KR20220101079A - 단백질 수용액 내 가시적 입자 형성의 방지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수성 단백질 제제 내 가시적 입자의 형성을 방지하는 방법뿐만 아니라, 상기 방법으로 수득한 조성물 및 약학적 제품을 제공한다.

Description

단백질 수용액 내 가시적 입자 형성의 방지
본 발명은 유리 지방산을 포함하는 가시 입자의 형성에 대해 안정화된 수성 단백질 조성물, 특히 약학적 항체 제제의 분야에 관한 것이다.
계면활성제는 단백질 응집을 유발할 수 있는 계면 응력으로부터 불안정한 단백질을 보호하기 때문에 단백질 제제에서 중요한 부형제이다. 단일클론 항체(mAb)와 같은 단백질은 비경구적으로 투여되며, 이는 가장 일반적으로 사용되는 계면활성제 중 하나인 폴리소르베이트 20(PS20)뿐 아니라 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188 및 콜리포어/솔루톨(Kolliphor/Solutol)® HS 15(12-히드록시스테아르산의 폴리-옥시에틸렌 에스테르)를 포함한 계면활성제의 선택을 제한한다1. PS20은 산화 분해 또는 효소 가수분해에 의해 제품의 유통 기한 동안 분해될 수 있다. 특히, 후자는 분해 산물로서 유리 지방산(FFA)을 생성하며, 이는 용액에서 침전된 후에 비가시적 및 가시적 입자를 형성할 수 있다.2 하지만, 바이오의약품 제제에서 일반적으로 발견되는 조건하에서, 유리 지방산(FFA)은 온도에 따라 이의 용해도 한계 미만에서도 침전될 수 있지만, 입자 침전의 시점은 잘 특성화된 분해 프로파일에 대해서도 잘 이해되지 않는다. 이는 핵형성 인자의 관련성을 시사한다.
따라서, 특히 장기간 보관을 위해 수성 단백질 용액에서 가시적 입자의 형성을 방지하기 위한 효율적인 해결책을 제시할 필요가 있다. 본 발명은 1차 포장재의 선택 및 처리에 의해 용해도 한계 미만의 유리 지방산(FFA) 입자 형성에 대해 경감 옵션을 제공하여 핵형성 인자로 작용하는 유리 침출물의 양을 감소시킨다.
이전 작업은 단일 바이알 로트에 대한 유리 표면의 이질성을 입증했으며, 이는 저장 시 유리 침출의 차이로 해석될 수 있다.3 본 발명의 경우, 유리 침출물이 유리 지방산(FFA) 입자 형성을 위한 핵형성 인자로 연구되었다.
도 1: 3회에 걸친 최종 멸균 후 20 mM 글리신 용액(pH 10)으로 채워진 확장(Expansion) 51 바이알로부터 생성된 유리 침출물 용액에 미리스트산을 스파이킹한 후 FTIR에 의해 가시적 입자를 유리 지방산(FFA)으로서 식별. FFA 입자 중 작은 일부만 강조 표시되었다.
도 2: SEM-EDX에 의해 금 필터 상의 알루미늄(몇 개가 어두운 원형 부분으로 강조 표시되었음) 및 마그네슘(점선의 원형으로 표시되었음)을 갖는 대표적인 FFA 입자. 상기 입자의 화학적 조성은 하기의 표에 요약되어 있다. 유리 침출물(글리신 용액이 포함된 Exp33 바이알로부터 생성됨)을 분해된 PS20/유리 지방산 혼합물을 함유한 숙성 단백질 용액(22M 5°C)에 스파이킹한 후 입자가 확인되었다.
도 3: 미리스트산 및 알루미늄에 대해 예시적으로 도시된 핵형성 인자에 따른 유리 지방산(FFA) 입자 형성의 제안된 메커니즘.
도 4: 보관 기간, 및 유통 기한의 종료 시 침출물 농도를 정당화하는 바이알 형식에 따라 3가지 상이한 위약 용액으로부터 생성된 Exp51 바이알의 과거 실시간 유리 침출물 데이터.
도 5: 보관 기간 및 온도에 따른 mAb1 및 mAb2의 PS 20 농도.
도 6: 보관 시간 및 온도에 따른 mAb1 및 mAb2의 미리스트산(A) 및 라우르산(B) 농도. 가시적 입자의 존재는 제1 그래프에서 회색 점선 박스로 표시되어 있다. 스파이크 실험에 사용된 샘플은 검은색 점선으로 표시되어 있다.
계면활성제 분해, 특히 PS20 및/또는 PS80 분해의 결과로서 유리 지방산(FFA)을 구성하는 가시적 입자의 형성은 비경구 계면활성제에 대한 선택이 제한적이기 때문에 바이오의약품 산업에서 주요 문제가 된다. 유리 지방산(FFA)은 특정 핵형성 인자 없이 이의 용해도 한계를 넘어서 침전될 수 있으므로, 다양한 수단을 통해 PS20 분해 및 유리 지방산(FFA)과 같은 분해 산물을 줄이는 것이 중요하다. 하지만, 용해도 한계 미만에서, 핵형성 인자는 유리 지방산(FFA)의 침전을 유도하고 제품의 유통 기한을 제한할 수 있다.
계면 활성제는 계면 응력 및 이후의 단백질 응집으로부터 보호하는 단백질 제제의 필수 성분이다. 현재 업계 전반에 걸친 문제 중 하나는, 예를 들어, 상업적인 수성 항체 제제와 같은 상업적인 단백질 함유 제제의 유통 기한 동안 가시적 입자를 형성하는 유리 지방산(FFA)의 형성을 잠재적으로 유도하는 폴리소르베이트 20(PS20)과 같은 비경구 계면활성제의 효소 분해이다. 유리 지방산(FFA)의 농도는 신뢰할 만하게 정량화할 수 있지만, 유리 바이알에 저장된 용액에서 입자 형성 시점은 예측할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은, 예를 들어, 유리 지방산(FFA) 입자 형성을 위한 핵형성 인자로서 유리 침출물과 같은 무기 이온의 영향을 연구하였다.
하기의 표 A는 저장된 용액, 유리 재료의 제조(예컨대, 최종 멸균), 용액 보관 기간, 및 온도에 따라 상이한 1차 포장재에 대해 가장 관련성이 높은 유리 침출물의 농도를 요약하였으며, 이는 코팅되지 않은 유리 바이알(Exp33/듀란(Duran)® 및 Exp51/피오락스(Fiolax)® 바이알)과 비교하여 표면 개질된 유리 바이알에 대한 침출물의 감소를 명확하게 강조한다. 표면 개질 바이알 중에는 규소화 바이알인 탑리오(TopLyo)® 바이알(Si-O-C-H 층, https://www.schott.com/d/pharmaceutical_packaging/7f629b7e-e978-4417-a15e-8621f969d225/1.4/schott-datasheet-schott-toplyo-english-14062017.pdf), 및 타입(Type) I 플러스® 바이알(공유 결합된 SiO2 층, https://www.schott.com/d/pharmaceutical_packaging/ff592e9e-4a7f-495f-9952-965c4d7b1ed8/1.4/schott-datasheet-schott-type-i-plus-english-14062017.pdf)이 있다.
표 A: 유리 침출물의 농도 - 보관 온도, 시간 및 유리 제조에 따라 상이한 용액을 갖는 상이한 유리 유형 내 알루미늄, 붕소, 규소 및 나트륨. 농도는 용액의 유리 침출물의 초기 농도 및 이의 정량 한계(LOQ)와 비교한다.
