KR20220017946A - 항-b7-h4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

항-b7-h4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220017946A
KR20220017946A KR1020217043062A KR20217043062A KR20220017946A KR 20220017946 A KR20220017946 A KR 20220017946A KR 1020217043062 A KR1020217043062 A KR 1020217043062A KR 20217043062 A KR20217043062 A KR 20217043062A KR 20220017946 A KR20220017946 A KR 20220017946A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
ser
set forth
val
Prior art date
Application number
KR1020217043062A
Other languages
English (en)
Inventor
하이칭 후아
수시아 리우
루디 바오
Original Assignee
상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
장쑤 한서 파마슈티칼 그룹 캄파니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드, 장쑤 한서 파마슈티칼 그룹 캄파니 리미티드 filed Critical 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20220017946A publication Critical patent/KR20220017946A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

항-B7-H4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도를 제공한다. 구체적으로, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 상기 항-B7-H4 항체의 CDR 영역을 포함하는 인간화된 항체, 및 이의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물, 및 상기 항체-약물 접합체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매 화합물의 약학 조성물, 및 항암 약물로서 이의 용도, 특히 B7-H4의 고 발현을 갖는 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물의 제조에서의 용도를 제공한다.

Description

항-B7-H4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-B7-H4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
종양 면역요법은 종양 요법 분야에서 장기간 지속 가능한 연구 개발 핫스팟(hotspot)이고 T 세포 종양 면역요법이 그 핵심 위치에 있다. 종양 회피는 종양 면역요법의 큰 장애물이다. 대부분의 종양은 다양한 정도로 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현한다. 그러나 많은 경우 효과기 T 세포의 비효율적인 활성화는 불충분한 면역 반응을 일으키고, 따라서 종양 세포는 면역계에 대한 이의 억제 효과에 의해 종양 성장을 촉진한다. 종양 면역요법은 종양을 죽이기 위해 종양이 있는 환자의 킬러 T 세포 및/또는 기타 면역 세포를 최대한 활용하고 동원하는 것이다.
CD28 수용체 및 이의 리간드에 대한 연구는 B7 슈퍼패밀리라고 하는 분자의 특성화로 이어졌다. B7 패밀리의 구성원은 면역글로불린-유사 V 도메인(IgV) 및 면역글로불린-유사 C 도메인(IgC)을 갖는 면역글로불린의 한 부류이다. 그 구성원은 공동-자극 인자 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86), 유도성 공동-자극 인자 리간드(ICOS-L/B7-H2), 예정세포사-1 리간드(PD-L1/B7-H1), 예정세포사-2 리간드(PD-L2/B7-DC), B7-H3 및 B7-H4 등을 포함한다.
인간 B7-H4는 282개 아미노산으로 이루어진 I형 막관통 단백질이다. 이의 암호화 유전자는 염색체 1의 p11.1 영역 중에 위치한다(문헌[Choi IH et al., J Immunol. 2003 Nov 1; 171(9): 4650-4]). B7-H4는 T 세포의 면역 반응에 대해 음의 조절 효과를 갖는다. B7-H4는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 분화 및 발생, 세포주기 진행 및 사이토카인 생산에서 광범위한 억제 역할을 한다(문헌[Sica GL et al., Immunity. 2003 Jun; 18(6): 849-61]). B7-H4 녹아웃 마우스에서 어떠한 면역세포 장애나 자가면역 현상도 발견되지 않았다(문헌[Zhu G et al., Blood. 2009 Feb 19; 113(8): 1759-67]; 문헌[Suh WK et al., Blood. Mol Cell Biol. 2006 Sep; 26(17): 6403-11]). 현재, B7-H4 및 이의 신호전달 경로의 수용체는 여전히 불명확하다.
최근의 연구는 B7-H4 단백질이 다양한 종양 조직에서 풍부하게 발현되고, 이는 종양 세포가 신체의 면역계에 의한 공격을 피할 수 있게 함을 발견하였다. B7-H4 분자를 종양 요법의 표적으로서 고려하는 것은 종양 면역요법에 대한 신규의 방법을 제공한다.
현재, 인간 B7-H4는 유방암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 신장암, 방광암 및 간암과 같은 암 세포상에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. B7-H4 mRNA의 발현은 비장, 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 췌장, 고환 및 난소에서 발견된다. 단백질 수준에서, B7-H4 발현은 유방(유관 및 소엽), 나팔관 상피, 및 자궁내막선과 같은 조직에서 낮은 수준으로 발견된다. 관련된 연구는 또한 B7-H4가 종양-연관된 대식세포(TAM)에서 과발현되고(문헌[Kryczek, I. et al., J. Exp. Med. 2006, 203(4): 871-881]), 대식세포는 종양 미세환경의 중요한 성분을 구성하고 종양 질량의 50% 정도를 차지할 수 있음을 입증하였다.
암 치료를 위한 한 가지 전략은 항체를 담체로 사용하여 세포독성 분자를 암세포에 전달한 다음 해리된 소분자에 의해 암세포를 죽이는 것이다. 이 전략에 사용되는 약물을 항체-약물 접합체라고 한다. 애드세트리스(Adcetris)와 캐사일라(Kadcyla)는 현재 시판 중인 항체-약물 접합체이다. 현재, 많은 다국적 제약 회사는 종양에 대한 환자의 면역계 반응을 개선시키고 종양 세포를 직접 죽이는 목표를 달성하기 위해 B7-H4 및/또는 이의 약물 접합체에 대한 단클론 항체를 개발하고 있다. 관련 특허는 예를 들어 WO2013025779, US20140322129 등이다. 메드임뮨(Medimmune), 파이브프라임(FivePrime) 및 기타 회사의 항-B7-H4 단클론 항체는 현재 여전히 전임상 개발 단계에 있고; 제넨테크(Genentech)의 항-B7-H4 항체-약물 접합체 또한 전임상 개발 단계에 있다.
본 발명의 목적은 하기의 기술적 해법을 통해 성취되는 높은 친화성, 높은 선택성, 높은 식작용 효율, 높은 항암 활성, 높은 안정성, 높은 안전성 및 낮은 독성과 부작용을 갖는 항-B7-H4 항체-약물 접합체를 제공하는 것이다.
하기 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
[화학식 A]
Figure pct00001
상기 식에서,
D는 세포독성 약물이고;
L1 및 L2는 링커 단위(linker unit)이고;
y는 1 내지 20의 수이고;
Ab는 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
상기 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제시된 하나 이상의 HCDR을 포함하고;
상기 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제시된 하나 이상의 LCDR을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 항체 중쇄 가변 영역은 또한 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제시된 하나 이상의 HCDR을 포함할 수 있거나,
상기 항체 중쇄 가변 영역은 또한 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제시된 하나 이상의 HCDR을 포함할 수 있고;
상기 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제시된 하나 이상의 LCDR을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 항체 중쇄 가변 영역은
서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 항체 중쇄 가변 영역은
서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 항체 중쇄 가변 영역은
서열번호 43에 제시된 HCDR1, 서열번호 44에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 45에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab의 항체 중쇄 가변 영역은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDR을 포함한다:
(1) 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3;
(2) 서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3;
(3) 서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
(4) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3.
상기 Ab의 항체 중쇄 가변 영역은 또한 하기 (5) 내지 (6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR을 포함할 수 있다:
(5) 서열번호 43에 제시된 HCDR1, 서열번호 44에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
(6) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 45에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 항체 경쇄 가변 영역은
각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
각각 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3
을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 항체 경쇄 가변 영역은
각각 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
각각 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34에 제시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab의 항체 중쇄 가변 영역은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDR을 포함한다:
(1) 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3;
(2) 서열번호 12에 제시된 LCDR1, 서열번호 13에 제시된 LCDR2 및 서열번호 14에 제시된 LCDR3;
(3) 서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 및
(4) 서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은
(1) 각각 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3; 또는
(2) 각각 서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 12에 제시된 LCDR1, 서열번호 13에 제시된 LCDR2 및 서열번호 14에 제시된 LCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은
(3) 서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 또는
(4) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은
(5) 각각 서열번호 43에 제시된 HCDR1, 서열번호 44에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 또는
(6) 각각 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 45에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3; 또는
서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3
을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab의 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDR을 포함한다:
(1) 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3;
(2) 서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 12에 제시된 LCDR1, 서열번호 13에 제시된 LCDR2 및 서열번호 14에 제시된 LCDR3;
(3) 서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 및
(4) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3.
상기 Ab의 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 또한 하기 (5) 또는 (6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR을 포함할 수 있다:
(5) 서열번호 43에 제시된 HCDR1, 서열번호 44에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3;
(6) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 45에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3; 및
서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 쥐 항체 또는 이의 단편, 키메라 항체 또는 이의 단편, 인간 항체 또는 이의 단편, 및 인간화된 항체 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 경쇄 프레임워크 영역 및 중쇄 프레임워크 영역 서열을 추가로 포함하고, 이들은 각각 인간 생식세포계열 경쇄 및 중쇄 서열 또는 이의 돌연변이 서열로부터 유래되고;
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2 또는 이의 변이체, IgG3 또는 이의 변이체, 또는 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래된 영역, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 영역, 보다 바람직하게는 아미노산 돌연변이 후에 증대된 ADCC 독성을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역, 가장 바람직하게는 서열번호 54에 제시된 중쇄 불변 영역을 포함하고;
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 인간 κ 쇄, λ 쇄 또는 이의 변이체로부터 유래된 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 κ 쇄로부터 유래된 상기 영역, 보다 바람직하게는 서열번호 55에 제시된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 16 또는 서열번호 18을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 36 또는 서열번호 38을 갖는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 36 또는 서열번호 38과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 15 또는 서열번호 17을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 35 또는 서열번호 37을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 35 또는 서열번호 37과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다:
(1) 서열번호 15에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16에 제시된 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 17에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18에 제시된 경쇄 가변 영역.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다:
(1) 서열번호 15에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16에 제시된 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 17에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18에 제시된 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호 35에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36에 제시된 경쇄 가변 영역; 및
(4) 서열번호 37에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 38에 제시된 경쇄 가변 영역.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 20 또는 서열번호 22를 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 40 또는 서열번호 42를 갖는 경쇄 또는 서열번호 20, 또는 서열번호 22, 서열번호 40 또는 서열번호 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 전장 경쇄를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 19 또는 서열번호 21을 갖는 중쇄를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는 하기의 서열: 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 39, 서열번호 41을 갖는 중쇄 또는 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 39, 서열번호 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 전장 중쇄를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는
(1) 서열번호 20의 경쇄 및 서열번호 19의 중쇄; 또는
(2) 서열번호 22의 경쇄 및 서열번호 21의 중쇄
를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, Ab는
(1) 서열번호 20의 경쇄 및 서열번호 19의 중쇄; 또는
(2) 서열번호 22의 경쇄 및 서열번호 21의 중쇄; 또는
(3) 서열번호 40의 경쇄 및 서열번호 39의 중쇄; 또는
(4) 서열번호 42의 경쇄 및 서열번호 41의 중쇄
를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 항-B7-H4 항체의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 항체(scFv), 이량체화된 V 영역(다이아바디(diabody)), 다이설파이드 결합 안정화된 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩타이드의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 세포독성 약물은 독소, 화학요법제, 항생제, 방사성동위원소 및 핵산분해 효소; 바람직하게는 세포 분열을 억제하는 튜불린 억제제 또는 DNA 국소이성화효소 억제제; 보다 바람직하게는 DM1, DM3, DM4, SN-38, MMAF 및 MMAE; 더욱 바람직하게는 튜불린 억제제 SN-38, MMAE 및 MMAF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여기서, MMAF 및 SN-38의 구조는 하기의 식들에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00002
Figure pct00003
.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 세포독성 약물은 캄토테신 유도체, 바람직하게는 엑사테칸(Exatecan)으로부터 선택된다:
Figure pct00004
.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
Figure pct00005
상기 식에서,
L1 및 L2는 링커 단위이고;
y는 1 내지 8로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 4로부터 선택되는 수이고;
Ab는 상기에서 정의된 바와 같은 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 II의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 II]
Figure pct00006
상기 식에서,
L1 및 L2는 링커 단위이고;
y는 1 내지 8로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 4로부터 선택되는 수이고;
Ab는 상기에서 정의된 바와 같은 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 III의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 III]
Figure pct00007
상기 식에서,
L1 및 L2는 링커 단위이고;
y는 1 내지 10로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 8로부터 선택되는 수, 보다 바람직하게는 4 내지 8로부터 선택되는 수이거나;
y는 2 내지 10으로부터 선택되는 수, 더욱 바람직하게는 6 내지 10으로부터 선택되는 수, 보다 바람직하게는 7 내지 9의 수, 가장 바람직하게는 7, 8, 9의 정수이고;
Ab는 상기에서 정의된 바와 같은 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, L1은 하기 화학식 B에 나타낸 바와 같다:
[화학식 B]
Figure pct00008
상기 식에서,
M1은 -CR1R2-이고;
