TW202245845A - 一種抗體藥物偶聯物及其醫藥用途 - Google Patents

一種抗體藥物偶聯物及其醫藥用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種抗BCMA抗體藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物及其醫藥用途，具體地，本發明的抗體藥物偶聯物由抗BCMA抗體或其抗原結合片段和依喜替康衍生物藉由接頭連接而成，本發明的抗體藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物具有顯著的抗腫瘤效果和良好的安全性。

Description

一種抗體藥物偶聯物及其醫藥用途
本發明屬於生物醫藥領域，具體地說，本發明涉及抗BCMA抗體偶聯物及其醫藥用途。
B細胞是淋巴細胞的一種，其在自適應體液免疫和特異性識別抗原的抗體的產生中發揮重要的作用。B細胞具有三種亞類，分別是幼稚B細胞、記憶B細胞和漿細胞。VDJ重組過程中，DNA的兩種或三種片段選自基因組文庫，並且重組可產生抗體可變結構域的組合陣列，藉由由不同譜系的B細胞編碼的可變結構域的進一步改變，可產生至多109種獨特的B細胞譜系，各譜系產生具有獨特靶特異性的抗體。多種疾病涉及B細胞，B細胞的惡性轉化導致癌症，包括一些淋巴瘤，如多發性骨髓瘤和霍奇金氏淋巴瘤。自身免疫性疾病也會涉及到B細胞，包括系統性紅斑狼瘡(SLE)和IgA腎病。涉及B細胞的癌症和自家免疫性疾病可被認為B細胞功能異常，因此控制這類疾病的可能的策略是使用靶向病理B細胞的抗體。
BCMA是TNF受體超家族的成員，其是對配體BAFF(B細胞激活因子)和APRIL(增殖誘導配體)的非糖基化的內在膜受體。BCMA和它的 相應配體具有調節體液免疫、B細胞發育和穩態等不同作用。BCMA由扁桃體記憶B細胞和由生髮中心B細胞表達，在脾臟、淋巴結、胸腺、腎上腺和肝臟均可以檢測到，並且多種B細胞系的分析表明在BCMA在成熟後的表達水平增加。
本發明的目的在於提供一種通式(I)所示的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，
Figure 111104080-A0202-12-0002-2
其中，
W選自-(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-，
Re或Rf各自獨立地選自氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基或羥烷基；較佳地，Re或Rf各自獨立地選自氫、氘，更佳為氫，
X1或X2各自獨立地選自N、H、O或S；較佳地，X1或X2各自獨立地選自S；更佳為O，
g、u或h各自獨立地選自1、2、3或4；較佳地，g、u或h各自獨立地選自1、2、3；更佳為2，
y為1~20；較佳4~10；更佳4、6、8或10；
Ab為抗BCMA抗體或其抗原結合片段。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3：以及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3的抗體輕鏈可變區。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體，嵌合抗體，人抗體或人源化抗體。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，
較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區；
更佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸突變後具有增強的ADCC毒性的IgG1重鏈恆定區；
或者，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：22所示的重鏈恆定區。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈的輕鏈恆定區；進一步佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：23所示的輕鏈恆定區。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11；
和/或，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
在本發明進一步較佳的實施方式中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少80%，85%，90%，95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；
和/或，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20。
在本發明進一步佳的實施方式中，其中，
該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；或，
該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：13所示的輕鏈可變區；或，
該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
在本發明進一步佳的實施方式中，其中，
該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：15所示的重鏈和SEQ ID NO：18所示的輕鏈；或，
該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：16所示的重鏈和SEQ ID NO：19所示的輕鏈；或，
該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自如通式(II)所示的體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式：
Figure 111104080-A0202-12-0005-3
Ab選自上述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，
y選自2-10，較佳4-10，更佳4、6、8或10。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自如通式(III)所示的體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 111104080-A0202-12-0006-4
Ab選自上述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，
y選自2-10，較佳4-10，更佳4、6、8或10。
在本發明進一步佳的實施方式中，該抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物選自如下結構：
Figure 111104080-A0202-12-0006-5
Figure 111104080-A0202-12-0007-6
Figure 111104080-A0202-12-0007-76