TS = 최종 멸균, n.m. = 측정되지 않음
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명에 따라, FTIR에 의해 확인된 유리 지방산(FFA) 입자는 무기 이온/성분을 이용한, 예컨대, SEM-EDX에 의한 화학 조성물의 추가적인 특성화에 의해 설명된 알루미늄과 같은 유리 침출물을 이용한 침전의 결과이다. 이는 상기 입자의 형성에 무기 원소가 개입함을 시사한다. 이산화규소, 삼산화붕소, 및 삼산화알루미늄은 비경구 제품에 사용되는 유형 I 붕규산 유리의 전형적인 유리 망목 형성제이다. 알칼리 산화물(예컨대, 나트륨, 칼륨) 및 알칼리 토금속의 산화물(예컨대, 칼슘 및 마그네슘)과 같은 상이한 유리 망목 변형제가 유리 제조 공정 중에 첨가되어 유리의 용융 온도를 낮춘다. 이론에 얽매이지 않고, 유리 유형, 제제 및 보관 조건에 따라 유리 바이알로부터 침출되는 무기 원소가 유리 지방산(FFA) 입자 형성을 위한 핵형성 종자(nucleation seed)로서 작용할 수 있다고 결론지을 수 있다. 현재 연구에서, 라우르산 및 미리스트산은 효소 PS20 분해의 주요 분해 산물로서 사용되었으며,4 상기 연구는 용해도 한계 미만의 유리 지방산이 존재하는 경우 침전된다는 가설을 검증하기 위해 상이한 유리 침출물뿐만 아니라 이들의 혼합물을 대상으로 하였다.
본 발명에 따르면, 놀랍게도 무기염, 특히 NaAlO2 및 CaCl2가 이의 용해도 한계 미만의 미리스트산 또는 라우르산의 존재 하에 가시적 입자의 형성을 개시한다는 것이 밝혀졌다. 상기 염은 일반적으로 비경구 제품에 사용되는 유형 I 붕규산 유리로부터의 침출물을 모방한다. 특히 놀랍게도, 5°C에서 2~3년의 유통 기한에 걸쳐 단백질성 약품에 대한 대표적인 침출물 농도 및 상이한 제제를 가진 상이한 유리 유형의 고압증기멸균 주기에 의해 수득한 혼합물 내 관련 유리 침출물은 라우르산/미리스트산과 함께 입자 형성, 상업적 비경구 항체 제제의 폴리소르베이트, 예컨대 PS20의 주요 분해 산물을 확인하였다. Exp33 바이알 및 Exp51 바이알 내 상이한 제제의 입자는 알루미늄 또는 실리콘과 같은 상이한 유리 침출물을 갖는 유리 지방산(FFA) 염으로 식별되었다. 또한, 본 발명은 특히 관련 알루미늄 농도에 따른 유리 지방산(FFA) 입자 형성을 입증하였다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 알루미늄 농도는 ppb 범위에 있다. 본 연구의 결과는 권장 저장 온도(22M, 5°C)에서 숙성된 단일클론 항체(mAb) 제제에 대한 두 가지 사례 연구에서 검증되었으며, 이는 상이한 FFA 혼합물을 초래하는 효소 PS20 분해 프로필을 보여준다. 이들에서, 유리 침출물 혼합물을 스파이크함으로써, 알루미늄, 규소, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 유리 지방산과 같은 유리 침출물의 복합체로 식별되는 즉시 가시적인 입자 형성을 유도하였다. 현재 결과를 바탕으로 실시간 조건에서 장기 보관 시 단백질 제제에서 입자 형성이 검증될 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 완충제, 항산화제를 포함한 안정화제, 및 계면활성제와 같은 부형제와 함께 단백질을 포함하는 안정한 수성 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 유리 바이알과 같은 포장재 외부로 확산되는 하나 또는 여러 유형의 무기 이온, 및 가시적 입자의 형성 없이 상기 계면활성제의 분해로부터 발생하는 물질의 혼합물을 추가로 함유한다. 일 양태에서, 상기 무기 이온은 알루미늄, 붕소, 규소, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 및 나트륨으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 무기 이온의 농도는 비표면 개질된 바이알(Exp33 및 exp51 바이알로 지칭됨)에 대한 각 이온 및 각 바이알 유형에 대해 표 A(6M 40℃)에 개시된 농도까지의 임의의 농도이다. 또 다른 양태에서, 구체적으로 상이한 바이알 형식의 Exp51 바이알에 대해, 상기 무기 이온의 농도는 도 4에 개시된 바와 같이 각 이온에 대한 각각의 농도 이하의 임의의 농도이다.
다른 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 조성물이 제공되며, 상기 조성물의 pH는 5 내지 7의 범위이다. 일 양태에서, 상기 pH는 약 6이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 단백질이 항체인 이전에 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 다른 양태에서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 단일클론, 단일- 또는 이중특이적 항체이다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 조성물에 존재하는 계면활성제의 분해로부터 발생하는 하나 또는 여러 유형의 물질(분해 생성물)을 추가로 포함하는, 앞서 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(PS)로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 계면활성제는 PS20 또는 PS80으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 분해 생성물은 상이한 사슬 길이 및 포화도의 상이한 지방산 및 상이한 극성 헤드 기, 상이한 지방산 꼬리 및 상이한 에스테르화 정도의 중합체성 에스테르로 이루어진 나머지 PS20 잔기의 혼합물이다. 일 양태에서, 상기 분해 생성물은 본원에 정의된 유리 지방산이다. 일 양태에서, 폴리소르베이트 분해로부터 발생하는 상기 물질은 이의 각각의 용해도 수준 이하이지만, 초과하지는 않는 농도의 유리 지방산이다. 다른 양태에서, 상기 유리 지방산은 PS20의 USP에 정의된 바와 같이 선택된다. 다른 양태에서, 상기 유리 지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산/올레산, 카프르산, 및 스테아르산으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 유리 지방산은 라우르산 및/또는 미리스트산으로부터 선택되고, 라우르산에 대한 용해도 수준은 15 μg/ml이고, 미리스트산에 대한 용해도 수준은 실온에서 수중 7 μg/ml이다.
일 구현예에서, 본 발명은 농도가 0.03 μg/ml 이하의 알루미늄, 및/또는 0.05 μg/ml 이하의 붕소, 및/또는 0.5 μg/ml 이하의 규소인, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 안정화제가 당, 당 알코올, 당 유도체, 또는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 안정화제는 (1) 수크로스, 트레할로스, 시클로덱스트린, 소르비톨, 만니톨, 글리신, 및/또는 (2) 메티오닌, 및/또는 (3) 아르기닌 또는 리신이다. 또 다른 양태에서, 상기 안정화제의 농도는 각각 (1) 500 mM 이하 또는 (2) 5~25 mM, 및/또는 (3) 350 mM 이하이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 완충제가 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 아르기닌, 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 글리신, 아스파르테이트, 및 글루타메이트 완충계로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 완충제는 유리 히스티딘 염기 및 히스티딘-HCl 또는 아세테이트 또는 숙시네이트 및/또는 아스파르테이트로 구성된다. 또한, 상기 구현예에서, 상기 완충제의 히스티딘 농도는 5 내지 50 mM이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 안정화제가 비이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(PS)이다. 다른 양태에서, 상기 계면활성제는 PS20 또는 PS80 또는 폴리옥실 15 히드록시스테아레이트이다. 또 다른 양태에서, 상기 계면활성제의 농도는 0.01%~1%(w/v)이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제가: 20 mM HisHCl 완충액 pH 5.5, 105 mM 트레할로스, 100 mM 수크로스, 10 mM 메티오닌, 및 0.04% 폴리소르베이트 20 내의 1000 U/mL 히알루로니다제인, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 상기 가시적 입자는 본원에 정의된 바와 같은 분해 생성물 및 무기 이온으로 구성된다. 일 양태에서, 상기 가시적 입자는 본원에 정의된 바와 같은 유리 지방산 및 무기 이온으로 구성된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이의 허가된 유통 기한이 끝날 때까지 상기 조성물이 상기 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 상기 조성물은 최대 5년 동안, 또는 최대 3년 동안, 또는 최대 24개월 동안, 또는 최대 18개월 동안, 또는 최대 12개월 동안 상기 가시적 입자가 없는 상태로 유지된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 상기 방법이 본원에 정의된 바와 같은 하나 또는 여러 무기 이온이 상기 조성물 내로 침출되는 것을 방지하는 1차 포장재를 선택하는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 수득하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 방법은 표 A(6M 40℃, 비표면 개질된 바이알) 및/또는 도 4에 제시된 각각의 농도를 초과하는 상기 하나 또는 여러 무기 이온의 침출을 방지한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 0.03 μg/ml 이하의 알루미늄, 및/또는 0.05 μg/ml 이하의 붕소, 및/또는 0.5 μg/ml 이하의 규소의 침출을 방지한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 1차 포장재는:
o 내부 표면 코팅을 갖는 유리 바이알,
o 공유결합으로 변형된 표면을 갖는 유리 바이알,
o 순수한 SiO2(>99%)의 유리 바이알,
o 하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 유리 바이알,
o 중합체 바이알,
o 내부 표면 코팅을 갖거나 표면 개질된 중합체 바이알로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 1차 포장재는:
o 실리콘 처리된 바이알,
o 탑리오® 바이알,
o 타입 I 플러스® 바이알,
o 퍼(Pur) Q® 바이알,
o 크리스탈 제니트(Crystal Zenith)® 바이알,
o SiO2 재료 과학SM 바이알,
o 하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 듀란(Duran)® 바이알, 및/또는
o 하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 피오락스(Fiolax)® 바이알로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 수성 단백질 조성물 내에서 사용 전, 예를 들어, 충전 전에 1차 포장재를 세척/건조하고, 및/또는 b) 이의 발열원 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 수득하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 세척은 50℃ 초과의 수온에서 실시하고, 이어서 <50 μl의 잔류 물을 허용하는 건조 단계를 실시한다. 일 양태에서, 상기 발열원의 제거는 400℃ 이하의 온도에서 실시한다. 다른 양태에서, 상기 발열원의 제거는 180~340℃의 온도에서 실시하고, 멸균 터널에서의 체류 시간은 8시간으로 제한한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 가시적 입자의 형성에 대해 상기 조성물의 안정성을 제공하는, 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 수득하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 가시적 입자는 본원에 정의된 바와 같은 하나 또는 여러 분해 생성물 및 하나 또는 여러 유형의 무기 이온을 포함한다. 일 양태에서, 상기 가시적 입자는 본원에 정의된 바와 같은 하나 또는 여러 유리 지방산 및 하나 또는 여러 무기 이온으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 조성물, 예를 들어, 이의 허가된 유통 기한이 만료될 때까지 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는 상업적 약학적 항체 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 최대 5년 동안, 또는 최대 3년 동안, 또는 최대 24개월 동안, 또는 최대 18개월 동안, 또는 최대 12개월 동안 상기 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 용기 내에 본원에 정의된 바와 같은 조성물, 예를 들어, 수성 항체 조성물을 포함하는 약학적 제형을 제공하며, 상기 조성물 내 하나 또는 여러 무기 이온의 농도는 상기 약학적 제형의 허가된 유통 기한 동안 실질적으로 일정하게 유지된다. 일 양태에서, 상기 하나 또는 여러 무기 이온의 농도는 저장의 시작 시, 예를 들어 2주 후, 또는 상기 조성물을 상기 용기 또는 포장재 내로 충전한 직후 동일한 용기 내에 동일한 조성물을 포함하는 약학적 제형으로 측정한 동일 이온(들)의 농도(들)와 비교할 때 최대 5년, 또는 3년, 또는 24개월, 또는 18개월, 또는 12개월의 저장 기간 동안 실질적으로 일정하게 유지된다. 일 양태에서, 상기 용기는 본원에 정의된 바와 같은 유리 바이알 또는 1차 포장재이다. 일 양태에서, 상기 무기 이온은 알루미늄, 붕소, 규소, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 및 나트륨으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 상기 본원에 정의된 바와 같은 약학적 제형, 예를 들어 용기 내의 수성 항체 제제를 제공하며, 상기 제형의 하나 또는 여러 무기 이온의 농도 증가는 표 A(비표면 개질된 바이알, 6M 40°C) 및/또는 도 4의 각 이온 및 각 바이알 유형에 대해 제시된 각각의 농도 미만으로 유지된다. 다른 양태에서, 바이알 유형과 상관없이, 저장의 시작 시, 예를 들어 2주 후, 또는 상기 조성물을 상기 용기 또는 포장재 내로 충전한 직후 동일한 용기 내에 동일한 조성물을 포함하는 약학적 제형으로 측정한 동일 이온(들)의 농도(들)와 비교할 때 알루미늄 농도는 0.03 μg/ml 미만으로, 및/또는 붕소 농도는 0.05 μg/ml 미만으로, 및/또는 규소 농도는 0.5 μg/ml 미만으로 최대 5년, 또는 3년, 또는 24개월, 또는 18개월, 또는 12개월의 저장 기간 이후에 유지된다. 일 양태에서, 상기 무기 이온은 알루미늄, 붕소, 규소, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 및 나트륨으로부터 선택된다. 일 양태에서, 상기 용기는 본원에 정의된 바와 같은 유리 바이알, 또는 1차 포장재이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 수성 항체 제제의 저장을 위한 상기 본원에 정의된 바와 같은 "1차 포장재"의 사용을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 수성 항체 제제의 저장 동안 가시적 입자, 예를 들어 유리 지방산(FFA)을 포함하는 입자의 형성을 감소하거나 방지하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 상기 "1차 포장재"의 사용을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 1차 포장재는 본원에 정의된 바와 같은 중합체 바이알이다. 다른 구현예에서, 상기 1차 포장재는 본원에 정의된 바와 같은 표면 개질된 유리 바이알이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구현예에서, 상기 보관은 상기 항체 제제가 상응하는 항체 제품의 적어도 허가된 유통 기한 동안 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는 것을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 상기 보관은 상기 항체 제제가 최대 5년, 또는 3년, 또는 24개월, 또는 18개월, 또는 12개월의 보관 기간 동안 가시적 입자가 없는 상태로 유지되는 것을 특징으로 한다.
용어 “부형제”는 활성 성분 이외에 대상체에게 비독성인 약학적 조성물 또는 제제 내의 성분을 지칭한다. 부형제는 완충제, 항산화제를 포함하는 안정화제, 계면활성제, 또는 방부제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "무기 이온"은 무기 화학 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 본원에서 사용된 무기 이온은 알루미늄, 붕소, 규소, 나트륨, 마그네슘, 칼륨, 및 칼슘을 의미한다. 바람직한 무기 이온은 알루미늄, 칼슘, 및 마그네슘이다. 본 발명에 따라, 상기 무기 이온은 농도가 0.03 μg/ml 이하의 알루미늄, 및/또는 0.05 μg/ml 이하의 붕소, 및/또는 0.5 μg/ml 이하의 규소 내에 존재한다.
용어 "완충제"는 유기 화학 또는 약학 분야, 예를 들어, 약학적 제제 개발 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 본원에 사용된 완충제는 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 아르기닌, 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 글리신, 아스파르테이트 및 글루타메이트 완충계를 의미한다. 또한, 상기 구현예에서, 상기 완충제의 히스티딘 농도는 5 내지 50 mM이다. 바람직한 완충제는 유리 히스티딘 염기 및 히스티딘-HCl 또는 아세테이트 또는 숙시네이트 및/또는 아스파르테이트이다. 또한, 상기 구현예에서, 상기 완충제의 히스티딘 농도는 5 내지 50 mM이다.
용어 "계면 활성제"는 유기 화학 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 본원에 사용된 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 의미한다. 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트, 특히 PS20 또는 PS80이다. 본 발명에 따라, 상기 계면활성제는 0.01%~1%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다.
