TWI613217B - Ｉｌ－１８結合分子 - Google Patents

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Abstract

IL-18參與先天性及後天性免疫二者。IL-18之生物活性係由IL-18結合蛋白(IL18BP)(即天然存在且高度特異性之抑制劑)負性調節。此可溶性蛋白質與游離IL-18形成複合物，從而防止其與IL-18受體之相互作用，由此中和並抑制其生物活性。本發明揭示結合IL-18但不結合已結合至IL-18BP之IL-18(IL-18/IL-18BP複合物)之結合分子，特定而言抗體或其片段。IL-18除了具有生理學作用以外，已顯示其介導各種自體免疫及發炎性疾病。本發明之該等結合分子可用作治療IL-18相關之自體免疫及發炎性疾病之治療性分子，或用作診斷工具，用於表徵、檢測及/或量測作為總IL-18庫之組份之未結合至IL-18BP之IL-18。

Description

IL-18結合分子
本發明係關於結合分子、更特定而言諸如抗體或其片段等免疫球蛋白，其結合細胞因子介白素18(IL-18)，但不結合與介白素18結合蛋白(IL-18BP)內源性抑制劑形成複合物之IL-18。本發明亦係關於編碼該等結合分子之聚核苷酸、包含該等結合分子之醫藥組合物、使用該等結合分子治療及/或預防疾病之方法，及檢測及/或量測未結合至IL-18BP之IL-18之存在及/或量之方法。根據下文說明，本發明之其他態樣、目的及優勢將顯而易見。
介白素-18(IL-18)最初於1989年闡述為干擾素-γ誘導因子(IGIF)。IL-18與IL-1家族相關，且在結構上與IL-1β相關(Okamura H等人，(1995)Nature；378：88-91)。IL-18主要係由巨噬細胞及T細胞以前體蛋白(pro-IL-18)形式產生，並以活性蛋白形式分泌，接著由半胱天冬酶-1裂解(Dinarello CA等人(1999)J Allergy Clin Immunol；103：11-24)。在正常生理中，與IL-12協同作用之IL-18與受諸如脂多糖(LPS)等微生物產物感染之後細胞介導之免疫之誘導相關(Sareneva T等人(2000)J Immunol；165(4)：1933-8)。在利用IL-18刺激後，自然殺手(NK)細胞及T細胞釋放在活化巨噬細胞及其他細胞中起重要作用之細胞因子干擾素γ(INF-γ)。除誘導干擾素γ之能力以外，IL-18亦具有各種功能。該等生物學性質包括NF-κB之活化、Fas配體表現、CC及 CXC趨化因子二者之誘導及勝任人類免疫缺陷病毒之增加之產生。由於IL-18誘導T細胞及巨噬細胞中之INF-γ產生之能力，其在Th1型免疫反應中起重要作用，並參與先天性及後天性免疫二者。
IL-18以高親和力結合，並藉助IL-18受體(IL-18R，即分別藉由基因IL18R1及IL18RAP編碼之α及β鏈之異源複合物)進行信號傳導(Torigoe K等人(1997)J Biol Chem；272(41)：25737-42)。IL-18之生物活性係由IL-18結合蛋白(IL18BP，即天然存在且高度特異性之抑制劑)負性調節。此可溶性蛋白質與游離IL-18形成複合物，從而防止其與IL-18受體之相互作用，由此中和並抑制其生物活性(Dinarello CA(2000)Ann Rheum Dis；59增刊1：i17-20)。IL-18BP係以高親和力結合至IL-18之組成分泌性蛋白質。IL-18BP之選擇性mRNA剪接變體產生四種同種型。健康人類之血清中主要之‘a’同種型之莫耳濃度超過IL-18之20倍(Dinarello及Kaplanski(2005)Expert Rev Clin Immunol,1(4),619-632)。
IL-18除了具有生理學作用以外，已顯示其介導各種自體免疫及發炎性疾病。已在若干自體免疫疾病中證明IL-18之表現上調，例如克隆氏病(Crohn’s disease)、牛皮癬、類風濕性關節炎、多發性硬化症及心血管疾病(Braddock等人(2004)Expert Opin Biol Ther；4(6)：847-860)。IL-18在某些發炎性疾病中亦上調，例如慢性阻塞性肺病(COPD)(Imaoka等人(2008)Eur Respir；J31：287-297)、自發性肺纖維化(IPF)(Kitasato等人(2004)Am J Resp Cell Mol Biol；31：619-625)、巨噬細胞活化症候群(MAS)(Dinarello及Kaplanski(2005)Expert Rev Clin Immunol；1(4)：619-632)、成人型史迪爾氏疾病(adult onset Still’s disease，AOSD)(Arlet JB等人(2006)Ann Rheum Dis 65(12)：1596-601)及全身性幼年自發性關節炎(SJIA)(Akashi等人(1994)Br J Haematol；87(2)：243-50)。
最近研究顯示，噬血性淋巴組織球增多症(HLH)之遺傳性及後天性形式二者中存在大量IL-18及INF-γ。HLH之特徵在於分泌大量發炎性細胞因子之經活化淋巴細胞及組織細胞(Janka GE等人(2007)Eur J Paediatr；166：95-109)以及NK細胞及細胞毒性T-細胞之功能受損。最重要地，已顯示兩種形式之特徵在於IL-18之失調(Mazodier等人(2005)Immunobiology 106(10)：3483-89)。
針對受到天然抑制劑調節之諸如IL-18等標靶之治療分子之研發極具挑戰性。全身性或局部總IL-18之存在量增加並不一定反映生物活性蛋白(不含IL-18BP之IL-18)之含量。可以結合游離IL-18及與IL-18BP形成複合物之IL-18二者，但仍有潛力中和IL-18活性之治療性化合物所需要的劑量將高於僅選擇性結合生物活性游離IL-18之化合物。需要以高劑量投與之治療化合物將會導致較顯著副效應或變得具有免疫原性。高劑量亦導致高產生成本。
會與IL-18競爭結合至IL18BP之治療性化合物可能干預患有特徵在於IL-18失調之疾病/病症之患者中所存在之游離/活性IL-18及已與IL-18BP結合/非活性IL-18的微妙平衡。
最後，很難在沒有能夠檢測及/或量測作為總IL-18之組份之不含IL-18BP之IL-18之診斷工具的情況下探討特徵在於游離IL-18之失調之疾病。
在一態樣中，其本發明提供特異性結合IL-18之結合分子，其中該結合分子不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物且其中該結合分子並非IL-18BP。
在此態樣之一實施例中，該結合分子結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位，其中該表位包含胺基酸Arg140及Glu152。
在此態樣之另一實施例中，該表位可進一步包含胺基酸Gln92、Pro93、Gly95、Pro143、Glu157或Glu177中之任一或多者。
在此態樣之又一實施例中，該表位可進一步包含胺基酸Lys89、Arg94、Met96、Phe138、Ser141、Gly144、His145、Asp146、Gln150或Leu180中之任一或多者。
在此態樣之另一實施例中，當IL-18BP係結合至IL-18時，該結合分子不與IL-18BP競爭結合IL-18。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子係選自：分離抗體、分離抗體之片段、單一可變結構域抗體、雙特異性或多特異性抗體、多價抗體、雙重可變結構域抗體、免疫偶聯物、纖維連接蛋白分子、支架蛋白(adnectin)、DARPin、高親和性多聚體(avimer)、親合體(affibody)、抗運載蛋白(anticalin)、人泛素(affilin)、蛋白質表位模擬物或其組合。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子結合IL-18，其中IL-18包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸37至胺基酸193。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子抑制IL-18依賴性干擾素γ(INF-γ)產生。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子以100pM或更小之KD結合IL-18。
在此態樣之另一實施例中，本發明之結合分子係分離之完全人類、人類化或嵌合抗體或其片段、較佳分離之完全人類抗體。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子係抗體片段或單一可變結構域抗體、較佳Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dAb或VHH。
在此態樣之另一實施例中，該結合分子係包含對IL-18之第一特異性及對另一多肽(例如IL-12或IL-1β)之第二特異性之分離雙特異性抗體或其片段。
在此態樣之又一實施例中，該結合分子係包含經突變或經化學修飾之胺基酸Fc區之分離抗體，其中當與野生型Fc區相比時，該經突變或經化學修飾之胺基酸Fc區防止或降低ADCC活性及/或延長半衰期。較佳地，該經突變或經化學修飾之胺基酸Fc區係沉默IgG1 Fc區。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及ii. 包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
較佳地，該抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：13之重鏈可變區H-CDR 2。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20或其保守變體之輕鏈可變結構域。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34或其保守變體之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：16或其保守變體之輕鏈可變結構域，或ii. 包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：40或其保守變體之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：20或其保守變體之輕鏈可變結構域。
較佳地，該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：14或其保守變體，且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：16或其保守變體，且視情況，SEQ ID NO：14之30-位置之胺基酸離胺酸(Lys；K)係經選自天冬醯胺(Asn；N)或絲胺酸(Ser；S)或蘇胺酸(Thr；T)或丙胺酸(Ala；A)或麩胺酸(Glu；E)或組胺酸(His；H)或白胺酸(Leu；L)或麩醯胺酸(Gln；Q)或精胺酸(Arg；R)或纈胺酸(Val；V)或酪胺酸(Tyr；Y)或異白胺酸(Ile；I)之胺基酸替代。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：18或其保守變體之重鏈可變結構域及含有SEQ ID NO：20或其保守變體之輕鏈可變結構域。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：56或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：45或其保守變體之輕鏈，或ii. 包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：158或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：160或其保守變體之輕鏈。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體時，該分離抗體或其片 段包含：i. 包含SEQ ID NO：43或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：45或其保守變體之輕鏈，或ii. 包含SEQ ID NO：158或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：160或其保守變體之輕鏈。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及ii. 包含SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：85或其保守變體之輕鏈可變結構域及含有SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：93或其保守變體之重鏈可變結構域。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體時，該分離抗體包含含有SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：103或其保守變體之重鏈及含有SEQ ID NO：98或其保守變體之輕鏈。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL- 18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：106或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及i. 包含SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：122或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：108或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：109或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：110或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：126或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：106或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及ii. 包含SEQ ID NO：107或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：108或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：109或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：110或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：111或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含： i. 包含SEQ ID NO：112或其保守變體之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：114或其保守變體之輕鏈可變結構域，或ii. 包含SEQ ID NO：138或其保守變體之重鏈可變結構域及包含SEQ ID NO：140或其保守變體之輕鏈可變結構域。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：116或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：118或其保守變體之輕鏈，或ii. 包含SEQ ID NO：142或其保守變體之重鏈及包含SEQ ID NO：144或其保守變體之輕鏈。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：120或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及ii. 包含SEQ ID NO：121或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：123或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：124或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：125或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體或其片段時，該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：130或其保守變體之重鏈可變結構域 及含有SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：153或其保守變體之輕鏈可變結構域。
在另一實施例中，當本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之分離抗體時，該分離抗體包含含有SEQ ID NO：134或其保守變體之重鏈及含有SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：150或SEQ ID NO：156或其保守變體之輕鏈。
在另一態樣中，提供編碼本發明之結合分子之分離聚核苷酸。
在此後一態樣之一實施例中，本發明之分離聚核苷酸編碼重鏈可變結構域，其中該聚核苷酸：i. 與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152具有至少90%一致性；或ii. 包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152；或iii. 基本上由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152組成。
在此態樣之另一實施例中，本發明之分離聚核苷酸編碼輕鏈可 變結構域，其中該聚核苷酸：i. 與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154具有至少90%一致性；或ii. 包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154；或iii. 基本上由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154組成。
在此態樣之另一實施例中，本發明之分離聚核苷酸編碼重鏈，其中該聚核苷酸：i. 與SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：159具有至少90%一致性；或ii. 包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：159；或iii. 基本上由SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：159組成。
在此態樣之另一實施例中，本發明之分離聚核苷酸編碼輕鏈，其中該聚核苷酸：i. 與SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157或SEQ ID NO：161具有至少90%一致性；或ii. 包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157或SEQ ID NO：161；或iii. 基本上由SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157或SEQ ID NO：161組成。
在此態樣之另一態樣中，提供包含一或多種本文所主張之聚核苷酸之選殖或表現載體。
在一實施例中，本發明之選殖或表現載體包含至少一種選自以 下之群之聚核苷酸：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157。
本發明進一步提供包含一或多種本文所主張之選殖或表現載體之宿主細胞。
在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種本文所主張之聚核苷酸之經穩定轉化或轉染之宿主細胞。
本發明進一步提供產生結合分子之方法，該方法包含在適於產生該結合分子之條件下培養本文所主張之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明進一步提供醫藥組合物，該醫藥組合物包含醫藥載劑及結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段，且其中該結合分子並非IL-18BP。
較佳地，本發明之醫藥組合物係呈經靜脈內、可吸入或經皮下可投與形式。
本發明進一步提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該結合分子並非IL-18BP)或包含彼結合分子之醫藥組合物，其用於療法。
在本發明之另一態樣中，提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該結合分子並非IL-18BP)或包含彼結合分子之醫藥組合物，其用於治療及/或預防哺乳動物患 者之類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞關節炎(GCA)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、1型糖尿病、2型糖尿病或動脈粥樣硬化及其任一組合。
