WO2020244657A1 - 抗b7-h4抗体-药物偶联物及其医药用途 - Google Patents

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刘素霞
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Definitions

  • B7-H4 protein is abundantly expressed in a variety of tumor tissues, allowing tumor cells to escape the body's immune system. Taking B7-H4 molecules as tumor therapy targets provides a new method for tumor immunotherapy.
  • the purpose of the present invention is to provide an anti-B7-H4 antibody-drug conjugate, which has high affinity, high selectivity, high endocytic efficiency, high anti-cancer activity, and high stability Sex, high safety, low side effects, achieved through the following technical solutions:
  • HCDR1 shown in SEQ ID NO: 3 HCDR2 shown in SEQ ID NO: 4, and HCDR3 shown in SEQ ID NO: 5;
  • LCDR1, LCDR2, and LCDR as shown in SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 34, respectively.
  • LCDR1 shown in SEQ ID NO: 12 LCDR2 shown in SEQ ID NO: 13, and LCDR3 shown in SEQ ID NO: 14;
  • LCDR1 shown in SEQ ID NO: 26 LCDR2 shown in SEQ ID NO: 27, and LCDR3 shown in SEQ ID NO: 28; or,
  • LCDR1 shown in SEQ ID NO: 26 LCDR2 shown in SEQ ID NO: 27, and LCDR3 shown in SEQ ID NO: 28;
  • the antibody-drug conjugate represented by general formula (A) or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof as described above, wherein the Ab is a murine antibody or Fragments, chimeric antibodies or fragments thereof, human antibodies or fragments thereof, and humanized antibodies or fragments thereof.
  • the heavy chain constant region includes a heavy chain constant region derived from human IgG1 or its variants, IgG2 or its variants, IgG3 or its variants or IgG4 or its variants, preferably derived from human IgG1, IgG2 or
  • the heavy chain constant region of IgG4 more preferably the heavy chain constant region of IgG1 that enhances ADCC toxicity after amino acid mutation, most preferably the heavy chain constant region shown in SEQ ID NO: 54;
  • the structure of MMAF and SN-38 is shown in the following formula:
  • y is a number selected from 1 to 8, preferably a number selected from 2-4;
  • n is an integer of 0-5, preferably 1, 2 or 3.
  • the aforementioned antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof is an antibody-drug conjugate represented by general formula (IB) or Its pharmaceutically acceptable salt or solvent compound:
  • mice can be immunized with human B7-H4 or fragments thereof, and the obtained antibodies can be renatured, purified, and amino acid sequencing can be performed by conventional methods.
  • Antigen-binding fragments can also be prepared by conventional methods.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the invention is genetically engineered to add one or more human FR regions to the non-human CDR region.
  • the human FR germline sequence can be obtained from the website http://imgt.cines.fr of ImmunoGeneTics (IMGT), or from the Journal of Immunoglobulin, 2001ISBN012441351.
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of mouse monoclonal antibody 2G6 are as follows:
  • the Biacore method is a recognized method for objectively detecting the affinity and kinetics between proteins.
  • the affinity and binding kinetics of the antibody to be tested of the present invention were analyzed by Biacore T200 (GE).
  • the NHS standard amino coupling method is used to covalently connect the anti-B7-H4 antibody to be tested to the CM5 (GE) chip.
  • 50nM human huB7-H4-His protein diluted in the same buffer was injected at a flow rate of 10uL/min. After injection, all were regenerated with the regeneration reagent in the kit. Track the antigen-antibody binding kinetics for 3 minutes and track the dissociation kinetics for 10 minutes.
  • MX-1 cells are used for evaluation.
  • MX-1 cells were trypsinized (washed with PBS first, 37°C, about 2min), collected and resuspended in pre-cooled FACS buffer, adjusting the cell concentration to 1 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • Take the EP tube add 1 mL of cell suspension, centrifuge at 1500 rpm for 5 minutes, and remove the supernatant. Add 1 mL of the prepared antibody to be tested to resuspend the cells. The final concentration of the antibody is 20 ⁇ g/ml.
  • 2a (2g, 17.2mmol) was dissolved in 75mL of acetonitrile, and potassium carbonate (9.27g, 67.2mmol), benzyl bromide (20mL, 167.2mmol) and tetrabutylammonium iodide (620mg, 1.68mmol) were added in sequence.
  • the reaction solution was stirred at room temperature for 48 hours, filtered through diatomaceous earth, the filter cake was rinsed with ethyl acetate (20ml), the combined filtrate was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography with a developing solvent system C to obtain Product 5a (3.2g, yield: 90.1%).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18OBD 5um 19*250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18 mL/min ), the corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to obtain products 5-A and 5-B (3.6 mg, 2.6 mg).
  • hu2F7-exitnotecan effectively killed NCI-H929-LUC cells, indicating that in the presence of B7-H4 positive cells, hu2F7-exitnotecan has a bystander killing effect, not only Kills B7-H4 positive cells, and can kill the originally insensitive B7-H4 negative cells (see “Single Cell Group”).

Abstract

一种抗B7-H4抗体-药物偶联物及其医药用途。具体地，一种抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，包含所述抗B7-H4抗体的CDR区的人源化抗体，及其抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化合物，以及前述抗体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂化合物的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途，尤其在制备用于治疗B7-H4高表达的疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗B7-H4抗体-药物偶联物及其医药用途 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及抗B7-H4抗体偶联物及其医药用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域长期持续的研究和开发热点，而其中T细胞肿瘤免疫治疗又处于核心位置。肿瘤逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，大部分肿瘤表达可不同程度地被宿主免疫系统识别的抗原，但在许多情况下，由于效应T细胞低效活化而引发不充分的免疫反应，因此肿瘤细胞利用其自身对免疫系统的抑制作用促进了肿瘤的生长。肿瘤免疫治疗即是充分利用并调动了肿瘤患者体内的杀伤性T细胞和/或其它免疫细胞，对肿瘤进行杀伤作用。
对CD28受体及其配体的研究己促成对称为B7超家族的相关分子的表征。B7家族成员是一类具有免疫球蛋白V样结构域(IgV)和免疫球蛋白C样结构域(IgC)的免疫球蛋白，其成员包括协同刺激因子B7.1(CD80)与B7.2(CD86)、可诱导的共剌激因子的配体(ICOS-L/B7-H2)、程序性死亡-1配体(PD-L1/B7-H1)、程序性死亡-2配体(PD-L2/B7-DC)、B7-H3和B7-H4等。
人B7-H4是由282个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，其编码基因位于1号染色体的p11.1区(Choi IH等，J Immunol.2003Nov 1；171(9):4650-4)。B7-H4对T细胞免疫应答起着负性调节的作用，B7-H4在CD4+、CD8+T细胞的分化发育、细胞周期进展以及细胞因子的产生方面发挥着广泛的抑制作用(Sica GL等，Immunity.2003Jun；18(6):849-61)。在B7-H4基因敲除的小鼠中没有发现免疫细胞紊乱和自身免疫现象(Zhu G等，Blood.2009Feb 19；113(8):1759-67；Suh WK等，Blood.Mol Cell Biol.2006Sep；26(17):6403-11)。目前对于B7-H4的受体及其信号转导途径尚不明确。
近来研究发现B7-H4蛋白在多种肿瘤组织中大量表达,，使肿瘤细胞逃避机体 免疫系统的攻击。以B7-H4分子为肿瘤治疗靶标，为肿瘤免疫治疗提供了一种新方法。