용어 "안정화제"는 유기 화학 또는 약학 분야, 예를 들어, 약학적 제제 개발 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 본 발명에 따른 안정화제는 당, 당 알코올, 당 유도체, 또는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서, 안정화제는 (1) 수크로스, 트레할로스, 시클로덱스트린, 소르비톨, 만니톨, 글리신, 및/또는 (2) 메티오닌, 및/또는 (3) 아르기닌 또는 리신이다. 또 다른 양태에서, 상기 안정화제의 농도는 각각 (1) 500 mM 이하 또는 (2) 5~25 mM, 및/또는 (3) 350 mM 이하이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리소르베이트의 분해로부터 발생하는 물질" 또는 "분해 생성물"은 당업자에게 공지된 폴리소르베이트의 분해로부터 발생하는 임의의 물질을 의미한다. 일 양태에서, 상기 물질은 유리 지방산이다. 용어 "지방산"(또는 "FA")는 유기 화학 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 일 양태에서, 지방산은 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지쇄이고 4 내지 28개; 또는 8 내지 24개; 또는 10 내지 22개; 또는 12 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 사슬을 갖는 임의의 카르복실산을 의미한다. 일 양태에서, 상기 유리 지방산은 PS20의 USP에 정의된 바와 같이 선택된다. 일 양태에서, 상기 유리 지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산/올레산, 카프르산, 및 스테아르산으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 유리 지방산은 라우르산 및/또는 미리스트산으로부터 선택된다. 본 발명에 따라, 폴리소르베이트의 분해로부터 발생하는 상기 물질은 실온에서 물에서 각각의 용해도 수준 이하의 농도로 존재할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 물질은 실온에서 물에서 각각의 용해도 수준 이하이지만 이를 포함하지는 않는 임의의 농도로 존재한다. 본원에 사용된 용어 "실온"은 통상적인 의미를 갖는다. 일 양태에서, 실온은 섭씨 20 내지 28도, 바람직하게는 섭씨 22 내지 26도를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포장재" 또는 "일차 포장재"는 제품과 접촉하는 재료를 의미한다. 일 구현예에서, 용어 1차 포장재는:
Figure pct00003
내부 표면 코팅을 갖는 유리 바이알,
Figure pct00004
공유결합으로 변형된 표면을 갖는 유리 바이알,
Figure pct00005
순수한 SiO2(>99%)의 유리 바이알,
Figure pct00006
하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 유리 바이알,
Figure pct00007
중합체 바이알,
Figure pct00008
내부 표면 코팅을 갖거나 표면 개질된 중합체 바이알로부터 선택된다.
일 구현예에서, 용어 1차 포장재는:
Figure pct00009
실리콘 처리된 바이알,
Figure pct00010
탑리오® 바이알,
Figure pct00011
타입 I 플러스® 바이알,
Figure pct00012
퍼(Pur) Q® 바이알,
Figure pct00013
크리스탈 제니트(Crystal Zenith)® 바이알,
Figure pct00014
SiO2 재료 과학SM 바이알,
Figure pct00015
하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 듀란(Duran)® 바이알, 및/또는
Figure pct00016
하기에 기재된 바와 같이 세척 및 멸균된 피오락스(Fiolax)® 바이알로부터 선택된다.
특정 구현예들에서, 상기 포장재는 상기 안정한 수성 단백질 조성물을 수용하기 전에 세척하고 및/또는 발열원이 제거된다. 상기 포장재의 세척은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세척은 50℃ 초과의 수온에서 실시하고, 이어서 <50 uL의 잔류 물을 허용하는 건조 단계를 실시한다. 상기 포장재의 발열원 제거는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 발열원의 제거는 400℃ 이하의 온도에서 실시한다. 더 바람직하게는, 상기 발열원의 제거는 180 내지 340℃ 사이의 온도에서 실시하고, 멸균 터널에서의 체류 시간은 8시간으로 제한한다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 임의의 치료적으로 관련된 폴리펩티드를 의미한다. 일 구현예에서, 용어 단백질은 항체를 의미한다. 일 구현예에서, 용어 단백질은 면역접합체를 의미한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 부류 또는 구조를 수반한다. 일 구현예에서, 이들 항체 중 임의의 것은 인간 또는 인간화이다. 일 양태에서, 상기 항체는 알렘투주맙(LEMTRADA®), 아테졸리주맙(TECENTRIQ®), 베바시주맙(AVASTIN®), 세툭시맙(ERBITUX®), 파니투무맙(VECTIBIX®), 페르투주맙(OMNITARG®, 2C4), 트라스투주맙(HERCEPTIN®), 토시투모맙(Bexxar®), 아브식시맙(REOPRO®), 아달리무맙(HUMIRA®), 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피네우주맙, 바실릭시맙(SIMULECT®), 바비툭시맙, 벨리무맙(BENLYSTA®) 브리안키누맙, 카나키누맙(ILARIS®), 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골(CIMZIA®), 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 식수투무맙, 클라자키주맙, 크레네주맙, 다클리주맙(ZENAPAX®), 달로투주맙, 데노수맙(PROLIA®, XGEVA®), 에쿨리주맙(SOLIRIS®), 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에미시주맙(HEMLIBRA®), 펠비주맙, 폰톨리주맙, 골리무맙(SIMPONI®), 이플리무맙, 임가투주맙, 인플릭시맙(REMICADE®), 라베투주맙, 레브리키주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 루카투무맙, 룰리주맙 페골, 룸레투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모가물리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 뮤로노맙, 나탈리주맙(TYSABRI®), 네시투무맙(PORTRAZZA®), 니모투주맙(THERACIM®), 놀로비주맙, 누마비주맙, 올로키주맙, 오말리주맙(XOLAIR®), 오나르투주맙(MetMAb로도 공지됨), 팔리비주맙(SYNAGIS®), 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 펨브로리주맙(KEYTRUDA®), 펙셀리주맙, 프릴릭시맙, 랄리비주맙, 라니비주맙(LUCENTIS®), 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로바투무맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 시팔리무맙, 시브로투주맙, 실툭시맙(SYLVANT®) 시플리주맙, 손투주맙, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙(ACTEMRA®), 토랄리주맙, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙(STELARA®), 베돌리주맙(ENTYVIO®), 비실리주맙, 자놀리무맙, 잘루투무맙으로부터 선택된다.
“항체 단편”은 원형 항체가 결합하는 항원에 결합하는 원형 항체의 부분을 포함하는, 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예컨대, scFv, 및 scFab); 단일 도메인 항체(dAbs); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
항체의 “부류”는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분화될 수 있다. 특정 양태들에서, 상기 항체는 IgG1 동형의 것이다. 특정 양태들에서, 상기 항체는 Fc 영역 작동체 기능을 감소시키기 위해 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 것이다. 다른 양태들에서, 상기 항체는 IgG2 동형의 것이다. 특정 양태들에서, 상기 항체는 IgG4 항체의 안정성을 개선하기 위해 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 동형의 것이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, a, d, e, g, 및 m으로 명명된다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 부호화 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다.
“인간화” 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양태들에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 항체의 것에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예컨대, 비인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변적이고, 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각, 예를 들어, "상보성 결정 영역" ("CDR")을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개 CDR을 포함한다: VH에서 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에서 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
달리 지시되지 않는 한, CDR들은 상기 Kabat 등의 문헌에 따라 결정된다. 당업자는 CDR 표시가 또한 상기 Chothia, 상기 McCallum, 또는 임의의 다른 과학적으로 허용되는 명명법에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
“면역접합체”는 세포독성제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 한 가지 또는 그 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 양태에서, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다.
“단리된” 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 양태들에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전위 초점조절(IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대 Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "약학 조성물" 또는 “약학 제제 (pharmaceutical formulation)”란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 약학 조성물이 투여되는 대상체에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분 이외에 약학 조성물 또는 제제 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에 정의된 바와 같은 부형제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
A. 키메라 및 인간화 항체
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예컨대, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 일례에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류로부터 변화된 “부류 전환된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 양태들에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR(또는 이의 부분)이 비인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 양태들에서, 인간화 항체 내 일부 FR 잔기는, 예컨대, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선하기 위해, 비인간 항체(예컨대, CDR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예컨대, Riechmann et al.,
Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 7,527,791호, 6,982,321호, 및 7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(SDR) 이식을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(“표면 노출 잔기 변형(resurfacing)”을 기재함); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(“FR 셔플링(shuffling)”을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 “유도된 선택” 접근법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용할 수 있는 인간 프레임워크 영역은 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: "최적 맞춤(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예컨대, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)을 참조); 특정 하위군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)을 참조); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)를 참조).
B. 인간 항체
특정한 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 인간화 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
항원 공격접종(challenge)에 반응하여 원형 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 원형 항체를 생성하기 위해 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 형질전환 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, Lonberg, Nat.
Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예컨대, 제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 휴맵(HUMAB)® 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; K-M 마우스(MOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공보 US 2007/0061900을 참조한다. 상기 동물에 의해 생성된 원형 항체로부터 인간 가변 영역은, 예컨대 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마 기반의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)을 참조한다.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 기재되어 있다. 추가 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생성을 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재함)에서 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한 인간 유래된 파지 전시 라이브러리로부터 선택된 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그런 다음, 상기 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술이 하기에 기재되어 있다.
