Aikon社等から購入することができる。以下の表に示す通りである。
(実施例1-1)
化合物aの合成
原材料a-1(4.1g、9.71mmol)及び原材料a-2(4.3g、8.09mmol、4%のアミノ異性体不純物を含有)を250mLの反応ボトルに入れた。DCM(54mL)及びMeOH(18mL)を窒素保護下で加え、攪拌し、0℃まで冷却した。DMTMM(3.6g、12.1mmol)及びトリエチルアミン(2.5g、24.2mmol)を加え、攪拌反応を0℃で1時間維持した。HPLC中央制御により、材料a-2が完全に反応したことが示され、圧力を下げることによって反応液体を乾燥させた(<25℃)。MTBE(120mL)をかき混ぜ液(スラッジ)に加えた。溶液を注ぎ出し、濾過し、120mLのMTBEをスラッジに再度加えてかき混ぜ(固形物)、濾過し、濾過ケークを水(60mL×2)で洗浄し、乾燥させて粗生成物を得て、粗生成物をジクロロメタン及びメタノールに溶かした。2ラウンドの湿カラムクロマトグラフィー(溶出液はDCM:MeOH=40:1～20:1)を行うことによって化合物a(6.2g、7.37mmol)を単離し、99.3%の純度及び91%の収率が得られた。
(実施例1-2)
化合物bの合成
化合物a(5.7g、6.77mmol)を500mlの三口ボトル内に入れ、乾燥THF(114ml)を窒素の保護下で導入し、攪拌して溶解させ、内部温度を約-10℃まで冷却した。DBU(3.09g、20.31mmol)を5分間滴下することによって加え、滴下中、内部温度を-10～-5℃で維持した。滴下後、内部温度を-10～-5℃で維持し、反応は2.5時間持続し、固形物を沈殿させた。
内部温度を-20℃まで冷却し、MTBE(114mL)を加え、期間中、内部温度を-20～-10℃で維持した。生成物を完全に沈殿させ、濾過し、濾過ケークをMTBE(57mL×2)で洗浄した。排出した後、6gの粗化合物bが得られ、後に使用するために-78℃で保管した。
(実施例1-3)
化合物eの合成
化合物c(651mg、1mmol)を10mLのDCMに溶かし、攪拌を氷浴中で開始し、DBU(456mg、3mmol)を滴下によって加えた。反応は氷浴中に1時間後に完了し、化合物d(257mg、1mmol)及びHATU(420mg、1.1mmol)を連続的に加えた。攪拌を氷浴中で30分間行い、LCMSにより、反応が完了したことが示された。反応溶液を25℃で濃縮し、残渣をカラム機器(H2O中のACN、生成物の50%)によって精製して、化合物e、赤褐色固形物、130mgが19%の収率で得られた。
MS:691.3[M+23]。
(実施例1-4)
化合物fの合成
化合物e(130mg、0.19mmol)をDCMに溶かし、アニソール(62mg、0.57mmol)及びジクロロ酢酸(245mg、1.9mmol)を加え、反応を室温で終夜16時間攪拌した。サンプリング、LC-MS中央制御により、原材料が完全に消費されたことが示され、反応を停止させた。反応溶液を25℃で濃縮し、残渣を逆相カラムのカラム機器(ACN/H2O、生成物の30%)によって精製して、化合物f、ピンク色固形物、53mgが54%の収率で得られた。
MS:519.2[M+1]。
(実施例1-5)
化合物dの合成
化合物f(23mg、0.044mmol)及び化合物b(27mg、0.044mmol)をDCM(3mL)及びMeOH(1mL)中に溶かし、窒素保護下で-30℃まで冷却した。DMTMM(20mg、0.067mmol)を加え、反応を-20℃～-10℃の制御された温度で1時間行った。サンプリング、LC-MS中央制御により、原材料が完全に消費されたことが示された。温度を-10℃で維持し、10mLの水を加えて反応を停止させ、層別化による分離のために30mLのDCMを加えた。水性相をDCM/MeOH=10/1(50mL)で抽出した。有機相をプールし、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下、25℃で濃縮した。残渣を精製して(ACN/H2O/0.05%のFA)、化合物d、5.8mg、白色固形物が、HPLCによって12%の収率及び98.87%の純度で得られた。
MS:1120.3[M+1]。
(実施例2)
抗原の調製
Hisタグ付けしたヒトBCMAの細胞外ドメイン(BCMA-His)をコードしているタンパク質は、SinoBiologics社によって合成された(カタログ番号10620-H08H)。
BCMA-Hisの配列:
(実施例3)
マウスハイブリドーマ及び抗体配列の獲得
合計5匹のBalb/c及び5匹のA/J雌の10週齢のマウスを、ヒト抗原BCMA-Hisで免疫化した。Sigma社の完全フロイントアジュバント(CFA)及びSigma社の不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。免疫原及び免疫アジュバントを1:1の比で十分に混合し、乳化させて安定な「油中水」液体を作製した。注射用量は25μg/200μL/マウスであった。