目前已知人B7-H4表达在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌和肝癌等多种癌症细胞上。在脾脏、肺、胸腺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、睾丸和卵巢中发现B7-H4mRNA的表达，蛋白质水平上，在乳房(导管和小叶)、输卵管上皮、子宫内膜腺等组织有低水平B7-H4表达。相关研究也己显示B7-H4在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中过表达(Kryczek,I.等，J.Exp.Med.2006,203(4):871-881)，而巨噬细胞构成了肿瘤微环境的一个重要成分并且可代表多达50％的肿瘤质量。
癌症治疗的一种策略是利用抗体作为载体，将细胞毒性分子携带进入癌细胞，然后利用解离下来的小分子杀伤癌细胞。利用这种策略的药物被称为抗体-药物偶联物。目前已经上市的抗体-药物偶联物有Adcetris和Kadcyla。目前有多家跨国制药公司在研发针对B7-H4的单克隆抗体和/或其与药物偶联物，提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，并达到对肿瘤细胞进行直接杀伤的目的。相关专利如WO2013025779、US20140322129等。Medimmune、FivePrime等公司的抗B7-H4单克隆抗体目前尚在临床前开发；基因泰克公司的抗B7-H4抗体-药物偶联物也已处在临床前开发阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗B7-H4抗体-药物偶联物，所述B7-H4抗体-药物偶联物具有高亲和力，高选择性，高内吞效率，高抗癌活性，高稳定性，高安全性，低毒副作用，通过以下技术方案实现：
通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
Ab-(L 2-L 1-D) y
(A)
其中：
D是细胞毒性药物；
L 1、L 2是接头单元；
y为1～20的数；
Ab为B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区；
所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：
SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，
SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11；
所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：
SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，
SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14。
在本发明的一个实施方案中，所述的抗体重链可变区还可以包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：
EQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，
SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，
SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，
SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，或者，
所述的抗体重链可变区还可以包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：
SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45；
所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：
SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，
SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，
SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，
SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结 合片段包含抗体重链可变区，其中所述的抗体重链可变区包含：
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；
或，
SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区，其中所述的抗体重链可变区包含：
SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；
或，
SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区，其中所述的抗体重链可变区包含：
SEQ ID NO:43所示的HCDR1、SEQ ID NO:44所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；
或，
SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:45所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab的抗体重链可变区包含选自以下(1)至(4)任一项的CDR：
(1)SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；
(2)SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID  NO:11所示的HCDR3；
(3)SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；或，
(4)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
所述Ab的抗体重链可变区还可以包含选自以下(5)至(6)的CDR：
(5)SEQ ID NO:43所示的HCDR1、SEQ ID NO:44所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；
或，
(6)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:45所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区，其中所述的抗体轻链可变区包含：
分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或者分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的一些实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区，其中所述的抗体轻链可变区包含：
分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或者分别如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的LCDR1、LCDR2和LCDR。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab的抗体轻链可变区包含选 自以下(1)至(4)任一项的CDR：
(1)SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
(2)SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3；
(3)SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或，
(4)SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段的重链和氢链可变区包含：
(1)分别如SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或者，
(2)分别如SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段的重链和氢链可变区包含：
(3)SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或者，
(4)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ  ID NO:31所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述抗B7-H4的抗体或其抗原结合片段的重链和氢链可变区包含：
(5)分别如SEQ ID NO:43所示的HCDR1、SEQ ID NO:44所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或者
(6)分别如SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:45所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab的抗体重链可变区和抗体轻链可变区包含选自以下(1)至(4)任一项的CDR：
(1)SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
(2)SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3；
(3)SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或，
(4)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
所述Ab的抗体重链可变区和抗体轻链可变区还可以包含选自以下(5)或(6)的CDR：
(5)SEQ ID NO:43所示的HCDR1、SEQ ID NO:44所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；
(6)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:45所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及
SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab是鼠源抗体或其片段，嵌合抗体或其片段，人抗体或其片段以及人源化抗体或其片段。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab进一步包含轻链骨架区和重链骨架区序列，所述轻链骨架区和重链骨架区序列分别源自人种系轻链和重链序列或其突变序列；
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab进一步包含重链恒定区，其中所述的重链恒定区包括源自人IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG3或其变体或IgG4或其变体的重链恒定区，优选源自人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区，更优选氨基酸突变后增强ADCC毒性的IgG1的重链恒定区，最优选如SEQ ID NO:54所示的重链恒定区；
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab进一步包含轻链恒定区，其中所述的重链恒定区包括源自人κ链、λ链或其变体的轻链恒定区，优选源自人 κ链的轻链恒定区，更优选如SEQ ID NO:55所示的轻链恒定区。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的轻链可变区：SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的轻链可变区：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同源性的轻链可变区。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的重链可变区：SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的重链可变区：SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同源性的重链可变区。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab的重链可变区和轻链可变区选自以下任意一种：
(1)SEQ ID NO：15所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；
(2)SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：18所示的轻链可变区。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述Ab的重链可变区和轻链可变区选自以下任意一种：
(1)SEQ ID NO：15所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；
(2)SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：18所示的轻链可变区；
(3)SEQ ID NO：35所示的重链可变区和SEQ ID NO：36所示的轻链可变 区；或，
(4)SEQ ID NO：37所示的重链可变区和SEQ ID NO：38所示的轻链可变区。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的轻链：SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的轻链：SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同源性的全长轻链。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的重链：SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab含有如下序列的重链：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同源性的全长重链。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab包含：
(1)SEQ ID NO:20的轻链和SEQ ID NO:19的重链；或，