C. 항체 유도체
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 입수 가능한 추가 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있고, 만약 하나를 초과한 중합체가 부착된 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하의 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
D. 면역접합체
본 발명은 하나 또는 그 이상의 치료제, 예컨대, 세포독성제, 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 진균성, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사능활성 동위원소에 접합된 본원에 개시된 항체를 포함하는 면역접합체를 또한 제공한다.
일 양태에서, 면역접합체는 항체가 상기 언급된 치료제 중 하나 이상에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. 상기 항체는 전형적으로 링커를 이용하여 치료제 중에서 한 가지 또는 그 이상에 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 예를 포함하는 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68:3-19 (2016)에서 제시된다.
다른 양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래) 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위하여 방사능활성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생성을 위해 입수 가능하다. 이의 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사능활성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출용으로 이용될 때, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또는 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 표지, 예컨대, 요오드-123 다시, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2작용기 단백질 커플링 물질, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2작용기 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스 활성 플로린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14 표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 “절단가능한 링커”일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다아제 민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 이용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수 가능한(예컨대, 미국 일리노이주 록퍼드에 소재한 피어스 바이오테크놀로지 사(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 가교제 시약으로 제조된 접합체를 명시적으로 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다.
E. 다중특이적 항체
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체이다. “다중 특이적 항체”는 적어도 2가지 상이한 부위들, 즉, 상이한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체이다. 특정 양태들에서, 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 갖는다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조), 및 "구멍 내 돌기(knob-in-hole)" 공학(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 Biol. 270:26 (1997)을 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공하고(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합하고(예컨대, 미국 특허 제 4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 류신 지퍼를 사용하여이중 특이적 항체를 형성하고(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 우회하기 위한 일반적인 경쇄 기술 사용하고(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위한 "디아바디" 기술을 사용하고(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체 사용하며(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조); 및, 예컨대, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조하여 만들 수 있다.
예를 들어, “옥토퍼스 항체”, 또는 DVD-Ig를 포함한, 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 또한 본원에 포함된다(예컨대면, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715를 참조). 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 실례는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 2개의 상이한 항원, 또는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(예컨대, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).
다중특이적 항체는 또한, 동일한 항원 특이성의 하나 또는 그 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 즉, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 일 양태에서, 다중특이적 항체는 교차 Fab 단편을 포함한다. 용어 "교차 Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 단편은 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 불변 영역 1(CH1)로 구성된 폴리펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭 Fab 팔은 또한 올바른 Fab 쌍형성을 지시하기 위해 도메인 계면 내로 하전 또는 비하전 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 조작될 수 있다. 예컨대, WO 2016/172485를 참조.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되어 있으며, 본원에 포함된다(예컨대, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106을 참조).
F. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예컨대, US 4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생성할 수 있다. 상기 방법을 위해, 항체를 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.
천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우에 2개의 핵산, 즉 경쇄 또는 이의 단편에 1개의 핵산 및 중쇄 또는 이의 단편에 1개의 핵산이 요구된다. 이러한 핵산(들)은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄(들))를 포함하는 아미노산 서열을 부호화한다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있다.
이종이량체 중쇄가 있는 이중특이적 항체의 경우에 4개의 핵산, 즉 제1 경쇄에 1개의 핵산, 제1 이종단량체의 Fc 영역 폴리펩티드를 포함한 제1 중쇄에 1개의 핵산, 제2 경쇄에 1개의 핵산, 및 제2 이종단량체의 Fc 영역 폴리펩티드를 포함한 제2 중쇄에 1개의 핵산이 요구된다. 상기 4개의 핵산은 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터에 포함될 수 있다. 이러한 핵산(들)은 제1 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제1 이종단량체의 Fc 영역을 포함한 제1 VH를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제2 VL을 포함한 아미노산 서열 및/또는 상기 항체의 제2 이종단량체의 Fc 영역을 포함한 제2 VH를 포함하는 아미노산 서열을 부호화한다(예컨대, 항체의 제1 및/또는 제2 경쇄 및/또는 제1 및/또는 제2 중쇄들). 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있으며, 보통 이들 핵산은 2개 또는 3개의 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 즉, 하나의 벡터가 이들 핵산 중 하나를 초과하여 포함할 수 있다. 이들 이중특이적 항체의 예는 CrossMab이다(예컨대, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191을 참조). 예를 들어, 상기 이종단량체의 중쇄 중 하나는 EU 지수 번호체계에 따라 소위 "돌기 돌연변이"(T366W 및 선택적으로 S354C 또는 Y349C 중 하나)를 포함하고 다른 하나는 소위 "구멍 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V와 선택적으로 Y349C 또는 S354C)를 포함한다(예컨대, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73을 참조).
항체의 재조합 생성을 위해, 예컨대, 상기 기재된 바와 같은 항체를 부호화하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 상기 핵산은 종래의 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열 분석되거나(예컨대, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써) 또는 재조합 방법에 의해 생성되거나 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.
항체 부호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 작동체 기능이 요구되지 않는 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서는, 예컨대 US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523을 참조한다. (또한, 대장균에서 항체 단편의 발현을 설명하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254를 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 박테리아 세포 덩어리로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가적으로, 진핵 미생물, 예컨대 섬유성 곰팡이 또는 효모는 항체 부호화 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 당화 경로가 “인간화되고", 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 생성되는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215를 참조한다.
(당화)항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 예컨대, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429(유전자 변형 식물에서 항체를 생성하는 플랜티바디(PLANTIBODIES)TM 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 상태에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예에는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 세포주(예컨대, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포(예컨대, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 기재됨); MRC 5 세포; 및 FS4 세포가 포함된다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.
본 발명이 이제 하기의 비제한적인 작업 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
실시예
물질 및 방법
유리 지방산(FFA) 용액(모액)
수성 모액은 0.02% PS20(클로다(Croda), 미국 뉴저지주 에디슨 소재)에서 (1) 5 mg/mL 및 (2) 12.5 mg/mL(라우르산, 시그마-알드리치/머크(Sigma-Aldrich/Merck), 독일 다름슈타트 소재) 또는 또는 (1) 1.5 mg/mL 및 (2) 5 mg/mL(미리스트산, 시그마-알드리치/머크, 독일 다름슈타트 소재)의 규정된 농도로 이전에 Doshi et al.에 기재된 바와 같이 제조하였다.6 FFA/PS20 모용액을 1:10 희석 전에 0.22 μm PVDF 스테리플립(Steriflip) 필터(머크 필리포어(Merck Millipore), 독일 다름슈타트 소재)를 사용하여 멸균 여과한 후 하이돌프 로타맥스(Heidolph Rotamax) 120 오비탈 셰이커(독일 쉬와바하(Schwabach))를 사용하여 자석 교반기없이 1시간 동안 25°C에서 100 rpm으로 균질화하였다. 1:500 희석 후, 상기 용액을 25℃에서 1시간 동안 균질화한 후 2~8℃에서 밤새 균질화하였다. 12~40 μL의 모액을 스파이킹 실험에 사용하여 (1) 10 μg/mL 및 (2) 25 μg/mL(라우르산) 또는 (1) 3 μg/mL 및 (2) 10 μg/mL(미리스트산)의 최종 FFA 농도를 수득하였다. 모액 1을 사용한 희석은 용해도 한계 미만의 FFA 농도를 수득한 반면, 모액 2는 가시적 입자의 형성으로 확인된 양성 대조군으로서 작용한다. FFA 농도는 LC-MS 샘플 acc. Honemann et al.에 따라 선택된 것에 대해 검증되었다.7
무기염 용액
상이한 염의 수용액을 1 mg/mL로 준비하고 250 mg/mL 및 1 g/mL 사이의 최종 농도로 스파이킹 실험에 사용하였다. NaCl, NaAlO2, NaBO2, B2O3, 및 CaCl2(시그마-알드리치/머크, 독일 다름슈타트 소재)는 이의 용해 생성물(이온)이 유형 I 붕규산 유리로부터의 전형적인 유리 용출물을 나타냄에 따라 선택되었다. NaAlO2 및 NaBO2 스톡 용액의 pH를 HCl을 사용하여 pH 6으로 조정한 후, 0.22 μm PVDF 스테리벡스(Sterivex) 필터(머크 밀리포어, 독일 다름 슈타트 소재)를 사용하여 여과하고, 실제 원소 농도를 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 측정하였다. 원소 농도는 각각 0.048 μg/mL의 알루미늄 및 295 μg/mL의 나트륨 및 78 μg/mL의 붕소 및 168 μg/mL였다. FFA를 사용한 스파이크 실험은 이중으로 실시하였다.