血清力価及び免疫化したマウスの血清の細胞表面抗原と結合する能力は、実施例3による間接ELISA方法を使用して評価した。細胞融合の開始は、力価の検出結果(100,000倍より高い希釈率)に従って決定した。高い血清力価、親和性、及びFACS結合を有する免疫化したマウスを1回の最終免疫化用に選択し、その後、屠殺した。脾臓細胞をSP2/0骨髄腫細胞と融合させ、蒔いて、ハイブリドーマが得られた。目的のハイブリドーマを間接ELISAによってスクリーニングし、限界希釈方法によってモノクローナル細胞株として確立させた。生じる抗体陽性株を間接ELISAによって更にスクリーニングして、組換えタンパク質と結合するハイブリドーマを選択した。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。RNAをTrizol(Invitrogen社、15596-018)で抽出し、逆転写(PrimeScript(商標)逆転写酵素、Takara社#2680A)に供した。逆転写によって得られたcDNAを、マウスIg-プライマーセット(Novagen社、TB326 Rev.B0503)を使用したPCRによって増幅した。最後に、マウス抗体M1の配列が得られた。
マウスモノクローナル抗体M1の重鎖及び軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
M1 HCVR
M1 LCVR
(実施例4)
抗体のin vitro結合活性の検出方法
(1)In vitro間接ELISA結合アッセイ:
BCMA Hisタンパク質(Sino Biological Inc.社、カタログ#10620-H08H)をpH7.4のPBSで1μg/mlの濃度まで希釈し、96ウェルの高親和性ELISAプレートに100μl/ウェルで加え、冷蔵庫内、4℃で終夜(16～20時間)インキュベートした。プレートをPBST(0.05%のTween-20を含有するpH7.4のPBS)で4回洗浄した後、PBSTで希釈した3%のウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液を150μl/ウェルで加え、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートした。ブロッキングの完了後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液で4回洗浄した。
試験する抗体を、1μMの初期濃度を用いて3%のBSAを含有するPBSTで10倍勾配希釈して、10個の希釈液が得られ、これをマイクロタイタープレートに100μl/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベートの完了後、プレートをPBSTで4回洗浄した。3%のBSAを含有するPBSTで希釈した、HRP標識したヤギ-抗ヒト二次抗体(Abcam社、カタログ#ab97225)を100μl/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで4回洗浄し、その後、TMB発色基質(Cell Sygnaling Technology社、カタログ#7004S)を100μl/ウェルで加え、室温、暗所で1分間インキュベートした。停止溶液(Cell Sygnaling Technology社、カタログ#7002S)を100μl/ウェルで加えて、反応を停止させた。450nmでの吸光度値をマイクロプレートリーダー(BioTek社、モデルSynergy H1)で読み取った。データを分析した。以下の表に示すように、結果は、濃度-シグナル曲線をプロットすることによって分析した。
(2)In vitro細胞結合アッセイ:
高いBCMA発現を有する培養細胞(BCMAを過剰発現するHEK-293T細胞、BCMAを発現する腫瘍細胞、NCI-H929)を収集した。細胞密度を調節し、細胞を96ウェルのU字底プレート上に1×105～2×105個の細胞/ウェルで蒔いた。プレートを1200gで5分間遠心分離し、上清を除去した。100μlの勾配希釈した抗体溶液又はマウス免疫化血清を加え、4℃で60分間インキュベートした。プレートを1200gで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞をPBSで2回洗浄した。蛍光標識した二次抗体(PE-GAH又はPE-GAM)を100μl/ウェルで加え、4℃で60分間インキュベートした。プレートを1200gで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞をPBSで2回洗浄し、その後、PBS中に再懸濁させた。フローサイトメーターを使用することによってシグナルを検出し、結果の分析のために濃度曲線をプロットした。
(実施例5)
マウス抗体のヒト化実験