(2)SEQ ID NO:22的轻链和SEQ ID NO:21的重链。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的Ab包含：
(1)SEQ ID NO:20的轻链和SEQ ID NO:19的重链；或，
(2)SEQ ID NO:22的轻链和SEQ ID NO:21的重链；或，
(3)SEQ ID NO:40的轻链和SEQ ID NO:39的重链；或，
(4)SEQ ID NO:42的轻链和SEQ ID NO:41的重链。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的抗B7-H4抗体抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键 稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的细胞毒性药物选自毒素、化疗药物、抗生素、放射性同位素和核溶酶；优选抑制细胞分裂的微管蛋白抑制剂或DNA拓扑异构酶抑制剂；更优选DM1、DM3、DM4、SN-38、MMAF或MMAE；进一步优选为微管蛋白抑制剂SN-38、MMAE或MMAF。其中MMAF和SN-38结构如下式所示：
Figure PCTCN2020094856-appb-000001
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的细胞毒性药物选自喜树碱衍生物，优选依喜替康，
Figure PCTCN2020094856-appb-000002
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
Figure PCTCN2020094856-appb-000003
其中：
L 1、L 2是接头单元：
y为选自1～8的数，优选为选自2-4的数；
Ab为如上述定义的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000004
其中：
L 1、L 2是接头单元：
y为选自1～8的数，优选为选自2-4的数：
Ab为如上述定义的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中，如前所述的通式(A)所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(III)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
Figure PCTCN2020094856-appb-000005
其中：
L 1、L 2是接头单元；
y为选自1～10的数，优选为选自2-8的数，更优选4-8的数；
或者，y优选为选自2-10的数，进一步为选自6-10的数，更优选7-9的数，最优选为7，8，9的整数；
Ab为如上述定义的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述L 1如以下通式(B)所示：
Figure PCTCN2020094856-appb-000006
其中：
M 1为-CR 1R 2-；
R 1和R 2相同或不同，各自独立的选自氢、烷基、卤素、羟基或氨基；
n为0～5的整数，优选1、2或3。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述L 2如以下通式(C)所示：
Figure PCTCN2020094856-appb-000007
其中：
M 2为-CR 4R 5-；
R 3选自氢原子、卤素、羟基、氨基、烷基、烷氧基和环烷基：
R 4和R 5相同或不同，各自独立的选自氢、烷基、卤素、羟基或氨基；
m为0～5的整数，优选1、2或3。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述L 2如以下通式(D)所示：
-K 1-K 2-K 3-K 4-
(D)
其中：
K 1为
Figure PCTCN2020094856-appb-000008
s为2至8的整数，进一步选为4至8的整数，更优选为4至6的整数；
K 2为-NR 1(CH 2CH 2O) pCH 2CH 2C(O)-、-NR 1(CH 2CH 2O) pCH 2C(O)-、-S(CH 2) pC(O)-或单键，p为1至20的整数，优选1-6；
R 1选自氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
K 3为四肽残基，优选地，所述四肽残基由选自两个或多个的苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基；更优选为GGFG的四肽残基；
K 4为-NR 2(CR 3R 4)t-，R 2、R 3或R 4各自独立地为氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基，t为1或2，
优选地，所述L 2的
K 1为
Figure PCTCN2020094856-appb-000009
s为5；
K 2为键；
K 3为GGFG的四肽残基；
K 4为-NR 2(CR 3R 4)t-，R 2、R 3或R 4各自独立地为氢、氘、羟基、氨基、C 1-6烷基、卤素、C 1-6卤代烷基、C 1-6氘代烷基和C 1-6羟烷基，t为1或2。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述的接头单元-L 2-，其K 1端与Ab相连，K 4端与L 1相连。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，L 1为-O-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-、-O-CR 5R 6-(CR aR b) m-、 -O-CR 5R 6-、-NH-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-；
R a和R b各自独立地选自氢、氘、卤素或烷基；
R 5为卤代烷基或环烷基；
R 6选自氢、卤代烷基或环烷基；
或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基；
m为0、1、2、3或4。
优选地，L 1的O端与接头单元L 2相连。
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述L 1如以下通式(E)所示：
Figure PCTCN2020094856-appb-000010
R 5为卤代烷基或环烷基，
R 6选自氢、卤代烷基或环烷基，
或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基；
优选地，
R 5为C 1-6卤代烷基或C 3-6环烷基，
R 6选自氢、C 1-6卤代烷基或环烷基，
或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0至4的整数；
更优选地，通式(E)选自以下取代基：
Figure PCTCN2020094856-appb-000011
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，所述-L 2-L 1-为以下结构：
Figure PCTCN2020094856-appb-000012
K 2为键；
K 3为GGFG的四肽残基；
R 5为卤代烷基或C 3-6环烷基；
R 6选自氢、卤代烷基或C 3-6环烷基；
或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 2、R 3或R 4各自独立地为氢或烷基；
s为2至8的整数，优选地，s为4、5或6的整数；
m为0至4的整数；
优选地，-L 2-L 1-选自：
Figure PCTCN2020094856-appb-000013
Figure PCTCN2020094856-appb-000014
在一个优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(IV)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000015
其中：
W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
K 2选自-NR 1(CH 2CH 2O) p1CH 2CH 2C(O)-、-NR 1(CH 2CH 2O) p1CH 2C(O)-、-S(CH 2) p1C(O)-或键，R 1选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基，p 1 为1至20的整数；
K 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，氨基酸可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基为一个或多个独立地选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基；
R 2独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R 3和R 4各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R 5选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R 6选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
m为0至4的整数；
y为1至10，y是小数或整数，优选地，y为2至10的数，更优选y为4至10的数，进一步优选6至9的数，最优选7、8或9的整数；
Ab为抗B7-H4抗体或其抗原结合片段。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(I-A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000016
y为1至10，y是小数或整数。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(I-B)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000017
y为1至10，y是小数或整数。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(II-A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000018
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(II-B)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000019
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为如通式(IV-A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000020
其中，s为2至8的整数，R 2～R 6、m和y如前述通式(IV)中所定义；
优选地，s为4、5或6的整数，y为4-10的数，优选为6-9的数，更优选为7或8。
在一个更优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，选自以下化合物，
Figure PCTCN2020094856-appb-000021
Figure PCTCN2020094856-appb-000022
Figure PCTCN2020094856-appb-000023
在一个最优选的实施方案中，如前所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自以下化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000024
Figure PCTCN2020094856-appb-000025
Figure PCTCN2020094856-appb-000026
Figure PCTCN2020094856-appb-000027
Figure PCTCN2020094856-appb-000028
Figure PCTCN2020094856-appb-000029
Figure PCTCN2020094856-appb-000030
Figure PCTCN2020094856-appb-000031
Figure PCTCN2020094856-appb-000032
Figure PCTCN2020094856-appb-000033
Figure PCTCN2020094856-appb-000034
Figure PCTCN2020094856-appb-000035
Figure PCTCN2020094856-appb-000036
Figure PCTCN2020094856-appb-000037
Figure PCTCN2020094856-appb-000038
Figure PCTCN2020094856-appb-000039
Figure PCTCN2020094856-appb-000040
Figure PCTCN2020094856-appb-000041
Figure PCTCN2020094856-appb-000042
Figure PCTCN2020094856-appb-000043
Figure PCTCN2020094856-appb-000044
Figure PCTCN2020094856-appb-000045
Figure PCTCN2020094856-appb-000046
Figure PCTCN2020094856-appb-000047
Figure PCTCN2020094856-appb-000048
Figure PCTCN2020094856-appb-000049
Figure PCTCN2020094856-appb-000050
Figure PCTCN2020094856-appb-000051
Figure PCTCN2020094856-appb-000052
Figure PCTCN2020094856-appb-000053
Figure PCTCN2020094856-appb-000054
Figure PCTCN2020094856-appb-000055
Figure PCTCN2020094856-appb-000056
Figure PCTCN2020094856-appb-000057
Figure PCTCN2020094856-appb-000058
Figure PCTCN2020094856-appb-000059
其中，y选自1～10的数，优选为选自2-10的数，进一步为选自6-10的数，更优选7-9的数，最优选为7，8，9的整数；或者y选自2-10的数，优选4-8的数，更优选6-8的数，进一步优选7-8的数，最优选8。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通式(IV)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法，其包括以下步骤：