R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬, 할로겐, 하이드록실 및 아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
N은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1, 2 또는 3이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, L2는 하기 화학식 C에 나타낸 바와 같다:
[화학식 C]
Figure pct00009
상기 식에서,
M2는 -CR4R5-이고;
R3은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실, 아미노, 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬, 할로겐, 하이드록실 및 아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1, 2 또는 3이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, L2는 하기 화학식 D에 나타낸 바와 같다:
[화학식 D]
-K1-K2-K3-K4-
상기 식에서,
K1은
Figure pct00010
이고, s는 2 내지 8의 정수, 더욱 바람직하게는 4 내지 8의 정수, 보다 바람직하게는 4 내지 6의 정수이고;
K2는 -NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-, -NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-, -S(CH2)pC(O)- 또는 단일 결합이고, p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고;
R1은 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
K3은 테트라펩타이드 잔기이고, 바람직하게는 상기 테트라펩타이드 잔기는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타메이트 및 아스파테이트 중 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 형성된 펩타이드 잔기; 보다 바람직하게 테트라펩타이드 잔기 GGFG이고;
K4는 -NR2(CR3R4)t-이고, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬이고; t는 1 또는 2이고,
바람직하게는 L2에 관하여,
K1은
Figure pct00011
이고, s는 5이고;
K2는 결합이고;
K3은 테트라펩타이드 잔기 GGFG이고;
K4는 -NR2(CR3R4)t-이고, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬, 할로겐, C1-6 할로알킬, C1-6 중수소화된 알킬 및 C1-6 하이드록시알킬이고, t는 1 또는 2이다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, 링커 단위 -L2-의 K1 말단은 Ab에 연결되고, K4 말단은 L1에 연결된다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, L1은 -O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-, -O-CR5R6-(CRaRb)m-, -O-CR5R6-, -NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)- 또는 -S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-이고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 할로겐 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 할로알킬 또는 사이클로알킬이고,
R6은 수소, 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 사이클로알킬을 형성하고;
m은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
바람직하게는, L1의 O 말단은 링커 단위 L2에 연결된다.
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, L1은 하기 화학식 E에 나타낸 바와 같다:
[화학식 E]
Figure pct00012
상기 식에서,
R5는 할로알킬 또는 사이클로알킬이고,
R6은 수소, 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 사이클로알킬을 형성하고;
바람직하게는
R5는 C1-6 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R6은 수소, C1-6 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 C3-6 사이클로알킬을 형성하고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
보다 바람직하게는, 화학식 E는 하기의 치환기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00013
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에서, -L2-L1-은 하기의 구조이다:
Figure pct00014
상기 식에서,
K2는 결합이고;
K3은 테트라펩타이드 잔기 GGFG이고;
R5는 할로알킬 또는 C3-6 사이클로알킬이고,
R6은 수소, 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 C3-6 사이클로알킬을 형성하고;
R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
s는 2 내지 8의 정수이고; 바람직하게는, s는 4, 5 또는 6이고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
바람직하게는, 상기 -L2-L1-은 하기의 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00015
Figure pct00016
바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 IV에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 IV]
Figure pct00017
상기 식에서,
W는 C1-8 알킬, C1-8 알킬-사이클로알킬 또는 1 내지 8개의 원자의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 헤테로알킬은 N, O 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서 상기 C1-8 알킬, 사이클로알킬 또는 선형 헤테로알킬은 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록실, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화된 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 추가로 치환되고;
K2는 -NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 및 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1은 수소 원자, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, p1은 1 내지 20의 정수이고;
K3은 2 내지 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 잔기이고, 상기 아미노산은 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 상기 치환기는 임의의 이용가능한 부착점에서 치환될 수 있고, 상기 치환기는 할로겐, 하이드록실, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화된 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상이고;
R2는 수소 원자, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R6은 수소 원자, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴을 형성하고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
y는 1 내지 10이고 y는 소수 또는 정수이고, 바람직하게는 y는 2 내지 10의 수이고, 보다 바람직하게는 y는 4 내지 10의 수, 더욱 바람직하게는 6 내지 9의 수, 가장 바람직하게는 7, 8 또는 9의 정수이고;
Ab는 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 I-A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-A]
Figure pct00018
상기 식에서,
y는 1 내지 10이고, y는 소수 또는 정수이다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 I-B의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-B]
Figure pct00019
상기 식에서,
y는 1 내지 10이고, y는 소수 또는 정수이다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 II-A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 II-A]
Figure pct00020
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 II-B의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 II-B]
Figure pct00021
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 IV-A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
[화학식 IV-A]
Figure pct00022
상기 식에서,
s는 2 내지 8의 정수이고, R2 내지 R6, m 및 y는 상기 화학식 IV에 정의된 바와 같고;
바람직하게는, s는 4, 5 또는 6의 정수이고, y는 4 내지 10의 수, 바람직하게는 6 내지 9의 수, 및 보다 바람직하게는 7 또는 8이다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
가장 바람직한 실시태양에서, 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
상기 식에서,
y는 1 내지 10으로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 10으로부터 선택되는 수, 추가로 6 내지 10으로부터 선택되는 수, 보다 바람직하게는 7 내지 9의 수, 가장 바람직하게는 7, 8, 9의 정수이거나; y는 2 내지 10으로부터 선택되는 수, 바람직하게는 4 내지 8의 수, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 수, 더욱 바람직하게는 7 내지 8의 수, 가장 바람직하게는 8이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 화학식 IV에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 제조 방법에 관한 것으로서, Ab가 환원될 때, 화학식 F에 제시된 화합물과 커플링 반응을 수행하여 화학식 IV에 제시된 화합물을 제조한다:
Figure pct00061
상기 식에서,
Ab는 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
W, K2, K3, R2 내지 R6, m 및 y는 화학식 IV에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시태양에서, 화학식 F에 제시된 화합물이 하기 화학식 F-1에 제시된 화합물 또는 이의 호변이성질체, 메소머, 라세메이트, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이들의 혼합 형태, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 F-1]
Figure pct00062
상기 식에서,
K2, K3, R2 내지 R6, s 및 m은 상기 -L2-L1-에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시태양에서, 화학식 F 또는 화학식 F-1에 제시된 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 B7-H4와 관련된 질병의 치료를 위한 약제, 바람직하게는 높은 B7-H4 발현을 갖는 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 화학식 A의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 이의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상기 암은 인간 뇌의 성상모세포종, 인간 인두암, 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연부 육종, 성상세포종, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 신장의 발색세포암종(chromophore cell carcinoma), 투명세포암종, 결장암, 결장직장암, 결합조직 증식성 소원형세포종양, 뇌실막종, 유잉육종, 골외점액 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 골의 섬유성 이형성증, 담낭 또는 담관암종, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬 세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방육종/악성 지방종 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비종양, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 선종, 소아암, 말초신경초종, 갈색세포종(pheocytoma), 뇌하수체종양, 전립선암, 후포도막흑색종, 신장전이암, 횡문근종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 활액 육종, 고환암, 흉선암, 갑상선 전이암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1: 항체-약물 접합체의 생체내 효능: hu2G6-MC-MMAF 및 hu2F7-MC-MMAF는 1.5 ㎎/㎏ 및 3 ㎎/㎏의 용량에서 MX-1 이종이식편 종양에 대해 억제 및 사멸 효과를 나타내었다.
도 2: 각각 2 및 4의 약물 부하를 갖는 hu2F7-MC-MMAF의 HPLC 스펙트럼.
도 3: 각각 2 및 4의 약물 부하를 갖는 hu2F7-MC-MMAF의 생체내 항-종양 효능.
도 4: 각각 2 및 4의 약물 부하를 갖는 hu2F7-MC-MMAF의 생체내 항-종양 효능. 도면은 21일째에 각 군의 마우스의 종양을 도시한다.
1. 용어
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서, 몇몇 기술 과학 용어들을 하기에 구체적으로 정의한다. 본 문서에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 아미노산의 3-문자 코드 및 1-문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기재된 바와 같다.
본 발명에 기재된 "항체"란 용어는 쇄간 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 테트라펩타이드 쇄 구조인 면역글로불린을 지칭한다. 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 아미노산의 조성 및 순서는 상이하고, 따라서 이들의 항원성도 또한 상이하다. 이에 따라, 면역글로불린을 5개의 유형(또한 면역글로불린의 아이소타입으로서 공지됨), 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 분류할 수 있고, 이들의 상응하는 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. 동일한 유형의 Ig를 힌지 영역의 아미노산 조성의 차이 및 중쇄 다이설파이드 결합의 수 및 위치에 따라 상이한 하위부류로 분류할 수 있다. 예를 들어, IgG를 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 분류할 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 따라 κ 쇄 또는 λ 쇄로 분류된다. Ig의 각각의 5개 유형은 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 영역은 인간 또는 쥐 κ, λ 쇄 또는 이들의 변이체를 포함한다.
본 발명에서, 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 영역은 인간 또는 쥐 IgG1, 2, 3, 4 또는 이들의 변이체를 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단 부근의 약 110개 아미노산의 서열은 대단히 다양하고 가변 영역(V 영역)이고; C-말단 부근의 나머지 아미노산 서열은 비교적 안정하고 불변 영역(C 영역)이다. 상기 가변 영역은 3개의 고가변 영역(HVR) 및 비교적 보존된 서열을 갖는 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 상기 3개의 고가변 영역은 항체의 특이성을 결정하고, 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로서 공지되어 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 이루어지고, 아미노 말단에서부터 카복실 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 상기 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 상기 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 VL 영역 및 VH 영역의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 또는 코티아(Chothia) 넘버링 기준 및 카밧 또는 AbM 정의 기준(http://bioinf.org.uk/abs/)을 준수한다.
"항원 제시 세포" 또는 "APC"란 용어는 표면상의 MHC와 복합체를 형성하는 외부 항원을 제공하는 세포이다. T 세포는 상기와 같은 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR)를 이용한다. APC의 예로는 비제한적으로 수지상세포(DC), 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 단핵세포, B 림프모세포 및 단핵세포-유래된 수지상세포(DC)가 있다. "항원 제시"란 용어는 APC가 항원을 포획하고 상기 항원을 T 세포에 의해, 예를 들어 MHC-I/MHC-II 접합체의 성분으로서 인식될 수 있게 하는 과정을 지칭한다.
"B7-H4"란 용어는 4개의 Ig-유사 세포외 도메인을 갖는 I형 막관통 단백질인 인간 B7 단백질 패밀리(또한 CD276으로서 공지됨)의 구성원을 지칭한다. B7-H4는 항원-제시 세포 또는 암세포의 표면상에서 발현되는 면역 관문 단백질 중 하나이고, T 세포의 기능적 활성화에 억제 효과가 있다. "B7-H4"란 용어는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 B7-H4의 임의의 변이체 또는 동형을 포함한다. 본 발명의 항체는 비-인간 종으로부터 유래된 B7-H4와 교차-반응할 수 있다. 또 다른 선택권으로서, 항체는 또한 인간 B7-H4에 특이적일 수 있고 다른 종과 교차-반응성을 나타내지 않을 수도 있다. B7-H4 또는 이의 임의의 변이체 또는 동형을, 이를 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 단리하거나, 당해 분야에 통상적으로 사용되는 기법 및 본원에 기재된 기법을 사용하는 재조합 기법에 의해 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 항-B7-H4 항체는 통상적인 글리코실화 패턴을 갖는 인간 B7-H4를 표적화한다.
"재조합 인간 항체"란 용어는 재조합 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 인간 항체, 예를 들어 (1) 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 이로부터 제조된 하이브리도마; (2) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 예를 들어 형질감염종; (3) 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 및 (4) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 이어맞춤으로써 및 다른 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함하고, 관련된 기법 및 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 재조합 인간 항체는, 생식세포계열 유전자에 의해 암호화된 특정한 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열을 이용하지만 항체 성숙 중 발생하는 것들과 같은 후속적인 재배열 및 돌연변이도 포함하는 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서 "쥐 항체"란 용어는 당해 분야의 지식과 기술에 따라 제조된 인간 B7-H4에 대한 단클론 항체이다. 제조 중에, 시험 피실험자는 B7-H4 항원이 주입되고, 이어서 목적하는 서열 또는 기능적 성질을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 쥐 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 쥐 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하거나, 쥐 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
"인간 항체"란 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "인간 항체"란 용어는 또 다른 포유동물 종(예를 들어 마우스)의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상에 접목된 항체(즉 "인간화된 항체")는 포함하지 않는다.
"인간화된 항체"(또한 CDR-접목된 항체로서 공지됨)란 용어는 쥐 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역의 프레임워크에 접목시킴으로써 생성된 항체를 지칭한다. 상기 항체는 다량의 쥐 단백질 성분을 운반하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 면역 반응을 극복할 수 있다. 면역원성 감소에 의해 야기되는 활성의 감소를 피하기 위해서, 인간 항체 가변 영역에 최소의 역 돌연변이를 가하여 상기 활성을 유지시킬 수 있다.