当分野の多くの文書中に公開されている方法に従って、マウス抗ヒトBCMAモノクローナル抗体のヒト化を行った。手短に述べると、親(マウス抗体)定常ドメインをヒト定常ドメインで置き換えた。ヒト生殖系列抗体配列を、マウス抗体とヒト抗体との間の同一性に従って選択した。マウス抗体M1を本開示においてヒト化した。
得られたマウス抗体のVH/VL CDRの典型的な構造に基づいて、重鎖及び軽鎖可変領域の配列をヒト抗体生殖系列データベースとアラインメントさせて、高い同一性を有するヒト生殖系列の鋳型を得た。
マウス抗体M1のCDR領域を選択した対応するヒト化鋳型に移植した。その後、マウス抗体の三次元構造に基づいて、埋め込まれた残基、CDR領域と直接相互作用する残基、並びにVL及びVHのコンホメーションに対して顕著な影響を与える残基を逆突然変異に供し、CDR領域中の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化した。発現試験及び逆突然変異数の比較の後、ヒト化重鎖可変領域HCVRの配列を選択及び設計し、これらは以下の通りである。
HCVR1
HCVR2
HCVR3
ヒト化軽鎖可変領域LCVRの配列を選択及び設計し、これらは以下の通りである。
LCVR1
LCVR2
LCVR3
設計した重鎖及び軽鎖可変領域配列をそれぞれヒトIgG1重鎖及び軽鎖定常領域配列と連結させた。例示的な重鎖及び軽鎖定常領域配列は、それぞれ以下の通りである。
IgG1 C
IgカッパC
得られた例示的な重鎖及び軽鎖配列は以下の通りである。
Ab1 HC
Ab2 HC
Ab3 HC
Ab1 LC
Ab2 LC
Ab3 LC
上記それぞれのヒト化抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列に従ってcDNA断片を合成し、pcDNA3.1発現ベクター(Life Technologies社カタログ番号V790-20)内に挿入した。発現ベクターを形質移入試薬PEI(Polysciences, Inc.社カタログ番号23966)と共に1:2の比で使用して、HEK293細胞(Life Technologies社カタログ番号11625019)を形質移入させた。細胞をCO2インキュベーター内で4～5日間インキュベートした。細胞培養液を収集し、遠心分離し、濾過した。その後、試料を抗体精製アフィニティーカラムに載せた。カラムをリン酸緩衝剤で洗浄した。試料をグリシン-塩酸緩衝液(pH2.7、0.1MのGly-HCl)で溶出させ、1Mのトリス塩酸pH9.0で中和し、リン酸緩衝剤に対して透析して、本開示のヒト化抗体タンパク質が得られた。
(実施例6)
In vitro結合親和性及び動力学的アッセイ
それぞれのヒト化抗体のヒトBCMA抗原に対する親和性(EC50)は、実施例4(1)に従ったin vitro間接ELISA結合アッセイを使用することによって決定し、以下の表に示す通りである。
それぞれのヒト化抗体のNCI-H929腫瘍細胞に対する親和性(EC50)は、実施例4(2)に従ったin vitro細胞結合アッセイを使用することによって決定し、以下のTable 7(表8)に示す通りである。
(実施例7)
抗体のエンドサイトーシス
本開示の抗体が、BCMAと結合した後に、ヒトBCMAと共に細胞内にエンドサイトーシスされ得るかどうかを評価するために、NCI-H929を使用した。NCI-H929細胞をトリプシンで消化し(PBSで1回、37℃で約2分間洗浄した後)、収集し、事前に冷却したFACS緩衝液中に再懸濁させた。細胞濃度を1×106個の細胞/mLに調節した。1mLの細胞懸濁液をEPチューブに加え、1500rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。1mLの試験する調製した抗体を加えて細胞を再懸濁させ、抗体の最終濃度は20μg/mlであった。細胞を振盪器内、4℃で1時間インキュベートし、遠心分離し(4℃、1500rpm×5分間)、上清を廃棄した。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、上清を除去した。100μLの蛍光二次抗体作業溶液をそれぞれのチューブに加えて細胞を再懸濁させた。細胞を振盪器内、4℃で30分間インキュベートし、遠心分離し(4℃、1500rpm×5分間)、上清を廃棄した。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、上清を除去した。1.0mLの事前に温めたNCI-H929細胞完全培地をそれぞれのチューブに加えて細胞を再懸濁させ、十分に混合した。細胞懸濁液を4本のチューブ内に200μL/チューブで、それぞれ0分間群、ブランク群、30分間群、及び2時間群として分割した。0分間及びブランクの群を氷上に置いた一方で、残りの群は、それぞれ30分間及び2時間のエンドサイトーシスのために37℃のインキュベーター内に入れた。対応する時点で、EPチューブを取り出し、氷上に置いて5分間予冷した。