Figure PCTCN2020094856-appb-000060
Ab还原后，与通式(F)偶联反应，得到通式(IV)所示的化合物；
其中：
Ab为抗B7H4抗体或其抗原结合片段；
W、K 2、K 3、R 2～R 6、m和y如通式(IV)中所定义。
在一个优选的实施方案中，所述的通式(F)为通式(F-1)所示的化合物：
Figure PCTCN2020094856-appb-000061
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
其中
K 2、K 3、R 2～R 6、s和m如前述-L 2-L 1-中所定义。
在一个优选的实施方案中，通式(F)或通式(F-1)所示的化合物选自：
Figure PCTCN2020094856-appb-000062
Figure PCTCN2020094856-appb-000063
Figure PCTCN2020094856-appb-000064
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明任一项所述的抗体－药物偶联物或所述抗体－药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通式(A)所述的抗体－药物偶联物或所述抗体－药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物或其药物组合物在制备用于治疗与人B7-H4相关的疾病的药物中的应用，优选在用于治疗B7-H4高表达癌症的药物中的应用。
在一个更优选的实施方案中，所述的癌症选自人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀肮癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊 索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波因肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铭细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、辜丸癌、胸腺癌、甲状腺转移性癌和子宫癌。
附图说明
图1：抗体-药物偶联物的体内药效：hu2G6-MC-MMAF和hu2F7-MC-MMAF在1.5mg/kg和3mg/kg的剂量下显示对MX-1移植瘤的抑制杀伤作用。
图2：药物载荷分别为2和4的hu2F7-MC-MMAF的HPLC谱图。
图3：药物载荷分别为2和4的hu2F7-MC-MMAF的抗肿瘤体内药效。
图4：药物载荷分别为2和4的hu2F7-MC-MMAF的抗肿瘤体内药效，图中显示第21天各组小鼠的肿瘤。
具体实施方式
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat或Chothia编号规则和Kabat或AbM定义规则(http://bioinf.org.uk/abs/)。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外用血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、B淋巴母细胞和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如作为MHC-I/MHC-II偶联物的组分。
术语“B7-H4”指人B7蛋白质家族的成员，也称为CD276，是具有四个Ig样胞外结构域的I型跨膜蛋白。B7-H4是抗原呈递细胞或癌细胞表面表达的免疫检 查点蛋白之一，对T细胞的功能激活有抑制作用。术语“B7-H4”包括由细胞天然表达的B7-H4的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的B7-H4交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人B7-H4特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。B7-H4或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗B7-H4抗体靶向具有正常糖基化模式的人源B7-H4。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人B7-H4的单克隆抗体。制备时用B7-H4抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源B7-H4抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行 最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后增强ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的 部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
本发明的术语“与B7-H4结合”，指能与人B7-H4相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人B7-H4作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的B7-H4结合的能力。 例如，结合人B7-H4的本发明的抗体也可以结合另一物种的B7-H4。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达B7-H4的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗B7-H4抗体接触时，与未与抗B7-H4抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，增强或降低降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人B7-H4或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致 抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症 状。
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下 文清楚可见。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。常规的药物组合物的制备见中国药典。
“可药用盐”是指本发明抗体-药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，其具有应有的生物活性。本发明抗体-药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
“溶剂化合物”指本发明的抗体-药物偶联物化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化合物，溶剂分子的非限制性实例包括：水、乙醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯。
“细胞毒性药物”在用于本发明时指抑制细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“微管蛋白抑制剂”是指通过抑制微管蛋白的聚合或促进微管蛋白的集合而干扰细胞有丝分裂过程，从而发挥抗肿瘤效果的一类化合物。其非限制性实例包括：美登素类、卡利奇霉素、紫杉烷类、长春新碱、秋水仙碱、尾海兔素/奥瑞他汀/单甲基奥瑞他汀E(MMAE)/单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
“接头”指抗体共价附着于药物的共价键或原子链的化学模块。接头的非限制性实例包括：亚芳基、亚杂芳基、PEG、聚亚甲基氧基、琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
“药物载荷”(DAR)由y表示，即通式(A)中每个抗体的平均细胞毒性药物数。本发明中的药物荷载范围可以为每个抗体1-20个细胞毒性药物(D)。通式(A)的抗体-药物偶联物为偶联有一定范围(1-20个)细胞毒性药物的抗体的集合。来自偶联反应的抗体-药物偶联物中的药物载荷(DAR)可通过常规手段表征，诸如质谱，HPLC和ELISA等。通过这些手段可以测定抗体-药物偶联物在y值上的定量分布。
二、缩写
MC＝6-马来酰亚氨基己酰基
VC＝缬氨酸-瓜氨酸
PAB＝对氨基苄氧羰基
MMAE＝单甲基奥瑞他汀E(MW 718)
MMAF＝单甲基奥瑞他汀E的变体，其在分子的C-末端处有苯丙氨酸(MW 731.5)
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：抗原准备和稳定细胞株构建
编码带His标签的人B7-H4(huB7-H4-His)序列、编码带Fc标签的人B7-H4(huB7-H4-Fc)序列由CRO公司Integrated DNA Technology(IDT)合成(以上B7-H4重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到pTT5载体上(Biovector)。重组的B7-H4蛋白在293T细胞表达后，通过如下实验方法进行纯化，纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。
huB7-H4-His序列：
Figure PCTCN2020094856-appb-000065
Figure PCTCN2020094856-appb-000066
huB7-H4-Fc序列：
Figure PCTCN2020094856-appb-000067
huB7-H4-His纯化步骤：
将HEK293细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液用离子交换(SP柱)进一步纯化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先将咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白置换到A液，并使用A液平衡SP柱，上样，B液浓度梯度0-100％，10倍柱体积洗脱，收集各洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，液相色谱-质谱联用(LC-MS)鉴定为正确后分装备用。
huB7-H4-Fc纯化步骤：
将HEK293细胞表达的上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS。用含有10mM磷酸缓冲液平衡Protein A亲和力柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有25倍柱体积缓冲液冲洗柱子，至A280读数降至基线。再用pH 3.5的0.8％醋酸缓冲液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰，分装后立刻加入1M Tris-Cl pH8.0缓冲液中和，然后使用Millipore’s Amico-15滤柱置换溶液为PBS pH 6.9。所得到的蛋白经电泳，肽图，液相色谱-质谱联用(LC-MS)鉴定后分装备用。
稳定CHO-S细胞池构建：
编码人或食蟹猴B7-H4蛋白(huB7-H4或cyB7-H4)的全长序列由Integrated DNA Technology(IDT)公司合成(以上B7-H4重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到改造过的pcDNA3.1载体上，pcDNA3.1/puro(Invitrogen#V79020)。CHO-S(ATCC)细胞于CD-CHO培养基(Life Technologies,#10743029)内培养至0.5x10 6个/ml。将10ug编码huB7-H4或cyB7-H4基因的载体与50ul LF-LTX(Life Technologies,#A12621)在1ml Opti-MEM培养基(Life Technologies,#31985088)中混合，室温孵育20分钟后，加入CHO细胞培养液中并放入二氧化碳培养箱培养。24小时后更换新培养基并加入10ug/ml嘌呤霉素。之后每2-3天更换一次新培养液，经过10-12天筛选后得到稳定CHO-S细胞池。
实施例2：鼠杂交瘤及抗体序列的获得
用人抗原huB7-H4-Fc进行动物免疫，共5只Balb/c和5只A/J小鼠，雌性，10周龄，使用Sigma完全弗氏佐剂(CFA)和Sigma不完全弗氏佐剂(IFA)，免疫原和免疫佐剂以1:1的比例充分混合乳化，制成稳定“油包水”液体；注射剂量25μg/200μL/小鼠。
第01天：第一次免疫，完全弗氏佐剂。
第21天：第二次免疫，不完全弗氏佐剂。
第35天：第三次免疫，不完全弗氏佐剂。
第42天：采血和血清效价检测(3免血)。
第49天：第四次免疫，不完全弗氏佐剂。
第56天：采血和血清效价检测(4免血)。
间接ELISA法检测抗体或血清的亲和力：用pH7.4的PBS将huB7-H4-His蛋白稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔高亲和力酶标板中，于4℃冰箱孵育过夜(16-20小时)。用PBST(pH7.4PBS含0.05％Tween-20)洗板4次后，加入用PBST稀释的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液150μl/孔，室温孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次。用含3％BSA的PBST稀释待测抗体或血清，1μM起始，10倍梯度，10个剂量，以100μl/孔加到酶标板中，放于室温孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3％BSA的PBST稀释的HRP标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室温孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，于室温避光孵育1分钟，加入100μl/孔终止溶液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)终止反应，用酶标仪(BioTek，型号Synergy H1)在450nm处读取吸收值，分析数据，获得抗体或血清与人B7-H4抗原结合的亲和力。