"키메라 항체"란 용어는 쥐 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합시킴으로써 형성된 항체이고, 이는 상기 쥐 항체에 의해 유도된 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체의 확립은 먼저 쥐 특이적 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립시키고, 이어서 상기 쥐 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝하고, 이어서 필요에 따라 상기 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 상기 쥐 가변 영역 유전자와 상기 인간 불변 영역 유전자를 연결하여 키메라 유전자(인간 발현 벡터에 삽입된다)를 형성시키고, 최종적으로 상기 키메라 항체 분자를 진핵생물 산업 시스템 또는 원핵생물 산업 시스템에서 발현시킴을 요한다. 상기 인간 항체 불변 영역은, 바람직하게는 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하거나 또는 아미노산 돌연변이 후에 증대된 ADCC(항체-의존적인 세포-매개된 세포독성) 독성을 갖는 IgG1을 사용하는, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이들의 변이체의 중쇄 불변 영역으로부터 선택될 수 있다.
"항원-결합 단편"이란 용어는 대개는 모 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역(예를 들어 하나 이상의 CDR)의 적어도 일부를 포함하는, 항체의 항원-결합 단편 및 항체 유사체를 지칭한다. 상기 항체 단편은 모 항체의 결합 특이성 중 적어도 일부를 보유한다. 일반적으로, 활성을 몰 기준으로 나타내는 경우, 상기 항체 단편은 모 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 바람직하게는, 상기 항체 단편은 표적에 대한 모 항체의 결합 친화성 중 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 항원-결합 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 선형 항체, 단쇄 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 다중특이성 항체를 포함한다. 조작된 항체 변이체는 문헌[Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136]에 리뷰되어 있다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 상기 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 다이설파이드 결합에 의해서 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용을 통해서 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 경쇄, 및 VH 도메인, CH1 도메인, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역(따라서 쇄간 다이설파이드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성될 수 있다)을 포함하여 F(ab')2 분자를 형성한다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하는(이에 의해 2개의 중쇄 사이에 쇄간 다이설파이드 결합을 형성한다) 2개의 중쇄를 포함한다. 따라서, 상기 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄간의 다이설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 없다.
"다중특이성 항체"란 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용되고, 다중에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이성 항체는 비제한적으로 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체(여기서 VH-VL 단위는 다중-에피토프 특이성을 갖는다); 2개 이상의 VL 및 VH 영역(각각의 VH-VL 단위는 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합한다)을 갖는 항체; 2개 이상의 단일 가변 영역(각각의 단일 가변 영역은 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합한다)을 갖는 항체; 전장 항체, 항체 단편, 다이아바디, 이중특이성 다이아바디 및 트라이아바디(triabody), 공유적으로 또는 비-공유적으로 함께 연결되는 항체 단편 등을 포함한다.
"단쇄 항체"란 용어는 링커 펩타이드를 통해 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 연결함으로써 형성된 단쇄 재조합 단백질이다. 상기 항체는 완전한 항원 결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편이다.
"도메인 항체 단편"이란 용어는 오직 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역만을 포함하는 면역학적 기능을 갖는 면역글로불린 단편이다. 일부의 경우에, 2개 이상의 VH 영역이 펩타이드 링커에 공유적으로 연결되어 2가 도메인 항체 단편을 형성한다. 상기 2가 도메인 항체 단편의 2개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
본 발명에서 "B7-H4에의 결합"이란 용어는 인간 B7-H4와 상호작용하는 능력을 지칭한다. 본 발명의 "항원-결합 부위"란 용어는, 항원상에 산재되고 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 인식되는 3차원 부위를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 "특이적으로 결합하다" 및 "선택적으로 결합하다"란 용어는 미리결정된 항원상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 일반적으로, 재조합 인간 B7-H4가 분석물로서 사용되고 항체가 리간드로서 사용되는 경우, 장비에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 측정될 때, 상기 항체는 상기 미리결정된 항원에 약 10-7 M 미만 또는 심지어 이보다 작은 평형 해리 상수(KD)로 결합하고, 상기 미리결정된 항원에 대한 이의 결합 친화성은 비-특이성 항원(상기 미리결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의, 예를 들어 BSA 등)에 대한 이의 결합 친화성의 적어도 2배이다. "...항원을 인식하는 항체"란 용어는 본원에서 "...에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어와 호환가능하게 사용될 수 있다.
"교차-반응성"이란 용어는 상이한 종들로부터의 B7-H4에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 B7-H4에 결합하는 본 발명의 항체는 또한 또 다른 종의 B7-H4에도 결합할 수 있다. 교차-반응성을, 결합 분석(예를 들어 SPR 및 ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적인 반응성을 검출하거나, B7-H4를 생리학적으로 발현하는 세포와의 결합 또는 기능적 상호작용에 의해 측정한다. 교차-반응성의 측정 방법은 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 분석, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 또는 유식 세포측정을 포함한다.
"억제" 또는 "차단"이란 용어는 호환가능하게 사용될 수 있고 부분적인 및 완전한 억제/차단을 모두 포함한다. 리간드의 억제/차단은 바람직하게는 리간드 결합이 억제나 차단 없이 발생하는 경우 존재하는 통상적인 수준 또는 유형의 활성을 감소시키거나 변경시킨다. 억제 및 차단은 또한 항-B7-H4 항체와 접촉하지 않는 리간드의 결합 친화성에 비해, 항-B7-H4 항체와 접촉하는 경우의 리간드의 결합 친화성의 임의의 측정가능한 감소를 포함하고자 한다.
"성장의 억제"(예를 들어 세포를 언급하는 경우)란 용어는 세포 성장의 임의의 측정가능한 감소를 포함하고자 한다.
"유도면역반응" 및 "증대된 면역반응"이란 용어는 호환가능하게 사용될 수 있고 특정 항원에 의한 자극에 대한 면역 반응(즉 수동 또는 적응)을 지칭한다. "CDC 또는 ADCC의 유도"란 표현에 사용되는 "유도하다"란 용어는 특정한 직접적인 세포사멸 기전을 자극함을 지칭한다.
본 발명에서 "ADCC", 즉 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성은, Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체의 Fc 분절을 인식함으로써 상기 항체로 코팅된 표적 세포를 직접 사멸시킴을 의미한다. 항체의 ADCC 효과 기능은 IgG의 Fc 분절을 변형시킴으로써 증대되거나, 감소되거나 또는 제거될 수 있다. 상기 변형은 항체의 중쇄 불변 영역의 돌연변이를 지칭한다.
항체 및 항원-결합 단편의 생성 및 정제 방법은 주지되어 있고, 종래 기술, 예를 들어 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, chapters 5-8 and 15]에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 마우스를 인간 B7-H4 또는 이의 단편으로 면역화할 수 있고, 수득된 항체를 재생 및 복원시킬 수 있고, 통상적인 방법을 사용하여 아미노산 서열분석을 수행할 수 있다. 항원-결합 단편을 또한 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 유전자 조작하여 하나 이상의 인간 FR 영역을 비-인간 CDR 영역상에 도입시킨다. 인간 FR 생식세포계열 서열을 ImmunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr로부터, 또는 문헌[Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351]으로부터 획득할 수 있다.
본 발명의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편을 통상적인 방법에 의해 제조하고 정제할 수 있다. 상응하는 항체의 cDNA 서열을 클로닝하고 GS 발현 벡터에 재조합할 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포를 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 보다 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템이, 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 유도할 수 있다. 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시킴으로써 안정한 클론을 수득한다. 양성 클론을 생물반응기의 무혈청 배지에서 확대시켜 항체를 생성시킨다. 항체가 분비되는 배양 배지를 통상적인 기법에 의해 정제하고 수집할 수 있다. 항체를 통상적인 방법에 의해 여과하고 농축시킬 수 있다. 용해성 혼합물 및 다량체를 또한 통상적인 방법, 예를 들어 분자체 및 이온 교환에 의해 제거할 수 있다. 생성되는 생성물은 즉시, 예를 들어 -70℃에서 동결시키거나 또는 동결건조시킬 필요가 있다.
본 발명의 항체는 단클론 항체를 지칭한다. 본 발명에 기재된 단클론 항체(mAb)는 단일 클로닝된 세포주로부터 수득된 항체를 지칭하고, 상기 세포주는 비제한적으로 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클로닝된 세포주이다. 단클론 항체 또는 항원-결합 단편을, 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술(예를 들어 CDR-접목) 또는 다른 기존의 기술을 사용하여 재조합에 의해 수득할 수 있다.
"투여하는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상자, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물을 상기 동물, 인간, 피실험자, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체와 접촉시킴을 지칭한다. "투여하는" 및 "치료하는"은 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포를 치료함은 시약을 상기 세포와 접촉시킴, 및 시약을 유체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서 상기 유체는 세포와 접촉하고 있다. "투여하는" 및 "치료하는"은 또한 예를 들어 세포를 시약, 진단제, 결합 조성물로, 또는 또 다른 유형의 세포로 시험관내에서 및 생체외에서 처리함을 의미한다. "치료하는"은 인간, 수의과 또는 연구 피실험자에 적용될 때 치료학적 치료, 예방 또는 예방학적 수단, 연구 및 진단 적용을 지칭한다.
"치료"는 내부 또는 외부 치료제, 예를 들어 본 발명의 결합 화합물 중 어느 하나를 포함하는 조성물을, 상기 치료제가 치료학적 효과를 갖는 것으로 공지된 하나 이상의 질병 증상이 있는 환자에게 투여함을 지칭한다. 일반적으로, 상기 치료제를, 치료된 피실험자 또는 집단에서 하나 이상의 질병 증상을 완화시키고, 상기와 같은 증상의 퇴행을 유도하거나 또는 상기와 같은 증상의 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로의 발달을 억제하기에 유효한 양으로 제공한다. 임의의 특정한 질병 증상을 완화시키기에 유효한 치료제의 양(또한 "치료 유효량"으로서 지칭된다)은 다양한 인자, 예를 들어 환자의 질병 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 목적하는 치료 효과를 생성시키는 약물의 능력에 따라 변할 수 있다. 질병 증상이 완화되었는지의 여부는 상기 증상의 중증도 또는 진행의 평가를 위해 의사나 다른 의료 전문가에 의해 통상적으로 사용되는 임의의 임상적 시험 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 실시태양(예를 들어 치료 방법 또는 생성물)이 각각의 관심 질병 증상을 완화시키는데 유효하지 않을 수도 있지만, 이들 실시태양은 상기 관심 질병 증상을 당해 분야에 공지된 임의의 통계학적 검정, 예를 들어 스튜던트 t-검정, 카이-제곱 검정, 만과 휘트니의 U 검정, 크루스칼-월리스 검정(H 검정), 존키어-터프스트라 검정 및 윌콕슨 검정에 의해 측정시, 통계학적으로 유의미한 수의 환자에서 상기 관심 질병 증상을 감소시켜야 한다.
명세서 및 청구범위 전체를 통해 사용되는 "...로 필수적으로 이루어진"이란 용어 또는 이의 변형은 기재된 모든 요소 또는 요소 군을 포함하고, 주어진 투여 섭생, 방법 또는 조성물의 기본적인 또는 새로운 성질을 그다지 변화시키지 않는, 사실상 기재된 요소와 유사하거나 상이한 다른 요소를 임의로 포함함을 의미한다. 비제한적인 예로서, 언급된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진 결합 화합물은 또한 상기 결합 화합물의 성질에 그다지 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 대상에 적용되는 "천연"이란 용어는 상기 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하고 자연 공급원으로부터 단리되고 실험실에서 인공적으로 의도적으로 변형되지 않은 경우 천연으로서 간주된다.
"유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 상태를 개선시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 상기 유효량은 또한 진단을 허용하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 지칭한다. 특정 환자 또는 수의학 피실험자에 대한 유효량은 하기의 인자에 따라 변할 수 있다: 예를 들어 치료되는 상태, 환자의 일반적인 건강 상태, 약물 투여 방법, 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 용량 섭생일 수 있다.
"외인성"은 배경에 따른 유기체, 세포 또는 인체 밖에서 생성된 물질을 지칭한다. "내인성"은 배경에 따른 세포, 유기체 또는 인체 내부에서 생성된 물질을 지칭한다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열간 또는 2개의 폴리펩타이드간의 서열 유사성을 지칭한다. 정렬된 2개 서열 중의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 2개의 DNA 분자의 각 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 상동성인 것으로 간주된다. 2개 서열간의 상동성 백분율은 상기 두 서열에 의해 공유된 합치되거나 상동성인 위치의 수를 정렬된 위치의 수로 나누어 100%를 곱한 함수이다. 예를 들어, 최적의 서열 정렬에서, 2개 서열의 10개 위치 중 6개가 합치되거나 상동성인 경우, 상기 두 서열은 60%의 상동성이다. 일반적으로, 상기 정렬은 2개 서열을 최대의 상동성 백분율을 획득하도록 정렬하는 경우 이루어진다.
본원에 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환가능하게 사용될 수 있고, 상기와 같은 명칭은 모두 이들의 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 단어는 1차 시험 세포, 및 계대수에 관계 없이 그로부터 배양된 배양물을 포함한다. 또한, 의도적인 또는 의도적이지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량의 면에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 알아야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 선별된 경우와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 상이한 명칭이 언급될 때 이는 문맥을 통해 명확하게 이해될 수 있다.
"임의의" 또는 "임의로"는 "임의의" 또는 "임의로"라는 단어 뒤에 오는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 발생할 필요는 없고 설명에는 상기 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우가 포함됨을 의미한다. 예를 들어, "임의로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만 존재할 필요는 없음을 의미한다.
"약학 조성물"은 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상, 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물, 및 다른 화학적 성분뿐만 아니라 다른 성분, 예를 들어 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 의미한다. 상기 약학 조성물의 목적은 유기체에의 약물 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 촉진하고 이에 의해 생물학적 활성을 발휘하기 위한 것이다. 통상적인 약학 조성물의 제조는 중국 약전에 기재되어 있다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 포유동물에 사용하기에 안전하고 유효하고 목적하는 생물학적 활성을 갖는, 본 발명의 항체-약물 접합체의 염을 지칭한다. 본 발명의 항체-약물 접합체는 하나 이상의 아미노기를 포함하고, 따라서 상기 접합체는 산과 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 비제한적인 예는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 설페이트, 수소 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 아스코르베이트, 옥살레이트, 나이트레이트, 소르베이트, 수소 포스페이트, 이수소 포스페이트, 살리실레이트, 수소 시트레이트, 타르트레이트, 말리에이트, 퓨마레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트 및 p-톨루엔설포네이트를 포함한다.
"용매화물"은 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성된 약학적으로 허용가능한 용매화물을 지칭한다. 용매 분자의 비제한적인 예는 수, 에탄올, 아세토나이트릴, 아이소프로판올 및 에틸 아세테이트를 포함한다.
"세포독성 약물"은 본 발명에서 사용될 때, 세포의 기능을 억제하고/하거나 세포사 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다.
"튜불린 억제제"는 튜불린의 중합을 억제하거나 튜블린의 응집을 촉진함으로써 세포 유사분열의 과정을 방해하여 항-종양 효과를 발휘는 화합물의 한 부류를 지칭한다. 이의 비제한적인 예는 메이탄시노이드, 칼케아미신, 탁산, 빈크리스틴, 콜히친, 돌라스타틴/아우리스타틴/모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)/모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)를 포함한다.
"링커"는 항체를 약물의 공유 결합 또는 원자쇄에 공유적으로 부착시키는 화학적 부분을 지칭한다. 링커의 비제한적인 예는 아릴렌, 헤테로아릴렌, PEG, 폴리메틸렌옥시, 숙시네이트, 숙신아미드, 다이글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드를 포함한다.
"약물 부하"(DAR)는 y로 나타내는데, 이는 화학식 A에서 항체당 세포독성 약물의 평균수이다. 본 발명에서 약물 부하의 범위는 항체당 1-20 세포독성 약물(D)일 수 있다. 화학식 A의 항체-약물 접합체는 특정 범위(1-20)의 세포독성 약물에 접합된 항체의 집합체이다. 커플링 반응으로부터의 항체-약물 접합체 중의 약물 부하(DAR)는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광분석, HPLC 및 ELISA에 의해 특성화될 수 있다. 이러한 수단에 의해, y 값에 대한 항체-약물 접합체의 정량적인 분포를 측정할 수 있다.
2. 약어
MC = 6-말레이미도헥사노일
VC = 발린-시트룰린
PAB = p-아미노벤질옥시카보닐
MMAE = 모노메틸 아우리스타틴 E(MW 718)
MMAF = 분자(MW 731.5)의 C-말단에 페닐알라닌을 갖는, 모노메틸 아우리스타틴 E의 변이체
본 발명의 추가의 기재를 위해 하기에 실시예를 포함시키지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 실시예에서 명시되지 않은 조건을 갖는 실험 방법은 일반적으로 통상적인 조건, 예를 들어 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]을 따르거나; 원료 물질 또는 원자재 제조사에 의해 권장되는 조건에 따른다. 명시되지 않은 출처를 갖는 시약은 시중에서 구입되는 통상적인 시약이다.
실시예 1: 항원 제조 및 안정한 세포주 구성
his-태그된 인간 B7-H4(huB7-H4-His)를 암호화하는 서열 및 Fc-태그된 인간 B7-H4(huB7-H4-Fc)를 암호화하는 서열을 CRO의 인티그레이티드 DNA 테크놀로지(IDT)(Integrated DNA Technology (IDT))에 의해 합성하고(상기 B7-H4 재조합 단백질의 주형 서열은 모두 본 발명에 의해 설계되었다) 각각 pTT5 벡터(바이오벡터(Biovector))내에 클로닝하였다. 재조합 B7-H4 단백질을 293T 세포에서 발현시킨 후에, 하기의 실험 방법에 의해 정제시키고, 정제된 단백질을 실시예의 다음 실험들에 사용할 수 있었다.