在本發明之另一態樣中，提供治療及/或預防哺乳動物患者之以下疾病之方法：類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞關節炎(GCA)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、1型糖尿病、2型糖尿病或動脈粥樣硬化及其任一組合，該方法包含向該哺乳動物患者投與治療有效量結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該結合分子並非IL-18BP)或包含彼結合分子之醫藥組合物。
在本發明之又一態樣中，提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該結合分子並非IL-18BP)或包含彼結合分子之醫藥組合物用於製造用以治療及/或預防哺乳動物患者之以下疾病之醫藥的用途：類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞關節炎(GCA)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、1型糖尿病、2型糖尿病或動脈粥樣硬化及其任一組合。
在本發明之用途之一實施例中，該哺乳動物患者係人類患者。
在另一態樣中，提供包含IL-18及結合IL-18但不結合IL-18/IL-18 結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中根據本發明該結合分子並非IL-18BP)之複合物。
在另一態樣中，本發明提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(且其中該結合分子並非IL-18BP)，其用於診斷或用於診斷套組。
在又一態樣中，本發明提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(且其中該結合分子並非IL-18BP)，其用於診斷或用於檢測及/或量測樣品中游離IL-18(即未結合至IL-18BP之IL-18)之存在及/或量。
在本發明之再一態樣中，提供檢測及/或量測樣品中游離IL-18(即未結合至IL-18BP之IL-18)之存在及/或量之方法，其中該樣品視情況係人類樣品，其中該方法包含使該樣品與結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(且其中該結合分子並非IL-18BP)接觸。
在此態樣之一實施例中，該樣品係人類血液。
在另一態樣中，本發明進一步提供診斷套組，其包含結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(且其中該結合分子並非IL-18BP)及/或包含IL-18及彼結合分子之複合物，其中該套組視情況包含第一對照化合物。
在此態樣之一實施例中，該第一對照化合物係游離IL-18，且該套組視情況包含為鼠類抗體125-2H之第二對照化合物。
在本發明之另一態樣中，提供醫學或診斷裝置，其包含結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(且其中該結合分子並非IL-18BP)及/或包含IL-18及彼結合分子之複合物。
圖1：本文所例示之抗體之重鏈可變區之CDR。
圖2：本文所例示之抗體之輕鏈可變區之CDR。
圖3(A至D)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對藉由LPS/IL-12(藉由天然IL-18之刺激)誘導之自PBMC之IFN-γ釋放之效應。數據顯示自來自個別供體之剛分離之人類PBMC之天然IL-18誘導之IFN-γ釋放的濃度依賴性抑制，其中每一數據點代表來自n=4個孔之平均值±SEM。天然IL-18係藉由LPS/IL-12治療刺激，且虛線代表IL-18依賴性程度，如藉由人類IL-18BPa-Fc之最大效力所測定。
圖4(A至B)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對藉由重組IL-18誘導之自PBMC之IFN-γ釋放的效應。數據顯示自來自代表性個別供體之剛分離之人類PBMC之重組人類IL-18(1nM)誘導之IFN-γ釋放之濃度依賴性抑制，其中每一數據點代表來自n=4個孔之平均值±SEM。
圖5(A至C)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對藉由人類IL-18誘導之自KG-1細胞之IFN-γ釋放的效應。數據顯示自KG-1細胞之重組人類IL-18(1nM)誘導之IFN-γ釋放之濃度依賴性抑制，其中每一數據點代表來自n=4個孔之平均值±SEM。
圖6(A至C)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對藉由食蟹猴IL-18誘導之自KG-1細胞之IFN-γ釋放的效應。數據顯示自KG-1細胞之重組食蟹猴IL-18(0.2nM)誘導之IFN-γ釋放之濃度依賴性抑制，其中每一數據點代表來自n=4個孔之平均值±SEM。
圖7(A至E)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對人類全血中由LPS/IL-12誘發之人類IL-18(天然IL-18之刺激作用)及後續IFN-γ釋放之效應。
圖8(A至E)：本發明之抗IL-18抗體及其片段對人類全血中之人類IL-18誘導之IFN-γ釋放之效應。數據顯示自獲取自個別供體之全血之重組人類IL-18誘導之IFN-γ釋放的濃度依賴性抑制，其中每一數據 點代表來自n=4個孔之平均值±SEM。
圖9(A至B)：抗IL-18抗體及片段與IL-18/IL-18BP複合物之結合。(A)親代MOR08775及MOR08776不能識別IL-18/IL-18BP複合物。在此實驗中，將MOR08775及MOR08776與經生物素化IL-18/IL-18BP複合物一起培育。(B)以與A)中所顯示類似之方式實施該實驗，惟使用未經生物素化人類IL-18。MOR03207係抗溶菌酶抗體，且125-2H係結合IL-18/IL-18BP複合物之抗IL-18小鼠IgG。
圖10：針對抗IL-18抗體MOR8775、MOR8776(A)及抗體MOR9464、MOR9464_N30K、MOR10222_N30S_M54I及MOR14431(B)之表位框並法。黑色單元填充指示競爭類似表位之抗體，而無單元填充指示無競爭。
圖11(A至B)：A)疊置於基於IL-1β/IL-1R複合物之結構創建之IL-18/IL-18Rα模型上之IL-1β/IL-1R複合物之結構。所有結構已以條帶來表示。IL-18及IL-1β之結構已用於重疊。B)基於IL-1β/IL-1R複合物之結構創建之IL-18/IL-18Rα複合物模型。IL-18Rα(以表面表示法顯示)包含三個免疫球蛋白樣結構域D1、D2及D3。在IL-18(以條帶表示法顯示)位點1及2上係IL-18Rα結合位點。位點3係IL-18Rβ結合位點。
圖12：IL-18上所結合之相關胺基酸之比較。1)SEQ ID NO：1之胺基酸37至193之IL-18之序列。2)來自Kim等人(2000)Proc Natl Acad Sci；97(3)：1190-1195(IL-18BP及其與人類IL-18之複合物之模型化)。3)來自Krumm等人(2008)Proc Natl Acad Sci；,2008 105(52)：,20711-2071552表1。4)來自Kato等人(2003)Nature Struct.Biol.2003；,10(11)：,966-971；IL-18Rα結合中所涉及之殘基。5)結合至IL-18之MOR9464之H/DxMS結果。
圖13：介於人類IL-18(以Cα跡線及溶劑可接觸表面顯示)與 MOR9464_N30K(以卡通表示法顯示)之間之複合物之三維結構之全貌圖。
圖14：(A)成熟人類及食蟹猴IL-18(胺基酸37至193)之序列之序列比對；(B)兩物種間不同之6個胺基酸之空間填充表示法。E177係抗體複合物界面中所存在之唯一胺基酸。IL-18係以Cα跡線及溶劑可接觸表面顯示，且MOR9464_N30K係以卡通表示法顯示。
圖15：疊置於基於IL-1β/IL-1R複合物之結構創建之IL-18/IL-18Rα複合物模型上之IL18/MOR9464_N30K複合物之條帶表示法。IL-18Rα結構係以表面表示法顯示，且MOR9464_N30K重鏈及輕鏈係分別呈深灰色及淺灰色。
圖16：結合至來自痘病毒之IL-18 BP(左)及MOR9464_N30K抗體片段(右)之人類IL-18及其疊加(中間)之條帶表示法。覆蓋係基於IL-18結構。IL-18係以Cα跡線及溶劑可接觸表面顯示，且MOR9464_N30K及來自痘病毒之IL-18 BP係以卡通表示法顯示。
圖17：結合至MOR9464_N30K抗體片段(右)及鼠類125-2H抗體片段(右)之人類IL-18及其疊加(中間)之條帶表示法。覆蓋係基於IL-18結構。IL-18係以Cα跡線及溶劑可接觸表面顯示，且MOR9464_N30K及125-2H係以卡通表示法顯示。
圖18：結合至覆蓋至結合至來自痘病毒之IL-18BP之IL-18上之125-2H之人類IL-18的條帶表示法。覆蓋係基於IL-18結構。IL-18係以Cα跡線及溶劑可接觸表面顯示，且MOR9464_N30K、125-2H及來自痘病毒之IL-18BP係以卡通表示法顯示。
圖19：結合至MOR9464_N30K抗體片段之人類IL-18之條帶表示法，其中表位及互補位殘基以棒表示法繪示，顯示與MOR9464_N30K之30-位置處之胺基酸離胺酸之特異性相互作用。
1. 定義
出於闡釋本說明書之目的，將應用以下定義且每當適宜時，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。貫穿詳細說明闡述其他定義。
術語「IL-18」係與IL-18多肽、介白素-18多肽、IFN-γ誘導因子(IFN-gamma-inducing factor)或干擾素-γ誘導因子或INF-γ誘導因子(INF-γ inducing factor)同義。術語「IL-18」係指包含SEQ ID NO：1之胺基酸37至193之人類IL-18。在本說明書通篇中，除非指明意指前形式或成熟形式，否則術語IL-18可互換地涵蓋pro-IL-18(成熟IL-18在蛋白酶裂解前之前體)及成熟IL-18(蛋白酶裂解後)。
術語cm IL-18係指包含SEQ ID NO：2之胺基酸37至193之食蟹猴IL-18。
術語「抗體」係指完整免疫球蛋白或其功能片段。天然存在之抗體通常包含經常由至少兩個重(H)鏈及至少兩個輕(L)鏈構成之四聚體。每一重鏈係由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區組成，經常由三個結構域(CH1、CH2及CH3)組成。重鏈可為任一同種型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。每一輕鏈係由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。重鏈及輕鏈可變區通常負責抗原識別，而重鏈及輕鏈恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(Clq))之結合。可將VH及VL進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及較保守之區(稱為框架區(FR))，二者散置排列。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端以下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。
本文中所使用之術語抗體之「抗原結合部分」(或簡寫為「抗原部分」)係指保留特異性結合至IL-18之能力之抗體之全長或一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段實施。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段之實例包括Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；F(ab)2片段，即包含兩個在鉸鏈區由雙硫橋連接之Fab片段的二價片段；由VH及CH1結構域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH結構域組成的Fv片段；dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其係由VH結構域組成；及分離互補決定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由分開基因編碼，但可使用重組方法藉由撓性連接體使該兩個結構域鏈接在一起，該撓性連接體使該兩個結構域能夠形成其中VL及VH區配對形成單價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；例如參見Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci；.85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。使用熟習此項技術者已知之習用技術獲得該等抗體片段，且篩選以與完整抗體相同之方式使用之片段。
在本說明書通篇中，術語「分離」意指免疫球蛋白、抗體或聚核苷酸根據情況存在於與其在自然界中可存在之環境不同之物理環境中。
然而，特異性結合IL18多肽之分離抗體可與其他抗原具有交叉反應性，例如來自其他物種之IL18(例如食蟹猴(cm)IL-18)。此外，分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
在本說明書通篇中，除非指明CDR係根據Chothia定義或藉由Chothia定義及Kabat定義二者一起定義，否則互補決定區(「CDR」)係根據Kabat定義來定義。Kabat定義係對抗體中之殘基進行編號之標 準，且通常使用其鑑別CDR區(Kabat等人(1991)，第5版，NIH出版號91-3242)。Chothia定義與Kabat定義類似，但其考慮某些結構環之位置(Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.,196：901-17；Al-Lazikani等人(1997)J.Mol.Biol.273：927-948)。
根據慣例，CDR區在重鏈中通常稱為H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3，且在輕鏈中稱為L-CDR1、LCDR2及L-CDR3。以自胺基端至羧基端之方向對其依序編號。
本文中所使用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有單一分子組成之抗體分子之製劑。單株抗體組合物對特定表位展示單一結合特異性及親和力。
本文中所使用之術語「人類抗體」意欲包括具有可變區之抗體，在該等可變區中框架區及CDR區二者皆係衍生自人類來源之序列。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦係衍生自該等人類序列，例如人類種系序列或人類種系序列之突變形式或含有衍生自人類框架序列分析之共有框架序列的抗體(例如，如Knappik等人(2000)J Mol Biol；296：57-86中所闡述)。
本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，本文中所使用之術語「人類抗體」並不意欲包括其中衍生自另一哺乳動物物種(例如小鼠)之種系之CDR序列已移植至人類框架序列上的抗體。
術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性且具有可變區之抗體，在該等可變區中框架區及CDR區二者皆係衍生自人類序列。
本文中所使用之術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、創建或分離之所有人類抗體，例如自人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或自其製備之融合瘤分離之抗 體、自經轉化以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體、自重組、組成人類抗體文庫分離之抗體，及藉由任一涉及人類免疫球蛋白基因之所有或一部分之剪接之其他方式製備、表現、創建或分離的抗體。該等重組人類抗體具有其中框架區及CDR區係衍生自人類種系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外誘變(或者，當使用人類Ig序列轉基因動物時，經受活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列儘管衍生自人類種系VH及VL序列並與其相關，但其係可不天然存在於人類活體內抗體種系譜中的序列。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
本文中所使用之「特異性結合至IL-18」之結合分子意欲指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小之KD結合至人類IL-18之結合分子。
「與除IL-18以外之抗原交叉反應」之結合分子意欲指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小之KD結合彼抗原之結合分子。「不與特定抗原交叉反應」之結合分子意欲指在標準結合分析中對該等蛋白質呈現基本上不可檢測之結合之結合分子。
本文中所使用之術語「拮抗劑」意欲指在人類細胞分析(例如在人類血液細胞中之IL-18依賴性干擾素-γ(IFN-γ)產生分析)中在存在IL-18之情況下抑制IL-18依賴性信號傳導活性之結合分子。於人類血液細胞中之IL-18依賴性IFN-γ產生分析之實例係更詳細地闡述於下文實例中。
本文中所使用之「不具有拮抗活性」之抗體意欲指在基於細胞之分析(例如人類血液細胞IFN-γ產生分析)中在不存在及/或存在IL-18之情況下不顯著增加IL-18依賴性信號傳導活性之結合分子。該等分 析係更詳細地闡述於下文實例中。
本文中所使用之術語「Kassoc」或「Ka」意欲指特定結合分子-抗原相互作用之締合速率，而本文中所使用之術語「Kdis」或「Kd」意欲指特定結合分子-抗原相互作用之解離速率。本文中所使用之術語「KD」意欲指解離常數，其係自Kd與Ka之比率(即Kd/Ka)獲得且以莫耳濃度(M)表示。可使用業內已充分確定之方法測定抗體之KD值。測定抗體之KD之方法係藉由使用表面電漿子共振(例如Biacore®系統)達成。
本文中所使用之術語「親和力」係指單一抗原性位點處結合分子與抗原之間之相互作用強度。
本文中所使用之術語對抗體之「高親和力」係指對標靶抗原具有1nM或更小之KD之抗體。
本文中所使用之術語「受試者」包括任一人類或非人類動物。
術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲類等。
本文中所使用之術語「經最佳化核苷酸序列」意指該核苷酸序列已經改變，以使用在產生細胞或有機體、通常真核細胞(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子編碼胺基酸序列。經最佳化核苷酸序列係經改造以完全保留最初由起始核苷酸序列(其亦稱為「親代」序列)編碼之胺基酸序列。經最佳化序列在本文中已經改造，以具有在CHO哺乳動物細胞中較佳之密碼子；然而本文亦預期該等序列在其他真核細胞中之經最佳化表現。
術語「一致性」係指至少兩個不同序列之間之類似性。此一致性可表示為一致性百分比，且藉由標準比對演算法測定，例如基本局 部比對工具(Basic Local Alignment Tool，BLAST)(Altshul等人(1990)J MoI Biol；215：403-410)；Needleman等人(1970)J MoI Biol；48：444-453之演算法或Meyers等人(1988)Comput Appl Biosci；4：11-17)之演算法。參數之集合可為Blosum 62計分矩陣，其中間隔罰分為12，間隔延伸罰分為4，且框移間隔罰分為5。兩個胺基酸或核苷酸序列之間之一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller,(1989)CABIOS；4(1)：1-17)之演算法並使用PAM 120權重殘基表、12之間隔長度罰分及4之間隔罰分來測定，該演算法已納入ALIGN程式(2.0版)中。一致性百分比經常係藉由比較類似長度之序列來計算。
術語「免疫反應」係指(例如)淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞因子及補體)之作用，其導致對具有侵入病原體、經病原體感染之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫性或病理性發炎之情形下正常人類細胞或組織之人類身體之選擇性損害、其破壞或自其之消除。
「信號轉導路徑」或「信號傳導活性」係指通常藉由蛋白質-蛋白質相互作用(例如生長因子與受體之結合)起始、從而導致信號自細胞之一部分傳送至細胞之另一部分之生物化學因果關係。通常，該傳送涉及一系列引起信號轉導之反應中之一或多種蛋白質上之一或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基之特異性磷酸化。倒數第二個製程通常包括核事件，從而導致基因表現之變化。