其中，y選自2-10，較佳4-10，更佳4、6、8或10。
本發明還提供一種製備如通式(I)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的方法，其包括以下步驟：
Figure 111104080-A0202-12-0007-8
Ab還原後，與通式(F)偶聯反應，得到通式(I)所示的化合物；
其中，W如前述內容所定義。
Ab選自上述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段；
y為1~20；較佳4-10；更佳4、6、8或10。
另一方面，本發明提供一種醫藥組成物，其包含上述抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
另一方面，本發明提供一種醫藥用途，本發明涉及抗BCMA抗體藥物偶聯物或該抗體藥物偶聯物藥學上可接受的鹽或溶劑化合物或其醫藥組成物在製備用於治療或預防BCMA介導的疾病或病症的藥物中的用途。
在本發明一個較佳的方案中，該BCMA介導的疾病或病症選自癌症或自身免疫疾病，其中該癌症較佳為表達BCMA的癌症，更佳淋巴瘤、白血病或骨髓瘤；該自身免疫疾病選自紅斑狼瘡、IgA腎病或風濕性關節炎。
本發明的抗體藥物偶聯物及其可藥用鹽或溶劑化合物具有顯著的抗腫瘤效果和良好的安全性，同是具有良好的體內代謝活性，體內藥效時間長，臨床應用前景廣闊。
[發明詳述]
一、術語
為了更容易理解本申請，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本申請所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本申請所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG 3、IgG 4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申請該抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則(http：//bioinf.org.uk/abs/)。
術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞。
術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“BCMA”包括由細胞天然表達的BCMA的任何變體或同種型。本申請的抗體可與得自非人物種的BCMA交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人BCMA特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。BCMA或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳地，抗BCMA抗體靶向具有正常糖基化模式的人源BCMA。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“鼠源抗體”在本申請中為根據本領域知識和技能製備的對人BCMA的單株抗體。製備時用BCMA抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本申請一個較佳的實施方案中，該鼠源BCMA抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本申請的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因 與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本申請的術語“與BCMA結合”，指能與人BCMA相互作用。
本申請的術語“抗原結合位點”指本申請抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本申請所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人BCMA作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本申請的抗體與來自不同物種的BCMA結合的能力。例如，結合人BCMA的本申請的抗體也可以結合另一物種的BCMA。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達BCMA的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面電漿共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合 時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗BCMA抗體接觸時，與未與抗BCMA抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本申請中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人BCMA或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本申請工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達 系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本申請的抗體指單株抗體。本申請該單株抗體，指由單一的株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本申請的任一種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根 據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本申請的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由......組成”或其變形表示包括所有該元件或元件組，並且任選包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組成物的基本性質或新性質。
本申請所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“可藥用鹽”是指本發明抗體-藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，其具有應有的生物活性。本發明抗體-藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性實例包括：鹽 酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
“溶劑化合物”指本發明的抗體-藥物偶聯物化合物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑化合物，溶劑分子的非限制性實例包括：水、乙醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯。