すべての処置群を遠心分離し(4℃、1500rpm×5分間)、上清を廃棄した。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、上清を除去した。250μLのストリップ緩衝液を、0分間群以外のすべての処置群のEPチューブに加えた。細胞を室温で8分間インキュベートし、遠心分離し(4℃、1500rpm×5分間)、上清を廃棄した。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、上清を除去した。すべての処置群に100μLの固定溶液を加え、免疫染色のために30分間より長く4℃に置き、フローサイトメーターDxFlexによって検出した。BCMA抗体エンドサイトーシスの百分率=(それぞれの時点での蛍光強度値-0分間群の平均蛍光強度値)/0分間群の平均蛍光強度値。結果を以下の表に示す。
(実施例8)
抗体薬物コンジュゲートの調製
ADC2の調製:
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(10mM、0.347mL、3.47μmol)の配合水溶液を、抗体Ab2のPBS緩衝水溶液(0.05MのPBS緩衝水溶液、pH=6.5、7.3ml、13.8mg/ml、0.681μmol)に37℃で加えた。反応溶液を水浴振盪器内に入れ、37℃で3時間振盪した後に反応を停止させた。反応溶液を水浴中で25℃まで冷却し、14.0mlまで希釈した。その後、3.3mlの溶液を次の反応のために取った。
化合物D(3.0mg、3.72μmol)を0.15mlのDMSOに溶かし、その後、上記の3.3mlの溶液に加えた。反応溶液を水浴振盪器内に入れ、25℃で3時間振盪した後に反応を停止させた。反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:0.05MのPBS緩衝水溶液、pH=6.5、0.001MのEDTAを含有)で精製して、式Ab2の抗体コンジュゲートに示す例示的な生成物ADC2のPBS緩衝溶液が得られた(1.35mg/ml、13ml)。溶液を4℃で凍結した。
平均値yを紫外線方法によって決定した。コハク酸ナトリウム緩衝液を満たしたキュベットをそれぞれ参照吸収セル及び試料決定吸収セル内に入れ、溶媒ブランクを推定した後、試験溶液を満たしたキュベットを試料決定吸収セル内に入れた。280nm及び370nmでの吸光度を測定した。
データ処理:
抗体含有量CAbは、検量線を確立し、280nmの波長での吸収を測定することによって決定した。小分子含有量C薬物は、370nmの波長での吸収を測定することによって決定した。
薬物負荷yの平均値=C薬物/CAb。
例示的な生成物ADC2については、上記方法によってyは4であると決定された。ADC2の試料(y=4)はUV-HPLC精製によって得られた。
(実施例9)
腫瘍細胞に対する抗体薬物コンジュゲートの死滅活性
本開示の抗体薬物コンジュゲートの腫瘍細胞に対する死滅効果を試験するために、BCMA高発現細胞系NCI-H929細胞(ATCC受託番号CRL-9068)を評価のために使用した。NCI-H929細胞を収集し、遠心分離し、計数した。細胞密度を完全培地で1×105個の細胞/mLに調節し、細胞を白色96ウェルプレートの60個のウェルに、100μL/ウェル、10,000個の細胞/ウェルの細胞数で蒔いた。100μLのDPBS/ウェルを残りの周辺ウェルに加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に入れ、終夜培養した。実験の2日目に、完全培地を用いて、96ウェルのV字底プレート中で、133μMの濃度から開始して、抗体-薬物コンジュゲート作業溶液を調製した(5倍の希釈率及び9濃度)。調製の完了後、溶液を白色96ウェルプレートに、80μL/ウェルで二連で加えた。細胞プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内に入れ、培養を72時間持続させた。実験の5日目に、プレートを検出し、読み取った。細胞培養プレートを取り出した。室温に平衡化した後、90μLのCellTiter-Glo(登録商標)溶液(Promega社、カタログ#G7573)をそれぞれのウェルに加えた。混合物を振盪及び混合し、暗所に置き、10分間静置し、その後、マイクロプレートリーダーのルミネセンスプログラムを使用することによって検出した。GraphPad Primsソフトウェアを使用してIC50値を計算した。化合物Dとコンジュゲートさせた陰性抗体IgG1のADC(y=4)を陰性対照として使用した。実験結果を以下の表に示す。
実験結果により、ADC2(y=4)がin vitroで腫瘍細胞に対して良好な死滅活性を有していたことが示された。
(実施例10)
抗体薬物コンジュゲートの腫瘍死滅活性