在本說明書通篇中，術語「中和」及其語法變化形式意指在存在結合蛋白或抗體之情況下標靶之生物活性完全或部分地降低，此視情況而定。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有具有與參照核酸類似之結合特性且以與天然存在之核苷酸 類似之方式代謝之天然核苷酸之已知類似物的核酸。除非另有說明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。具體而言，可藉由生成其中一或多個所選擇(或全部)密碼子之第三位係經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代的序列達成簡併密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
「聚核苷酸」或「核酸」中之核苷酸可包含修飾包括鹼基修飾，例如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯(phosphoraniladate)及胺基磷酸酯。
術語「載體」意指適於轉化或轉染宿主細胞並含有引導及/或控制(連同宿主細胞)一或多個與其可操作連接之異源編碼區之表現之核酸序列的任一分子或實體(例如核酸、質粒、噬菌體或病毒)。
編碼結合分子、抗體或其片段之序列之「保守變體」係指包含保守胺基酸修飾之序列。「保守胺基酸修飾」意欲指不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特性之胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基係經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺 酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。修飾可藉由業內已知標準技術引入本發明之結合蛋白中，例如定點誘變及PCR介導之誘變。保守胺基酸取代亦可涵蓋通常藉由化學肽合成而非藉由於生物學系統中之合成納入之非天然存在之胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸包括(但不限於)擬肽物、胺基酸部分之反向或倒置形式。
術語「表位」係抗原之藉由免疫系統(例如抗體或其片段)識別之部分。在本說明書中，術語「表位」可互換用於構象表位及線性表位二者。構象表位係由抗原之胺基酸序列之間斷段構成，而線性表位係藉由抗原之胺基酸之連續序列形成。
術語「治療」(「treat」、「treating」、「treatment」)、「預防」(「prevent」、「preventing」或「prevention」)包括降低受試者將患上病症之因素或其他風險因素之治療性治療、預防性治療及應用。治療不需要完全治癒病症，並涵蓋降低症狀或潛在風險因素。
2. 結合分子
本文中所使用之術語「結合分子」意指特異性結合至IL-18多肽之任一蛋白質或肽。「結合分子」包括(但不限於)抗體及其片段，例如免疫功能片段。本文中所使用之術語抗體或免疫球蛋白鏈之「免疫功能片段」係一種包含抗體之缺少全長鏈中所存在之至少一些胺基酸但仍能夠特異性結合IL-18多肽之部分(無論彼部分係如何獲得或合成)之結合蛋白。該等片段之生物活性在於其結合IL-18多肽。「結合分子」係指特異性結合IL-18多肽且可另外中和IL-18多肽與IL-18受體之相互作用之蛋白質。
本文中所使用之術語「結合分子」亦排除天然存在之IL-18結合蛋白及分離IL-18BP，例如WO2001/085201中所闡述。
本發明之結合分子特異性結合IL-18，其中該結合分子不結合IL- 18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該結合分子並非IL-18BP。
本文中所使用之術語「不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物」意欲指以1×10-5M或更大之KD結合至IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子。
評估結合分子是否結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之一方式在本文中係闡述於範例之部分9中。
在本發明之另一態樣中，該結合分子特異性結合IL-18，其中當IL-18BP係結合至IL-18時，該結合分子不與IL-18結合蛋白(IL-18 BP)競爭結合至IL-18。
術語「競爭」(「compete」、「competing」)及「交叉競爭」及其語法變化形式在本文中互換使用，以意指當IL-18BP已結合至IL-18時結合分子與IL-18BP競爭結合IL-18之能力。在此意義上，本發明之結合分子(例如)抗體或其片段不競爭。結合分子之間之競爭係藉由其中測試當IL-18係結合至IL-18BP時該結合分子與IL-18之特異性結合之分析來測定。為避免任何疑問，若結合分子可自IL-18/IL-18BP複合物置換IL18，則彼結合分子與IL-18 BP競爭結合IL-18。
本發明之結合分子並非IL-18BP，分離抑或或天然存在之IL-18BP。
該結合分子可選自以下骨架：抗體、抗體之片段、單一可變結構域抗體、雙特異性或多特異性抗體、多價抗體、雙重可變結構域抗體、免疫偶聯物、纖維連接蛋白分子、支架蛋白(adnectin)、DARPin、高親和性多聚體、親合體、抗運載蛋白、人泛素、蛋白質表位模擬物或其組合且如下文中所闡述。
較佳地，IL-18包含SEQ ID NO：1(人類IL-18)或SEQ ID NO：2(食蟹猴IL-18)之胺基酸37至胺基酸193。
IL-18BP結構之特徵在於單一Ig樣結構域，並類似於具有Ig樣結構之細胞因子受體之細胞外區段。人類IL-18BP已經鑑別呈四種不同同種型。IL-18BP同種型a(IL-18BPa)對IL-18呈現最大親和力，且具有快速締合速率(on-rate)、緩慢解離速率(off-rate)及399pM之解離常數(KD)。IL-18BP同種型c(IL-18BPc)共享IL-18BPa之Ig結構域，C-端之最後29個胺基酸除外。IL-18BPc之KD係IL-18BPa之1/10(2.94nM)。然而，IL-18BPa及IL-18BPc在兩倍莫耳過量下中和大於95%的IL-18。IL-18BP同種型b及d缺少完整Ig結構域，且缺少結合或中和IL-18之能力。已知鼠類IL-18BP呈兩種同種型、即c及d同種型，其具有相同Ig結構域且亦在兩倍莫耳過量下中和大於95%的鼠類IL-18。然而，鼠類IL-18BPd與人類IL-18BPa共享常見C-端模體，亦中和人類IL-18(Kim等人(2000)Proc Natl Acad Sci,97(3)：1190-1195)。
在本說明書通篇中，術語「IL-18BP」係指呈每一同種型之人類、鼠類或病毒IL-18結合蛋白，無論天然存在、經分離或經改造，例如闡述IL-18BP之類似物(「突變蛋白」)之WO2001/085201中所揭示之IL-18BP(其中一或多種胺基酸係經插入、經不同保守取代替代或缺失)、IL-18BP融合蛋白(例如IL-18BP與免疫球蛋白重鏈區或Fc之融合蛋白)及功能衍生物(例如PEG化之IL-18BP)。
在一實施例中，本發明之結合分子結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其中該結合分子與參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位結合，其中該表位：a. 係包含於參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18之以下胺基酸內：i. 胺基酸41及42及胺基酸87至97；或ii. 胺基酸138至160；或iii. 胺基酸177至181；或 iv. 胺基酸41及42、胺基酸87至97、胺基酸138至160及胺基酸177至181；或v. 胺基酸41、42、87；89；90；或vi. 胺基酸93、94；95、96；或vii. 胺基酸140；141；150；177；或viii. 胺基酸92；93；94；138；140；152；157；或ix. 胺基酸142；143；150；152；或x. 胺基酸143；144；145；177；180；或xi. 胺基酸41、42、87；89；90；93、94；95、96；140；141；150；177；或xii. 胺基酸92；93；94；138；140；142；143；144；145；150；152；157；177；180；或xiii. 胺基酸41；42、87；89；90；92；93、94；95、96；138；140；141；142；143；144；145；150；152；157；177；180；或b. 包含至少一個、兩個、三個、四個a)中所列示之群組(i)至(xiii)中之任一者中所定義之胺基酸；或c. 包含a)中所列示之群組(iv)至(xii)中之任一者中所定義之胺基酸。
在另一實施例中，本發明之結合分子結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其中該結合分子與參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位結合，其中該表位包含胺基酸Arg140及Glu152。在一實施例中，該表位進一步包含胺基酸Gln92、Pro93、Gly95、Pro143、Glu157或Glu177中之任一或多者。在另一實施例中，該表位進一步包含胺基酸Lys89、Arg94、Met96、Phe138、Ser141、Gly144、His145、Asp146、Gln150或Leu180中之任一或多者。
在本發明之一實施例中，該結合分子特異性結合IL-18，其中該結合分子不結合IL-18/IL-18結合蛋白同種型a或同種型c(IL-18 BPa或IL-18BPc)複合物，其中該結合分子係選自：抗體、抗體之片段、單一可變結構域抗體、雙特異性或多特異性抗體、多價抗體、雙重可變結構域抗體、免疫偶聯物、纖維連接蛋白分子、支架蛋白(adnectin)、DARPin、高親和性多聚體、親合體、抗運載蛋白、人泛素、蛋白質表位模擬物或其組合。較佳地，IL-18包含SEQ ID NO：1(人類IL-18)或SEQ ID NO：2(食蟹猴IL-18)之胺基酸37至胺基酸193。更佳地，該結合分子係抗體或其片段。
在另一實施例中，本發明之結合分子結合IL-18且不結合IL-18/IL-18結合蛋白同種型a或同種型c(IL-18 BPa或IL-18BPc)複合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其中該結合分子與參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位結合，其中該表位包含胺基酸Arg140及Glu152。在一實施例中，該表位進一步包含胺基酸Gln92、Pro93、Gly95、Pro143、Glu157或Glu177中之任一或多者，且其中該結合分子係選自：抗體、抗體之片段、單一可變結構域抗體、雙特異性或多特異性抗體、多價抗體、雙重可變結構域抗體、免疫偶聯物、纖維連接蛋白分子、支架蛋白(adnectin)、DARPin、高親和性多聚體、親合體、抗運載蛋白、人泛素、蛋白質表位模擬物或其組合。
在另一實施例中，本發明之結合分子結合IL-18且不結合IL-18/IL-18結合蛋白同種型a或同種型c(IL-18 BPa或IL-18BPc)複合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其中該結合分子與參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位結合，其中該表位包含胺基酸Arg140及Glu152，且其中該結合分子係抗體或其片段。在此實施例中，該表位可進一步包含胺基酸Gln92、Pro93、Gly95、Pro143、Glu157或Glu177中之任一或多者。
本發明之結合分子能夠抑制一或多種IL-18生物活性，例如Th1調變；Th2調變、NK-調變、嗜中性球調變、單核球-巨噬細胞譜系調變、嗜酸性球調變、B-細胞調變、細胞因子調變、趨化因子調變；黏著分子調變及細胞募集調變。在一實施例中，本發明之結合分子抑制(較佳)KG-1細胞中之IL-18依賴性干擾素γ(INF-γ)產生。在本發明之另一實施例中，在下文在實例中所定義之分析中該結合分子以10nM或更小或1nM或更小或100pM或更小之IC50抑制KG-1細胞中之IL-18依賴性干擾素γ(INF-γ)產生。
在下文在實例中所定義之分析中，本發明之特異性結合IL-18之結合分子具有10nM或更小之解離常數(KD)。在一實施例中，KD係1nM或更小。在另一實施例中，該結合分子具有100pM或更小之KD，且該結合分子係抗體或其片段。
本發明之結合分子可係結晶結合分子、較佳受控釋放結晶結合分子及/或不含載劑。在一實施例中，該結晶結合分子係抗體或其片段。在另一實施例中，該結晶結合分子具有較可溶性對應物長之活體內半衰期，並在結晶後保留其生物學功能。
本發明之結合分子亦可係包含該結合分子及IL-18之複合物之一部分。較佳地，該結合分子係與IL-18形成複合物之抗體或其片段。
最後，本發明之結合分子亦可與鼠類抗體125-2H競爭結合人類IL-18。
2)抗體
本發明之結合分子包括如下文中所闡述並如圖1及2中所顯示經分離並進行結構表徵之抗體或其片段。
2.1)人類抗體
如本文中所使用，若人類抗體或其片段之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈係自使用人類種系免疫球蛋白基因之系統獲得，則該 抗體包含為特定種系序列「之產物」或「衍生自」其之可變區或全長鏈。該等系統包括利用所關注抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠進行免疫或利用所關注抗原篩選噬菌體上所展示之人類免疫球蛋白基因文庫。為人類種系免疫球蛋白序列「之產物」或「衍生自」其之人類抗體或其片段由此可藉由以下方式來鑑別：比較該人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白之胺基酸序列並選擇序列與該人類抗體之序列最近(即最大一致性百分比)之人類種系免疫球蛋白序列。為特定人類種系免疫球蛋白序列「之產物」或「衍生自」其之人類抗體可含有與該種系序列相比歸因於(例如)天然存在之體細胞突變或定點突變之有意引入之胺基酸差異。然而，選定人類抗體之胺基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列具有至少90%一致性，並當與其他物種之種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時，其含有鑑別該人類抗體為人類之胺基酸殘基。在某些情形下，人類抗體之胺基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、或至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%一致性。通常，衍生自特定人類種系序列之人類抗體將展示不超過10個與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列之胺基酸差異。在某些情形下，該人類抗體可展示不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列之胺基酸差異。
人類抗體可藉由熟習此項技術者已知之許多方法產生。人類抗體可藉由融合瘤方法使用人類骨髓瘤或小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系製得(Kozbor,J Immunol；(1984)133：3001；Brodeur,Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications，第51頁至第63頁，Marcel Dekker公司，1987)。替代方法包括使用噬菌體文庫或轉基因小鼠，其二者利用人類可變區譜(Winter G；(1994)Annu Rev Immunol 12：433-455,Green LL,(1999)J Immunol Methods 231：11-23)。
現可利用轉基因小鼠之若干品系，其中其小鼠免疫球蛋白基因座已經人類免疫球蛋白基因區段替代(Tomizuka K,(2000)Proc Natl Acad Sci,97：722-727；Fishwild DM(1996)Nature Biotechnol 14：845-851；Mendez MJ,(1997)Nature Genetics 15：146-156)。在抗原攻擊時，該等小鼠能夠產生可選擇所關注抗體之人類抗體譜。特別值得注意的係TrimeraTM系統(Eren R等人(1988)Immunology 93：154-161)，其中將人類淋巴細胞移植至經輻照小鼠中；選定淋巴細胞分離抗體系統(SLAM，Babcook等人，Proc Natl Acad Sci(1996)93：7843-7848)，其中人類(或其他物種)之淋巴細胞有效地經歷大規模集中活體外分離抗體生成程序，接著經歷反褶積、有限稀釋及選擇程序；及XenomouseTM(Abgenix公司)。替代方法係獲得自Morphotek公司並使用MorphodomaTM技術。
噬菌體展示技術可用於產生人類抗體及其片段(McCafferty；(1990)Nature,348：552-553及Griffiths AD等人(1994)EMBO 13：3245-3260)。根據此技術，將分離抗體可變結構域基因在框架內選殖至絲狀噬菌體(例如M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，並在噬菌體粒子表面上展示(經常藉助於輔助噬菌體)為功能分離抗體片段。基於分離抗體之功能性質之選擇導致編碼呈現該等性質之分離抗體之基因之選擇。該噬菌體展示技術可用於自獲取自罹患疾病或病症之個體或或者自未經免疫人類供體之人類B細胞製得之文庫選擇抗原特異性抗體(Marks；J Mol Bio(1991)222：581-591)。若期望包含Fc結構域之完整人類分離抗體，則需要將噬菌體展示之衍生片段再選殖至包含期望恆定區之哺乳動物表現載體中並創建穩定表現細胞系。
親和力成熟之技術(Marks；Biotechnol(1992)10：779-783)可用於 提供結合親和力，其中一級人類分離抗體之親和力係藉由以下方式經改良：利用天然存在之變體依序替代H及L鏈可變區並基於經改良結合親和力選擇。現亦可利用此技術之變體(例如「表位印跡法」)(WO 93/06213；Waterhouse；Nucl Acids Res(1993)21：2265-2266)。
本文闡述本發明之各種(所列舉)實施例。應認識到，在每一實施例中所指明之特徵可與其他指明特徵組合以提供本發明之其他實施例。
實施例1：一種結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子，其中該結合分子係分離人類抗體或其片段；較佳地，分離人類單株抗體或其片段。
實施例2：根據實施例1之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段與參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位結合，其中該表位：a. 係包含於參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18之以下胺基酸內：i. 胺基酸41及42及胺基酸87至97；或ii. 胺基酸138至160；或iii. 胺基酸177至181；或iv. 胺基酸41及42、胺基酸87至97、胺基酸138至160及胺基酸177至181；或v. 胺基酸41、42、87；89；90；或vi. 胺基酸93、94；95、96；或vii. 胺基酸140；141；150；177；或viii. 胺基酸92；93；94；138；140；152；157；或ix. 胺基酸142；143；150；152；或x. 胺基酸143；144；145；177；180；或xi. 胺基酸41、42、87；89；90；93、94；95、96；140； 141；150；177；或xii. 胺基酸92；93；94；138；140；142；143；144；145；150；152；157；177；180；或xiii. 胺基酸41；42、87；89；90；92；93、94；95、96；138；140；141；142；143；144；145；150；152；157；177；180；或b. 包含至少一個、兩個、三個、四個a)中所列示之群組(i)至(xiii)中之任一者中所定義之胺基酸；或c. 包含a)中所列示之群組(iv)至(xii)中之任一者中所定義之胺基酸。
實施例3：根據實施例1之分離人類抗體或其片段，其結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之IL-18表位，其中該表位包含胺基酸Arg140及Glu152。
實施例4：根據實施例3之分離人類抗體或其片段，其中該表位進一步包含胺基酸Gln92、Pro93、Gly95、Pro143、Glu157或Glu177中之任一或多者。
實施例5：根據實施例3及4之分離人類抗體或其片段，其中該表位進一步包含胺基酸Lys89、Arg94、Met96、Phe138、Ser141、Gly144、His145、Asp146、Gln150或Leu180中之任一或多者。
實施例6：根據前述實施例中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中IL-18包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸37至胺基酸193。