“細胞毒性藥物”在用於本發明時指抑制細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“微管蛋白抑制劑”是指藉由抑制微管蛋白的聚合或促進微管蛋白的集合而干擾細胞有絲分裂過程，從而發揮抗腫瘤效果的一類化合物。其非限制性實例包括：美登素類、卡利奇黴素、紫杉烷類、長春新鹼、秋水仙鹼、尾海兔素/奧瑞他汀/單甲基奧瑞他汀E(MMAE)/單甲基奧瑞他汀F(MMAF)。
“接頭”指包含是抗體共價附著於藥物的共價鍵或原子鏈的化學模塊。接頭的非限制性實例包括：亞(伸)芳基、亞(伸)雜芳基、PEG、聚亞甲基氧基、琥珀酸酯、琥珀醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己醯胺。
“藥物載荷”(DAR)由y表示，即通式(A)中每個抗體的平均細胞毒性藥物數。本發明中的藥物荷載範圍可以為每個抗體1-20個細胞毒性藥物(D)。通式(A)的抗體-藥物偶聯物為偶聯有一定範圍(1-20個)細胞毒性藥物的抗體的集合。來自偶聯反應的抗體-藥物偶聯物中的藥物載荷(DAR)可藉由常規手段表徵，諸如質譜，HPLC和ELISA等。藉由這些手段可以測定抗體-藥物偶聯物在y值上的定量分佈。
本發明還包括各種氘化形式的式(I)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)化合物。在製備氘代形式的式(I)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。
術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本發明抗體藥物偶聯物的鹽，或本發明中所述的化合物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本發明配體藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
術語“載藥量”是指式(V)分子中每個抗體或其抗原片段上加載的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體連接0-12個，較佳1-10個細胞毒性藥物(D)。在本發明的實施方案中，載藥量表示為y，也可稱為DAR值，示例性的為1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10的均值。可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC特徵鑑定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。
本發明的一些實施方式中，細胞毒性藥物藉由連接單元偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，在本發明的另一些實施方式中，細胞毒性藥物藉由連接單元偶聯在配體的巰基上。一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：
(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，
(2)控制反應時間和溫度，
(3)選擇不同的反應試劑。
本發明的抗體藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物具有顯著的抗腫瘤效果和良好的安全性。
以下結合實施例用於進一步描述本申請，但這些實施例並非限制著本申請的範圍。本申請實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。
本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
本發明的已知原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買江蘇艾康等公司，具體見下表：
Figure 111104080-A0202-12-0022-9
實施例1-1化合物a的合成
Figure 111104080-A0202-12-0022-10
取原料a-1(4.1g，9.71mmol)、原料a-2(4.3g，8.09mmol，含4%胺基異構體雜質)置於250mL反應瓶中，氮氣保護下加入DCM(54mL)，MeOH(18mL)攪拌並冷至0℃，加入DMTMM(3.6g，12.1mmol)，三乙胺(2.5g， 24.2mmol)，並保持0℃攪拌反應1h，HPLC中控顯原料原料a-2反應完全，減壓(<25℃)蒸乾反應液，加入MTBE(120mL)攪拌打漿(泥狀物)，倒出溶液過濾，泥狀物再次加入120mL MTBE打漿(固體)，過濾，濾餅用水(60mL×2)洗，晾乾得粗品，粗品用二氯甲烷和甲醇溶解，濕法上樣管柱層析兩次(沖提劑DCM：MeOH=40：1-20：1)分離得到化合物a純品(6.2g,7.37mmol)，純度：99.3%，收率91%
實施例1-2化合物b的合成
Figure 111104080-A0202-12-0023-11
取化合物a(5.7g,6.77mmol)置於500mL三口瓶中，氮氣保護下加入乾燥的THF(114mL)，攪拌溶解並冷卻內溫至-10℃左右，加入DBU(3.09g，20.31mmol)，滴加過程中保持內溫-10至-5℃，5min加畢，滴畢後，保持內溫-10至-5℃，反應2.5h，固體析出。
冷卻內溫至-20℃，加入MTBE(114mL)，期間保持內溫-20至-10℃，產物完全析出，過濾，濾餅用MTBE(57mL×2)洗，抽乾後得到化合物b粗品6g，-78℃保存待用。
實施例1-3化合物e的合成
Figure 111104080-A0202-12-0024-12
將化合物c(651mg，1mmol)溶於10mL的DCM裡，冰浴冷卻下開啟攪拌，滴入DBU(456mg,3mmol)。冰浴下反應一個小時後反應完成，依次加入化合物d(257mg,1mmol)和HATU(420mg，1.1mmol)，在冰浴下攪拌30分鐘後，LCMS顯示反應完成，反應液在25℃條件下濃縮，殘留物用過管柱機反相管柱純化(ACN in H2O，50%出產物)得到化合物e，紅棕色固體，130mg，收率19%。
MS：691.3[M+23]。
實施例1-4化合物f的合成
Figure 111104080-A0202-12-0024-13
將化合物e(130mg,0.19mmol)溶於DCM，加入苯甲醚(62mg，0.57mmol)和二氯乙酸(245mg，1.9mmol)，反應在室溫下攪拌過夜，共16小時，取樣LC-MS中控，顯示原料完全消耗，停止反應，將反應液在25℃條件下濃縮，殘留物用過管柱機反相管柱純化(ACN/H2O，30%出產物)，得化合物f，粉色固體，53mg，收率54%。
MS：519.2[M+1]。
實施例1-5化合物D的合成
Figure 111104080-A0202-12-0025-14
將化合物f(23mg,0.044mmol)和化合物b(27mg,0.044mmol)溶於DCM(3mL)和MeOH(1mL)，在氮氣保護下冷卻到-30℃。加入DMTMM(20mg，0.067mmol)，反應在-20℃~-10℃控溫反應1小時，取樣LC-MS中控，顯示原料完全消耗。控制溫度在-10℃，加入10mL水淬滅反應，加入30mL的DCM分層。水相用DCM/MeOH=10/1(50mL)萃取。合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，在25℃條件下減壓濃縮，殘留物經製備純化(ACN/H2O/0.05%FA)，得化合物D，白色固體，5.8mg，收率12%，HPLC純度98.87%。