对免疫小鼠血清使用间接ELISA法评估血清效价及结合细胞表面抗原的能力，对照效价检测情况(大于10万倍稀释度)决定启动细胞融合。选择血清效价、亲和力和FACS结合强的免疫小鼠进行一次终免疫后处死小鼠，取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后铺板获得杂交瘤，通过间接ELISA筛选到目标杂交瘤，并通过有限稀释法建株为单克隆细胞株。得到的阳性抗体株进一步使用稳转表达huB7-H4和cyB7-H4的CHO-S细胞，对比空白CHO-S细胞以排除非特异性结合抗体杂交瘤株，用类似于实施例5体外细胞结合实验的方法进行筛选，筛选到目标杂交瘤，并通过有限稀释法建株为单克隆细胞株。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA并反转录(PrimeScript TM Reverse Transcriptase，Takara#2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-引物组(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序，最终得到4株鼠源抗体 的序列用于人源化和抗体-药物偶联物的构建。
鼠单抗2G6的重链和轻链可变区序列如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000068
鼠单抗2G6的重链和轻链可变区包含如下CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSRYGMS SEQ ID NO：3
HCDR2 GINGGGSYTYYLDTVKG SEQ ID NO：4
HCDR3 QGSNYYFDY SEQ ID NO：5
LCDR1 HASQGISSNIG SEQ ID NO：6
LCDR2 HGTNLED SEQ ID NO：7
LCDR3 VQYAQFPYT SEQ ID NO：8
鼠单抗2F7的重链和轻链可变区序列如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000069
Figure PCTCN2020094856-appb-000070
鼠单抗2F7的重链和轻链可变区包含如下CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSNYYMS SEQ ID NO：9
HCDR2 YVSSGGGSTYYSDSVKG SEQ ID NO：10
HCDR3 ESYSQGNYFDY SEQ ID NO：11
LCDR1 RASQSISDYLH SEQ ID NO：12
LCDR2 FASQSIS SEQ ID NO：13
LCDR3 QNGHSFSLT SEQ ID NO：14
鼠单抗2F8的重链和轻链可变区序列如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000071
Figure PCTCN2020094856-appb-000072
鼠单抗2F8的重链和轻链可变区包含如下CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GYTFTNSWMN SEQ ID NO：23
HCDR2 GIYPNSGNIEYNEKFKG SEQ ID NO：24
HCDR3 DSRFSY SEQ ID NO：25
LCDR1 KASQDVRTAVA SEQ ID NO：26
LCDR2 STSYRYT SEQ ID NO：27
LCDR3 QQHYSTPLT SEQ ID NO：28
鼠单抗1C9的重链和轻链可变区序列如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000073
鼠单抗1C9的重链和轻链可变区包含如下CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GDTFTTY SEQ ID NO：29
HCDR2 YLNSGS SEQ ID NO：30
HCDR3 DSRFSY SEQ ID NO：31
LCDR1 KASQDVSTAVA SEQ ID NO：32
LCDR2 SASYRYT SEQ ID NO：33
LCDR3 QQHYNTPLT SEQ ID NO：34
实施例3：小鼠抗体人源化实验
鼠源抗人B7-H4单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，本发明根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，将鼠源抗体2G6、2F7、2F8和1C9人源化。将鼠源抗体2G6和2F7的CDR区移植到选择好的相应人源化模板上，替换人源化可变区，再与IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，其中鼠单抗2F8的HCDR1优化为GYTFTSSWMN(SEQ ID NO:43)，HCDR2优化为GIYPNRGNIEYNEKFKG(SEQ ID NO:44)，鼠单抗1C9的HCDR2优化为YLNRGS(SEQ ID NO:45)，设计如下轻重链可变区序列组合而成的人源化抗体。
人源化抗体hu2G6的重轻链可变区如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000074
Figure PCTCN2020094856-appb-000075
人源化抗体hu2F7的重轻链可变区如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000076
人源化抗体hu2F8的重轻链可变区如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000077
人源化抗体hu1C9的重轻链可变区如下：
Figure PCTCN2020094856-appb-000078
Figure PCTCN2020094856-appb-000079
将可变区与IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组，示例性的重轻链恒定区序列如下所示，
Figure PCTCN2020094856-appb-000080
经连接后，得到如下示例性的轻重链序列组成的人源化抗体：
Figure PCTCN2020094856-appb-000081
Figure PCTCN2020094856-appb-000082
Figure PCTCN2020094856-appb-000083
Figure PCTCN2020094856-appb-000084
实施例4：抗B7-H4人源化抗体表达
根据人源化抗体序列设计重组载体。重链载体设计如下：信号肽+人源化重链。轻链载体设计如下：信号肽+人源化轻链。
分别将上述序列插入pCEP4载体(ThermoFisher #V04450)。按照上述设计合成表达载体，得到载体质粒后，大抽质粒，将质粒送测序验证。将验证合格的质粒用PEI(ThermoFisher # BMS1003-A)转染至人293F细胞(ThermoFisher # R79007)中，连续培养，将293F细胞用无血清培养液(上海奥浦迈生物，OPM-293 CD03)培养至对数生长期用于细胞转染。将21.4μg人源化抗体轻链质粒和23.6μg人源化抗体重链质粒溶解在10ml
Figure PCTCN2020094856-appb-000085
I Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混匀，然后加入200ug PEI，混匀，RT孵育15min，加入50mL细胞中。细胞培养条件：5％CO2，37℃，125rpm/min。培养期间，第1天和第3天加补料，直到细胞活率低于70％，收取细胞上清，离心过滤。将离心过滤后的 细胞培养液上样到抗体纯化亲和柱，经磷酸缓冲液洗柱、甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)洗脱、1M Tris盐酸pH 9.0中和、以及磷酸缓冲液透析，最终获得纯化的人源化抗体，可用于各实施例实验中。
实施例5：人源化抗体的体外结合活性检测
对设计的人源化抗体在体外进行了以下实验测定：
1.体外细胞结合实验：
收集培养好的表达人B7-H4的MX-1细胞(CLS Cell Lines Service GmbH #300296)，用pH为7.4的PBS调节细胞密度后分铺于96孔V型底板，每孔1x10 5个细胞。2000rpm离心5分钟，去上清，每孔加入100μl已梯度稀释的人源化抗体溶液(用含0.5％BSA的PBS稀释，1μM起始，3倍梯度，10个剂量)，混匀，4℃摇床孵育1个小时；2000rpm离心5分钟，去上清，PBS洗细胞2次后，每孔加入100μl用0.5％BSA的PBS稀释的FITC标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97224)，混匀，4℃摇床孵育30分钟。2000rpm离心5分钟，去上清。PBS洗细胞2次后，再重悬于PBS，使用流式细胞仪(BECKMAN COULTER，型号DxFLEX)检测信号，并作浓度曲线分析结果。结果如表1所示，人源化抗体hu2G6和hu2F7均与高表达B7-H4的MX-1细胞阳性结合。
表1.各人源化抗体对MX-1细胞的亲和力(EC 50)
抗体名称 与MX-1细胞的FACS Binding EC 50(nM)
hu2G6 14.3
hu2F8 7.26
hu1C9 7.25
hu2F7 7.32
2.亲和力动力学实验：
Biacore方法是公认的客观检测蛋白相互间亲和力和动力学的检测方法。通过Biacore T200(GE)分析本发明待测抗体表征亲和力及结合动力学。利用由Biacore提供的试剂盒，采用NHS标准氨基偶联法将本发明待测抗B7-H4抗体共价连接至CM5(GE)芯片上。然后将稀释于同样缓冲液中的50nM人huB7-H4-His蛋白进样，流速10uL/min，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用GE的BIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法计算人源化抗体亲和动力学数据如表2所示，人源化抗体hu2G6、hu2F7、hu2F8和hu1C9均对人B7-H4抗原蛋白显出很强的亲和力。
表2.各人源化抗体亲和力及动力学表征
Figure PCTCN2020094856-appb-000086
实施例6：抗B7-H4抗体的内吞作用
为检测本发明抗体结合B7-H4后是否能够和人B7-H4共同内吞入细胞内，用MX-1细胞进行评估。MX-1细胞使用胰酶消化(先用PBS清洗一遍，37℃、2min左右)，收集细胞并用预冷的FACS buffer重悬，调整细胞浓度为1×10 6个/mL。取EP管，加入1mL细胞悬液，1500rpm离心5分钟后去上清，加入1mL已经配制好的待测抗体重悬细胞，抗体的终浓度均为20μg/ml，4度摇床孵育1h， 离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS buffer洗涤两次，去上清。每管加入100μL荧光二抗工作液重悬细胞，4℃摇床孵育30min，离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS buffer洗涤两次，去上清。每管加入1.0mL预热的MX-1细胞完全培养基重悬细胞并混匀，分装为4管，每管200μL，分别为0min组，blank组，30min组和2h组，取出0min及blank置于冰上，其余放置于37℃培养箱，分别内吞30min、2h，在相应时间点取出EP管，置于冰上预冷5min，所有处理组离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，用FACS buffer洗涤一次，去上清。除0min组外所有处理组EP管中加入250μL strip buffer，室温孵育8min，离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS buffer洗涤两次，去上清。所有处理组加入100μL免疫染色固定液，4℃放置30min以上，用流式细胞仪DxFlex进行检测。B7-H4抗体内吞百分比(％)＝(各个时间点平均荧光强度值-blank组平均荧光强度值)/(零点时的平均荧光轻度值-blank组平均荧光强度值)×100％。结果见表3：
表3.人源化抗体介导的B7-H4蛋白内吞效率
抗体 0小时(％) 0.5小时(％) 2小时(％)
IgG对照 0 0.1 0.9
hu2G6 0 18.6 28.7
hu2F7 0 13.9 25.9
实施例7：抗体偶联MC-MMAF
本发明抗体具有细胞亲和活性且具有细胞内吞活性，使得本发明抗体适合与药物偶联形成抗体-药物偶联物用于治疗B7-H4介导的疾病。偶联过程见下式，其中Ab代表hu2G6或hu2F7：
Figure PCTCN2020094856-appb-000087
第一步将硫代乙酸S-(3-羟基丙基)酯(0.7mg，5.3mol)溶解于0.9mL乙腈溶液备用。向抗体pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.35mg/mL,9.0mL，0.97mol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羟基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加1.0mL的氰基硼氢化钠(14.1mg，224mol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后，用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，得产物1f溶液，浓缩到10mg/mL后直接进行下一步反应。
第二步，向1f溶液(11.0mL)中加入0.35mL的2.0M盐酸羧胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，得到产物2f溶液(浓度6.17mg/mL，14.7mL)。
第三步，将化合物MC-MMAF(1.1mg，1.2mol，采用PCT专利W02005081711公开的方法制备得到)溶解于0.3mL乙腈中，加入2f溶液(浓度6.17mg/mL，3.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，在无菌条件下用滤器过滤后得到产物Ab-MC-MMAF抗体-药物偶联物的PBS缓冲液(3.7mg/mL，4.7mL)，于4℃冷藏。使用HIC-HPLC测定产物hu2G6-MC-MMAF的平均值y为3.8，通过HIC-HPLC纯化得到hu2G6-MC-MMAF(y＝4)的样品。使用HIC-HPLC测定产物hu2F7-MC-MMAF的平均值y为3.2，通过HIC-HPLC纯化得到hu2F7-MC-MMAF(y＝2)和hu2F7-MC-MMAF(y＝4)的样品。
实施例8：抗体偶联SN-38
通过以下偶联过程制备抗体偶联药物，其中Ab代表hu2F7：
Figure PCTCN2020094856-appb-000088
第一步将硫代乙酸S-(3-羟基丙基)酯(0.7mg，5.3mol)溶解于0.9mL乙腈溶液备用。向抗体pH＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.35mg/mL,9.0mL，0.97mol)加入上述预制的硫代乙酸S-(3-羟基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加1.0mL的氰基硼氢化钠(14.1mg，224mol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后，用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，得产物1h溶液，浓缩到10mg/mL后直接进行下一步反应。