實施例7：根據前述實施例中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段抑制IL-18依賴性干擾素γ(INF-γ)產生。
實施例8：根據前述實施例中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段以100pM或更小之KD結合IL-18。
實施例9：根據前述實施例中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段進一步與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例10：根據前述實施例中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例11：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：4或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例12：根據實施例11之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：4或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7 或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例13：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：9或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例14：根據實施例13之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：9或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例15：根據實施例13或14之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，其中該分離抗體或其片段包含：i. 包含SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及 ii. 包含SEQ ID NO：9或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
較佳地，此分離人類抗體係分離之完全人類抗體或其片段、更佳地分離之完全人類單株抗體或其片段。
實施例16：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：10或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例17：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：11或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例18：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H- CDR1、及含有SEQ ID NO：12或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例19：根據實施例10之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：13或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例20：根據實施例19之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：13或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2、及含有SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例21：根據實施例19或20之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，其中該分離抗體或其片段包 含：i. 包含SEQ ID NO：3或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1，及ii. 包含SEQ ID NO：13或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2，及iii. 包含SEQ ID NO：5或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3，及iv. 包含SEQ ID NO：6或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1，及v. 包含SEQ ID NO：7或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2，及vi. 包含SEQ ID NO：8或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
較佳地，此分離人類抗體係分離之完全人類抗體或其片段、更佳地分離之完全人類單株抗體或其片段。
實施例22：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例23：根據實施例22之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：75或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例24：根據實施例22之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：76或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例25：根據實施例22之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：77或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例26：根據實施例22之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：74或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：78或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：79或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：80或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：81或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：82或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例27：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18 結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：106或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：122或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：108或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：109或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：110或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：126或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例28：根據實施例27之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：106或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：107或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：108或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：109或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：110或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：111或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
較佳地，此分離人類抗體或其片段係分離之完全人類抗體或其片段、更佳地分離之完全人類單株抗體或其片段。
實施例29：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：106或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：122或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：108或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：109或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：110或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：126或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例30：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其 片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：120或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：121或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：123或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：124或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：125或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例31：根據實施例30之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：120或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：121或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：123或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：124或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：125或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：127或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例32：根據實施例30之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：120或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：121或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：123或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：124或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：125或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：128或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例33：根據實施例30之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：120或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：121或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：123或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：124或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：125或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：129或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
上文所概述之CDR區係使用Kabat系統描述(Kabat,E.A.等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)。
在本發明之一些其他實施例中，該人類抗體或其片段包含使用Chothia定義描述之CDR區(Chothia等人(1987)J Mol Biol 196：901-17)。
實施例34：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：67或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：61或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：62或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：63或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：64或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例35：根據實施例34之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：59或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：60或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：61或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有 SEQ ID NO：62或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：63或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：64或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例36：根據實施例35之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例37：根據實施例34之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：65或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：60或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：61或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：62或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：63或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：64或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例38：根據實施例37之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例39：根據實施例34之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：66或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：67或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：61或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：62或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：63或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：64或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例40：根據實施例39之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例41：根據實施例34之分離人類抗體或其片段，其中該分 離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：68或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：69或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：70或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：71或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：72或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：73或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例42：根據實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：162或其保守變體之重鏈可變區H-CDR1、及含有SEQ ID NO：163或其保守變體之重鏈可變區H-CDR2、及含有SEQ ID NO：164或其保守變體之重鏈可變區H-CDR3、及含有SEQ ID NO：165或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR1、及含有SEQ ID NO：166或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR2及含有SEQ ID NO：167或其保守變體之輕鏈可變區L-CDR3。
根據Kabat定義，如上文所論述，重鏈可變結構域(VH)中之CDR胺基酸殘基係編號為31至35(H-CDR1)、50至65(H-CDR2)及95至102(H-CDR3)；且輕鏈可變結構域(VL)中之CDR胺基酸殘基係編號為24至34(L-CDR1)、50至56(L-CDR2)及89至97(L-CDR3)。根據Chothia，VH中之CDR胺基酸係編號為26至32(H-CDR1)、52至56(H-CDR2)及95至102(H-CDR3)；且VL中之胺基酸殘基係編號為26至32(L-CDR1)、50至52(L-CDR2)及91-96(L-CDR3)。藉由組合Kabat及Chothia二者之CDR定義並考慮插入用於較長環，該等CDR係由人類VH中之胺基酸殘基26至35(H-CDR1)、50至65(H-CDR2)及95至102(H-CDR3)及人類VL中之胺基酸殘基24至34(L-CDR1)、50至56(L-CDR2)及89至97(L-CDR3)組成。