MS：1120.3[M+1]。
實施例2：抗原準備
編碼帶His標簽的人BCMA(BCMA-His)蛋白由SinoBiologics公司合成(Cat No.：Cat No.：10620-H08H)。
BCMA-His序列：
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAHHHHHHHHHHH SEQ ID NO：21
實施例3：鼠融合瘤及抗體序列的獲得
用人抗原BCMA-His進行動物免疫，共5隻Balb/c和5隻A/J小鼠，雌性，10週齡，使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。
表1. 免疫方案
Figure 111104080-A0202-12-0026-15
對免疫小鼠血清使用如實施例3該間接ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。選擇血清效價、親和力和FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫 後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後鋪板獲得融合瘤，藉由間接ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株為單株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用間接ELISA進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體M1的序列。
鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
M1 HCVR
Figure 111104080-A0202-12-0027-16
SEQ ID NO：1
M1 LCVR
EILLTQSPAIIVTSPGEKVTITCSASSSVIYMNWYQQKPGSSPKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFSFTINSMEAEDVATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO：2
表2. 鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區CDR序列
Figure 111104080-A0202-12-0028-17
實施例4：抗體的體外結合活性檢測方法
(1)體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將BCMA His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體，1μM起始，10倍梯度，10個劑量，以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗人二抗(Abeam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止 反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據。做濃度信號值曲線分析結果，如下表所示：
表3. 鼠抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50值)
Figure 111104080-A0202-12-0029-18
(2)體外細胞結合實驗：
收集培養好的BCMA高表達細胞(過表達BCMA的HEK-293T細胞和表達BCMA的腫瘤細胞，NCI-H929)，調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。1200g，5min離心，去上清，添加100ul已梯度稀釋的抗體溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；1200g，5min離心，去上清，PBS洗細胞2次後，添加螢光標記二抗(PE標記山羊抗人單抗或PE標記山羊抗鼠單抗)每孔100uL，4℃孵育60min。1200g，5min離心去上清。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀檢測信號，並作濃度曲線分析結果。
表4. 鼠抗體對表達BCMA的細胞的親和力(EC50值)
Figure 111104080-A0202-12-0029-19
實施例5：小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人BCMA單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本申請將鼠源抗體M1進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。
將鼠源抗體M1的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，經表達測試和回復突變數量對比，選擇出設計了人源化重鏈可變區HCVR的序列，序列如下：
HCVR1
Figure 111104080-A0202-12-0030-20
SEQ ID NO：9
HCVR2
Figure 111104080-A0202-12-0030-21
SEQ ID NO：10
HCVR3
Figure 111104080-A0202-12-0031-22
SEQ ID NO：11
選擇出設計了人源化輕鏈可變區LCVR的序列，序列如下：
LCVR1
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVIYMNWYQQKPGQAPRLLIYGISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：12
LCVR2
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVIYMNWYQQKPGQSPKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：13
LCVR3
EILLTQSPATLSLSPGERATLTCSASSSVIYMNWYQQKPGSSPKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：14
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列與人IgG1重鏈和人抗體輕鏈恆定區序列連接，示例性的重鏈和輕鏈恆定區序列分別如下所示：
IgG1 C
Figure 111104080-A0202-12-0031-23
Figure 111104080-A0202-12-0032-24
SEQ ID NO：22
Ig kappa C
Figure 111104080-A0202-12-0032-25
SEQ ID NO：23
得到重鏈和輕鏈序列如下：
Ab1 HC