유리 침출물의 용액
유리 침출물의 대표적인 혼합물은 세 가지 상이한 유형의 유리 바이알, 즉, 가속 노화 조건을 나타내는 3가지 고압증기멸균 주기(121°C, 20분)에 의한 6 mL 형식의 Exp 33 및 Exp51(스코트(Schott) AG, 독일 뮐하임(M
Figure pct00017
llheim) 소재 및 스코트 노스 아메리카(Schott North America Inc.), 미국 뉴욕주 소재)로부터 수득하였다. 바이알은 6 mL의 주사용수(WFI), 20 mM의 글리신 용액(pH 10) 또는 20 mM 히스티딘/히스티딘-HCl 완충액(pH 6.0), 10 mM 메티오닌, 240 mM 자당(페로 판스티엘(Ferro Pfanstiehl), 미국 일리노이주 워키건(Waukegan) 소재) 및 0.02% PS20으로 구성된 단백질 제형에 사용되는 일반적인 위약 용액으로 충전하였다. 글리신 용액의 pH는 HCl을 사용하여 pH 6.0으로 고압멸균한 후 조정하였고, 0.22 μm PVDF 스테리벡스(Sterivex) 필터(머크 밀리포어, 독일 다름 슈타트 소재)를 통해 여과하였다. 침출물 농도는 Ditter et al.에 기재된 바와 같이 ICP-MS(표 1)로 검증하였다.8 FFA를 사용한 스파이크 실험은 3회 실시하였다.
표 1: 스파이킹 용액에서 선택된 유리 침출물의 농도.
Figure pct00018
mAB 제제
mAb1(IgG1, Mw=145.5 kDa, 퍼투주맙) 및 mAb2(IgG1, Mw=148 kDa, 트라스투주맙)는 F. Hoffmann-La Roche로부터 입수하였고, 20 mM HisHCl 완충액 pH 5.5, 105 mM 트레할로스, 100 mM 수크로스, 10 mM 메티오닌, 및 0.04% 폴리소르베이트 20의 1000 U/mL 히알루로니다제로 제제화하였다. 상응하는 위약은 단백질이 없는 동일한 제제였다. 제제를 5°C 및 25°C에서 24개월 동안 보관하였다. 위약을 구비한 각 대조군을 포함하는 스파이크 실험은 무기 염 용액(10+1 희석의 CaCl2 및 NaAlO2) 또는 10+1 또는 100+1 희석의 모액으로부터의 유리 침출물을 사용하여 3회 실시하였다.
분석적 특성화
샘플은 이전에 Ditter et al.에 의해 기재된 바와 같이 사이데나더 V 90-T 기기(사이데나더 마시넨바우(Seidenader Maschinenbau) GmbH, 독일 마르크트 슈바벤 소재)에 의한 육안 검사9 및 Ph. Eur. 2.9.20에 따른 흑백 패널을 사용하여 분석하였고10, E/P 상자 내 많은 입자(>7), 적은 입자(4~7), 또는 입자가 거의 없음(0~ 4), 및 사이데나더에 의한 많은 입자(>10), 적은 입자(6~10), 본질적으로 입자가 없음(1~5), 또는 입자가 없음(0)으로 분류하였다.
비가시적 입자(SVP)는 이전에 Ditter et al.에 의해 기재된 바와 같이9 HRLD-150 센서(스칸(Skan) AG, 알슈빌(Allschwill), CH 소재)를 구비한 HIAC/ROYCO 9703 액체 주사기 샘플러 3000A를 사용하여 Ph. Eur. 2.9.19에 따른 차광에 의해 측정하였다.11
탁도는 Ph. Eur. 2.2.1.12 에 기재되 바와 같이 비율 모드의 하크(Hach) 2100AN 탁도계(하크 회사(Hach Company), 콜로라도주 러브랜드 소재)를 사용하여 측정하였다.
참조 스펙트럼과 비교하여 니콜렛(Nicolet)™ iNTM10 적외선 현미경(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여 푸리에 변환 적외선 분광법(FTTIR)에 의해 >20 μm의 입자를 추가로 식별하였다. 샘플을 금 코팅된 폴리카보네이트 필터(공극 크기 0.8 μm, 직경 13 mm, 스털리텍(Sterlitech))를 통한 층류 기류하에 여과하였다. 필터 조건화에는 에탄올 몇 방울과 무입자 물 1 mL가 포함되었다. 샘플을 여과한 후 ~1 mL의 냉각된 무입자 물을 분석 전 최종 세척 단계로 사용했하였다.
선택된 입자의 화학 조성물은 LOT 퀀텀 디자인(Quantum Design) GmbH의 페놈(Phenom) XL 기기를 사용하는 에너지 분산 X선 분광법(SEM-EDX)과 관련된 주사 전자 현미경으로 확인하였다.
모든 용액의 pH가 확인되었다. 샘플은 스파이크 직후 및 최대 7일 동안 정기적으로 육안으로 검사하였다. HIAC, 탁도, FTIR 및 SEM-EDX에 의한 추가 특성화는 1일차에만 실시하였다. 모든 샘플은 실온(4 시간)과 평형을 이룰 때 분석하였다.
mAb 샘플에 대한 폴리소르베이트 함량은 증발 광산란 검출을 사용하는 혼합 모드 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 1 인공 유리 침출물(염)은 FFA 입자 형성을 유발한다
인공 유리 침출물을 시뮬레이션하여 상이한 무기 염 용액, 즉, CaCl2, NaAlO2, NaBO2, B2O3 및 NaCl을 제조하였다. 가수분해 PS20 분해의 주요 분해 산물로서의 미리스트산 및 라우르산을 이의 용해도 한계 미만의 농도로 첨가하고 시료를 가시적 입자, SVP 및 탁도에 대하여 분석하였다. 샘플을 관련 대조군과 비교하고 pH를 pH 6에서 확인하였다.
염 농도에 따라 NaAlO2를 사용하는 미리스트산 및 라우르산 모두에서 스파이크 후 가시적 입자의 즉각적인 형성이 관찰되었다. 즉각적인 입자 형성은 특히 시험된 모든 염 농도에 대해 미리스트산 및 CaCl2를 스파이킹한 직후에 나타났다. 증가하는 입자 형성은 일반적으로 지방산 용액의 배양 시간 증가와 각각의 NaAlO2 및 CaCl2 농도 증가와 관련이 있다. 입자는 검사 시점에 따라 표 1에 요약된 바와 같이 칼슘의 존재 하에 미리스트산에 대해 특히 E/P 상자 내에서 가시적이었다. 입자는 이후에 FTIR에 의해 FFA 입자로 식별되었다(데이터는 표시되지 않음). NaBO2 및 B2O3 용액의 경우, 시간 경과에 따른 염 농도에 따라 미리스트산 및 라우르산 모두에 대해 사이데나더에서 가시적인 입자가 수득되었지만 CaCl2 및 NaAlO2에 비해 훨씬 적은 정도였다. 1 mg/mL의 염 농도까지 염화나트륨을 첨가할 때 입자 형성이 관찰되지 않았다.