實施例43：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：14或其保守變體之重鏈可變區(VH)及含有SEQ ID NO：16或其保守變體之輕鏈可變區(VL)，且其中該重鏈可變區(VH)包含：i. 與胺基酸26至35 SEQ ID NO：14相對應之重鏈可變區H-CDR1；及ii. 與胺基酸50至66 SEQ ID NO：14相對應之重鏈可變區H-CDR2；及iii. 與胺基酸99至108 SEQ ID NO：14相對應之重鏈可變區H-CDR3；且其中該輕鏈可變區(VL)包含：iv. 與胺基酸23至35 SEQ ID NO：16相對應之輕鏈可變區L-CDR1；及v. 與胺基酸51至57 SEQ ID NO：16相對應之輕鏈可變區L-CDR2；及vi. 與胺基酸90至100 SEQ ID NO：16相對應之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例44：根據實施例43之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例45：根據實施例43或44之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺 基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例46：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含含有SEQ ID NO：18或其保守變體之重鏈可變區(VH)及含有SEQ ID NO：20或其保守變體之輕鏈可變區(VL)，且其中該重鏈可變區(VH)包含：i. 與胺基酸26至35 SEQ ID NO：18相對應之重鏈可變區H-CDR1；及ii. 與胺基酸50至66 SEQ ID NO：18相對應之重鏈可變區H-CDR2；及iii. 與胺基酸99至108 SEQ ID NO：18相對應之重鏈可變區H-CDR3；且其中該輕鏈可變區(VL)包含：iv. 與胺基酸23至35 SEQ ID NO：20相對應之輕鏈可變區L-CDR1；及v. 與胺基酸51至57 SEQ ID NO：20相對應之輕鏈可變區L-CDR2；及vi. 與胺基酸90至100 SEQ ID NO：20相對應之輕鏈可變區L-CDR3。
實施例47：根據實施例46之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭 結合IL-18。
實施例48：根據實施例46或47之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位。
考慮到該等人類抗體中之每一者可結合至IL18且抗原結合特異性主要係由CDR1、2及3區提供，可將H-CDR1、2及3序列及L-CDR1、2及3序列「混合」並「匹配」(即可將來自不同人類抗體之CDR混合並匹配，含有H-CDR1、2及3集及L-CDR1、2及3集之每一抗體創建本發明之其他抗IL18結合分子。該等「經混合並匹配」抗體之IL18結合可使用實例中之結合分析(例如ELISA)測試。當將VH CDR序列混合並匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列替代。同樣，當將VL CDR序列混合並匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列替代。熟習此項技術者將易知，新穎VH及VL序列可藉由用來自本文針對本發明人類抗體所顯示之CDR序列之結構上類似之序列取代一或多種VH及/或VL CDR區序列來創建(圖1及2)。
在另一態樣中，本發明提供分離人類抗體，其結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：14、18、22、25、28、31、34、37、40、83、87、90、93、112、130及138中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16、20、85、114、132、140、147及153中所顯示之序列之VL胺基酸序列。本發明之其他抗體包括已藉由胺基酸缺失、插入或取代突變、但在CDR區中與上文所闡述序列中所繪示之CDR區仍具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性之胺基酸。在一些實施例中，其包括突變體胺基酸序列，其中當與上文所闡述序列中所繪示之CDR區相比時，在 CDR區中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸已藉由胺基酸缺失、插入或取代來突變。
實施例49：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：28或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例50：分離人類抗體或其片段根據實施例49，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：28或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中SEQ ID NO：28之30-位置之胺基酸天冬醯胺(Asn；N)係經選自離胺酸(Lys；K)或絲胺酸(Ser；S)或蘇胺酸(Thr；T)或丙胺酸(Ala；A)或麩胺酸(Glu；E)或組胺酸(His；H)或白胺酸(Leu；L)或麩醯胺酸(Gln；Q)或精胺酸(Arg；R)或纈胺酸(Val；V)或酪胺酸(Tyr；Y)或異白胺酸(Ile；I)或甘胺酸(Gly；G)之胺基酸替代。
實施例51：根據實施例49或50之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例52：根據實施例49至51中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、 Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例53：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：14或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例54：根據實施例53之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例55：根據實施例53至55中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例56：分離人類抗體或其片段根據實施例53，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：14或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16或其保守變體中所 顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中SEQ ID NO：14之30-位置之胺基酸離胺酸(Lys；K)係經選自天冬醯胺(Asn；N)或絲胺酸(Ser；S)或蘇胺酸(Thr；T)或丙胺酸(Ala；A)或麩胺酸(Glu；E)或組胺酸(His；H)或白胺酸(Leu；L)或麩醯胺酸(Gln；Q)或精胺酸(Arg；R)或纈胺酸(Val；V)或酪胺酸(Tyr；Y)或異白胺酸(Ile；I)或甘胺酸(Gly；G)之胺基酸替代。
實施例57：根據實施例56之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例58：根據實施例55或57中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例59：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：18或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例60：根據實施例59之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例61：根據實施例59或60中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例62：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：40或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例63：根據實施例62之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：40或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中i. SEQ ID NO：40之1位之胺基酸麩胺酸(Glu；E)係經胺基酸麩醯胺酸(Gln；Q)替代，且ii. 其中SEQ ID NO：40之30-位置之胺基酸天冬醯胺(Asn；N)係經選自絲胺酸(Ser；S)或蘇胺酸(Thr；T)或天冬胺酸(Asp；D)之胺基酸替代。
實施例64：根據實施例63之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：40或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中i. SEQ ID NO：40之1位之胺基酸麩胺酸(Glu；E)係經胺基酸麩醯胺酸(Gln；Q)替代；且ii. 其中SEQ ID NO：40之30-位置之胺基酸天冬醯胺(Asn；N)係經選自絲胺酸(Ser；S)或蘇胺酸(Thr；T)或天冬胺酸(Asp；D)之胺基酸替代；且iii. 其中SEQ ID NO：40之54位之胺基酸甲硫胺酸(Met；M)係經選自酪胺酸(Tyr；Y)或天冬醯胺(Asn；N)或異白胺酸(Ile；I)之胺基酸替代。
實施例65：根據實施例62至64之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例66：根據實施例65至66中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例67：根據實施例62之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：40或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中i. SEQ ID NO：40之1位之胺基酸麩胺酸(Glu；E)係經胺基酸麩醯胺酸(Gln；Q)替代，且ii. 其中SEQ ID NO：40之31位之胺基酸絲胺酸(Ser；S)係經選自蘇胺酸(Thr；T)或天冬醯胺(Asn；N)或丙胺酸(Ala；A)之胺基酸替代。
實施例68：根據實施例67之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：40或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中
i. SEQ ID NO：40之1位之胺基酸麩胺酸(Glu；E)係經胺基酸麩醯胺酸(Gln；Q)替代；且
ii. 其中SEQ ID NO：40之31位之胺基酸絲胺酸(Ser；S)係經選自蘇胺酸(Thr；T)或天冬醯胺(Asn；N)或丙胺酸(Ala；A)之胺基酸替代。
iii. 其中SEQ ID NO：40之54位之胺基酸甲硫胺酸(Met；M)係經選自酪胺酸(Tyr；Y)或天冬醯胺(Asn；N)或異白胺酸(Ile；I)之胺基酸替代。
實施例69：根據實施例67或68之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例70：根據實施例67至69中任一實施例之分離人類抗體或 其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例72：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34或其保守變體中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：16或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例73：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：37中所顯示之序列之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及選自SEQ ID NO：20或其保守變體中所顯示之序列之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
實施例74：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：43、47、50、53、56、96、100、103、116、134、142及158或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列；及選自SEQ ID NO：45、98、118、136、144、150、156及160或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例75：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片 段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：43或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：45或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例76：根據實施例75之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例77：根據實施例75或76中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例78：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：158或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：160或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例79：根據實施例78之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例80：根據實施例78或79中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例81：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：56或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：45或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例82：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：100或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：160或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例83：根據實施例81或82之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且其中該分離人類抗體或其片段與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例84：根據實施例81至83中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且彼抗體或其片段結合至參照SEQ ID NO：1所定義之IL-18上之包含Arg140及Glu152之表位，視情況該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177或Leu180中之任一或多者，較佳地該表位進一步包含胺基酸Lys89、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Phe138、Ser141、Pro143、Gly144、Glu157、Glu177及Leu180。
實施例85：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：103或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：98或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例86：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：116或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：118或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例87：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：142或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：144或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸序列。
實施例88：實施例1至9中任一實施例之分離人類抗體或其片段，其中該分離人類抗體或其片段結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，且包含選自SEQ ID NO：134或其保守變體中所顯示之序列之VH胺基酸序列及選自SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：150或SEQ ID NO：156或其保守變體中所顯示之序列之VL胺基酸 序列。
2.2)人類化或嵌合抗體
本文中所揭示之本發明明顯替代係使用人類化或嵌合抗體代替人類抗體。
使用完整的非人類抗體來治療人類疾病或病症伴隨著出現現已充分確定之免疫原性問題之可能。亦即，患者之免疫系統可識別非人類完整分離抗體為非自我的並增加抗體反應。在向人類患者多次投與非人類分離抗體時此尤其明顯。多年來已研發各種技術來克服該等問題，且該等技術通常涉及減少完整分離抗體之非人類免疫原性特徵，而保留自經免疫動物(例如小鼠、大鼠或兔)獲得非人類抗體之相對容易性。廣義上，兩種方法已用於達成此。第一個方法係嵌合(chimeric，有時「chimaeric」)抗體，其通常包含融合至人類恆定區之非人類(例如齧齒動物，例如小鼠)可變結構域。由於分離抗體之抗原結合位點係定位於可變區內，故嵌合分離抗體保留其對抗原之結合親和力，但獲取人類恆定區之效應子功能，且從而能夠實施效應子功能，例如上文所闡述。嵌合抗體通常係使用重組DNA方法產生。分離編碼該等抗體之DNA(例如cDNA)，並使用習用程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼本發明分離抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)對其測序。融合瘤細胞用作該DNA之經典來源。在分離後，將DNA置於表現載體中，然後將其轉染至不另外產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以合成分離抗體。DNA可藉由將人類L及H鏈之編碼序列取代為相應非人類(例如鼠類)H及L恆定區來修飾(Morrison；PNAS 81,6851(1984))。
第二個方法涉及人類化抗體之生成，其中分離抗體之非人類含量係藉由使可變區人類化來降低。用於人類化之兩種技術已得到普 及。第一種係藉由CDR移植之人類化。CDR在靠近分離抗體之N-端處構建環，在N-端處其形成安裝於框架區所提供之骨架中之表面。分離抗體之抗原結合特異性主要係藉由形貌及藉由其CDR表面之化學特性來界定。該等特徵進而係由個別CDR之構象、由CDR之相對佈置及由包含CDR之殘基側鏈之性質及佈置決定。免疫原性之較大降低可藉由僅將非人類(例如鼠類)抗體(「供體」抗體)之CDR移植至人類框架(「受體框架」)及恆定區上來達成(Jones等人(1986)Nature 321：522-525及Verhoeyen M等人(1988)Science 239：1534-1536)。然而，CDR移植本身可不會導致抗原結合性質之完全保留，且時常發現若欲恢復顯著抗原結合親和力，則供體分離抗體之一些框架殘基(有時稱為‘回復突變’)需要保存於人類化化合物中(Queen C等人(1989)Proc Natl Acad Sci 86：10029-10033；Co,M等人(1991)Nature 351,501-502)。在此情形下，與非人類供體分離抗體顯示最大序列同源性之人類可變區係選自數據庫以提供人類框架(FR)。人類FR之選擇可自人類共有或個別人類抗體進行。若需要，則將來自供體分離抗體之關鍵殘基取代至人類受體框架中以保存CDR構象。分離抗體之電腦模型化可用於幫助鑑別該等結構上重要之殘基。
或者，人類化可係藉由「面飾」之製程達成。獨特人類及鼠類免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之統計學分析揭露，經暴露殘基之精確模式在人類及鼠類抗體中係不同的，且大部分個別表面位置對少量不同殘基具有強烈偏好(Padlan EA等人；(1991)Mol Immunol 28：489-498及Pedersen JT等人(1994)J Mol Biol 235：959-973)。因此，可藉由替代其與人類抗體中所經常發現之彼等不同之框架區中之經暴露殘基來降低非人類Fv之免疫原性。由於蛋白質抗原性可與表面可接觸性相關，但表面殘基之替代可足以使得小鼠可變區對於人類免疫系統「可見」(亦Mark GE等人(1994)，Handbook of Experimental Pharmacology第113卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies,Springer-Verlag，第105頁至第134頁)。此人類化程序係稱為「面飾(veneering)」，此乃因僅改變分離抗體之表面，而支撐殘基保持未受干擾。