huB7-H4-His의 서열:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKADYKDDDDKGSHHHHHHHH 서열번호 1
huB7-H4-Fc의 서열:
FGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKAGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 서열번호 2
huB7-H4-His의 정제 단계:
HEK293 세포 발현 상등액 샘플을 고속으로 원심분리시켜 불순물을 제거하였다. 완충제를 PBS에 대해 교체하고 이미다졸을 5 mM의 최종 농도로 가하였다. 니켈 컬럼을 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 평형화하고 컬럼 부피의 2 내지 5배로 세척하였다. 교체 후에 수득된 상등액 샘플을 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 A280 판독이 기준선으로 떨어질 때까지, 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 세정하였다. 이어서 크로마토그래피 컬럼을 PBS+10 mM 이미다졸로 세정하여 비-특이적으로 결합된 단백질 불순물을 제거하고, 용출물을 수집하였다. 표적 단백질을 300 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 용출시키고, 용출 피크를 수집하였다. 수집된 용출물을 이온 교환(SP 컬럼)에 의해 추가로 정제하였다. A 용액 제조: 0.01 M PB, pH 8.0. B 용액 제조: A 용액 + 1 M NaCl. 먼저, 용출된 표적 단백질을 갖는 이미다졸의 PBS 용액을 용액 A에 대해 교체하고, SP 컬럼을 용액 A를 사용하여 평형화하고 샘플을 로딩하였다. 용액 B의 농도 구배는 0 내지 100%였다. 샘플을 컬럼 부피의 10배로 용출시키고, 각 용출 피크를 수집하였다. 수득된 단백질은 전기영동, 펩타이드 지도 및 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)에 의해 정확한 것으로서 확인되었고, 이어서 사용을 위해 분액하였다.
huB7-H4-Fc의 정제 단계:
HEK293 세포 발현 상등액 샘플을 고속으로 원심분리시켜 불순물을 제거하였다. 완충제를 PBS에 대해 교체하였다. 단백질 A 친화성 컬럼을 10 mM PBS 완충제로 평형화하고 컬럼 부피의 2-5배로 세척하였다. 교체 후에 수득된 상등액 샘플을 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 A280 판독이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼 부피의 25배 완충제로 세척하였다. 표적 단백질을 pH 3.5의 0.8% 아세테이트 완충제로 용출시키고 용출 피크를 수집하였다. 분액 후에, 1 M 트리스-Cl pH 8.0 완충제를 중화를 위해 즉시 첨가하였다. 이어서 용액을 밀리포어(Millipore)의 아미코(Amico)-15 필터 컬럼을 사용하여 PBS pH 6.9에 대해 교체하였다. 수득된 단백질은 전기영동, 펩타이드 지도 및 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)에 의해 확인되었고, 이어서 사용을 위해 분액하였다.
안정한 CHO-S 세포 풀(pool)의 구성:
인간 또는 키노몰구스 원숭이 B7-H4 단백질(huB7-H4 또는 cyB7-H4)을 암호화하는 전장 서열을 인티그레이티드 DNA 테크놀로지(IDT)에 의해 합성하고(상기 B7-H4 재조합 단백질의 주형 서열은 모두 본 발명에 의해 설계되었다) 각각 변형된 pcDNA3.1 벡터, pcDNA3.1/퓨로(인비트로젠(Invitrogen) #V79020)내에 클로닝하였다. CHO-S(ATCC) 세포를 CD-CHO 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), #10743029)에 0.5x106 세포/㎖로 배양하였다. huB7-H4 또는 cyB7-H4 유전자를 암호화하는 벡터 10 ㎍을 1 ㎖의 Opti-MEM 배지(라이프 테크놀로지스, #31985088) 중의 50 ㎕ LF-LTX(라이프 테크놀로지스, #A12621)와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 배양하고 CHO 세포의 배양 배지에 가하였다. 세포를 배양을 위해 이산화 탄소 배양기에 넣었다. 24시간 후에, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하고 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 가하였다. 그 후에, 배양 배지를 2 내지 3일마다 새로운 배지로 교체하고, 10-12일의 선택 후에 안정한 CHO-S 세포 풀을 수득하였다.
실시예 2: 마우스 하이브리도마 및 항체 서열의 획득
총 5마리의 Balb/c 및 5마리의 A/J 암컷 10-주된 마우스를 인간 항원 huB7-H4-Fc로 면역시켰다. 시그마(Sigma) 완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 시그마 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)를 사용하였다. 면역원 및 면역 항원보강제를 충분히 혼합하고 1:1의 비로 유화시켜 안정한 "유중 수적형" 액체를 제조하였다. 주입 용량은 25 ㎍/200 ㎕/마우스였다.
01일: 1차 면역화, 완전 프로인트 항원보강제.
21일: 2차 면역화, 불완전 프로인트 항원보강제.
35일: 3차 면역화, 불완전 프로인트 항원보강제.
42일: 혈액 샘플링 및 혈청 역가 시험(3회 면역화 후 혈액).
49일: 4차 면역화, 불완전 프로인트 항원보강제.
56일: 혈액 샘플링 및 혈청 역가 시험(4회 면역화 후 혈액).
간접적인 ELISA 방법을 사용하여 항체 또는 혈청의 친화성을 검출하였다: huB7-H4-His 단백질을 PBS pH 7.4로 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하고, 100 ㎕/웰로 96-웰 고-친화성 ELISA 플레이트에 가하고, 밤새(16-20시간) 배양을 위해 4℃에서 냉장보관하였다. 플레이트를 PBST(0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 pH 7.4 PBS)로 4회 세척하였다. PBST로 희석된 3% 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액을 150 ㎕/웰로 가하고 차단을 위해 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 차단 완료 후에, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충제로 4회 세척하였다. 시험하고자 하는 항체 또는 혈청을 3% BSA를 함유하는 PBST로 희석하여 1 μM로부터 시작하는 10회 용량(10-배 희석)의 구배를 획득하고, 이를 100 ㎕/웰로 미세적정 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양의 완료 후에, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 3% BSA를 함유하는 PBST로 희석된 HRP-표지된 염소 항-인간 2차 항체(애브캠(Abcam), cat#ab97225)를 100 ㎕/웰로 가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 이어서 TMB 색원성 기질(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), cat#7004S)을 100 ㎕/웰로 가하고 실온의 암실에서 1분간 배양하였다. 정지액(셀 시그널링 테크놀로지, cat#7002S)을 100 ㎕/웰로 가하여 반응을 종료시켰다. 흡광도 값을 미세플레이트 판독기(바이오텍(BioTek), 시너지(Synergy) H1 모델)로 450 ㎚에서 판독하였다. 데이터를 분석하여 인간 B7-H4 항원에 대한 항체 또는 혈청의 결합 친화성을 획득하였다.
혈청 역가 및 세포 표면 항원에 결합하는 면역된 마우스 혈청의 능력을 간접 ELISA 방법을 사용하여 평가하였다. 세포 융합을 역가의 검출 결과(100,000배 초과의 희석)에 따라 수행하였다. 높은 혈청 역가, 친화성 및 FACS 결합을 갖는 면역된 마우스를 하나의 최종 면역화를 위해 선택하고 이어서 희생시켰다. 비장 세포 및 SP2/0 골수종 세포를 융합시키고 도말하여 하이브리도마를 수득하였다. 표적 하이브리도마를 간접 ELISA에 의해 선별하고 단클론 세포주를 제한-희석 방법에 의해 확립시켰다. 수득된 양성 항체 균주 중에서, 비-특이적 결합 항체를 발현하는 하이브리도마 균주를, huB7-H4 및 cyB7-H4를 안정하게 발현하는 CHO-S 세포와 블랭크(blank) CHO-S 세포를 비교함으로써 추가로 제외시켰다. 표적 하이브리도마를 실시예 5의 시험관내 세포 결합 실험의 방법과 유사한 방법을 사용하여 선별하고, 제한-희석 방법에 의해 단클론 세포 균주로서 확립시켰다. 대수 성장기의 하이브리도마 세포를 수집하였다. RNA를 트리졸(Trizol)(인비트로젠, 15596-018)로 추출하고, 역 전사를 가하였다(프라임스크립트(PrimeScript)(상표) 역전사효소, 타카라(Takara) #2680A). 역전사에 의해 수득된 dDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(노바겐(Novagen), TB326 Rev.B 0503)와 함께 PCR에 의해 증폭시키고 서열분석하였다. 최종적으로, 쥐 항체의 4개 균주의 서열을 항체-약물 접합체의 인간화 및 구성을 위해 획득하였다.
쥐 단클론 항체 2G6의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:
2G6 HCVR
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPEKRLEWVAGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNSRNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVSQGSNYYFDYWGQGTTLTVSS 서열번호 46
2G6 LCVR
DIRMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPYTFGGGTKLEIK 서열번호 47.
쥐 단클론 항체 2G6의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기의 CDR 서열을 포함한다:
Figure pct00066
쥐 단클론 항체 2F7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 하기와 같다:
2F7 HCVR
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYYMSWVRQTPEKRLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKPEDTAMYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTLTVSS 서열번호 48
2F7 LCVR
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFSLTFGAGTKLELK 서열번호 49.
쥐 단클론 항체 2F7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기의 CDR 서열을 포함한다:
Figure pct00067
쥐 단클론 항체 2F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 하기와 같다:
2F8 HCVR
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTNSWMNWAKLRPGQGLEWIGGIYPNSGNIEYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMDLTSLTSEDSAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA 서열번호 50
2F8 LCVR
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRTAVAWYQQKPGQSPKLLISSTSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFIISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK 서열번호 51.
쥐 단클론 항체 2F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기의 CDR 서열을 포함한다:
Figure pct00068
쥐 단클론 항체 1C9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 하기와 같다:
1C9 HCVR
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGDTFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGGIYLNSGSSEYNEKFKGKATLSVDTSSSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA 서열번호 52
1C9 LCVR
DIVMTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPELLISSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYNTPLTFGAGTQLELK 서열번호 53.
쥐 단클론 항체 1C9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기의 CDR 서열을 포함한다:
Figure pct00069
실시예 3: 쥐 항체의 인간화 실험
쥐 항-인간 B7-H4 단클론 항체의 인간화를 당해 분야의 다수의 문서에 공개된 바와 같은 방법을 사용하여 수행하였다. 간단히, 모(쥐 항체) 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 교체하였다. 본 발명에서, 인간 생식세포계열 항체 서열을 쥐 항체와 인간 항체간의 상동성에 따라 선택하였고, 쥐 항체 2G6, 2F7, 2F8 및 1C9를 인간화하였다. 쥐 항체 2G6 및 2F7의 CDR 영역을 상기 선택된 상응하는 인간화된 주형상에 접목시켜 상기 인간화된 가변 영역을 교체하고, 이어서 IgG 불변 영역(바람직하게는 중쇄의 경우 IgG1, 및 경쇄의 경우 κ)과 재조합시켰다. 이어서, 쥐 항체의 3차원 구조에 기반하여, 내장된 잔기, CDR 영역과 직접 상호작용하는 잔기 및 VL 및 VH의 형태에 상당한 영향을 미치는 잔기를 역 돌연변이시키고, CDR 영역의 화학적으로 불안정한 아미노산 잔기를 최적화하였고, 여기서 쥐 단클론 항체 2F8의 HCDR1은 GYTFTSSWMN(서열번호 43)에 최적화되었고, HCDR2는 GIYPNRGNIEY NEKFKG(서열번호 44)에 최적화되었고, 쥐 단클론 항체 1C9의 HCDR2는 YLNRGS(서열번호 45)에 최적화되었고, 하기 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함하는 설계된 인간화된 항체를 수득하였다.
인간화된 항체 hu2G6의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기와 같다:
hu2G6 HCVR
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVSQGSNYYFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 15
hu2G6 LCVR
DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIK 서열번호 16
인간화된 항체 hu2F7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기와 같다:
hu2F7 HCVR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTVTVSS 서열번호 17
hu2F7 LCVR
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKFASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFSLTFGQGTKLEIK 서열번호 18.
인간화된 항체 hu2F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기와 같다:
hu2F8 HCVR
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYPNRGNIEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS 서열번호 35
hu2F8 LCVR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTAVAWYQQKPGKAPKLLISSTSYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK 서열번호 36
인간화된 항체 hu1C9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하기와 같다:
hu1C9 HCVR
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTTYWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYLNRGSSEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS 서열번호 37
hu1C9 LCVR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLISSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYNTPLTFGGGTKVEIK 서열번호 38.
가변 영역들을 IgG 불변 영역(바람직하게는 중쇄의 경우 IgG1, 및 경쇄의 경우 κ)과 재조합시켰다. 예시적인 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열을 하기와 같이 나타낸다:
IgG1 C:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 서열번호 54
Ig 카파 C:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 서열번호 55.
하기의 예시적인 경쇄 및 중쇄로 이루어진 인간화된 항체를 하기의 연결 후에 수득하였다:
hu2G6 HC
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINGGGSYTYYLDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVSQGSNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 19
hu2G6 LC
DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKALIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 20
hu2F7 HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVAYVSSGGGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 21
hu2F7 LC
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKFASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFSLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 22
hu2F8 HC
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYPNRGNIEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 39
hu2F8 LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTAVAWYQQKPGKAPKLLISSTSYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 40
hu1C9HC
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTTYWMNWVRQAPGQRLEWMGGIYLNRGSSEYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 41
hu1C9 LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLISSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYNTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 42
실시예 4: 항-B7-H4 인간화된 항체의 발현
재조합 벡터를 인간화된 항체의 서열에 따라 설계하였다. 중쇄 벡터를 하기와 같이 설계하였다: 신호 펩타이드 + 인간화된 중쇄. 경쇄 벡터를 하기와 같이 설계하였다: 신호 펩타이드 + 인간화된 경쇄.
상기 서열을 pCEP4 벡터(써모피셔(ThermoFisher) #V04450)내에 삽입하였다. 발현 벡터를 상기 설계에 따라 합성하였다. 벡터 플라스미드를 수득하고 대규모로 추출하고 검증을 위한 서열분석을 위해 보냈다. 적격 플라스미드를 PEI(써모피셔 # BMS1003-A)와 함께 인간 293F 세포(써모피셔 # R79007)내에 형질감염시켰다. 293F 세포를 무혈청 배지(상하이 OPM 바이오사이언시즈(Shanghai OPM Biosciences), OPM-293 CD03)와 함께 대수 성장기로 계속해서 배양하고 세포 형질감염에 사용하였다. 21.4 ㎍의 인간화된 항체 경쇄 플라스미드 및 23.6 ㎍의 인가화된 항체 중쇄 플라스미드를 10 ㎖ Opti-MEM(등록상표) I 환원 혈청 배지(GIBCO, 31985-070)에 용해시키고, 잘 혼합하고, 이어서 200 ㎍의 PEI를 가하고 잘 혼합하고, RT에서 15분간 배양하였다. 이어서 50 ㎖의 세포를 가하였다. 세포 배양 조건: 5% CO2, 37℃, 125 rpm/분. 배양 중에, 세포 생육력이 70% 미만일 때까지 1일 및 3일째에 보충물을 가하였다. 세포 상등액을 수집하고, 원심분리하고 여과하였다. 원심분리되고 여과된 세포 배양 배지를 항체 정제 친화성 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 포스페이트 완충제로 세척하였다. 샘플을 글리신 하이드로클로라이드 완충제(pH 2.7 0.1 M Gly-HCl)로 용출시키고, 1 M 트리스 하이드로클로라이드 pH 9.0으로 중화시키고, 포스페이트 완충제에 대해 투석시켜 최종적으로 정제된 인간화된 항체를 수득하였고, 이를 각 실시예의 실험에 사용할 수 있었다.
실시예 5: 인간화된 항체의 시험관내 결합 능력의 검출
설계된 인간화된 항체를 하기와 같이 시험관내 실험으로 시험하였다:
1. 시험관내 세포 결합 실험:
인간 B7-H4를 발현하는 배양된 MX-1 세포(CLS 셀 라인즈 서비스(Cell Lines Service) GmbH #300296)를 수집하고, 세포 밀도를 PBS로 pH 7.4로 조절하고, 세포를 V-모양 바닥을 갖는 96-웰 플레이트상에, 웰당 1x105 세포로 도말하였다. 플레이트를 2000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 100 ㎕의 구배 희석된 인간화된 항체 용액(0.5% BSA를 함유하는 PBS로 희석, 1 μM로 출발하여, 10회 용량의 3배 구배)을 각 웰에 가하고, 잘 혼합하고 진탕기상에서 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 2000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 100 ㎕의 PBS 중 0.5% BSA로 희석된 FITC-표지된 염소 항-인간 2차 항체(애브캠, cat#ab97224)를 각 웰에 가하고, 잘 혼합하고, 진탕기상에서 4℃에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 2000 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 이어서 PBS에 재현탁시켰다. 신호를 유식 세포계(벡크만 쿨터(BECKMAN COULTER), 모델 DxFLEX)를 사용하여 검출하고, 농도 곡선을 결과 분석을 위해 플롯팅하였다. 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다. 인간화된 항체 hu2G6 및 hu2F7 모두 B7-H4의 고 발현과 함께 MX-1 세포에 양으로 결합한다.