스파이크 실험은 일반적으로 비경구 제품의 기본 포장으로 사용되는 붕규산 유리로부터의 관련 유리 침출물을 시뮬레이션하여 염의 존재하에 가시 범위에서 FFA 입자 형성의 가능성을 보여준다. 입자 형성은 배양 시간뿐만 아니라 Ca2+ 또는 Al3+와 같은 이온/염의 유형 및 농도에 크게 의존하는 것으로 밝혀졌다. 적절한 제어 외에도, 시료의 검사 및 평형의 시점/용액의 온도가 상기 실험에 중요하다: FFA 용해도는 온도에 크게 의존하고 더 낮은 온도에서 더 많은 입자가 검출된다(예컨대, 실온으로의 평형 시간 1시간 대 4시간). FFA의 용해도 한계는 또한 pH에 크게 의존한다. 따라서, 실험은 pH 6에서 실시하였다. 하지만, NaAlO2 및 NaBO2는 초기에 용액(~pH 10)에서 수산화물을 형성한다. 따라서, 스파이크 용액의 pH를 조정한 후, 나머지 이온 농도(여과 후)를 ICP-MS로 확인해야 한다. 스파이크 용액에 존재하는 정확한 이온 농도는 방법 섹션에 개략되어 있다. 특히 알루미늄의 경우, 농도는 도 4에 요약된 관련 위약 제제에 대해 확장(Expansion) 51 바이알로부터 수득한 실시간 데이터에 필적하는 관련 침출 가능한 농도를 사용하였다.
표 2: 상이한 염 농도에서 상이한 무기 염 용액(CaCl2 및 NaAlO3)으로 용해도 이하의 (A) 미리스트산과 (B) 라우르산을 스파이크한 후 보이는 가시적 입자. 음성 대조군(염 없음) 및 양성 대조군(용해도 한계 초과의 FFA)에 대해 검증된 중복 데이터가 제공된다. 입자는 E/P 상자에서 많은 입자(>7, xxx), 적은 입자(4~7, xx) 또는 입자가 거의 없음(0~4, /), 및 많은 입자(>10, xxx), 입자가 거의 없음(6~10, xx), 본질적으로 입자가 없음(1-5, x), 또는 사이데나더에 의한 입자가 없음(0, /)으로 분류되었다. d = 검사일. d0 = 스파이크 직후. * pH 조정 및 여과 전의 공칭 염 농도.
(A) 미리스트산
Figure pct00019
(B) 라우린산
Figure pct00020
실시예 2: '실제' 유리 침출물(혼합물)은 FFA 입자 형성을 유발한다.
유리 침출물은 WFI, pH 6으로 조정된 글리신 용액 및 mAb 제제를 대표하는 위약 용액을 포함한 상이한 매트릭스 용액을 이용하여 상이한 유형의 유리 바이알, 예컨대 Exp33 및 Exp51 바이알로부터 생성되었다. 유리 침출물의 농도는 표 1에 제시되어 있다. 용해도 한계 미만의 미리스트산 및 라우르산의 정의된 양을 유리 침출물의 용액/혼합물에 첨가하고 분석하였다. 사이데나더의 가시적 입자는 표 3에 요약되어 있으며 다양한 대조군과 대조적으로 모든 샘플에서 검출되었다. 입자 형성은 유리 침출성 용액과 배양 시간에 따라 달라졌다. 검사 시점(d1)에서 SVP 및 탁도에 대한 명확한 경향은 결정되지 않았지만, 데이터는 가시적 입자가 아직 형성되지 않은 경우 SVP가 증가함을 시사한다. 배양 시간에 대한 입자 형성의 의존성에 대한 예는 Exp51 바이알/글리신 용액으로부터 유리 침출성 용액 내 미리스트산에 대해 표 3에 제시되어 있다. 상기 예는 스파이크 직후에 입자가 없고 배양 5일 및 7일에 10개 초과의 입자를 보이는 입자 형성의 동역학을 강조한다. 선택된 샘플의 경우, FTIR에 의해 입자를 추가로 특성화하고 식별하여 유리 지방산의 존재를 확인하였다. FFA는 WFI로 생성된 유리 침출성 용액에 대해 FTIR로는 확인되지 않았으며, 이는 d1에서의 FTIR 분석 시점 및 상기 샘플에 대한 입자 형성의 늦은 개시와 관련이 있다. 위약 샘플은 추가 0.02% PS20의 존재로 인해 양성 대조군이 음성으로 밝혀짐에 따라서 FTIR에 의해 추가로 분석되지 않았고, 이는 잠재적으로 FFA 종자를 가용화하였다. SEM-EDX에 의한 입자의 특성화는 FFA 입자의 표면 상에 알루미늄 또는 규소와 같은 유리 침출물의 존재를 확인시켰다. 도 1은 상이한 크기의 소수의 FFA 입자와 대표적인 FFA 스펙트럼을 강조한 FTIR 분석 후 금 필터의 일반적인 사진을 도시한다. 스파이킹 연구는 '실제' 유리 침출물의 혼합물이 FFA의 침전 및 유리 침출물의 혼합물 및 양에 따라 그리고 배양 시간에 따라 가시 범위에서의 입자 형성을 유도한다는 점을 강조한다.
표 3: FTIR 및 SEM-EDX로 선택된 샘플에 대한 가시적 입자(사이데나더) 및 입자 식별(d1). 라우르산 및 미리스트산을 상이한 유리 바이알 내 3회의 고압멸균 주기에 의해 생성된 상이한 유리 침출물 함유 용액에 용해도 한계 미만으로 스파이크한 후 가시적 입자가 보고되었다. 3회의 결과는 최대 7일의 배양 시간 동안 더 적은 입자에서 가장 많은 입자 생성(+, ++, ++++)의 순으로 서로 상대적인 순위로 보고된다. 배양 시간에 대한 입자 형성의 의존성은 Exp51/글리신 매트릭스의 미리스트산에 대해 예시적으로 도시된다. n.t. = 시험되지 않음
Figure pct00021
실시예 3: 숙성된 매트릭스에서 유리 침출물이 있는 경우 FFA 입자 형성의 확인(사례 연구)
상이한 농도의 '실제' 유리 침출물을 첨가하여 숙성된 mAb1 및 mAb2 용액(22M, 5°C)에서 단백질 매트릭스 내 FFA 입자의 침전을 추가로 연구하였다. 상기 실험에서, FFA의 존재는 의약품의 유통 기한 동안 형성되는 PS20 분해의 결과였다. Mab1 및 mAb2는 동일한 매트릭스로 제제화되었지만 mAb(CDR) 유형이 상이하다. 상이한 원료의약품 공정 및 정제 공정에서 비롯된 PS20 분해율은 상이한 것으로 나타났으며(도 5), 후속 결과로서 FFA의 유형 및 농도도 다르게 나타났다(도 6). 흥미롭게도, mAb2는 25°C에서 12 M 보관 후 FFA 및 알루미늄으로 특성화되는 가시 입자를 나타내는 반면, mAb1은 그렇지 않았다. 25°C에서 12M 보관하고 + 5°C에서 10M 보관 후, 두 제제 모두 FFA 및 상이한 유리 침출물의 복합체로 확인된 가시 입자를 보여주었다.
제품은 실험 전에 가시적 입자가 없는 것으로 특성화되었다(5°C에서 22M 동안 보관). 두 제제 모두에 대해, 사이데나더 검사 기계에서 가시적 입자 형성은 이미 50 또는 500 μL의 상이한 유리 침출물 혼합물과 함께 배양한 후 관찰되었다(표 4). 결과는 초기 시점과 같은 다양한 대조군과 비교하였고 가시적 입자가 남아 있지 않은 스파이크 위약 용액과 비교하였다. 선택된 입자는 고해상도 SEM-EDX에 의해 무기 이온의 혼합물과 조합하여 FFA 입자(FTIR)로 추가로 확인되었다. 도 2는 알루미늄 및 마그네슘의 존재를 강조하는 FFA 입자의 대표적인 SEM 사진을 도시한다. 다양한 유리 침출물의 존재를 나타내는 화학 조성이 요약되어 있다. 이는 핵형성 인자로 작용하는 스파이크 유리 침출물이 존재할 때의 FFA 침전을 시사한다. 상기 발견을 기반으로 하지만 이론에 얽매이지 않고, 입자 형성의 잠재적 메커니즘이 도 3에 도시되어 있다. FFA는 바이오의약품에 대한 관련 pH 값에서 양성자화 및 탈양성자화 형태의 평형 상태로 존재한다. 알루미늄의 예를 들면, 삼중 전하를 띤 알루미늄 이온은 탈양성자화된 FFA와 반응하여 매우 불용성인 알루미늄-지방산-트리-카르복실레이트를 형성할 수 있으며, 이는 핵형성 종자로 작용할 것이다. FFA의 소수성 사슬은 소수성 상호작용에 의해 추가로 상호작용하여 종자 성장을 촉진할 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 알루미늄이 존재하는 경우 미리스트산에 대해 제안된 메커니즘이 도시된다. 마지막으로, 소수성 증가로 인해 입자가 침전될 수 있다.