2.3)分離抗體片段及單一可變結構域抗體
在本發明之另一實施例中，該結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體片段或單一可變結構域抗體。較佳地，該結合分子係Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb或VHH。
傳統上，該等片段係藉由完整抗體經(例如)木瓜酶消化之蛋白水解消化產生(例如參見WO 94/29348)，但亦可直接自經重組轉化之宿主細胞產生。另外，分離抗體片段可使用下文所闡述之各種改造技術產生。
Fv片段之兩個鏈似乎具有較Fab片段低之相互作用能量。為穩定VH與VL結構域之締合，其已利用肽(Bird等人(1988)Science,242：423-426；Huston等人(1998)PNAS,85：5879-5883)、雙硫橋(Glockshuber等人(1990)Biochemistry,29：1362-1367)及「凸起於孔洞中(knob in hole)」突變(Zhu等人(1997),Protein Sci,6：781-788)連接。ScFv片段可藉由熟習此項技術者熟知之方法產生(Whitlow等人(1991),Methods companion Methods Enzymol,2：97-105及Huston等人(1993)Int Rev Immunol 10：195-217)。ScFv可在細菌細胞(例如大腸桿菌)中產生，但更佳在真核細胞中產生。scFv之一缺點在於該產物之單價性，其阻礙歸因於多價結合及其較短半衰期之增加之親合力。克服該等問題之努力包括自含有其他C端半胱胺酸之scFv藉由化學偶合(Adams等人(1993)Can Res 53：4026-4034及McCartney等人(1995)Protein Eng,8：301-314)或藉由含有非成對C端半胱胺酸殘基之scFv之自發位點特異 性二聚合(Kipriyanov等人(1995)Cell.Biophys 26：187-204)產生之二價(scFv’)2。或者，可藉由將肽連接體縮短至3個及12個殘基以形成「雙體抗體」來迫使scFv形成多聚體(Holliger等人PNAS(1993),90：6444-6448)。更進一步減小連接體可產生scFv三聚體(「三體抗體」，參見Kortt等人(1997)Protein Eng,10：423-433)及四聚體(「四體抗體」，Le Gall等人(1999)FEBS Lett,453：164-168)。二價scFv化合物之構築亦可藉由與蛋白質二聚合模體遺傳融合以形成「微抗體(miniantibodies)」(Pack等人(1992)Biochemistry 31：1579-1584)及「微小抗體(minibodies)」(Hu等人(1996),Cancer Res.56：3055-3061)來達成。ScFv-sc-Fv串聯((scFv)2)亦可藉由第三肽連接體連接兩個scFv單元來產生(參見Kurucz等人(1995)J Immunol,154：4576-4582)。雙特異性雙體抗體可藉助兩個單鏈融合產物的非共價締合產生，該兩個單鏈融合產物由藉由短連接體聯結至另一分離抗體之VL結構域之來自一分離抗體之VH結構域組成(參見Kipriyanov等人(1998),Int J Can 77：763-772)。該等雙特異性雙體抗體之穩定性可藉由引入雙硫橋或上文所闡述之「凸起於孔洞中」突變或藉由形成單鏈雙體抗體(ScDb)來增強，其中兩個雜合scFv片段係藉助肽連接體聯結(參見Kontermann等人(1999)J Immunol Methods 226：179-188)。四價雙特異性化合物可藉由(例如)藉助鉸鏈區將scFv片段融合至IgG化合物之CH3結構域或融合至Fab片段來獲得(參見Coloma等人(1997)Nature Biotechnol,15：159-163)。或者，四價雙特異性化合物已藉由融合雙特異性單鏈雙體抗體來創建(參見Alt等人(1999)FEBS Lett 454：90-94)。較小四價雙特異性化合物亦可藉由scFv-scFv串聯與含有螺旋-環-螺旋模體之連接體(DiBi微抗體，參見Muller等人(1998)FEBS Lett 432：45-49)或包含四個呈防止分子內配對之定向之分離抗體可變結構域(VH及VL)之單鏈化合物(串聯雙體抗體，參見Kipriyanov等人(1999)J Mol Biol 293：41- 56)之二聚合來形成。雙特異性F(ab’)2片段可藉由Fab’片段之化學偶合或藉由藉助白胺酸拉鏈之異源二聚合來創建(參見Shalaby等人(1992)J Exp Med 175：217-225及Kostelny等人(1992),J Immunol 148：1547-1553)。
術語「單一可變結構域抗體」係指獨立於不同V區或結構域特異性結合抗原或表位之抗體可變結構域(VH、VHH、VL)。單一可變結構域抗體可呈具有其他不同可變區或可變結構域之格式(例如同源多聚物或異源多聚物)，其中該單一可變結構域結合抗原時不需要該等其他區或結構域(即其中該單一結構域抗體獨立於其他可變結構域結合抗原)。「結構域抗體」或「dAb」與本文中所使用之術語能結合至抗原之「單一可變結構域抗體」相同。單一可變結構域抗體可為人類抗體可變結構域，但亦包括來自其它物種之單一抗體可變結構域，例如齧齒動物(例如，如WO 00/29004中所揭示)、鉸口鯊及駱駝科(Camelid)VHH dAb。駱駝科VHH係源自包括駱駝、駱馬、羊駝、單峰駱駝及原駝之物種的單一可變結構域多肽，其產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體。可根據業內可利用之標準技術對該等VHH結構域進行人類化，且仍可將該等結構域視為本發明之「結構域抗體」。本文中所使用之「VH」包括駱駝科VHH結構域。
2.4)同源抗體或其片段及保守變體
在本發明之另一實施例中，該結合分子係抗體或其片段，該抗體或其片段具有可變區重鏈及輕鏈胺基酸序列或與本文中所闡述抗體之胺基酸序列同源之重鏈及輕鏈胺基酸序列，且其中該等同源抗體或其片段保留本發明之結合分子之期望功能性質。
例如，本發明提供包含VH及VL之分離抗體或其片段，其中：VH與選自由SEQ ID NO：14；18；22；25；28；31；34；37；40；83；87；90；93；112；130或138組成之群之胺基酸序列具有至少 80%或至少90%一致性；VL與選自由SEQ ID NO：16；20；85；114；132；140；147或153組成之群之胺基酸序列具有至少80%或至少90%一致性，其中該同源抗體特異性結合至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物。該同源抗體可呈現至少一種其他功能性質，例如抑制IL18結合至IL18R或抑制IL18依賴性IFN-γ產生。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與上文所闡釋之序列具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可係一致的，不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸位置之胺基酸取代除外。具有與分別SEQ ID NO 14；18；22；25；28；31；34；37；40；83；87；90；93；112；130或138及SEQ ID NO 16；20；85；114；132；140；147或153之VH及VL區具有高(即80%或更大)一致性之VH及VL區之抗體可藉由以下方式來獲得：分別編碼SEQ ID NO：15；19；23；26；29；32；35；38；41；84；88；91；94；113；131；139；146或152及17；21；24；27；30；33；36；39；42；86；89；92；95；115；133；141；148或154之核酸分子之誘變(例如定點或PCR介導之誘變)、接著使用上文所闡述之功能分析測試所編碼之經改變抗體之保留功能(即上文所闡釋之功能)。
該同源抗體可係(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。較佳地，該抗體係完全人類沉默IgG1抗體。
如本文中所使用，兩個序列間之一致性百分比隨該等序列所共享之一致位置數而變化(即，%一致性=一致位置數/位置總數×100)，其中考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之間隔數及每一間隔之長度。序列之比較及兩個序列間之一致性百分比之測定可使用數學演算法來實現，如下文所闡述。
兩個胺基酸序列間之一致性百分比可使用E.Meyers及W.Miller, (1988)Comput.Appl.Biosci 4：11-17之演算法並使用PAM120權重殘基表、12之間隔長度罰分及4之間隔罰分來測定，該演算法已納入ALIGN程式(2.0版)中。或者，兩個胺基酸序列間之一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(1970)J Mol Biol 48：444-453演算法並使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4之間隔權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定，該演算法已納入GCG軟體包(可於http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式中。
2.5)雙重可變結構域抗體
雙重可變結構域(DVD)抗體包含兩個或更多個抗原結合位點，且為四價或多價抗體，例如二價及四價。特定而言，該多價抗體係經改造以具有兩個或更多個抗原結合位點，且通常並非天然存在之抗體。該等DVD抗體可能夠結合兩個或更多個相關或不相關標靶。該等DVD抗體可具有單特異性(即，能夠結合一種抗原)或多特異性(即，能夠結合兩種或更多種抗原)。在一些實施例中，該DVD抗體包含兩個重鏈及兩個輕鏈。每一重鏈及輕鏈包含兩個抗原結合位點。每一結合位點包含重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，每個抗原結合位點具有總共6個參與抗原結合之CDR。
在一實施例中，本發明之結合分子係結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之雙重可變結構域(DVD)抗體。
特定而言，本發明之雙重可變結構域抗體能夠結合IL-18及第二標靶。該第二標靶可係選自IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-25、IL-33、IL-1β、TNF α/β及IFN-γ。
2.6)雙特異性及多特異性分子及抗體
在一實施例中，本發明之結合分子係包含對IL-18之第一特異性及對另一多肽(例如IL-12)之第二特異性之分離雙特異性抗體或其片段；其中該雙特異性抗體不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合 物。
特定而言，本發明之雙特異性抗體能夠結合IL-18及第二標靶。該第二標靶可係選自IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-25、IL-33、IL-1β、TNF α/β及IFN-γ。
在又一態樣中，本發明提供結合分子，該結合分子係包含對IL-18之第一特異性、對另一多肽(例如IL-12)之第二特異性及對另一多肽之至少第三特異性之分離多特異性抗體或其片段，其中該多特異性抗體不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物。
特定而言，本發明之多特異性抗體能夠結合IL-18、第二及第三標靶。該等第二及第三標靶可係選自IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-25、IL-33、IL-1β、TNF α/β及IFN-γ。
雙特異性分離抗體係對至少兩個不同表位具有結合特異性之分離抗體。製造該等抗體之方法為業內所已知。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白H鏈-L鏈對之共表現，其中該兩個H鏈具有不同結合特異性(參見Millstein等人(1983)Nature 305：537-539、WO93/08829及Traunecker等人(1991)EMBO 10：3655-3659)。由於H及L鏈之隨機分配，產生十種不同分離抗體結構之可能混合物，其中僅一者具有期望結合特異性。替代方法涉及將具有期望結合特異性之可變結構域融合至包含鉸鏈區之至少一部分、CH2及CH3區之重鏈恆定區。較佳使至少一個融合物中存在含有輕鏈結合所需位點之CH1區。將編碼該等融合物之DNA及(若需要)L鏈插入分開表現載體中，且然後共轉染至適宜宿主有機體中。但可將兩個或所有三個鏈之編碼序列插入一表現載體中。在一較佳方法中，該雙特異性分離抗體係由在一臂中具有第一結合特異性之H鏈及在另一臂中提供第二結合特異性之H-L鏈對構成，參見WO94/04690。亦參見Suresh等人，Methods in Enzymology 121,210,1986。
本發明之雙特異性及多特異性抗體可衍生或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體配體))，以生成結合至至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。事實上，本發明之抗體可衍生或連接至一個以上其他功能分子，以生成結合至兩個以上不同結合位點及/或標靶分子之多特異性分子；該等多特異性分子亦意欲涵蓋於本文中所使用之術語「雙特異性分子」中。為創建本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可功能連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)至一或多種其他結合分子(例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，以使得產生雙特異性分子。
在一實施例中，本發明之雙特異性分子以結合特異性包含至少一種抗體或其抗體片段，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。該抗體亦可係輕鏈或重鏈二聚體或其任一最小片段，例如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人，美國專利第4,946,778號中所闡述。
可用於本發明之雙特異性分子之其他抗體係鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性及多特異性分子可藉由使用業內已知方法偶聯組成結合特異性來製備。例如，雙特異性分子之每一結合特異性可分開生成且然後彼此偶聯。當該等結合特異性係蛋白質或肽時，各種偶合或交叉連接劑可用於共價偶聯。交叉連接劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、S-乙醯基-硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SATA)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-伸苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)(例如參見Karpovsky等人(1984)J Exp Med；160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc Natl Acad Sci USA；82：8648)。其他方法包括Paulus(1985) Behring Inst Mitt；78：118-132；Brennan等人(1985)Science；229：81-83)及Glennie等人(1987)J Immunol；139：2367-2375中所闡述之彼等。偶聯劑係SATA及磺基-SMCC，二者皆購自Pierce Chemical公司(Rockford,IL)。
當該等結合特異性係抗體時，其可藉由兩個重鏈之C-端鉸鏈區之巰基鍵結偶聯。在特定實施例中，該鉸鏈區係經修飾以在偶聯前含有奇數個巰基(例如一個)。
或者，兩種結合特異性可在相同載體中編碼，並在相同宿主細胞中表現並組裝。若該雙特異性分子係mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配體×Fab融合蛋白質，則此方法特別有用。本發明之雙特異性分子可係包含一個單鏈抗體及結合決定簇之單鏈分子或包含兩個結合決定簇之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法係闡述於(例如)美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由(例如)酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來證實。該等分析中之每一者通常藉由採用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來檢測特別關注之蛋白質-抗體複合物之存在。
2.7)多價抗體
在另一態樣中，本發明提供多價抗體，該等多價抗體包含至少兩個相同或不同之本發明抗體之抗原結合部分，該等本發明抗體結合至IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物。
在一實施例中，該多價抗體提供至少兩個、三個或四個本文所闡述抗體之抗原結合部分。該等抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價連接來連接在一起。或者，已針對雙特異性分子闡述連接方法。四價化合物可藉由(例如)使本發明抗體與結合至本發明抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體交叉連接來獲得。
2.8)免疫偶聯物
在另一實施例中，本發明之結合分子係結合至IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或其片段，其中該抗體或其片段係偶聯至治療性部分，例如細胞毒素、藥物(例如免疫阻抑劑)或放射性毒素。
該等偶聯物在本文中係稱為「免疫偶聯物」。包括一或多種細胞毒素之免疫偶聯物係稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對(例如殺死)細胞有害之任一藥劑。實例包括紫杉醇、細胞遲緩素B、短桿菌素D、溴乙啶、吐根素、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙素(t.colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括(例如)抗代謝物質(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、切除劑(例如二氯甲基二乙胺、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法蘭(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環磷醯胺、白消安 (busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑(cisplatin))、蒽環抗生素(例如柔紅黴素(先前之道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin)(先前之放線菌素D(actinomycin D))、博萊黴素(bleomycin)、光輝黴素及安麯黴素(anthramycin，AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春花鹼)。
可偶聯至本發明抗體之治療性細胞毒素之其他實例包括多卡米星(duocarmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、美坦辛(maytansine)及奧裏斯他汀(auristatin)及其衍生物。卡奇黴素抗體偶聯物之實例市面有售(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
細胞毒素可使用業內可利用之連接體技術偶聯至本發明抗體。已用於將細胞毒素偶聯至抗體之連接體類型之實例包括(但不限於)含有腙、硫醚、酯、二硫化物及肽之連接體。可選自(例如)易於由溶酶體隔室內之低pH裂解或易於由蛋白酶(例如腫瘤組織中優先表現之蛋白酶，例如組織自溶酶(例如組織自溶酶B、C、D))裂解之連接體。
對於用於將治療劑偶聯至抗體之細胞毒素類型、連接體及方法之進一步論述，亦參見Saito,G等人(2003)Adv Drug Deliv Rev；55：199-215；Trail,PA等人(2003)Cancer Immunol Immunother；52：328-337；Payne,G(2003)Cancer Cell；3：207-212；Allen,TM(2002)NatRev Cancer；2：750-763；Pastan,I及Kreitman,R J(2002)Curr Opin Investig Drugs；3：1089-1091；Senter,PD及Springer,CJ(2001)Adv Drug Deliv Rev；53：247-264。