Figure 111104080-A0202-12-0032-26
SEQ ID NO：15
Ab2 HC
Figure 111104080-A0202-12-0033-27
SEQ ID NO：16
Ab3 HC
Figure 111104080-A0202-12-0033-28
SEQ ID NO：17
Ab1 LC
Figure 111104080-A0202-12-0034-75
SEQ ID NO：18
Ab2 LC
Figure 111104080-A0202-12-0034-29
SEQ ID NO：19
Ab3 LC
Figure 111104080-A0202-12-0034-30
SEQ ID NO：20
表5. 抗體及其重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
Figure 111104080-A0202-12-0035-31
根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本申請的人源化抗體蛋白。
實施例6：體外結合親和力和動力學實驗
使用實施例4(1)體外間接ELISA結合實驗測定的各人源化抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)如下表所示：
表6. 各人源化抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)
Figure 111104080-A0202-12-0036-32
使用實施例4(2)體外細胞結合實驗測定的各人源化抗體對NCI-H929腫瘤細胞的親和力(EC50)如下表所示：
表7. 各人源化抗體對NCI-H929腫瘤細胞的親和力(EC50)
Figure 111104080-A0202-12-0036-33
實施例7：抗體的內吞作用
檢測本發明抗體結合BCMA後是否能夠和人BCMA共同內吞入細胞內，用NCI-H929進行評估。NCI-H929細胞使用胰酶消化(先用PBS清洗一遍，37℃、2min左右)，收集細胞並用預冷的FACS緩衝液重新懸浮，調整細胞濃度為1×106/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後去上清，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為20μg/ml，4度搖床孵育1h，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS緩衝液洗滌兩次，去上 清。每管加入100μL螢光二抗工作液重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30min，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS緩衝液洗滌兩次，去上清。每管加入1.0mL預熱的NCI-H929細胞完全培養基重新懸浮細胞並混勻，分裝為4管，每管200μL，分別為0min組，blank組，30min組和2h組，取出0min及blank置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30min、2h，在相應時間點取出EP管，置於冰上預冷5min，所有處理組離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，用FACS緩衝液洗滌一次，去上清。去除0min組外所有處理組EP管中加入250μL strip緩衝液，室溫孵育8min，離心棄上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS緩衝液洗滌兩次，去上清。所有處理組加入100μL免疫染色固定液，4℃放置30min以上，用流式細胞儀DxFlex進行檢測。BCMA抗體內吞百分比=(各個時間點螢光強度值-零點時的平均螢光強度值)/零點時的平均螢光輕度值。結果見下表：
表8.抗體在NCI-H929腫瘤細胞中的內吞作用(EC50)
Figure 111104080-A0202-12-0037-34
實施例8：抗體偶聯藥物的製備
ADC2的製備
Figure 111104080-A0202-12-0038-35
在37℃條件下，向抗體Ab2的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至14.0ml，並取出3.3ml溶液往下反應。
將化合物D(3.0mg，3.72μmol)溶解於0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到Ab2抗體偶聯物的示例性產物ADC2的PBS緩衝液(1.35mg/mL，13mL)，於4℃冷凍儲液。
採用紫外法測定平均值y。將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
數據處理：
藉由建立標準曲線，測定280nm波長下的吸收，確定抗體含量CAb，測定370nm波長下的吸收，確定小分子含量CDrug。
藥物載量平均值y=CDrug/CAb。
藉由以上方法測定示例性產物ADC2的y值為4。藉由UV-HPLC純化獲得ADC2(y=4)樣品。
實施例9抗體藥物偶聯物的細胞殺傷活性
為檢測本公開的抗體-藥物偶聯物對腫瘤細胞的殺傷作用，採用BCMA高表達水平細胞株NCI-H929(ATCC保藏號CRL-9068)進行評估。收集NCI-H929細胞，離心計數後用完全培養基調整細胞密度為1×105個/mL，鋪於白色96孔板中間60個孔，每孔100μL，細胞數為10000細胞/孔，邊緣孔加入100μL/孔DPBS，細胞板放入37℃，5%CO2培養箱培養過夜。次日，用完全培養基在96孔V型底板中配製抗體-藥物偶聯物工作溶液，133uM起始，5倍稀釋，9個濃度，配製完成後加入到白色96孔板中，每孔80μL，兩複孔，將細胞板放入37℃，5% CO2培養箱中繼續培養72小時。實驗第五天，檢測讀數：取出細胞培養板，平衡至室溫後，每孔加入90μl CellTiter-Glo®細胞活力檢測試劑(Promega，Cat#：G7573)，振盪混勻後放於暗處靜置10分鐘後使用酶標儀的發光程序進行檢測。使用GraphPad Prims軟體計算IC50值。使用陰性抗體IgG1與化合物D偶聯的抗體-藥物偶聯物(y=4)作為陰性對照。實驗結果如下表所示：
表9. 抗體偶聯藥物對腫瘤細胞的殺傷作用
Figure 111104080-A0202-12-0040-36
實驗結果表明：ADC2(y=4)具有較好的腫瘤細胞的體外殺傷活性。
實施例10：抗體藥物偶聯物的腫瘤殺傷活性
為進一步研究抗體-藥物偶聯物對體內形成的腫瘤的增殖抑制效果，在小鼠體內用NCI-H929細胞(ATCC保藏號CRL-9068)形成移植瘤後，評估本公開抗體-藥物偶聯物的抗腫瘤效果。將10x106個NCI-929細胞接種於到6-8週齡的免疫缺陷的雌性小鼠(NOD SCID)背部皮下，14天後開始藉由靜脈注射抗體-藥物偶聯物，每1週尾靜脈注射給藥1次，連續給藥兩週，給藥劑量為3mg/kg。對照組採用人IgG1 isotype control蛋白，劑量為3mg/kg，對照組或給藥組每組5隻小鼠。藉由測量腫瘤體積計算抑瘤率，計算公式如下：
抑瘤率TGI %=100%-(第14天給藥組腫瘤體積-第0天給藥組腫瘤體積)/(第14天對照組腫瘤體積-第0天對照組腫瘤體積)。