MX-1 세포에 대한 각각의 인간화된 항체의 친화성(EC50)
항체 명칭 MX-1 세포와의 FACS 결합 EC50(nM)
hu2G6 14.3
hu2F8 7.26
hu1C9 7.25
hu2F7 7.32
2. 친화성 동역학 실험:
비아코아(Biacore) 방법은 단백질들간의 친화성 및 동역학을 객관적으로 검출하는데 일반적으로 인정되는 방법이다. 본 발명의 시험하고자 하는 항체의 친화성 및 결합 동역학을 비아코어 T200(GE)에 의해 분석하였다. 본 발명의 시험하고자 하는 항-B7-H4 항체를 비아코어에 의해 제공된 키트 및 NHS 표준 아미노 커플링 방법을 사용하여 CM5(GE) 칩에 공유 결합시켰다. 이어서 동일한 완충제 중에서 희석된 50 nM의 인간 huB7-H4-His 단백질을 10 uL/분의 유량으로 주입하였다. 주입 후에, 샘플을 모두 상기 키트 중의 재생 시약으로 재생시켰다. 항원-항체 결합 동역학을 3분간 추적하고 해리 동역학을 10분간 추적하였다. 획득된 데이터를 GE의 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1(랭뮤어) 결합 모델로 분석하였다. 상기 방법에 의해 계산된 인간화된 항체의 친화성 동역학 데이터는 표 2에 나타낸 바와 같다. 인간화된 항체 hu2G6, hu2F7, hu2F8 및 hu1C9는 모두 인간 B7-H4 항원 단백질에 대해 강한 친화성을 나타낸다.
각각의 인간화된 항체의 친화성 및 동역학 특성화
항체 결합속도
ka(1/M*s)		 해리속도
kd (1/s)		 친화성
KD
hu2G6 7.41e+05 1.00e-05 1.35e-11
hu2F8 4.47e+05 1.12e-04 2.50e-10
hu1C9 3.35e+05 1.00e-05 2.98e-11
hu2F7 3.29e+05 2.49e-04 7.57e-10
실시예 6: 항-B7-H4 항체의 세포내이입
본 발명의 항체가 B7-H4에 결합 후에 인간 B7-H4와 함께 세포내이입될 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서, MX-1 세포를 평가에 사용하였다. MX-1 세포를 트립신처리하고(먼저 약 2분간 37℃에서 PBS로 1회 세척한다), 수집하고 예비-냉각된 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 세포 농도를 1x106 세포/㎖로 조절하였다. 1 ㎖의 세포 현탁액을 EP 튜브에 가하고, 1500 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 1 ㎖의 상기 제조된 시험하고자 하는 항체를 가하여 세포를 재현탁시켰고, 항체의 최종 농도는 20 ㎍/㎖이었다. 세포를 4℃ 진탕기상에서 1시간 동안 배양하고, 원심분리하고, 상등액을 버렸다(4℃, 1500 rpm x 5분). 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고 상등액을 제거하였다. 100 ㎕의 형광 2차 항체 작업 용액을 각 튜브에 가하여 세포를 재현탁시켰다. 세포를 4℃ 진탕기상에서 30분간 배양하고, 원심분리하고, 상등액을 버렸다(4℃, 1500 rpm x 5분). 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, 상등액을 제거하였다. 1.0 ㎖의 예온된 MX-1 세포 완전 배지를 각 튜브에 가하여 세포를 재현탁시키고 혼합하였다. 세포 현탁액을 튜브당 200 ㎕로 4개의 튜브에 분액하였다(이들은 각각 0분 군, 블랭크 군, 30분 군 및 2시간 군이었다). 0분 및 블랭크 군은 얼음상에 놓은 반면, 다른 군들은 각각 30분 및 2시간 동안 세포내이입을 위해 37℃ 배양기에 넣었다. 상응하는 시점에서, EP 튜브를 꺼내어 얼음상에 놓아 5분간 예냉시켰다. 모든 처리 군을 원심분리하고 상등액을 버렸다(4℃, 1500 rpm x 5분). 세포를 FACS 완충제로 1회 세척하고 상등액을 제거하였다. 250 ㎕ 스트립 완충제를, 0분 군을 제외한 모든 처리 군의 EP 튜브에 가하고 실온에서 8분간 배양하였다. 세포를 원심분리하고 상등액을 버렸다(4℃, 1500 rpm x 5분). 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고 상등액을 제거하였다. 모든 처리 군에 100 ㎕ 면역염색 정착액을 가하고, 30분 넘게 4℃에 두고, 유식 세포계 DxFlex에 의해 검출하였다. B7-H4 항체의 세포내이입 백분율(%) = (매 시점에서의 평균 형광 강도값 - 블랭크 군의 평균 형광 강도값)/(0 시점에서의 평균 형광 강도값 - 블랭크 군의 평균 형광 강도값) x 100%. 데이터를 표 3에 나타낸다.
B7-H4 단백질의 인간화된 항체-매개된 세포내이입 효율
항체 0시간(%) 0.5시간(%) 2시간(%)
IgG 대조용 0 0.1 0.9
hu2G6 0 18.6 28.7
hu2F7 0 13.9 25.9
실시예 7: MC-MMAF에 대한 항체의 접합
본 발명의 항체는 세포 친화성 활성 및 세포내이입 활성을 갖고, 이는 상기 항체를 약물과의 커플링에 적합하게 하여 B7-H4-매개된 질병의 치료를 위한 항체-약물 접합체를 형성시킨다. 커플링 과정을 하기 식에 나타내고, 여기서 Ab는 hu2G6 또는 hu2F7을 나타낸다:
Figure pct00070
첫 번째 단계에서, S-(3-하이드록시프로필)티오아세테이트(0.7 ㎎, 5.3 mol)를 0.9 ㎖ 아세토나이트릴에 용해시켜, 나중에 사용하기 위한 용액을 형성시켰다. 상기 예비-제조된 S-(3-하이드록시프로필)티오아세테이트의 아세토나이트릴 용액을 pH = 4.3 아세테이트/나트륨 아세테이트 완충제(10.35 ㎎/㎖, 9.0 ㎖, 0.97 mol) 중의 항체에 가하였다. 이어서, 1.0 ㎖의 나트륨 시아노보로하이드라이드(14.1 ㎎, 224 mol)의 수용액을 반응 혼합물에 적가하고 25℃에서 2시간 동안 진탕하에서 반응시켰다. 반응의 완료 후에, 반응 혼합물을 탈염시키고 세파덱스(Sephadex) G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)을 사용하여 정제시켜 생성물 1f의 용액을 수득하였다. 용액을 10 ㎎/㎖로 농축시키고 다음 반응에 바로 사용하였다.
두 번째 단계에서, 1f 용액(11.0 ㎖)을 0.35 ㎖의 2.0 M 카복시아민 하이드로클로라이드 용액과 함께 가하고 25℃에서 30분간 진탕하에서 반응시켰다. 이어서 반응 용액을 탈염시키고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)을 사용하여 정제시켜 생성물 2f(농도 6.17 ㎎/㎖, 14.7 ㎖)의 용액을 수득하였다.
세 번째 단계에서, 화합물 MC-MMAF(1.1 ㎎, 1.2 mol, PCT 특허 WO2005081711에 개시된 방법에 의해 제조됨)를 0.3 ㎖ 아세토나이트릴에 용해시키고, 2f 용액(농도 6.17 ㎎/㎖, 3.0 ㎖)에 가하고 25℃에서 4시간 동안 진탕하에서 반응시켰다. 이어서 반응 용액을 탈염시키고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)에 의해 정제시키고, 멸균 조건하에서 필터로 여과하여 PBS 완충제 중의 생성물 Ab-MC-MMAF 항체-약물 접합체(3.7 ㎎/㎖, 4.7 ㎖)를 수득하고, 이를 4℃에서 냉장보관하였다. HIC-HPLC에 의해 측정된 생성물 hu2G6-MC-MMAF의 평균값 y는 3.8이었고, hu2G6-MC-MMAF(y=4)의 샘플을 HIC-HPLC 정제에 의해 수득하였다. HIC-HPLC에 의해 측정된 생성물 hu2F7-MC-MMAF의 평균값 y는 3.2였고, hu2F7-MC-MMAF(y=2) 및 hu2F7-MC-MMAF(y=4)의 샘플을 HIC-HPLC 정제에 의해 수득하였다.
실시예 8: SN-38에 대한 항체의 접합
항체-접합된 약물을 하기의 커플링 과정을 통해 제조하였고, 여기서 Ab는 hu2F7을 나타낸다:
Figure pct00071
첫 번째 단계에서, S-(3-하이드록시프로필)티오아세테이트(0.7 ㎎, 5.3 mol)를 0.9 ㎖ 아세토나이트릴에 용해시켜, 나중에 사용하기 위한 용액을 형성시켰다. 상기 예비-제조된 S-(3-하이드록시프로필)티오아세테이트의 아세토나이트릴 용액을 pH = 4.3 아세테이트/나트륨 아세테이트 완충제(10.35 ㎎/㎖, 9.0 ㎖, 0.97 mol) 중의 항체에 가하였다. 이어서, 1.0 ㎖의 나트륨 시아노보로하이드라이드(14.1 ㎎, 224 mol)의 수용액을 반응 혼합물에 적가하고 25℃에서 2시간 동안 진탕하에서 반응시켰다. 반응의 완료 후에, 반응 혼합물을 탈염시키고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)을 사용하여 정제시켜 생성물 1h의 용액을 수득하였다. 용액을 10 ㎎/㎖로 농축시키고 다음 반응에 바로 사용하였다.
두 번째 단계에서, 1h 용액(11.0 ㎖)을 0.35 ㎖의 2.0 M 카복시아민 하이드로클로라이드 용액과 함께 가하고 25℃에서 30분간 진탕하에서 반응시켰다. 이어서 반응 용액을 탈염시키고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)을 사용하여 정제시켜 생성물 2h(농도 6.2 ㎎/㎖, 15.0 ㎖)의 용액을 수득하였다. 상기 2h 용액을 약 10 ㎎/㎖로 농축시키고 다음 반응에 사용하였다.
세 번째 단계에서, 화합물 MC-VC-PAB-SN-38(1.3 ㎎, 1.2 mol)을 0.3 ㎖ 아세토나이트릴에 용해시키고, 2h 용액(농도 6.2 ㎎/㎖, 3.0 ㎖)에 가하고 25℃에서 4시간 동안 진탕하에서 반응시켰다. 이어서 반응 용액을 탈염시키고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 용액)에 의해 정제시키고, 멸균 조건하에서 필터로 여과하여 PBS 완충제 중의 생성물 hu2F7-SN-38 항체-약물 접합체(3.7 ㎎/㎖, 4.7 ㎖)를 수득하고, 이를 4℃에서 냉장보관하였다. 평균값 y를 자외선 방법에 의해 측정하였다. 나트륨 숙시네이트 완충제로 충전된 큐벳을 각각 참조 흡수 셀 및 샘플 측정 흡수 셀에 넣고, 용매 블랭크를 공제한 후에, 시험 용액으로 충전된 큐벳을 샘플 측정 흡수 셀에 넣었다. 280 ㎚ 및 370 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
데이터 처리:
항체 함량 Cmab를, 표준 곡선을 확립시키고 280 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 소분자 함량 CDrug을 370 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
평균 약물 부하 y = CDrug/Cmab
생성물 hu2F7-SN-38의 평균값 y = 3.7이 상기 방법에 의해 측정되었다. hu2F7-SN-38(y=4)의 샘플은 UV-HPLC 정제에 의해 수득되었다.
실시예 9: 엑사테칸에 대한 항체의 접합
Figure pct00072
1 단계에서, 2a(2 g, 17.2 mmol)를 75 ㎖ 아세토나이트릴에 용해시키고 칼륨 카보네이트(9.27 g, 67.2 mmol), 벤질 브로마이드(20 ㎖, 167.2 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오다이드(620 ㎎, 1.68 mmol)를 연속적으로 가하였다. 반응 용액을 실온에서 48시간 동안 교반하고 규조토를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 에틸 아세테이트(20 ㎖)로 세정하였다. 여액을 모으고 감압하에서 농축시켰다. 수득된 잔사를 전개 용매 시스템 C와 함께 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 생성물 5a(3.2 g, 수율: 90.1%)를 수득하였다.
2 단계에서, 5a(181.3 ㎎, 0.879 mmol) 및 4b(270 ㎎, 0.733 mmol)를 반응 플라스크에 가하고, 6 ㎖ 테트라하이드로퓨란을 가하고 아르곤으로 3회 교체하였다. 반응 혼합물을 빙-수욕에서 0-5℃로 냉각시키고 칼륨 3급-부톡사이드(164 ㎎, 1.46 mmol)를 가하고, 이어서 빙욕을 제거하여 실온으로 가온하고 40분간 교반하였다. 반응 혼합물에 15 ㎖ 빙수를 가하고 에틸 아세테이트(40 ㎖ x 2) 및 클로로포름(20 ㎖ x 5)으로 추출하였다. 유기상을 모으고 농축시켰다. 수득된 잔사를 6 ㎖ 다이옥산에 용해시키고, 3 ㎖ 수, 나트륨 바이카보네이트(73.8 ㎎, 0.879 mmol) 및 9-플루오렌 메틸 클로로포르메이트(190 ㎎, 0.734 mmol)를 가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 30 ㎖ 수를 가하고 에틸 아세테이트(20 ㎖ x 3)로 추출하였다. 유기상을 포화된 염화 나트륨 용액(30 ㎖)으로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시키고 여과하였다. 여액을 감압하에서 농축시켰다. 수득된 잔사를 전개 용매 시스템 C와 함께 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 생성물 5b 벤질 10-사이클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-다이옥소-2,9-다이옥사-4,7-다이아자운데크-11-에이트(73 ㎎, 수율: 19.4%)를 수득하였다.
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1].
3 단계에서, 5b(30 ㎎, 0.058 mmol)를 6.75 ㎖의 테트라하이드로퓨란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 혼합된 용매에 용해시키고, 탄소상 팔라듐(18 ㎎, 함량 10%, 건조 기준)을 가하고, 수소로 3회 교체하고, 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 용액을 규조토로 여과하였다. 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 세정하였다. 여액을 농축시켜 조 생성물 5c, 10-사이클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-다이옥소-2,9-다이옥사-4,7-다이아자운데크-11-산(20 ㎎)을 수득하고, 이를 정제 없이 다음 반응에 바로 사용하였다.
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1].
4 단계에서, 1b(15 ㎎, 28.2 μmol)를 반응 플라스크에 가하고, 1.5 ㎖ N,N-다이메틸포름아미드를 가하고 아르곤으로 3회 교체하였다. 반응 혼합물을 빙수욕에서 0-5℃로 냉각시키고, 1 방울의 트라이에틸아민을 가하고, 조 생성물 5c(20 ㎎, 47.1 μmol)를 가하고, 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸클로로모르폴린(25.4 ㎎, 86.2 μmol)을 가하고, 빙욕에서 40분간 교반하면서 반응시켰다. 반응 혼합물에 15 ㎖ 수를 가하고, 에틸 아세테이트(20 ㎖ x 3)로 추출하였다. 유기상을 모았다. 유기상을 포화된 염화 나트륨 용액(20 ㎖ x 2)으로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시키고 여과하였다. 여액을 감압하에서 농축시켰다. 수득된 잔사를 전개 용매 시스템 B와 함께 박층 크로마토그래피에 의해 정제시켜 표제 생성물 5d (9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-사이클로프로필-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-다이옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌로지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트(23.7 ㎎, 수율: 78.9%)를 수득하였다.
MS m/z (ESI): 842.1[M+1].
5 단계에서, 5d(30 ㎎, 35.7 μmol)를 3 ㎖ 다이클로로메탄에 용해시키고, 1.5 ㎖ 다이에틸아민을 가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압하에서 농축시키고, 1.5 ㎖ 톨루엔을 가하고 감압하에서 농축시키고, 2회 반복하였다. 잔사에 4.5 ㎖ n-헥산을 가하고 펄프화하였다. 정치 후에 상등액을 붓고 고체를 유지시켰다. 고체 잔사를 감압하에서 농축시키고 건조 펌핑하여 조 생성물 5e 2-((2-아미노아세트아미도)메톡시)-2-사이클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-다이옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌로지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드(23 ㎎)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 반응에 바로 사용하였다.
MS m/z (ESI): 638.0[M+18].
6 단계에서, 조 생성물 5e(20 ㎎, 32.3 μmol)를 1 ㎖ N,N-다이메틸포름아미드에 용해시키고 아르곤으로 3회 교체하였다. 반응 혼합물을 빙수욕에서 0-5℃로 냉각시키고, 0.5 ㎖의 4 g(31.8 ㎎, 67.3 μmol)의 N,N-다이메틸포름아미드 용액을 가하고, 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸클로로모르폴린(27.8 ㎎, 94.3 μmol)을 가하고 빙욕에서 10분간 교반하면서 반응시켰다. 반응 혼합물을 빙욕을 제거하여 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하에서 반응시켜 화합물 5를 생성시켰다. 반응 용액을 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5 ㎛ 19*250 ㎜; 이동상: A-수(10 mmol NH4OAc): B-아세토나이트릴, 구배 용출, 유량: 18 ㎖/분)에 의해 정제시켰다. 상응하는 성분을 수집하고 감압하에서 농축시켜 생성물 5-A 및 5-B(3.6 ㎎, 2.6 ㎎)를 수득하였다.
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1].
단일 배열 화합물 5-A(보다 짧은 체류 시간)
UPLC 분석: 체류 시간 1.14분, 순도: 85%(컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 ㎛ 2.1*50 ㎜; 이동상: A-수(5 mmol NH4OAc), B-아세토나이트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 2H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m, 4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 2H), 2.80-2.62 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H).
단일 배열 화합물 5-B(보다 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간 1.16분, 순도: 89%(컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 ㎛ 2.1*50 ㎜; 이동상: A-수(5 mmol NH4OAc), B-아세토나이트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H).
다른 중간체의 제조 방법은 중간체 5의 방법을 참조하였다.
항체 hu2F7의 PBS 완충된 수용액(pH = 6.5 0.05 M PBS 완충된 수용액; 7.3 ㎖, 13.8 ㎎/㎖, 0.681 μmol)에 37℃에서 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(10 mM, 0.347 ㎖, 3.47 μmol)의 제조된 수용액을 가하였다. 반응 혼합물을 수욕 진탕기에 넣고 37℃에서 진탕하에 3시간 동안 반응시켰다. 반응을 종료시키고, 반응 용액을 수욕에서 25℃로 냉각시키고, 14.0 ㎖로 희석하고, 상기 용액 3.3 ㎖을 다음 반응을 위해 취하였다.
화합물 5-A(3.0 ㎎, 3.72 μmol)를 0.15 ㎖ DMSO에 용해시키고 상기 3.3 ㎖ 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 수욕 진탕기에 넣고 25℃에서 3시간 동안 진탕하에서 교반하였다. 반응을 종료시켰다. 반응 용액을 탈염하고 세파덱스 G25 젤 컬럼(용출상: pH 6.5 0.05 M PBS 완충된 수용액, 0.001 M EDTA 함유)을 사용하여 정제시켜 PBS 완충제(1.35 ㎎/㎖, 13 ㎖) 중의 Ab-엑사테칸, hu2F7-엑사테칸(화합물 34)의 예시적인 생성물을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다. 평균값 y를 자외선 방법에 의해 측정하였다. 나트륨 숙시네이트 완충제로 충전된 큐벳을 각각 참조 흡수 셀 및 샘플 측정 흡수 셀에 넣고, 용매 블랭크를 공제한 후에, 시험 용액으로 충전된 큐벳을 샘플 측정 흡수 셀에 넣었다. 280 ㎚ 및 370 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
데이터 처리:
항체 함량 Cmab를, 표준 곡선을 확립시키고 280 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 소분자 함량 CDrug을 370 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
평균 약물 부하 y = CDrug/Cmab
예시적인 생성물 hu2F7-엑사테칸(화합물 34)에 관하여, y가 상기 방법에 의해 7.6인 것으로 측정되었다. hu2F7-엑사테칸(y=8)의 샘플은 UV-HPLC 정제에 의해 수득되었다.
다른 항체 접합체의 제조 방법은 화합물 34의 방법을 참조하였다.
실시예 10: 종양 세포에 대한 항체-약물 접합체의 사멸 활성
종양 세포에 대한 본 발명의 항체-약물 접합체의 사멸 효과를 시험하기 위해서, MX-1 유방암 세포를 평가에 사용하였다. MX-1 세포를 수집하고, 원심분리하고 카운트하였다. 세포 밀도를 완전 배지로 0.44x106 세포/㎖로 조절하고, 세포를 백색 96-웰 플레이트의 60 웰에, 웰당 90 ㎕로 40,000의 세포수로 도말하였다. 나머지 말초 웰에 100 ㎕ PBS를 가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 밤새 배양하였다. 실험 2일째에, 항체-약물 접합체 용액을, 1000 nM의 농도로 출발하여(3배 희석 및 9개 농도), 96-웰 V-바닥 플레이트에서 PBS로 제조하였다. 제조의 완료 후에, 용액을 백색 96-웰 플레이트에 웰당 10 ㎕로 중복해서 가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 배양을 72시간 동안 지속시켰다. 실험 5일째에, 플레이트를 검출하고 판독하였다. 세포 배양 플레이트를 꺼냈다. 2개의 대조용 웰을 설정하였다. 40,000 세포를 함유하는 100 ㎕ 배지를 각 웰에 가하고, 실온으로 평형화 후에, 50 ㎕ CTG 용액(프로메가 G7573)을 각 웰에 가하였다. 혼합물을 진탕하고 혼합하고, 암실에 두고 10분간 방치하고, 이어서 미세플레이트 판독기의 발광 프로그램을 사용하여 검출하였다. 최대 사멸율 = (1-1000 nM 웰의 형광값/대조용 웰의 형광값)%. 실험 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다:
종양 세포에 대한 항체-약물 접합체의 사멸 활성의 평가
항체-약물 접합체 IC50 (nM) 최대 용량에서 사멸 효과
IgG-MC-MMAF (대조용) ND ND
hu2G6-MC-MMAF (화합물 1, y=4) 1.1 48.2%
hu2F7-MC-MMAF (화합물 2, y=4) 3.4 53.9%
hu2F7-SN-38 (화합물 6, y=4) 78.85 56.4%
hu2F7-Exatecan (화합물 34, y=8) 80.28 60.39%
ND: 검출할 수 있는 활성 없음
실시예 11: 종양 세포의 성장에 대한 항체-약물 접합체의 억제 효과
종양 세포에 대한 본 발명의 항체-약물 접합체의 사멸 효과를 시험하기 위해서, SK-BR-3(ATCC #HTB30) 유방암 세포를 평가에 사용하였다. SK-BR-3 세포를 수집하고, 원심분리하고 카운트하였다. 세포 밀도를 완전 배지로 0.44x106 세포/㎖로 조절하고, 세포를 백색 96-웰 플레이트의 60 웰에, 웰당 90 ㎕로 40,000의 세포수로 도말하였다. 나머지 말초 웰에 100 ㎕ PBS를 가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 밤새 배양하였다. 실험 2일째에, 항체-약물 접합체 용액을, 1000 nM의 농도로 출발하여(3배 희석 및 9개 농도), 96-웰 V-바닥 플레이트에서 PBS로 제조하였다. 제조의 완료 후에, 용액을 백색 96-웰 플레이트에 웰당 10 ㎕로 중복해서 가하였다. 2개의 다른 대조용 웰을 설정하고 10 ㎕ PBS를 각 웰에 가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 배양을 72시간 동안 지속시켰다. 실험 5일째에, 플레이트를 검출하고 판독하였다. 세포 배양 플레이트를 꺼냈다. 실온으로 평형화 후에, 50 ㎕ CTG 용액(프로메가 G7573)을 각 웰에 가하였다. 혼합물을 진탕하고 혼합하고, 암실에 두고 10분간 방치하고, 이어서 미세플레이트 판독기의 발광 프로그램을 사용하여 검출하였다. 최대 억제율 = (1-1000 nM 웰의 형광값/대조용 웰의 형광값)%. 실험 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다:
종양 세포에 대한 항체-약물 접합체의 억제 활성의 평가
항체-약물 접합체 IC50 (nM) 최대 억제율
IgG-MC-MMAF (대조용) ND ND
hu2G6-MC-MMAF (화합물 1, y=4) 1.0 90.3%
hu2F7-MC-MMAF (화합물 2, y=4) 9.5 91.8%
ND: 검출할 수 있는 활성 없음
실시예 12: MMAF에 접합된 항체-약물 접합체의 생체내 효능의 평가
마우스에서 MX-1 세포로 이식된 종양을 형성시킨 후에, 본 발명의 항체-약물 접합체의 항-종양 효과를 평가하였다. 5x106 MX-1 세포를 면역결핍 누드 마우스(BALB/c Nude)에 피하 주입하였다. 2주 후에, 항체-약물 접합체 hu2G6-MC-MMAF 및 hu2F7-MC-MMAF의 정맥내 주입을, 주당 1회의 빈도 및 1.5 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 용량으로 수행하였다. 인간 IgG1 단백질을 3 ㎎/㎏의 용량으로 대조용으로서 사용하였다. 대조군 또는 투여 군의 각 군에 5마리의 마우스가 존재하였다. 종양 억제율을 종양 부피를 측정하여 계산하였다. 종양 억제율 = 100% - (21일째에 투여 군의 종양 부피 - 0일째에 투여 군의 종양 부피)/(21일째에 대조군의 종양 부피 - 0일째에 대조군의 종양 부피). 실험 결과는 도 1 및 표 6에 나타낸 바와 같다. hu2G6-MC-MMAF 및 hu2F7-MC-MMAF 모두 용량-의존적인 항-종양 효과를 나타낸다. hu2G6-MC-MMAF 및 hu2F7-MC-MMAF 모두 3 ㎎/㎏의 용량에서 100%를 초과하는 종양 억제율을 나타내고, 이는 본 발명의 항체-약물 접합체가 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라, 이미 형성된 종양에 대해 사멸 효과를 발휘할 수 있음을 의미한다.
종양-함유 누드 마우스에서 MX-1 이식된 종양에 대한 투여 화합물의 효능
투여 군 종양 억제율
hu2G6-MC-MMAF (화합물 1, y=4) 1.5 ㎎/㎏ 38.0%
hu2G6-MC-MMAF (화합물 1, y=4) 3 ㎎/㎏ 115.6%
hu2F7-MC-MMAF (화합물 2, y=4) 1.5 ㎎/㎏ 90.3%
hu2F7-MC-MMAF (화합물 2, y=4) 3 ㎎/㎏ 163.8%
실시예 13: 상이한 약물 부하를 갖는 항체-약물 접합체의 생체내 효능의 평가
상이한 약물 부하를 갖는 항체-약물 접합체를 추가로 연구하기 위해서, 항체-약물 접합체를 실시예 7의 방법에 의해 제조하고 HPLC에 의해 정제시켜 hu2F7-MC-MMAF(y=2) 및 hu2F7-MC-MMAF(y=4)를 수득하였다(도 2). 마우스에서 MX-1로 이식된 종양을 형성시킨 후에, 본 발명의 항체-약물 접합체의 항-종양 효과를 평가하였다. 5x106 MX-1 세포를 면역결핍 누드 마우스에 피하 주입하였다. 2주 후에, 항체-약물 접합체 hu2F7-MC-MMAF(y=2) 및 hu2F7-MC-MMAF(y=4)의 정맥내 주입을, 주당 1회의 빈도 및 3 ㎎/㎏의 용량으로 수행하였다. 인간 IgG1 단백질을 3 ㎎/㎏의 용량으로 대조용으로서 사용하였다. 대조군 또는 투여 군의 각 군에 5마리의 마우스가 존재하였다. 종양 억제율을 종양 부피를 측정하여 계산하였다. 종양 억제율 = 100% - (21일째에 투여 군의 종양 부피 - 0일째에 투여 군의 종양 부피)/(21일째에 대조군의 종양 부피 - 0일째에 대조군의 종양 부피). 실험 결과는 도 3 및 표 7에 나타낸 바와 같다. hu2F7-MC-MMAF(y=2) 및 hu2F7-MC-MMAF(y=4) 모두 항-종양 효과를 나타낸다. hu2F7-MC-MMAF(y=4)는 3 ㎎/㎏의 용량에서 hu2F7-MC-MMAF(y=2)보다 더 강한 항-종양 효과를 갖고, 이는 100%를 초과하는 종양 억제율을 나타내고, 이는 hu2F7-MC-MMAF(y=4)가 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라, 이미 형성된 종양에 대해 사멸 효과를 발휘할 수 있음을 의미한다(도 4).
종양-함유 누드 마우스에서 MX-1 이식된 종양에 대한 상이한 약물 부하를 갖는 항체-약물 접합체의 효능
투여 군 종양 억제율
hu2F7-MC-MMAF (y=2) 3 ㎎/㎏ 87.99%
hu2F7-MC-MMAF (y=4) 3 ㎎/㎏ 197.87%
실시예 14: 엑사테칸에 접합된 항체-약물 접합체의 생체내 효능의 평가
엑사테칸에 접합된 항체-약물 접합체를 연구하기 위해서, 항체-약물 접합체를 실시예 9의 방법에 의해 제조하고 HPLC에 의해 정제시켜 hu2F7-엑사테칸(화합물 34, y=8)을 수득하였다. 마우스에서 MX-1 세포로 이식된 종양을 형성시킨 후에, 본 발명의 항체-약물 접합체의 항-종양 효과를 평가하였다. 5x106 MX-1 세포를 면역결핍 누드 마우스에 피하 주입하였다. 2주 후에, 항체-약물 접합체 hu2F7-엑사테칸(y=8)의 정맥내 주입을, 주당 1회의 빈도 및 5 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏의 용량으로 수행하였다. 인간 IgG1 단백질을 5 ㎎/㎏의 용량으로 대조용으로서 사용하였다. 대조군 또는 투여 군의 각 군에 5마리의 마우스가 존재하였다. 종양 억제율을 종양 부피를 측정하여 계산하였다. 종양 억제율 = 100% - (18일째에 투여 군의 종양 부피 - 0일째에 투여 군의 종양 부피)/(18일째에 대조군의 종양 부피 - 0일째에 대조군의 종양 부피). 실험 결과는 표 8에 나타낸 바와 같다. hu2F7-엑사테칸은 5 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏ 모두의 용량에서 100%를 초과하는 종양 억제율을 나타내고, 이는 hu2F7-엑사테칸(y=8)이 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라, 이미 형성된 종양에 대해 사멸 효과를 발휘할 수 있음을 의미한다.
종양-함유 누드 마우스에서 MX-1 이식된 종양에 대한 엑사테칸에 접합된 항체-약물 접합체의 효능
투여 군 종양 억제율
hu2F7-엑사테칸 (화합물 34, y=8) 5 ㎎/㎏ 173.55%
hu2F7-엑사테칸 (화합물 34, y=8) 10 ㎎/㎏ 183.48%
실시예 15: 엑사테칸에 접합된 항체-약물 접합체의 방관자 사멸 활성의 실험
방관자 효과를 통한 B7-H4 음성 세포 사멸에 대한 본 발명의 엑사테칸에 접합된 항체-약물 접합체의 효과를 연구하기 위해서, 음성 B7-H4 발현을 갖는 골수종 세포주에 대한 상기 항체-약물 접합체의 사멸 활성을 ONE-Glo(상표) 루시페라제 분석 검출 키트를 사용하여 검출하였다. MX-1 세포를 검출하고, 원심분리하고, 카운트하고, 완전 배지로 7.5x106 세포/㎖의 세포 현탁액으로 조절하고, 백색 96-웰 플레이트상에 도말하였다. 33 ㎕의 MX-1 세포 현탁액을 "혼합 세포 군"의 각 웰에 가하고, 33 ㎕ PBS를 "단세포 군"의 각 웰에 가하였다. 음성 B7-H4 발현을 갖는 NCI-H929-LUC 종양 세포(코바이오어(Cobioer) 카탈로그 번호 CBP30061L)를 수집하였다. 세포 밀도를 1.5x106 세포/㎖로 조절하였다. 33 ㎕의 NCI-H929-LUC 세포 현탁액을 "혼합 세포 군" 및 "단세포 군"의 각 웰에 가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 밤새 배양하였다. 실험 2일째에, 시험하고자 하는 항체-약물 접합체 hu2F7-엑사테칸(화합물 34, y=8)의 최고 농도를 3000 nM로 균일하게 조절하고, 희석하여 9개 용량의 5배 구배를 획득하였다. 33.3 ㎕의 희석된 항체-약물 접합체 작업 용액을 실험 플레이트의 각 웰에 가하고 서서히 혼합하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 48시간 동안 배양하였다. 세포 배양 플레이트를 꺼내고 실온으로 평형화하였다. 이어서 100 ㎕의 ONE-Glo(상표) 루시페라제 시약(프로메가 E6120)을 각 웰에 가하였다. 세포를 실온의 암실에서 10분간 진탕 및 용해시켰다. 세포 용해물을 1000 rpm/분에서 1분간 원심분리하고, 이어서 웰당 180 ㎕로 투명 바닥을 갖는 96-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 미세플레이트 판독기상에서 490 ㎚의 파장에서 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 실험 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다. ONE-Glo(상표) 루시페라제 시약은 NCI-H929-LUC 세포의 생육력을 특이적으로 검출할 수 있다. hu2F7-엑사테칸은 "혼합 세포 군"의 NCI-H929-LUC 세포를 유효하게 사멸시키고, 이는 B7-H4 양성 세포의 존재하에서, hu2F7-엑사테칸이 방관자 사멸 효과를 갖고, B7-H4 양성 세포를 사멸시킬 뿐만 아니라, 둔감한 B7-H4 음성 세포("단세포 군" 중의)도 사멸시킬 수 있음을 가리킨다.
방관자 사멸 활성의 평가
실험 군 IC50 (nM) 최대 억제율
혼합 세포 군 (MX-1:NCI-LUC=5:1) 70.34 76.8%
단세포 군 (NCI-H929-LUC) ND ND
ND: 검출가능한 활성 없음
SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI HANSOH BIOMEDICAL CO., LTD. JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD. <120> ANTI-B7-H4 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND MEDICINAL USE THEREOF <130> 702041CPCT <140> PCT/CN2020/094856 <141> 2020-06-08 <150> CN 201910498993.2 <151> 2019-06-06 <150> CN 202010215322.3 <151> 2020-03-24 <160> 55 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> huB7-H4-His <400> 1 Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser 20 25 30 Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile 35 40 45 Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu 50 55 60 Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val 65 70 75 80 His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met 85 90 95 Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr 115 120 125 Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu 130 135 140 Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn 145 150 155 160 Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln 165 170 175 Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser 180 185 190 Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met 195 200 205 Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser 210 215 220 Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val 225 230 235 240 Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser 245 250 255 Lys Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser His His His His 260 265 270 His His His His 275 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> huB7-H4-Fc <400> 2 Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro 20 25 30 Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val 35 40 45 Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu 50 55 60 Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val 65 70 75 80 Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp 85 90 95 Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn 100 105 110 Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn 115 120 125 Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg 130 135 140 Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly 145 150 155 160 Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu 165 170 175 Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn 180 185 190 Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly 195 200 205 Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln 210 215 220 Leu Leu Asn Ser Lys Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR1 <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 <400> 4 Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 <400> 5 Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 <400> 6 His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR2 <400> 7 His Gly Thr Asn Leu Glu Asp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR3 <400> 8 Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR1 <400> 9 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 <400> 10 Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 <400> 11 Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR2 <400> 13 Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR3 <400> 14 Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2G6 HCVR <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2G6 LCVR <400> 16 Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2F7 HCVR <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2F7 LCVR <400> 18 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2G6 HC <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2G6 LC <400> 20 Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2F7 HC <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 22 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2F7 LC <400> 22 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR1 <400> 23 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 <400> 24 Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 <400> 25 Asp Ser Arg Phe Ser Tyr 1 5 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 <400> 26 Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR2 <400> 27 Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR3 <400> 28 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR1 <400> 29 Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR2 <400> 30 Tyr Leu Asn Ser Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> HCDR3 <400> 31 Asp Ser Arg Phe Ser Tyr 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR1 <400> 32 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR2 <400> 33 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> LCDR3 <400> 34 Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2F8 HCVR <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu2F8 LCVR <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu1C9 HCVR <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu1C9 LCVR <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2F8 HC <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu2F8 LC <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu1C9HC <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> hu1C9 LC <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Optimized HCDR1 <400> 43 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Optimized HCDR2 <400> 44 Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Optimized HCDR2 <400> 45 Tyr Leu Asn Arg Gly Ser 1 5 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2G6 HCVR <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2G6 LCVR <400> 47 Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2F7 HCVR <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2F7 LCVR <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 50 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2F8 HCVR <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Ala Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 2F8 LCVR <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 52 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 1C9 HCVR <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> 1C9 LCVR <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 54 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> IgG1 C <400> 54 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Ig kappa C <400> 55 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (41)