本發明之抗體亦可偶聯至放射性同位素，以生成細胞毒性放射性醫藥，亦稱為放射性免疫偶聯物。可偶聯至抗體以在診斷上或在治療上使用之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘131、銦111、釔90及鑥177。業內已確定製備放射性免疫偶聯物之方法。放射性免疫偶 聯物之實例市面有售，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)及BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，且可使用本發明抗體使用類似方法製備放射性免疫偶聯物。
本發明之抗體偶聯物可用於修飾所給生物學反應，且藥物部分不應理解為限於經典化學治療劑。例如，藥物部分可係具有期望生物活性之蛋白質或多肽。該等蛋白質可包括(例如)酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素或白喉毒素；或生長因子。
用於將治療性部分偶聯至抗體之技術已眾所周知，例如參見Amon等人「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(編輯)，第243頁至第56頁(Alan R.Liss公司1985)；Hellstrom等人「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623頁至第53頁(Marcel Dekker公司1987)；Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies’84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編輯)，第475頁第至506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編輯)，第303頁至第16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,(1982)Immunol Rev；62：119-58。
2.9)異源偶聯物抗體
異源偶聯物抗體亦形成本發明之實施。異源偶聯物抗體係由兩個使用任何便利交叉連接方法形成之共價鏈接抗體構成，其中至少一 個鏈接抗體係本發明之結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體。例如參見US 4,676,980。
2.10)框架改造
本發明之經改造抗體包括已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以(例如)改良抗體之性質之彼等。通常，進行該等框架修飾以降低抗體之免疫原性。例如，一方法係使一或多種框架殘基「回復突變」至相應種系序列。更具體而言，已經受體細胞突變之抗體可含有與衍生該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變或PCR介導之誘變使體細胞突變「回復突變」至種系序列。該等「經回復突變」抗體亦意欲涵蓋於本發明內。
另一類型之框架修飾涉及使一或多個於框架區內或甚至於一或多個CDR區內之殘基突變，以去除T細胞-表位，從而降低該抗體之可能免疫原性。此方法亦稱為「去免疫化」，且更詳細地闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號。
2.11)其他修飾
除框架或CDR區內進行之修飾以外或替代其，本發明之抗體可經改造以包括於Fc區內之修飾，通常以改變該抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體結合(fixation)、Fc受體結合(binding)及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其糖基化，以再次改變該抗體之一或多個功能性質。該等實施例中之每一者係更詳細地闡述於下文中。Fc區中之殘基之編號係根據Kabat之EU索引之編號。
在一實施例中，CH1之鉸鏈區係經修飾，以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法係進一步闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數 係經改變，以(例如)促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低該抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區係經突變，以縮短該抗體之生物學半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中，以使得相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合，該抗體具有受損葡萄球菌蛋白質A(SpA)結合。此方法係更詳細地闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，該抗體係經修飾以延長其生物學半衰期。各種方法皆可。例如，可引入一或多個以下突變：T252L、T254S、T256F，如Ward之美國專利第6,277,375號中所闡述。或者，為延長生物學半衰期，該抗體可於CH1或CL區內經改變，以含有自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環獲得之補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述。
在又其他實施例中，Fc區係藉由用不同胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變，以改變該抗體之效應子功能。例如，一或多種胺基酸可經不同胺基酸殘基替代，以使得該抗體對效應子配體具有經改變親和力，但保留親代抗體之抗原結合能力。親和力經改變之效應子配體可係(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方法係更詳細地闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基替代，以使得該抗體具有經改變之Clq結合及/或經降低或廢除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法係更詳細地闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基係經改變，以從而改變該抗體結合補體之能力。此方法係進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一實施例中，Fc區係經修飾，以增加該抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或以藉由修飾一或多個胺基酸來增加該抗體對Fcγ受體之親和力。此方法係進一步闡述於Presta之PCT公開案WO 00/42072。此外，已對人類IgG1上針對FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點進行定位，且已闡述具有經改良結合之變體(參見Shields,R.L.等人(2001)J Biol Chem 276：6591-6604)。
在某些實施例中，使用IgG1同種型之Fc結構域。在一些具體實施例中，使用IgG1 Fc片段之突變體變體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或結合至Fcγ受體之能力之沉默IgG1 Fc。其中胺基酸234-位置及235-位置之白胺酸殘基被丙胺酸殘基替代之IgG1同種型沉默突變體之實例係如Hezareh等人J.Virol(2001)；75(24)：12161-8所闡述。
在某些實施例中，Fc結構域係防止Fc結構域之297-位置之糖基化之突變體。例如，Fc結構域含有297-位置處天冬醯胺殘基之胺基酸取代。該胺基酸取代之實例係N297經甘胺酸或丙胺酸之替代。
在再一實施例中，抗體之糖基化係經修飾。例如，可製造無糖基化之抗體(即該抗體缺乏糖基化)。糖基化可經改變，以(例如)增加抗體對抗原之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來實現。例如，可進行一或多個可消除一或多個可變區框架糖基化位點、從而消除彼位點處之糖基化之胺基酸取代。此一糖基化可增加抗體對抗原之親和力。此一方法係更詳細地闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或或者，可製造具有經改變之糖基化類型之抗體，例如具有減少量之岩藻糖基殘基之經低岩藻糖基化之抗體或具有增加之二等分型GlcNac結構之抗體。已證實該經改變糖基化模式增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)於具有經改變之糖基 化機制之宿主細胞中表現抗體來實現。業內已闡述具有經改變之糖基化機制之細胞，且其可用作其中表現本發明之重組抗體以從而產生具有經改變之糖基化之抗體的宿主細胞。例如，Hang等人之EP 1,176,195闡述具有功能上受到破壞之FUT8基因之細胞系，其編碼岩藻糖基轉移酶，以使得此一細胞系中所表現之抗體呈現低岩藻糖基化。因此，在一實施例中，本發明之抗體係藉由於呈現低岩藻糖基化模式之細胞系(例如編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因之缺陷表現之哺乳動物細胞系)中之重組表現來產生。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述變體CHO細胞系Lecl3細胞，其具有減少之將岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力，亦導致彼宿主細胞中所表現之抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述如以下細胞系：其經改造以表現修飾糖蛋白之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))，以使得經改造細胞系中所表現之抗體呈現增加之二等分型GlcNac結構，此導致該等抗體之增加之ADCC活性(亦參見Umana等人1999 Nat.Biotech.17：176-180)。或者，本發明之抗體可於產生針對哺乳動物樣糖基化模式經改造且能夠產生缺乏岩藻糖作為糖基化模式之抗體之酵母或絲狀真菌中(例如參見EP1297172B1)。
本文中抗體之涵蓋於本發明內之另一修飾係聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化，以(例如)延長彼抗體之生物學(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常在一或多個PEG基團變得附接至抗體或抗體片段之條件下，使該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。本文中所使用之術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG之 任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，欲經聚乙二醇化之抗體係無糖基化之抗體。使蛋白質聚乙二醇化之方法為業內已知，且可應用於本發明之抗體。例如參見Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
抗體之涵蓋於本發明內之另一修飾係本發明抗體之至少抗原結合區與血清蛋白質(例如人類血清白蛋白或其片段)之偶聯物或蛋白質融合，以延長所得分子之半衰期。該方法係闡述於(例如)Ballance等人EP0322094中。
3. 將抗原結合結構域移植至替代框架或骨架中
可採用各種各樣抗體/免疫球蛋白框架或骨架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合區且其中該結合分子並非IL-18BP即可。該等框架或骨架包括人類免疫球蛋白或其片段之5種主要個體基因型(例如本文中其他地方所揭示之彼等)，且包括其他動物物種之免疫球蛋白、較佳具有人類化態樣。就此而言，單一重鏈抗體(例如駱駝科中所鑑別之彼等)特別值得關注。熟習此項技術者繼續發現並研發新穎框架、骨架及片段。
3.1)非免疫球蛋白框架
可採用已知或未來之非免疫球蛋白框架及骨架，只要其包含對IL-18具有特異性但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合區且其中該結合分子並非IL-18BP即可。該等化合物在本文中係稱為「包含標靶特異性結合區之多肽」。已知非免疫球蛋白框架或骨架包括(但不限於)支架蛋白(adnectin)(Adnectins®-Compound Therapeutics公司，Waltham，MA)、DARPin、高親和性多聚體、親合體®(Affibody AG，瑞典(Sweden))、抗運載蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，德國(Germany))、人泛素®(γ-水晶體蛋白或泛素；Scil Proteins GmbH，Halle，德國)及蛋白質表位模擬物(PEM；Polyphor®有限公司，Allschwil，瑞士(Switzerland))。
3.2)纖維連接蛋白分子及支架蛋白(adnectin)
在本發明之一態樣中，該結合分子係纖維連接蛋白分子。該纖維連接蛋白分子具有較佳基於纖維連接蛋白III型結構域(例如纖維連接蛋白III型之第十模組(10 Fn3結構域))之骨架。在一實施例中，該結合分子係支架蛋白(adnectin)(Adnectins®)。
該纖維連接蛋白III型結構域具有7個或8個分佈於兩個β片之間之β鏈，該等β鏈自身彼此包裹以形成蛋白質之核心，且該結構域進一步含有將β鏈彼此聯結並係溶劑暴露之環(類似於CDR)。在β片夾心結構之每一邊緣處存在至少三個該等環，其中該邊緣係蛋白質之垂直於β鏈之方向之邊界(US 6,818,418)。
該等基於纖維連接蛋白之骨架並非免疫球蛋白，但整體摺疊與最小功能抗體片段(即重鏈之可變區，其包含駱駝及駱馬IgG中之整個抗原識別單元)之摺疊緊密相關。由於此結構，該非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力方面與抗體類似之抗原結合性質。該等骨架可用於與抗體之活體內親和力成熟過程類似之活體外環隨機化及改組策略。該等基於纖維連接蛋白之分子可用作骨架，在骨架中該分子之環區可使用標準選殖技術經本發明之CDR替代。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之纖維連接蛋白分子。
在另一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之支架蛋白(adnectin)。
3.3)DARPin
該技術係基於使用以錨蛋白衍生之重複模組作為骨架之蛋白質攜帶可用於結合至不同標靶之可變區。該錨蛋白重複模組係由兩個抗平行α-螺旋組成之33胺基酸多肽，且可變區之β-轉角結合主要係藉由使用核糖體展示經最佳化。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之錨蛋白/DARPin。
3.4)高親和性多聚體
高親和性多聚體係衍生自含有天然A-結構域之蛋白質，例如LRP-1。該等結構域天生係用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中超過250種蛋白質在結構上係基於A-結構域。高親和性多聚體係由許多經由胺基酸連接體連接之不同「A-結構域」單體(2-10)組成。可使用於(例如)US20040175756；US20050053973；US20050048512；及US20060008844中所闡述之方法創建結合至標靶抗原之高親和性多聚體。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之高親和性多聚體。
3.5)親合體®
親合體®係較小簡單蛋白質，其由基於蛋白質A之一IgG結合結構域之骨架之3螺旋束構成。蛋白質A係來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之表面蛋白質。此骨架結構域係由58個胺基酸組成，其中13個係經隨機化以生成具有大量配體變體之親合體®文庫(例如參見US 5,831,012)。親合體®分子模擬抗體；與抗體之分子量(其係150kDa)相比，其具有6kDa之分子量。儘管其大小較小，但親合體®分子之結合位點與抗體類似。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之親合體。
3.6)抗運載蛋白®
抗運載蛋白®係由公司Pieris ProteoLab AG研發之產品。其係衍生自脂質運載蛋白，即經常參與化學敏感或不溶性之化合物之生理學運輸或儲存之較小且穩健之廣泛蛋白質群組。若干天然脂質運載蛋白出現於人類組織或體液中。
蛋白質構造係類似於免疫球蛋白，在剛性框架頂部具有超變環。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白係由具有160個至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈構成，該單一多肽鏈僅略大於單一免疫球蛋白結構域。
構成結合袋之4個環之集合顯示顯著結構塑性並容許存在各種側鏈。因此可於專門製程中重塑結合位點，以以高親和力及特異性識別所規定之不同形狀之標靶化合物。
脂質運載蛋白家族之一蛋白質、即大菜粉蝶(Pieris brassicae)之膽汁三烯結合蛋白(BBP)已用於藉由誘變處理4個環之集合來研發抗運載蛋白。闡述「抗運載蛋白」之專利申請案之一實例係PCT WO 199916873。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗運載蛋白。
3.7)人泛素®
人泛素®分子係針對對蛋白質及小分子之特異性親和力經設計之較小非免疫球蛋白蛋白質。新人泛素®分子可極快地自兩個文庫選出，其每一者係基於不同人類源骨架蛋白質。
人泛素TM分子對免疫球蛋白蛋白質不顯示任何結構同源性。Scil Proteins採用兩種人泛素TM骨架，其中一者係γ結晶、即人類結構性眼 晶狀體蛋白，且另一者係「泛素」超家族蛋白質。兩種人類骨架皆極小，顯示高溫度穩定性，且對pH變化及變性劑幾乎具有抗性。此高穩定性主要係歸因於蛋白質之經擴展之β片結構。γ結晶衍生之蛋白質之實例係闡述於WO200104144中，且「泛素樣」蛋白質之實例係闡述於WO2004106368中。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之人泛素。
3.8)蛋白質表位模擬物
蛋白質表位模擬物(PEM)係模擬蛋白質之β髮夾二級結構(即參與蛋白質-蛋白質相互作用之主要二級結構)之中等大小環狀肽樣分子(大約1kDa至2kDa)。
因此，在一實施例中，該結合分子係結合(例如特異性結合)至IL18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之蛋白質表位模擬物。
4. 編碼本發明之結合分子之聚核苷酸
本發明之另一態樣係關於編碼本發明之結合分子之分離聚核苷酸。
編碼本文中所闡述之分離人類抗體之重鏈可變結構域聚核苷酸係顯示於SEQ ID NO：15、19、23、26、29、32、35、38、41、84、88、91、94、113、131、139、146及152中。編碼本文中所闡述之分離人類抗體之輕鏈可變結構域聚核苷酸係顯示於SEQ ID NO：17、21、24、27、30、33、36、39、42、86、89、92、95、115、133、141、148及154。編碼本發明抗體之其他聚核苷酸包括已經突變、但與上文所闡述之序列仍具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性之聚核苷酸，例如已針對於哺乳動物細胞(例如CHO細胞系)中之蛋白質表現經最佳化之聚核苷酸。
實施例89：一種變體核酸，其中當與上文所闡述之序列中所繪示之可變區相比時，在可變區中不超過1個、2個、3個、4個或5個核苷酸已藉由核苷酸缺失、插入或取代來改變。
實施例90：一種分離聚核苷酸，其編碼本發明之抗體或其片段之重鏈可變結構域，其中該聚核苷酸：a. 與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152具有至少90%一致性，或b. 包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152，或c. 基本上由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152組成。
實施例91：一種分離聚核苷酸，其編碼本發明之抗體或其片段之輕鏈可變結構域，其中該聚核苷酸：a. 與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154具有至少90%一致性，或b. 包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154，或c. 基本上由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：154組成。