實驗結果如下表所示：
表10抗體-藥物偶聯物對腫瘤的殺傷作用
Figure 111104080-A0202-12-0040-37
實驗結果表明：抗體-藥物偶聯物ADC2(y=4)顯示出良好的體內腫瘤抑制效果。
<110> 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司(SHANGHAI HANSOH BIOMEDICAL CO.,LTD) 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司(JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO.,LTD.)
<120> 一種抗體藥物偶聯物及其醫藥用途
<130>
<150> CN 202110123809.3
<151> 2021-01-29
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(121)
<223> 鼠單抗M1重鏈可變區
<400> 1
Figure 111104080-A0202-12-0042-38
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(106)
<223> 鼠單抗M1的輕鏈可變區
<400> 2
Figure 111104080-A0202-12-0043-39
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> HCDR1
<400> 3
Figure 111104080-A0202-12-0043-40
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> HCDR2
<400> 4
Figure 111104080-A0202-12-0043-41
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(14)
<223> HCDR3
<400> 5
Figure 111104080-A0202-12-0044-42
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> LCDR1
<400> 6
Figure 111104080-A0202-12-0044-43
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> LCDR2
<400> 7
Figure 111104080-A0202-12-0044-44
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> LCDR3
<400> 8
Figure 111104080-A0202-12-0044-45
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(121)
<223> 人源化抗體重鏈可變區1
<400> 9
Figure 111104080-A0202-12-0045-46
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(121)
<223> 人源化抗體重鏈可變區2
<400> 10
Figure 111104080-A0202-12-0045-47
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(121)
<223> 人源化抗體重鏈可變區3
<400> 11
Figure 111104080-A0202-12-0046-48
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(106)
<223> 人源化抗體輕鏈可變區1
<400> 12
Figure 111104080-A0202-12-0046-49
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(106)
<223> 人源化抗體輕鏈可變區2
<400> 13
Figure 111104080-A0202-12-0047-50
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(106)
<223> 人源化抗體輕鏈可變區3
<400> 14
Figure 111104080-A0202-12-0047-51
<210> 15
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(451)
<223> 人源化抗體重鏈1
<400> 15
Figure 111104080-A0202-12-0048-52
Figure 111104080-A0202-12-0049-53
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(451)
<223> 人源化抗體重鏈2
<400> 16
Figure 111104080-A0202-12-0049-54
Figure 111104080-A0202-12-0050-55
<210> 17
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(451)
<223> 人源化抗體重鏈3
<400> 17
Figure 111104080-A0202-12-0050-56
Figure 111104080-A0202-12-0051-57
<210> 18
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(213)
<223> 人源化抗體輕鏈1
<400> 18
Figure 111104080-A0202-12-0051-58
Figure 111104080-A0202-12-0052-59
<210> 19
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(213)
<223> 人源化抗體輕鏈2
<400> 19
Figure 111104080-A0202-12-0052-60
<210> 20
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(213)
<223> 人源化抗體輕鏈3
<400> 20
Figure 111104080-A0202-12-0053-61
<210> 21
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(65)
<223> 人BCMA-His蛋白
<400> 21
Figure 111104080-A0202-12-0053-62
Figure 111104080-A0202-12-0054-63
<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(330)
<223> 重鏈恆定區
<400> 22
Figure 111104080-A0202-12-0054-64
Figure 111104080-A0202-12-0055-65
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(107)