  1. 하기 화학식 A로 나타내는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 A]
    Figure pct00073

    상기 식에서,
    D는 세포독성 약물이고;
    L1 및 L2는 링커 단위이고;
    y는 1 내지 20의 수이고;
    Ab는 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    상기 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 제시된 하나 이상의 HCDR을 포함하고,
    상기 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 제시된 하나 이상의 LCDR을 포함한다.
  2. 제1항에 있어서,
    Ab의 항체 중쇄 가변 영역이 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (1) 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3;
    (2) 서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3;
    (3) 서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
    (4) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3.
  3. 제1항에 있어서,
    Ab의 항체 경쇄 가변 영역이 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (1) 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3;
    (2) 서열번호 12에 제시된 LCDR1, 서열번호 13에 제시된 LCDR2 및 서열번호 14에 제시된 LCDR3;
    (3) 서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 및
    (4) 서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3.
  4. 제1항에 있어서,
    Ab의 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역이 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (1) 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3; 및
    서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3;
    (2) 서열번호 9에 제시된 HCDR1, 서열번호 10에 제시된 HCDR2 및 서열번호 11에 제시된 HCDR3; 및
    서열번호 12에 제시된 LCDR1, 서열번호 13에 제시된 LCDR2 및 서열번호 14에 제시된 LCDR3;
    (3) 서열번호 23에 제시된 HCDR1, 서열번호 24에 제시된 HCDR2 및 서열번호 25에 제시된 HCDR3; 및
    서열번호 26에 제시된 LCDR1, 서열번호 27에 제시된 LCDR2 및 서열번호 28에 제시된 LCDR3; 및
    (4) 서열번호 29에 제시된 HCDR1, 서열번호 30에 제시된 HCDR2 및 서열번호 31에 제시된 HCDR3; 및
    서열번호 32에 제시된 LCDR1, 서열번호 33에 제시된 LCDR2 및 서열번호 34에 제시된 LCDR3.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab가 쥐 항체 또는 이의 단편, 키메라 항체 또는 이의 단편, 인간 항체 또는이의 단편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편인 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab가 하기 (a), (b) 및 (c) 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 또한 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (a) 인간 생식세포계열 경쇄 및 중쇄 서열 또는 이의 돌연변이 서열로부터 유래된 경쇄 프레임워크 영역 및 중쇄 프레임워크 영역;
    (b) 인간 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2 또는 이의 변이체, IgG3 또는 이의 변이체, 또는 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래된 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 중쇄 불변 영역, 보다 바람직하게는 아미노산 돌연변이 후에 증대된 ADCC 독성을 갖는 IgG1의 중쇄 불변 영역, 가장 바람직하게는 서열번호 54에 제시된 중쇄 불변 영역; 및
    (c) 인간 κ 쇄, λ 쇄 또는 이의 변이체로부터 유래된 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 κ 쇄로부터 유래된 경쇄 불변 영역, 보다 바람직하게는 서열번호 55에 제시된 경쇄 불변 영역.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab가 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 36 또는 서열번호 38의 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 36 또는 서열번호 38과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab가 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 35 또는 서열번호 37의 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 35 또는 서열번호 37과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab의 경쇄가 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 40 또는 서열번호 42, 및 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 40 또는 서열번호 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 전장 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab의 중쇄가 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 39 또는 서열번호 41, 및 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 39 또는 서열번호 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 전장 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (1) 서열번호 15에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16에 제시된 경쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호 17에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18에 제시된 경쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호 35에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36에 제시된 경쇄 가변 영역; 및
    (4) 서열번호 37에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 38에 제시된 경쇄 가변 영역.
  12. 제11항에 있어서,
    Ab가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    (1) 서열번호 20에 제시된 경쇄 및 서열번호 19에 제시된 중쇄;
    (2) 서열번호 22에 제시된 경쇄 및 서열번호 21에 제시된 중쇄;
    (3) 서열번호 40에 제시된 경쇄 및 서열번호 39에 제시된 중쇄; 및
    (4) 서열번호 42에 제시된 경쇄 및 서열번호 41에 제시된 중쇄.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 항체, 이량체화된 V 영역, 다이설파이드 결합 안정화된 V 영역, 및 CDR을 포함하는 펩타이드의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포독성 약물이 독소, 화학요법제, 항생제, 방사성동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포독성 약물이
    튜불린 억제제 또는 세포 분열을 억제하는 DNA 국소이성화효소 억제제;
    바람직하게는 DM1, DM3, DM4, SN-38, MMAF 및 MMAE;
    보다 바람직하게는 튜불린 억제제 SN-38, MMAE 및 MMAF
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포독성 약물이 캄토테신 유도체, 바람직하게는 엑사테칸(Exatecan)으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00074
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포독성 약물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00075
  18. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 I에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 I]
    Figure pct00076