第二步，向1h溶液(11.0mL)中加入0.35mL的2.0M盐酸羧胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后，将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，得到产物2h溶液(浓度6.2mg/mL，15.0mL)，浓缩到约10mg/ml后用于下一步反应。
第三步，将化合物MC-VC-PAB-SN-38(1.3mg，1.2mol)溶解于0.3ml的乙腈中，加入2h溶液(浓度6.2mg/mL，3.0mL)中，于25℃下振荡反应4小时后， 将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)后，在无菌条件下用滤器过滤后得到产物hu2F7-SN-38抗体-药物偶联物的PBS缓冲液(3.7mg/mL，4.7mL)，于4℃冷藏。采用紫外法测定平均值y。将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
数据处理：
通过建立标准曲线，测定280nm波长下的吸收，确定抗体含量Cmab，测定370nm波长下的吸收，确定小分子含量CDrug。
药物载量平均值y＝CDrug/Cmab
通过以上方法测定产物hu2F7-SN-38的平均值y＝3.7，通过UV-HPLC纯化得到hu2F7-SN-38(y＝4)样品。
实施例9：抗体偶联依喜替康
Figure PCTCN2020094856-appb-000089
第一步，将2a(2g，17.2mmol溶于75mL乙腈中，依次加入碳酸钾(9.27g，67.2mmol)、溴化苄(20mL，167.2mmol)和四丁基碘化铵(620mg，1.68mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(20ml)淋洗， 合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到产物5a(3.2g，产率：90.1％)。
第二步，将5a(181.3mg,0.879mmol)和4b(270mg，0.733mmol)加入反应瓶，加入6mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(164mg，1.46mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟，加入15mL冰水，用乙酸乙酯(40mL×2)和氯仿(20mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于6mL二氧六环中，加入3mL水，加入碳酸氢钠(73.8mg，0.879mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(190mg，0.734mmol)，室温搅拌2小时。加入30mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到产物5b 10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯(73mg，产率：19.4％)。
MS m/z(ESI):515.0[M+1]。
第三步，将5b(30mg，0.058mmol)溶于6.75mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(18mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品产物5c 10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸(20mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):424.9[M+1]。
第四步，将1b(15mg，28.2μmol)加入反应瓶，加入1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品5c(20mg，47.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(25.4mg，86.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入15mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5d(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-环丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯(23.7mg，产率：78.9％)。
MS m/z(ESI):842.1[M+1]。
第五步，将5d(30mg，35.7μmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入1.5mL二乙 胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入1.5mL甲苯并减压浓缩，重复两次。向残余物中加入4.5mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品产物5e 2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(23mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):638.0[M+18]。
第六步，将粗品5e(20mg，32.3μmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入4g(31.8mg，67.3μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(27.8mg，94.3μmol)，冰浴搅拌反应10分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物5。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到产物5-A和5-B(3.6mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI):1074.4[M+1]。
单一构型化合物5-A(较短保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.14分钟，纯度：85％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,2H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,2H),2.80-2.62(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
单一构型化合物5-B(较长保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.16分钟，纯度：89％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s, 2H),5.35-5.15(m,3H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
其他中间体的制备方法参考中间体5。
在37℃条件下，向抗体hu2F7的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至14.0ml，并取出3.3ml溶液往下反应。
将化合物5-A(3.0mg，3.72μmol)溶解于0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到Ab-依喜替康的示例性产物hu2F7-依喜替康(化合物34)的PBS缓冲液(1.35mg/mL，13mL)，于4℃冷冻储存。采用紫外法测定平均值y。将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
数据处理：
通过建立标准曲线，测定280nm波长下的吸收，确定抗体含量Cmab，测定370nm波长下的吸收，确定小分子含量CDrug。
药物载量平均值y＝CDrug/Cmab
通过以上方法测定示例性产物hu2F7-依喜替康(化合物34)为7.6。通过UV-HPLC纯化获得hu2F7-依喜替康(y＝8)样品。
其他抗体偶联物的制备方法参考化合物34。
实施例10：抗体-药物偶联物对肿瘤细胞杀伤活性
为检测本发明的抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用，用乳腺癌细胞 MX-1进行评估。收集MX-1细胞，离心计数后用完全培养基调整细胞密度为0.44×10 6个/mL，铺于白色96孔板中间60个孔，每孔90μL，细胞数为40000，其余边孔加入100μL PBS，细胞板放入37℃，5％CO2培养箱培养过夜。实验第二天，用PBS在96孔V型底板中配制抗体-药物偶联物溶液，浓度为1000nM起始，3倍稀释，9个浓度，配制完成后加入到白色96孔板中，每孔10μL，两复孔，将细胞板放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养72小时。实验第五天，检测读数：取出细胞培养板后，设置两个对照复孔，每个复孔加入含有40000个细胞的100μL培养基，平衡至室温后，每孔加入50μL CTG溶液(Promega G7573)，振荡混匀后放于暗处静置10分钟后，使用酶标仪的发光程序进行检测。最大杀伤率＝(1-1000nM孔荧光值/对照孔荧光值)％实验结果如表4所示：
表4.抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的杀伤活性评价
Figure PCTCN2020094856-appb-000090
ND:没有检测到活性
实施例11：抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的生长抑制作用
为检测本发明的抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用，用乳腺癌细胞SK-BR-3(ATCC#HTB30)进行评估。收集SK-BR-3细胞，离心计数后用完全培养基调整细胞密度为0.44×10 6个/mL，铺于白色96孔板中间60个孔，每孔90μL，细胞数为40000，其余边孔加入100μL PBS，细胞板放入37℃，5％CO2培养箱培养过夜。实验第二天，用PBS在96孔V型底板中配制抗体-药物偶联物溶液，浓度为1000nM起始，3倍稀释，9个浓度，配制完成后加入到白色96孔板中，每孔10μL，两复孔，另外设置两个对照复孔，每孔加入每孔10μL的PBS。将细胞板放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养72小时。实验第五天，检测读数：取出细胞培养板，平衡至室温后，每孔加入50μL CTG溶液(Promega G7573)，振荡混匀后放于暗处静置10分钟后，使用酶标仪的发光程序进行检测。最大抑制率＝(1-1000nM孔荧光值/对照孔荧光值)％实验结果如表5所示：
表5.抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的抑制活性评价
Figure PCTCN2020094856-appb-000091
ND：没有检测到活性
实施例12：偶联MMAF的抗体-药物偶联物体内药效评估
在小鼠体内用MX-1细胞形成移植瘤后，评估本发明抗体-药物偶联物的抗肿瘤效果。将5x10 6个MX-1细胞注射到免疫缺陷的裸鼠(BALB/c Nude)皮下，2周后开始通过静脉注射抗体-药物偶联物hu2G6-MC-MMAF和hu2F7-MC-MMAF，每周注射一次，剂量为1.5mg/kg或3mg/kg。对照采用人IgG1 蛋白，剂量为3mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。抑瘤率＝100％-(第21天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第21天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。实验结果如图1和表6示。hu2G6-MC-MMAF和hu2F7-MC-MMAF均显示与剂量相关的抗肿瘤效果。在3mg/kg的剂量下，hu2G6-MC-MMAF和hu2F7-MC-MMAF均显示了超过100％的抑瘤率，意味着本发明的抗体-药物偶联物不仅能抑制肿瘤的生长，而且对已形成的肿瘤有杀伤的作用。
表6.给药化合物对荷瘤裸鼠MX-1移植瘤的疗效
Figure PCTCN2020094856-appb-000092
实施例13：不同药物载荷的抗体-药物偶联物体内药效评估
为进一步研究不同药物载荷的抗体-药物偶联物，通过实施例7的方法制备抗体-药物偶联物，通过HPLC纯化获得hu2F7-MC-MMAF(y＝2)和hu2F7-MC-MMAF(y＝4)(图2)。在小鼠体内用MX-1形成移植瘤后，评估本发明抗体-药物偶联物的抗肿瘤效果。将5x10 6个MX-1细胞注射到免疫缺陷的裸鼠皮下，2周后开始通过静脉注射抗体-药物偶联物hu2F7-MC-MMAF(y＝2) 和hu2F7-MC-MMAF(y＝4)，每周注射一次，剂量为3mg/kg。对照采用人IgG1蛋白，剂量为3mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。抑瘤率＝100％-(第21天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第21天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。实验结果如图3和表7所示。hu2F7-MC-MMAF(y＝2)和hu2F7-MC-MMAF(y＝4)均显示抗肿瘤效果。在3mg/kg的剂量下，hu2F7-MC-MMAF(y＝4)的抗肿瘤效果强于hu2F7-MC-MMAF(y＝2)，显示了超过100％的抑瘤率，意味着hu2F7-MC-MMAF(y＝4)不仅能抑制肿瘤的生长，而且对已形成的肿瘤有杀伤的作用(图4)。
表7.不同药物载荷的抗体-药物偶联物对荷瘤裸鼠MX-1移植瘤的疗效
给药组 抑瘤率
hu2F7-MC-MMAF(y＝2)3mg/kg 87.99％
hu2F7-MC-MMAF(y＝4)3mg/kg 197.87％
实施例14：偶联依喜替康的抗体-药物偶联物体内药效评估