표 4: 가시적 입자(사이데나더). 상이한 혼합물 및 유리 침출물의 양을 스파이킹한 후 위약과 비교하여 숙성된 mAb1 및 mAb2 제형(22M, 5°C). d= 검사일
Figure pct00022
실시예 4: 폴리소르베이트 분해의 결과로 입자의 핵형성에 대한 세척 및 멸균 절차의 영향
유리 바이알의 제조
20 cc 구성의 확장(Expansion) 51 유리 바이알(피오락스(Fiolax)®)은 스코트 노스 아메리카(Schott North America Inc.)(미국 뉴욕주 소재)로부터 구입하였다. 바이알은 유럽 약전(Ph. Eur.)에 따라 유형 I 유리에 따른다. 하기에 기재된 바와 같이 세척 및 발열원을 제거한 후, 바이알을 (1.) 더 이상의 부형제(음성 대조군, NC), (2.) 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 20(PS20) 또는 (3.) 0.4 mg/mL PS20을 함유하지 않고, 추가로 스파이크된 최종 Al3+ 농도가 ~250 ppb(양성 대조군, PC)인 AlCl3을 첨가한 12.2　mL의 위약 완충액(20 mM His/His-HCl, 240 mM 수크로스, 10 mM 메티오닌, pH 5.5)을 충전하였다. 이전에 0.4 mg/mL의 PS20이 이전에 기재된 바와 같이13 C. 남극(Antarctica) 결합 비드로 ~10% 분해되었다. 바이알을 5°C, 25°C/60% RH 및 40°C/70% RH에서 세워서 보관하였다.
세척 및 발열원의 제거
바이알은 FAW1020 바이알 세척 기계(바우쉬 & 스트로벨(Bausch & Stroebel), 독일 소재)를 사용하여 70°C(물 및 공기 압력 1 bar, 최종 공기 압력 2.5 bar)에서 주사용수(WFI)로 세척하였다. 그 후, 바이알을 스테인리스 스틸 상자에 넣고 층류 기류 하에서 96시간 동안 건조시켰다.
바이알은 표 5에 명시된 최상의 또는 최악의 멸균 조건에 따라 추가로 처리하였다. 모든 바이알의 발열원 제거는 DHT2550 살균 터널(바우쉬 & 스트로벨, 독일 소재)에서 실시하였다. 공정 조건은 잔류 수분, 가열 영역 온도, 살균 온도, 터널 내 체류 시간 및 컨베이어 벨트 속도에 따라 상이하다. 최악의 조건에 따라 처리된 바이알은 잔류 수분의 존재를 시뮬레이션하기 위해 발열원 제거 전에 281 μL의 WFI로 채웠다. 또한, 바이알이 터널에서 장기간 체류하는 동안 멸균 영역에 들어간 후 컨베이어 벨트를 중지하였다. 가열, 살균 및 냉각 영역에서의 시간은 최악의 조건(총 966.5분)에 대해 각각 3분, 16시간 및 3.5분과 비교하여 최상의 조건(총 134.5분)에 대해 각각 41분, 43.5분 및 50분으로 계산하였다.
표 5. 발열원 제거 공정 매개변수
Figure pct00023
* 부피는 기본적으로 80 μL의 잔류 수분을 포함하는 2 cc 바이알의 표면적에 대해 정규화되었다. 정규화된 부피 = 표면적 * F; F = 80 μL/2cc 바이알 표면적
시각적 검사
입자는 Ph. Eur. 2.9.20 및 사이데나더 V 90-T 기기(세이데나더 마시넨바우(Seidenader Maschinenbau) GmbH, 독일 마르크트 슈바벤 소재)에 따라 흑백 패널을 모두 사용한 육안 검사를 통해 확인하였다. 후자는 상기 연구에서 향상된 육안 검사로 지칭된다. 육안 검사를 향상시키기 위해, 샘플은 바닥 및 상단뿐만 아니라 뒤에서도 조명을 받도록 하였다. 용기를 회전시키면서 2중 돋보기를 통해 검사하였다. 두 기기 모두에 대해, 용기를 실온과 3시간 동안 평형화시킨 후 샘플을 검사하였다. 평균 입자의 수는 5개 바이알의 평균으로서 보고한다.
결과:
강화된 육안 검사(표 6A)로 분석할 때 2개월부터 시작하여 25°C 및 40°C에서 보관한 후 최악의 멸균 샘플의 경우 입자 형성이 관찰되었다. 최상의 샘플의 경우, 입자 형성은 3개월 후 40°C에서 시작되지만 그 정도는 작았다. 입자 형성이 확률적 사건이라는 점을 감안할 때, E/P 상자(표 6B)에 의한 분석의 경향은 보다 민감한 향상된 육안 검사의 결과를 따른다. 3개월 후 40°C 최악의 경우로 멸균된 바이알에서 입자 형성이 시작되었다. 일반적으로, 육안 검사 방법 및 시험된 샘플 중 그 어느 것도 5°C 보관에서 최대 3개월까지는 입자 형성이 관찰되지 않았다. 모든 온도 및 분석 시점에 대해 육안 검사 방법을 모두 사용하여 입자의 부재에 대해서는 음성 대조군을 확인하고 입자의 존재에 대해서는 양성 대조군을 확인하였다.
따라서, 세척 및 멸균 절차는 폴리소르베이트 분해의 결과로서 입자의 핵 생성에 주요 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있다.
표 6: 육안 검사 결과 요약.
Figure pct00024
Figure pct00025
참조 문헌
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Claims (15)

  1. 약학적으로 허용가능한 부형제 예컨대, 예를 들어, 완충제, 항산화제를 포함한 안정화제, 및 계면활성제와 함께 단백질을 포함하는 안정한 수성 조성물로서,
    상기 조성물은 유리 바이알과 같은 포장재 외부로 확산되는 하나 또는 여러 유형의 무기 이온, 및 가시적 입자의 형성 없이 상기 계면활성제의 분해로부터 발생하는 물질의 혼합물을 추가로 함유하는, 안정한 수성 조성물.
  2. 제2항에 있어서,
    상기 무기 이온은 알루미늄, 붕소, 규소, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 및 나트륨으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 5 내지 7의 범위, 바람직하게는 약 6인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질은 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    0.03 μg/ml 이하의 알루미늄, 및/또는 0.05 μg/ml 이하의 붕소, 및/또는 0.5 μg/ml 이하의 규소의 농도를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제는 당, 당 알코올, 당 유도체, 또는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충제는 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 아르기닌, 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 글리신, 아스파르테이트, 및 글루타메이트 완충계로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면 활성제의 분해로부터 발생하는 물질은 실온에서 물에 대한 용해도 수준 미만의 유리 지방산인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용가능한 부형제는: 20 mM HisHCl 완충액 pH 5.5, 105 mM 트레할로스, 100 mM 수크로스, 10 mM 메티오닌, 및 0.04% 폴리소르베이트 20 내의 1000 U/mL 히알루로니다제인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 수득하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항에 정의된 바와 같은 하나 또는 여러 무기 이온이 상기 조성물 내로 침출되는 것을 방지하는 1차 포장재를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 1차 포장재는 유리 또는 중합체 바이알인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    사용 전에, 상기 1차 포장재를 a) 세척하고, 및/또는 b) 이의 발열원을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 가시적 입자의 형성에 대해 상기 조성물의 안정성을 제공하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 용기 내에 포함하는 약학적 제형으로서,
    상기 조성물 내의 알루미늄, 붕소, 규소, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 및 나트륨으로부터 선택된 하나 또는 여러 무기 이온의 농도는 이의 허가된 유통 기한 동안 실질적으로 일정하게 유지되는, 약학적 제형.
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