In vivoで形成された腫瘍の増殖に対する抗体薬物コンジュゲートの阻害効果を更に調査するために、マウスにおけるNCI-H929(ATCC受託番号CRL-9068)細胞系を用いた移植腫瘍の形成の後、本開示の抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を評価した。10×106個のNCI-H929細胞を6～8週齢の免疫不全ヌードマウス(NOD-SCID)の背部に皮下注射した。14日後、尾静脈を介した抗体薬物コンジュゲートの静脈内注射を、1回/週の頻度、2週間の連続投与、3mg/kgの用量で行った。ヒトIgG1アイソタイプ対照タンパク質を対照として3mg/kgの用量で使用した。対照群又は投与群のそれぞれの群中に5匹のマウスが存在した。腫瘍阻害率は、以下のように腫瘍体積を測定することによって計算した。
腫瘍阻害率TGI%=100%-(14日目の投与群の腫瘍体積-0日目の投与群の腫瘍体積)/(14日目の対照群の腫瘍体積-0日目の対照群の腫瘍体積)。
実験結果を以下の表に示す。
実験結果により、抗体薬物コンジュゲートADC2(y=4)がin vivoで良好な腫瘍阻害効果を示したことが示された。

Claims (15)

  1. 一般式(I):
    [式中、
    Wは、-(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-であり、
    Re又はRfは、独立して、水素、重水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、重水素化アルキル、ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、好ましくは、Re又はRfは、独立して、水素、重水素からなる群から選択され、より好ましくは、Re又はRfは水素であり、
    X1又はX2は、独立して、N、H、O、又はSからなる群から選択され、好ましくは、X1又はX2は、独立してSから選択され、より好ましくは、X1及び/又はX2は、独立してOから選択され、
    g、u、又はhは、独立して、1、2、3、及び4からなる群から選択され、好ましくは、g、u、又はhは、独立して、1、2、3からなる群から選択され、より好ましくは、g、u、又はhは2であり、
    yは1～20であり、好ましくは、yは4～10であり、より好ましくは、yは、4、6、8、又は10であり、
    Abは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片である]によって表され、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、それぞれ配列番号3、配列番号4、及び配列番号5に記載のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号6、配列番号7、及び配列番号8に記載のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  2. 抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  3. 抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4、又はその変異体に由来する重鎖定常領域を更に含み、好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、そのヒトIgG1、IgG2、又はIgG4に由来する重鎖定常領域を更に含み、より好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸突然変異後に増強されたADCC毒性を有するIgG1重鎖定常領域を更に含む、或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号22に示す重鎖定常領域を更に含む、請求項2に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  4. 抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、ヒトκ鎖、λ鎖、又はその変異体に由来する軽鎖定常領域を更に含み、好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、ヒトκ鎖に由来する軽鎖定常領域を更に含み、より好ましくは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号23に示す軽鎖定常領域を更に含む、請求項2に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  5. 抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11からなる群から選択される重鎖可変領域、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する重鎖可変領域を含み、