为研究偶联依喜替康的抗体-药物偶联物，通过实施例9的方法制备抗体-药物偶联物，通过HPLC纯化获得hu2F7-依喜替康(化合物34，y＝8)。在小鼠体内用MX-1形成移植瘤后，评估本发明抗体-药物偶联物的抗肿瘤效果。将5x10 6个MX-1细胞注射到免疫缺陷的裸鼠皮下，2周后开始通过静脉注射抗体-药物偶联物hu2F7-依喜替康(y＝8)，每周注射一次，剂量分别为5mg/kg和10mg/kg。对照采用人IgG1蛋白，剂量为5mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。抑瘤率＝100％-(第18天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第18天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。实验结果如表8所示。hu2F7-依喜替康在5mg/kg和10mg/kg的剂量下均显示了超过100％的抑瘤率，意味着hu2F7-依喜替康(y＝8)不仅能抑制肿瘤的生长，而且对已形成的肿瘤有杀伤的作用。
表8.偶联依喜替康的抗体-药物偶联物对荷瘤裸鼠MX-1移植瘤的疗效
Figure PCTCN2020094856-appb-000093
实施例15：偶联依喜替康的抗体-药物偶联物旁观者杀伤活性实验
为研究本发明的偶联依喜替康的抗体-药物偶联物通过旁观者效应杀伤B7-H4阴性细胞的作用，利用ONE-Glo TM Luciferase Assay检测试剂盒检测抗体-药物偶联物对B7-H4表达阴性的骨髓瘤细胞系细胞的杀伤活性。收集MX-1细胞，离心计数后用完全培养基将细胞调整为7.5×10 6个/mL的细胞悬浮液，铺于白色96孔板中。在“混合细胞组”中，每孔加入33μL的MX-1细胞悬浮液，在“单一细胞组”每孔加入33μL PBS。收集B7-H4表达阴性的NCI-H929-LUC肿瘤细胞(Cobioer货号CBP30061L)，调整细胞密度至1.5x10 6个/mL。在“混合细胞组”和“单一细胞组”中，每孔加入33μL的NCI-H929-LUC细胞悬浮液。细胞板放入37℃，5％CO2培养箱培养过夜。实验第二天，将待测抗体-药物偶联物hu2F7-依喜替康(化合物34，y＝8)的最高浓度统一调整为3000nM,按照5倍梯度，9个剂量进行稀释。于实验板中每孔加入33.3uL稀释好的待测抗体-药物偶联物工作液，轻轻混匀。将细胞板置于37℃,5％培养箱中孵育48小时。取出细胞培养板，平衡至室温后，每孔加入100μL ONE-Glo TM Luciferase试剂(Promega E6120)。室温避光震荡裂解10分钟,以1000rmp/min的速度离心1分钟后将细胞裂解物转移至底部透明的96孔板，每孔加入180μL，在酶标仪上490nm波长处读数。用Graphpad Prism软件分析数据，实验结果如表9所示。ONE-Glo TM Luciferase试剂可以特异性的检测NCI-H929-LUC细胞的活率。hu2F7-依喜替康在“混合细胞组”中有效的杀伤了NCI-H929-LUC细胞，说明在B7-H4 阳性细胞存在的情况下，hu2F7-依喜替康具备旁观者杀伤效应，不仅能杀伤B7-H4阳性细胞，而且能杀伤原本不敏感的B7-H4阴性性细胞(见“单一细胞组”)。
表9.旁观者杀伤活性评价
Figure PCTCN2020094856-appb-000094
ND：没有检测到活性

Claims (41)

  1. 一种如通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
    Ab-(L 2-L 1-D) y
    (A)
    其中：
    D是细胞毒性药物；
    L 1、L 2是接头单元；
    y为1～20的数；
    Ab为B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区，
    所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的HCDR：
    SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，
    SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，
    SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，
    SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，
    所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：
    SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，
    SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，
    SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，
    SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34。
  2. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab的抗体重链可变区包含选自以下(1)至(4)任一项的CDR：
    (1)SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；
    (2)SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
    (3)SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ  ID NO:25所示的HCDR3；或，
    (4)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
  3. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab的抗体轻链可变区包含选自以下(1)至(4)任一项的CDR：
    (1)SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
    (2)SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3；
    (3)SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或，
    (4)SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
  4. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab的抗体重链可变区和抗体轻链可变区包含选自以下(1)至(4)任一项的CDR：
    (1)SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及
    SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
    (2)SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；以及
    SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3；
    (3)SEQ ID NO:23所示的HCDR1、SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:25所示的HCDR3；以及
    SEQ ID NO:26所示的LCDR1、SEQ ID NO:27所示的LCDR2和SEQ ID NO:28所示的LCDR3；或，
    (4)SEQ ID NO:29所示的HCDR1、SEQ ID NO:30所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3；以及
    SEQ ID NO:32所示的LCDR1、SEQ ID NO:33所示的LCDR2和SEQ ID NO:34所示的LCDR3。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab是鼠源抗体或其片段，嵌合抗体或其片段，人抗体或其片段以及人源化抗体或其片段。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述Ab进一步包含(a)、(b)和(c)中的任一项或其组合：
    (a)源自人种系轻链和重链序列或其突变序列的轻链骨架区和重链骨架区；
    (b)源自人IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG3或其变体或IgG4或其变体的重链恒定区，优选源自人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区，更优选氨基酸突变后增强ADCC毒性的IgG1的重链恒定区，最优选如SEQ ID NO:54所示的重链恒定区；
    (c)源自人κ链、λ链或其变体的轻链恒定区，优选源自人κ链的轻链恒定区，更优选如SEQ ID NO:55所示的轻链恒定区。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab含有如下序列的轻链可变区：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同源性的轻链可变区。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab含有如下序列的重链可变区：SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同源性的重链可变区。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的 盐或溶剂化合物，其中所述Ab的轻链选自如下序列：SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同源性的全长轻链。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的Ab的重链选自如下序列：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，或与其具有至少80％，85％，90％，95％或99％同源性的全长重链。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab的重链可变区和轻链可变区选自以下任意一种：
    (1)SEQ ID NO：15所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；
    (2)SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：18所示的轻链可变区；
    (3)SEQ ID NO：35所示的重链可变区和SEQ ID NO：36所示的轻链可变区；或，
    (4)SEQ ID NO：37所示的重链可变区和SEQ ID NO：38所示的轻链可变区。
  12. 根据权利要求11所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述Ab选自以下任意一种：
    (1)SEQ ID NO:20所示的轻链和如SEQ ID NO:19所示的重链；
    (2)SEQ ID NO:22所示的轻链和如SEQ ID NO:21所示的重链；
    (3)SEQ ID NO:40所示的轻链和如SEQ ID NO:39所示的重链；或，
    (4)SEQ ID NO:42所示的轻链和如SEQ ID NO:41所示的重链。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、二聚化的V区、二硫键稳定化的V区和包含CDR的肽的抗原结合片段。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的细胞毒性药物选自毒素、化疗药物、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的细胞毒性药物选自抑制细胞分裂的微管蛋白抑制剂或DNA拓扑异构酶抑制剂；优选DM1、DM3、DM4、SN-38、MMAF或MMAE；更优选为微管蛋白抑制剂SN-38、MMAE或MMAF。
  16. 根据权利要求1-14中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的细胞毒性药物选自喜树碱衍生物，优选依喜替康：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100001
  17. 根据权利要求1-15中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的细胞毒性药物选自：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100002
  18. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(I)所示，
    Figure PCTCN2020094856-appb-100003
    其中：
    L 1、L 2是接头单元：
    y为选自1～8的数，优选为选自2-4的数；
    Ab为权利要求1-12中任一项所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
  19. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(II)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100004
    其中：
    L 1、L 2是接头单元：
    y为选自1～8的数，优选为选自2-4的数：
    Ab为权利要求1-12中任一项所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
  20. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(III)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100005
    其中：
    L 1、L 2是接头单元；
    y为选自1～10的数，优选为选自2-8的数，更优选4-8的数，进一步优选6-8的数，最优选8；
    Ab为权利要求1-12中任一项所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
  21. 根据权利要求18-20中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L 1如通式(B)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100006
    其中：
    M 1为-CR 1R 2-；
    R 1和R 2相同或不同，各自独立的选自氢、烷基、卤素、羟基或氨基；
    n为0～5的整数，优选1、2或3。