<223> 輕鏈恆定區
<400> 23
Figure 111104080-A0202-12-0055-66
Figure 111104080-A0202-11-0002-1

Claims (15)

  1. 一種通式(I)所示的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，
    Figure 111104080-A0202-13-0001-67
    其中，
    W選自-(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-，
    Re或Rf各自獨立地選自氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基或羥烷基；較佳地，Re或Rf各自獨立地選自氫、氘，更佳為氫，
    X1或X2各自獨立地選自N、H、O或S；較佳地，X1或X2各自獨立地選自S；更佳為O，
    g、u或h各自獨立地選自1、2、3或4；較佳地，g、u或h各自獨立地選自1、2、3；更佳為2，
    y為1~20；較佳4~10；更佳4、6、8或10，
    Ab為抗BCMA抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及該 輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
  2. 如請求項1所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體。
  3. 如請求項2所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，
    較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區；
    更佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸突變後具有增強的ADCC毒性的IgG1重鏈恆定區。
    或者，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：22所示的重鏈恆定區。
  4. 如請求項2所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈的輕鏈恆定區；進一步佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：23所示的輕鏈恆定區。
  5. 如請求項2所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的 重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11；
    和/或，選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
  6. 如請求項5所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，
    該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；或，
    該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：13所示的輕鏈可變區；或，
    該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
  7. 如請求項5所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；
    和/或，選自以下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20。
  8. 如請求項7所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，
    該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：15所示的重鏈和SEQ ID NO：18所示的輕鏈；或，
    該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：16所示的重鏈和SEQ ID NO：19所示的輕鏈；或，
    該抗BCMA抗體包含SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自如通式(II)所示的體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式：
    Figure 111104080-A0202-13-0004-68
    其中，Ab，y如請求項1中所定義。
  10. 如請求項9所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自如通式(III)所示的體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
    Figure 111104080-A0202-13-0005-69
    其中，Ab，y如請求項1中所定義。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，該抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物選自如下結構：
    Figure 111104080-A0202-13-0005-70
    Figure 111104080-A0202-13-0006-72
    Figure 111104080-A0202-13-0006-73
    其中，y如請求項1中所定義。
  12. 一種製備如通式(I)所示的抗體一藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物的方法，其包括以下步驟：
    Figure 111104080-A0202-13-0006-74
    Ab還原後，與通式(F)偶聯反應，得到通式(I)所示的化合物，
    其中，W、Ab、y如請求項1中所定義。
  13. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至11中任一項所述的抗體藥物偶聯物或該抗體藥物偶聯物藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  14. 一種如請求項1至11中任一項所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物或如請求項13所述的醫藥組成物在製備用於治療或預防BCMA介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  15. 如請求項14所述的用途，其中，該BCMA介導的疾病或病症選自癌症或自身免疫疾病，其中該癌症較佳為表達BCMA的癌症，更佳淋巴瘤、白血病或骨髓瘤；該自身免疫疾病選自紅斑狼瘡、IgA腎病或風濕性關節炎。
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