    並びに/或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号12、配列番号13、及び配列番号14からなる群から選択される軽鎖可変領域、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、
    請求項2に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  6. 抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号9に示す重鎖可変領域及び配列番号12に示す軽鎖可変領域を含む、又は
    抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号10に示す重鎖可変領域及び配列番号13に示す軽鎖可変領域を含む、又は
    抗BCMA抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号11に示す重鎖可変領域及び配列番号14に示す軽鎖可変領域を含む、
    請求項5に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  7. 抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号15、配列番号16、若しくは配列番号17に示す重鎖、又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する重鎖を含み、
    並びに/或いは、抗BCMA抗体又はその抗原結合断片が、配列番号18、配列番号19、若しくは配列番号20に示す軽鎖、又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、若しくは99%の同一性を有する軽鎖を含む、
    請求項5に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  8. 抗BCMA抗体が、配列番号15に示す重鎖及び配列番号18に示す軽鎖を含む、又は
    抗BCMA抗体が、配列番号16に示す重鎖及び配列番号19に示す軽鎖を含む、又は
    抗BCMA抗体が、配列番号17に示す重鎖及び配列番号20に示す軽鎖を含む、
    請求項7に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  9. 一般式(II):
    [式中、Ab及びyは、請求項1に定義した通りである]に示した通り、又はその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、若しくは混合物の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  10. 一般式(III):
    [式中、Ab及びyは、請求項1に定義した通りである]に示した通りである、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  11. 以下の構造:
    [式中、yは、請求項1に定義した通りである]からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  12. 以下の工程:
    Abを還元した後、これを一般式(F)とのカップリング反応に供して一般式(I)の化合物が得られる工程[式中、W、Ab、yは、請求項1に定義した通りである]を含む、一般式(I)の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法。
  13. 請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物と、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む、医薬組成物。
  14. BCMAに媒介される疾患又は状態を処置又は防止するための医薬の調製における、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、或いは請求項13に記載の医薬組成物の使用。
  15. BCMAに媒介される疾患又は状態が癌又は自己免疫疾患であり、癌が、好ましくはBCMAを発現する癌、より好ましくはリンパ腫、白血病、又は骨髄腫であり、自己免疫疾患が、好ましくは、エリテマトーデス、IgA腎症、及びリウマチ性関節炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項14に記載の使用。
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