    상기 식에서,
    L1 및 L2는 링커 단위이고;
    y는 1 내지 8로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 4로부터 선택되는 수이고;
    Ab는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
  19. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 II에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 II]
    Figure pct00077

    상기 식에서,
    L1 및 L2는 링커 단위이고;
    y는 1 내지 8로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 4로부터 선택되는 수이고;
    Ab는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
  20. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 III에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 III]
    Figure pct00078

    상기 식에서,
    L1 및 L2는 링커 단위이고;
    y는 1 내지 10으로부터 선택되는 수, 바람직하게는 2 내지 8로부터 선택되는 수, 보다 바람직하게는 4 내지 8의 수, 더욱 바람직하게는 6 내지 8의 수, 가장 바람직하게는 8이고;
    Ab는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1이 하기 화학식 B에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 B]
    Figure pct00079

    상기 식에서,
    M1은 -CR1R2-이고;
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬, 할로겐, 하이드록실 및 아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    n은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1, 2 또는 3이다.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2가 하기 화학식 C에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 C]
    Figure pct00080

    상기 식에서,
    M2는 -CR4R5-이고;
    R3은 수소, 할로겐, 하이드록실, 아미노, 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 수소, 알킬, 할로겐, 하이드록실 및 아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    m은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1, 2 또는 3이다.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2가 하기 화학식 D에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 D]
    -K1-K2-K3-K4-
    상기 식에서,
    K1은
    Figure pct00081
    이고, s는 2 내지 8의 정수이고;
    K2는 -NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-, -NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-, -S(CH2)pC(O)- 및 단일 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고;
    R1은 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    K3은 테트라펩타이드 잔기이고, 바람직하게는 상기 테트라펩타이드 잔기는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타메이트 및 아스파테이트 중 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 의해 형성된 펩타이드 잔기; 보다 바람직하게 테트라펩타이드 잔기 GGFG이고;
    K4는 -NR2(CR3R4)t-이고, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬이고; t는 1 또는 2이다.
  24. 제23항에 있어서,
    링커 단위 -L2-의 K1 말단이 Ab에 연결되고, K4 말단이 L1에 연결되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  25. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1이 -O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-, -O-CR5R6-(CRaRb)m-, -O-CR5R6-, -NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb가 각각 독립적으로 수소, 중수소, 할로겐 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5가 할로알킬 또는 사이클로알킬이고,
    R6이 수소, 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자가 사이클로알킬을 형성하고;
    m이 0, 1, 2, 3 또는 4인
    항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  26. 제25항에 있어서,
    L1의 O 말단이 링커 단위 L2에 연결되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  27. 제25항에 있어서,
    L1이 하기 화학식 E에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 E]
    Figure pct00082

    상기 식에서,
    R5는 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6은 수소, 할로알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 사이클로알킬을 형성하고;
    바람직하게는
    R5는 C1-6 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6은 수소, C1-6 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 C3-6 사이클로알킬을 형성하고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    보다 바람직하게는, 화학식 E는 하기의 치환기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
    Figure pct00083
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L2-L1-이 하기의 구조에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00084

    상기 식에서,
    K2는 결합이고;
    K3은 테트라펩타이드 잔기 GGFG이고;
    R5는 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6은 수소, 할로알킬 및 C3-6 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 C3-6 사이클로알킬을 형성하고;
    R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
    s는 2 내지 8의 정수이고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    바람직하게는, 상기 -L2-L1-은 하기의 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
    Figure pct00085

    Figure pct00086
    .
  29. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 화학식 IV에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 IV]
    Figure pct00087

    상기 식에서,
    W는 C1-8 알킬, C1-8 알킬-사이클로알킬 및 1 내지 8개의 원자의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서 상기 C1-8 알킬, 사이클로알킬 및 선형 헤테로알킬은 할로겐, 하이드록실, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화된 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 추가로 치환되고;
    K2는 -NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 및 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1은 수소 원자, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, p1은 1 내지 20의 정수이고;
    K3은 2 내지 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 잔기이고, 상기 아미노산은 치환되거나 비치환될 수 있고; 치환되는 경우, 상기 치환기는 임의의 이용가능한 부착점에서 치환될 수 있고, 상기 치환기는 할로겐, 하이드록실, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화된 알킬, 알콕실 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이고;
    R2는 수소 원자, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화된 알킬 및 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6은 수소 원자, 할로겐, 할로알킬, 중수소화된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R5 및 R6 및 이들이 연결된 탄소 원자는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴을 형성하고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    y는 1 내지 10이고, y는 소수 또는 정수이고;
    Ab는 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
  30. 제18항에 있어서,
    하기 화학식 I-A에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 I-A]
    Figure pct00088
    .
  31. 제18항에 있어서,
    하기 화학식 I-B에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 I-B]
    Figure pct00089
    .
  32. 제19항에 있어서,
    하기 화학식 II-A에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 II-A]
    Figure pct00090
    .
  33. 제19항에 있어서,
    하기 화학식 II-B에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    [화학식 II-B]
    Figure pct00091
    .
  34. 제29항에 있어서,
    하기 화학식 IV-A에 제시되고:
    [화학식 IV-A]
    Figure pct00092
    ,
    바람직하게는, 하기와 같이 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00093

    Figure pct00094

    Figure pct00095
    .
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00096

    Figure pct00097

    Figure pct00098

    Figure pct00099

    Figure pct00100

    Figure pct00101

    Figure pct00102

    Figure pct00103

    Figure pct00104

    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109

    Figure pct00110

    Figure pct00111

    Figure pct00112

    Figure pct00113

    Figure pct00114

    Figure pct00115

    Figure pct00116

    Figure pct00117

    Figure pct00118

    Figure pct00119

    Figure pct00120

    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123

    Figure pct00124

    Figure pct00125

    Figure pct00126

    Figure pct00127

    Figure pct00128

    Figure pct00129

    상기 식에서,
    y는 2 내지 10, 바람직하게는 4 내지 8, 보다 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 바람직하게는 7 내지 8로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 8이다.
  36. 하기의 단계를 포함하는, 화학식 IV에 제시된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 제조 방법으로서, Ab가 환원될 때, 화학식 F에 제시된 화합물과 커플링 반응을 수행하여 화학식 IV에 제시된 화합물을 제조하는 제조 방법:
    Figure pct00130

    상기 식에서,
    Ab는 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    W, K2, K3, R2 내지 R6, m 및 y는 제29항에 정의된 바와 같다.
  37. 제36항에 있어서,
    화학식 F에 제시된 화합물이 하기 화학식 F-1에 제시된 화합물 또는 이의 호변이성질체, 메소머, 라세메이트, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이들의 혼합 형태, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염인, 제조 방법:
    [화학식 F-1]
    Figure pct00131

    상기 식에서,
    K2, K3, R2 내지 R6, s 및 m은 제28항에 정의된 바와 같다.
  38. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식 F 또는 화학식 F-1에 제시된 화합물:
    Figure pct00132

    Figure pct00133

    Figure pct00134
    .
  39. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  40. 인간 B7-H4와 관련된 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 제39항에 따른 약학 조성물의 용도.
  41. 제40항에 있어서,
    높은 B7-H4 발현을 갖는 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도로서, 상기 암이 인간 뇌의 성상모세포종, 인간 인두암, 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연부 육종, 성상세포종, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 신장의 발색세포암종(chromophore cell carcinoma), 투명세포암종, 결장암, 결장직장암, 결합조직 증식성 소원형세포종양, 뇌실막종, 유잉육종, 골외점액 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 골의 섬유성 이형성증, 담낭 또는 담관암종, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬 세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방육종/악성 지방종 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비종양, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 선종, 소아암, 말초신경초종, 갈색세포종(pheocytoma), 뇌하수체종양, 전립선암, 후포도막흑색종, 신장전이암, 횡문근종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 활액 육종, 고환암, 흉선암, 갑상선 전이암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
KR1020217043062A 2019-06-06 2020-06-08 항-b7-h4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도 KR20220017946A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910498993 2019-06-06
CN201910498993.2 2019-06-06
CN202010215322.3 2020-03-24
CN202010215322 2020-03-24
PCT/CN2020/094856 WO2020244657A1 (zh) 2019-06-06 2020-06-08 抗b7-h4抗体-药物偶联物及其医药用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220017946A true KR20220017946A (ko) 2022-02-14

Family

ID=73652996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217043062A KR20220017946A (ko) 2019-06-06 2020-06-08 항-b7-h4 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230072897A1 (ko)
EP (1) EP3981434A4 (ko)
JP (1) JP2022535858A (ko)
KR (1) KR20220017946A (ko)
CN (1) CN112351797B (ko)
AU (1) AU2020288275A1 (ko)
BR (1) BR112021024406A2 (ko)
CA (1) CA3142641A1 (ko)
MX (1) MX2021014960A (ko)
TW (1) TW202112398A (ko)
WO (1) WO2020244657A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023249473A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 주식회사 피노바이오 하나의 항체에 2종의 약물-링커 접합체가 연결된 항체-약물 접합체

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210353764A1 (en) * 2018-09-26 2021-11-18 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Ligand-drug conjugate of exatecan analogue, preparation method therefor and application thereof
JP2023505708A (ja) * 2019-12-12 2023-02-10 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗クローディン抗体薬物複合体及びその医薬用途
MX2022015695A (es) 2020-06-08 2023-03-21 Baili Bio Chengdu Pharmaceutical Co Ltd Medicina de camptotecina con alta unidad de conexion hidrofila y conjugado de la misma.
EP3995496A4 (en) * 2020-09-15 2022-11-30 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. CAMPTOTHECIN MEDICINE AND AN ANTIBODY CONJUGATE THEREOF
WO2022147532A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Mersana Therapeutics, Inc. B7h4-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof
EP4285936A1 (en) * 2021-01-29 2023-12-06 Shanghai Hansoh Biomedical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate and medical use thereof
WO2022166719A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 四川百利药业有限责任公司 一种ca4衍生物及其配体-药物偶联物
WO2022171115A1 (zh) * 2021-02-09 2022-08-18 微境生物医药科技(上海)有限公司 用于adc制备的喜树碱衍生物
TW202300148A (zh) * 2021-03-17 2023-01-01 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 喜樹鹼衍生物的製備方法
CN116917324A (zh) * 2021-04-26 2023-10-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗Nectin-4抗体和抗Nectin-4抗体-药物偶联物及其医药用途
CN113816969B (zh) * 2021-04-30 2024-01-16 联宁（苏州）生物制药有限公司 依喜替康类化合物、其抗体药物偶联物及其应用
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
AU2022386505A1 (en) 2021-11-15 2024-05-23 Systimmune, Inc. Bispecific antibody-camptothecin drug conjugate and pharmaceutical use thereof
CN116212044A (zh) 2021-12-03 2023-06-06 成都百利多特生物药业有限责任公司 抗人Trop2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
AU2022447933A1 (en) 2022-03-25 2023-11-09 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co, Ltd. Dna toxic dimer compound and conjugate thereof
TW202340255A (zh) * 2022-03-30 2023-10-16 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 B7h4抗體藥物偶聯物及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2489364T1 (sl) 2003-11-06 2015-04-30 Seattle Genetics, Inc. Monometilvalinske spojine, konjugirane s protitelesi
AR069747A1 (es) * 2007-11-30 2010-02-17 Medarex Inc Conjugado anticuerpo monoclonal anti-b7h4- farmaco y metodos de utilizacion
US8852599B2 (en) * 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
US9676854B2 (en) 2011-08-15 2017-06-13 Medimmune, Llc Anti-B7-H4 antibodies and their uses
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
EP3299391B1 (en) * 2013-03-14 2019-12-04 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
CN113698488A (zh) * 2014-09-12 2021-11-26 基因泰克公司 抗-b7-h4抗体及免疫缀合物
WO2018018018A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Berg Llc Methods for the treatment of cancer using coenzyme q10 in combination with immune checkpoint modulators
EP3522933B1 (en) * 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
CN110366560B (zh) * 2018-02-11 2023-07-28 江苏豪森药业集团有限公司 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023249473A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 주식회사 피노바이오 하나의 항체에 2종의 약물-링커 접합체가 연결된 항체-약물 접합체

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022535858A (ja) 2022-08-10
AU2020288275A1 (en) 2022-02-03
CA3142641A1 (en) 2020-12-10
US20230072897A1 (en) 2023-03-09
BR112021024406A2 (pt) 2022-04-19
MX2021014960A (es) 2022-03-04
TW202112398A (zh) 2021-04-01
CN112351797B (zh) 2023-12-22
EP3981434A4 (en) 2023-11-01
WO2020244657A1 (zh) 2020-12-10
CN112351797A (zh) 2021-02-09
EP3981434A1 (en) 2022-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112351797B (zh) 抗b7-h4抗体-药物偶联物及其医药用途
CN112543771B (zh) 抗b7h3抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
JP2023505708A (ja) 抗クローディン抗体薬物複合体及びその医薬用途
WO2021190480A1 (zh) 抗体-药物偶联物及其医药用途
CN112585168B (zh) 抗bcma抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN115279781A (zh) 抗体药物偶联物及其医药用途
KR20220113747A (ko) 항 cea 항체-엑사테칸 유사체의 접합체 및 이의 약학적 용도
EP4406974A1 (en) Antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and pharmaceutical use thereof
US20240228658A1 (en) Anti-5t4 antibodies and uses thereof
US20240115721A1 (en) Anti-dll3 antibody-drug conjugate
CN115998900A (zh) 抗trop-2抗体药物偶联物及其医药用途
KR20230142530A (ko) 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도