  22. 根据权利要求18-20中任一项所述抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L 2如通式(C)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100007
    其中：
    M 2为-CR 4R 5-；
    R 3选自氢、卤素、羟基、氨基、烷基、烷氧基和环烷基：
    R 4和R 5相同或不同，各自独立的选自氢、烷基、卤素、羟基或氨基；
    m为0～5的整数，优选1、2或3。
  23. 根据权利要求18-20中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述L 2如通式(D)所示：
    -K 1-K 2-K 3-K 4-
    (D)
    其中：
    K 1为
    Figure PCTCN2020094856-appb-100008
    s为2至8的整数；
    K 2选自-NR 1(CH 2CH 2O) pCH 2CH 2C(O)-、-NR 1(CH 2CH 2O) pCH 2C(O)-、-S(CH 2) pC(O)-或单键，p为1至20的整数，优选1-6；
    R 1选自氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    K 3为四肽残基，优选地，所述四肽残基由选自两个或多个的苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基；更优选为GGFG的四肽残基；
    K 4为-NR 2(CR 3R 4) t-，R 2、R 3或R 4各自独立地为氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基，t为1或2。
  24. 根据权利要求23所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的接头单元-L 2-，其K 1端与Ab相连，K 4端与L 1相连。
  25. 根据权利要求18-20中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中：
    L 1选自-O-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-、-O-CR 5R 6-(CR aR b) m-、-O-CR 5R 6-、-NH-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 5R 6-C(O)-；
    R a和R b各自独立地选自氢、氘、卤素或烷基；
    R 5为卤代烷基或环烷基；
    R 6选自氢、卤代烷基或环烷基；
    或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基；
    m为0、1、2、3或4。
  26. 根据权利要求25所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L 1的O端与接头单元L 2相连。
  27. 根据权利要求25所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述L 1如通式(E)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100009
    R 5选自卤代烷基或环烷基，
    R 6选自氢、卤代烷基或环烷基，
    或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基；
    优选地，
    R 5选自C 1-6卤代烷基或C 3-6环烷基，
    R 6选自氢、C 1-6卤代烷基或C 3-6环烷基，
    或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    m为0至4的整数；
    更优选地，通式(E)选自以下取代基：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100010
  28. 根据权利要求1-27中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述-L 2-L 1-如以下结构所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100011
    K 2为键；
    K 3为GGFG的四肽残基；
    R 5选自卤代烷基或C 3-6环烷基；
    R 6选自氢、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    R 2、R 3或R 4各自独立地为氢或烷基；
    s为2至8的整数；
    m为0至4的整数；
    优选地，所述-L 2-L 1-选自以下结构：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100012
    Figure PCTCN2020094856-appb-100013
  29. 根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(IV)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100014
    其中：
    W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基任选地进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
    K 2选自-NR 1(CH 2CH 2O) p1CH 2CH 2C(O)-、-NR 1(CH 2CH 2O) p1CH 2C(O)-、-S(CH 2) p1C(O)-或键，R 1选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基，p 1 为1至20的整数；
    K 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，氨基酸可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基为一个或多个独立地选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基；
    R 2独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 3和R 4各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 5选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 6选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 5和R 6与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    m为0至4的整数；
    y为1至10，y是小数或整数；
    Ab为抗B7-H4抗体或其抗原结合片段。
  30. 根据权利要求18所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(I-A)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100015
  31. 根据权利要求18所述的通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(I-B)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100016
  32. 根据权利要求19所述的通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上 可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(II-A)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100017
  33. 根据权利要求19所述的通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(II-B)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100018
  34. 根据权利要求29所述的的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物如通式(IV-A)所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100019
    优选地，所述抗体-药物偶联物如下所示：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100020
    Figure PCTCN2020094856-appb-100021
    Figure PCTCN2020094856-appb-100022
  35. 根据权利要求1-34中任一项所述的通式(A)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体-药物偶联物选自如下化合物：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100023
    Figure PCTCN2020094856-appb-100024
    Figure PCTCN2020094856-appb-100025
    Figure PCTCN2020094856-appb-100026
    Figure PCTCN2020094856-appb-100027
    Figure PCTCN2020094856-appb-100028
    Figure PCTCN2020094856-appb-100029
    Figure PCTCN2020094856-appb-100030
    Figure PCTCN2020094856-appb-100031
    Figure PCTCN2020094856-appb-100032
    Figure PCTCN2020094856-appb-100033
    Figure PCTCN2020094856-appb-100034
    Figure PCTCN2020094856-appb-100035
    Figure PCTCN2020094856-appb-100036
    Figure PCTCN2020094856-appb-100037
    Figure PCTCN2020094856-appb-100038
    Figure PCTCN2020094856-appb-100039
    Figure PCTCN2020094856-appb-100040
    Figure PCTCN2020094856-appb-100041
    Figure PCTCN2020094856-appb-100042
    Figure PCTCN2020094856-appb-100043
    Figure PCTCN2020094856-appb-100044
    Figure PCTCN2020094856-appb-100045
    Figure PCTCN2020094856-appb-100046
    Figure PCTCN2020094856-appb-100047
    Figure PCTCN2020094856-appb-100048
    Figure PCTCN2020094856-appb-100049
    Figure PCTCN2020094856-appb-100050
    Figure PCTCN2020094856-appb-100051
    Figure PCTCN2020094856-appb-100052
    Figure PCTCN2020094856-appb-100053
    Figure PCTCN2020094856-appb-100054
    Figure PCTCN2020094856-appb-100055
    Figure PCTCN2020094856-appb-100056
    其中，y选自2-10，优选4-8，更优有选6-8，进一步优选7-8，最优选8。
  36. 一种制备如通式(IV)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，包括以下步骤：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100057
    Ab还原后，与通式(F)偶联反应，得到通式(IV)所示的化合物；
    其中：
    Ab为抗B7-H4抗体或其抗原结合片段；
    W、K 2、K 3、R 2～R 6、m和y如权利要求29中所定义。
  37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述的通式(F)为通式(F-1)所示的化合物：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100058
    或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
    其中
    K 2、K 3、R 2～R 6、s和m如权利要求28中所定义。
  38. 通式(F)或通式(F-1)所示的化合物选自：
    Figure PCTCN2020094856-appb-100059
    Figure PCTCN2020094856-appb-100060
  39. 一种药物组合物，其包含如权利要求1-35任一项所述的抗体－药物偶 联物或所述抗体－药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物，和一种或多种可药用的载体。
  40. 根据权利要求1-35任一项所述的抗体－药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物以及权利要求39所述的药物组合物在制备用于治疗与人B7-H4相关的疾病的药物中的应用。
  41. 根据权利要求40所述的应用，其特征在于，制备用于治疗B7-H4高表达癌症的药物中的应用，其中所述的癌症选自人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀肮癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波因肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铭细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、辜丸癌、胸腺癌、甲状腺转移性癌和子宫癌。
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