實施例92：一種分離聚核苷酸，其編碼本發明抗體之重鏈，其中該聚核苷酸：a. 與SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155具有至少90%一致性；或b. 包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155；或c. 基本上由SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：159 或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155組成。
實施例93：該分離聚核苷酸編碼本發明抗體之輕鏈，其中該聚核苷酸：a. 與SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157具有至少90%一致性；或b. 包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157；或c. 基本上由SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157組成。
該聚核苷酸可存在於整個細胞中，存在於細胞溶解物中，或呈以部分純化或基本上純之形式。當藉由標準技術(包括鹼性/SDS治療、CsCl分級、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他技術)自其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)純化時，聚核苷酸係「經分離」或「經證明為實質上純的」。參見F.Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明之聚核苷酸可係(例如)DNA或RNA，且可含有或可不含內含子序列。在一實施例中，該聚核苷酸係cDNA分子。該聚核苷酸可存在於諸如噬菌體展示載體 等載體中或存在於重組質粒載體中。
本發明之聚核苷酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於藉由融合瘤(例如自攜帶下文進一步闡述之人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠製備之融合瘤)表現之抗體，編碼藉由融合瘤製得之抗體之輕鏈及重鏈之cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體，編碼該抗體之聚核苷酸可自為該文庫之成員之各種噬菌體純系回收。
在獲得編碼VH及VL區段之DNA片段後，該等DNA片段可進一步藉由標準重組DNA技術操縱，以(例如)將可變區基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，將編碼VL或VH之DNA片段與另一DNA分子或編碼另一蛋白質之片段(例如抗體恆定區或撓性連接體)可操作連接。此上下文中所使用之術語「可操作連接」意欲指以功能方式鏈接該兩個DNA片段，例如，以使得藉由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留於框內，或以使得在期望啟動子之控制下表現該蛋白質。
可藉由將編碼VH之DNA可操作連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來將編碼VH區之分離DNA轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內所已知(例如參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號91-3242)，且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該重鏈恆定區可係IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施例中，該重鏈恆定區係選自IgG1同種型。對於Fab片段重鏈基因，可將編碼VH之DNA可操作連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一 DNA分子來將編碼VL區之分離DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號91-3242)，且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可係κ或λ恆定區。
為創建scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作連接至編碼撓性連接體(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之另一片段，以使得該等VH及VL序列可表現為連續單鏈蛋白質，其中該等VL及VH區係藉由撓性連接體鏈接(例如參見Bird等人1988 Science 242：423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348：552-554)。
根據實施例89至93中任一實施例之聚核苷酸可經活體外修飾，以使得當注射至哺乳動物細胞中時，其防止聚核苷酸之消化並允許哺乳動物細胞之轉譯機制自經修飾聚核苷酸起始來產生抗體(例如Kariko等人之美國專利第8,278,036 B2號中所闡述)。然後可將此一活體外合成之經修飾RNA注射至哺乳動物細胞中或患者中作為基因療法之一部分。
因此，本發明之另一態樣涵蓋誘導哺乳動物細胞產生本文中所闡述之抗體之方法，該方法包含：使該哺乳動物細胞與衍生自根據實施例89至93中任一實施例之聚核苷酸之活體外合成之經修飾RNA接觸，其中該活體外合成之經修飾RNA包含一或多種美國專利第8,278,036 B2號中所闡述之修飾。
5. 抗體之產生
單株抗體(mAb)可藉由各種技術產生，包括習用單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,(1975)Nature 256：495之標準體細胞雜交技 術。可採用產生單株抗體之許多技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉化。
分離融合用經免疫脾細胞之免疫方案及技術為業內已知。融合伴侶(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知。
本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上文所闡述製備之鼠類單株抗體之序列來製備。編碼免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之DNA可自所關注之鼠類融合瘤獲得，並使用標準分子生物學技術加以改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為創建嵌合抗體，可使用業內已知方法(例如參見Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)將鼠類可變區連接至人類恆定區。為創建人類化抗體，可使用業內已知方法(例如參見Winter之美國專利第5225539號及Queen等人之美國專利第5530101號；第5585089號；第5693762號及第6180370號)將鼠類CDR區插入人類框架中。
可使用攜帶有人類免疫系統而非小鼠系統之一部分的轉基因或轉染色體小鼠來生成人類單株抗體。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中共同稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb小鼠®(Medarex公司)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微衛星基因座以及使內源性μ及κ鏈基因座不活化之靶向突變(例如參見Lonberg等人(1994)Nature；368(6474)：856-859)。因此，該等小鼠呈現小鼠IgM或κ之減少之表現，且因應免疫，所引入之人類重鏈及輕鏈轉基因經受類別轉換及體細胞突變，以生成高親和力人類IgGκ單株(Lonberg,N等人(1994)，參見上文；綜述於Lonberg,N(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N及Huszar,D(1995)Intern Rev Immunol；13：65-93及Harding,F and Lonberg,N (1995)Ann N Y Acad Sci；764：536-546中)。HuMAb小鼠之製備及使用以及該等小鼠所攜帶之基因組修飾係進一步闡述於Taylor,L等人；(1992)Nucl Acids Res；20：6287-6295；Chen,J等人(1993)Int Immunol；5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA；94：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Gen；4：117-123；Chen,J等人(1993)EMBO J；12：821-830；Tuaillon等人(1994)J Immunol；152：2912-2920；Taylor,L等人(1994)Int Immuno；6：579-591；及Fishwild,D等人(1996)Nature Biotech；14：845-851中，所有文獻之內容以引用的方式全文明確併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；全部皆頒予Lonberg及Kay；頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，全部皆頒予Lonberg及Kay；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在一實施例中，可使用在轉基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(例如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生本發明之人類抗體。該等小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)係詳細闡述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再此外，業內可用表現人類免疫球蛋白基因之替代轉基因動物系統，且可使用其來產生本發明抗體。例如，可使用稱為Xeno小鼠(Abgenix公司)之替代轉基因系統。該等小鼠係闡述於(例如)Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，業內可用表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物 系統，且可使用其來產生本發明抗體。例如，可使用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小鼠(稱為「TC小鼠」)；該等小鼠係闡述於Tomizuka等人2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，業內已闡述攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛(Kuroiwa等人2002 Nature Biotech 20：889-894)。
亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因之文庫之噬菌體展示方法製備本發明之人類重組抗體。業內已確定或在下文實例中闡述用於分離人類抗體之該等噬菌體展示方法。例如參見：頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號；第5,403,484號；及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號；第6,521,404號；第6,544,731號；第6,555,313號；第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，在該等SCID小鼠中人類免疫細胞已經重構，以使得可在免疫時生成人類抗體反應。該等小係鼠闡述於(例如)頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
本發明之抗體亦可使用(例如)業內熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合於宿主細胞轉染瘤中產生(例如Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
例如，為表現該等抗體或其抗體片段，可藉由標準分子生物學技術(例如使用表現所關注之抗體之融合瘤之PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA，且可將該等DNA插入選殖或表現載體中，以使得將該等基因可操作連接至轉錄及轉譯控制序列。在此上下文中，術語「可操作連接」意欲指使抗體基因接合至載體，以使得該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因之轉錄及 轉譯之預期功能。選殖或表現載體及表現控制序列係經選擇以與所使用之表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入分開載體中，或更通常地，將兩種基因插入相同表現載體中。藉由標準方法將抗體基因插入表現載體中(例如，將抗體基因片段上之互補限制位點與載體接合，或若不存在限制位點，則利用鈍端接合)。可使用本文中所闡述之抗體之輕鏈及重鏈可變區藉由以下方式創建任一抗體同種型之全長抗體基因：將該等可變區插入已編碼期望同種型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，以使得VH區段可操作連接至該載體內之CH區段，且VL區段可操作連接至該載體內之CL區段。另外或或者，重組表現載體可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至該載體中，以使得信號肽框內連接至抗體鏈基因之胺基端。信號肽可係免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
在一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明聚核苷酸之選殖或表現載體。
實施例94：一種選殖或表現載體，其包含至少一種選自以下之聚核苷酸：SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：1O4或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：157。
除編碼抗體鏈之聚核苷酸以外，本發明之選殖或表現載體攜帶控制抗體鏈基因於宿主細胞中之表現之調節序列。術語「調節序列」 意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。該等調節序列係闡述於(例如)Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA 1990)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可視諸如所欲轉化宿主細胞之選擇、期望蛋白質之表現含量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括在哺乳動物細胞中引導高含量之蛋白質表現之病毒元件，例如源自巨大病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或增強子。或者，可使用非病毒調節序列，例如泛素啟動子或P-球蛋白啟動子。再此外，調節元件由來自不同來源之序列構成，例如SRa啟動子系統，該SRa啟動子系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞白血病病毒1型之長末端重複序列(Takebe,Y.等人1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
此外，本發明之選殖或表現載體可攜帶其他序列，例如調節該載體於宿主細胞中之複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。該可選擇標記基因促進已引入該載體之宿主細胞之選擇(例如參見美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，全部皆頒予Axel等人)。例如，通常可選擇標記基因賦予已引入該載體之宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺蝶呤)之抗性。可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於經甲胺蝶呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。
為表現輕鏈及重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋多種各樣之常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及諸如此類。理論上可在原核或真核 宿主細胞中表現本發明抗體。論述抗體於真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞、酵母或絲狀真菌)中之表現，此乃因該等真核細胞、且特定而言哺乳動物細胞比原核細胞更可能組裝並分泌經正確摺疊且具有免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生高產量之活性抗體係無效的(Boss,M.A.及Wood,C.R.,1985 Immunology Today 6：12-13)。
用於選殖或表現編碼本發明抗體之載體之適宜宿主細胞係原核、酵母或高等真核細胞。適宜原核細胞包括真細菌(Eubacteria)，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如艾氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325))、腸桿菌屬(Enterobacter)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)及志賀桿菌屬(Shigella))以及桿菌屬(Bacilli)(例如枯草桿菌(B.subtilis)及地衣桿菌(B.licheniformis))(參見DD 266 710)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa))及鏈黴菌屬(Streptomyces)。在酵母或真菌宿主細胞中，亦涵蓋釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母菌屬(Yarrowia)(EP402,226)、甲醇酵母(EP183070，亦參見Peng等人(2004)J Biotechnol；108：185-192)、假絲酵母菌屬(Candida)、裏氏木黴(Trichoderma reesei)(EP244234)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主(例如構巢麯黴(A.nidulans)及黑麯黴(A.niger))。
儘管原核及酵母宿主細胞明確涵蓋於本發明內，然而較佳地，本發明之宿主細胞係高等真核細胞。
因此，在一態樣中，本發明提供包含一或多種包含本文中所闡述之聚核苷酸選殖或表現載體之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供包含一或多種本文中所闡述之聚核苷酸之經穩定轉化或轉染之宿主細胞。
實施例95：一種經穩定轉化之宿主細胞，其包含編碼根據實施例1至88中任一實施例之分離抗體或其片段之重鏈及/或輕鏈之載體。較佳地，該等宿主細胞包含編碼該輕鏈之第一載體及編碼該重鏈之第二載體。
適宜高等真核宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如COS-1(ATCC編號CRL 1650)COS-7(ATCC CRL 1651)、人類胎腎細胞系293、幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC編號：CRL 10314)、293(ATCC編號CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1，ATCC編號：CCL 61，DHFR-CHO細胞系，例如DG44(參見Urlaub等人(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12,555-556))，特定而言適於懸浮培養之彼等CHO細胞系、小鼠賽特利氏(sertoli)細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、犬腎細胞(ATCC CCL 34)、人類肺細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞(例如NSO(參見US5807715)、Sp2/0、YO)。
較佳地，用於表現本發明之結合分子之哺乳動物宿主細胞包括FUT8基因表現缺陷之哺乳動物細胞系，例如US6946292中所闡述。
可藉由熟習此項技術者所已知之任一方法培養經編碼該等結合分子之載體轉化之宿主細胞。可於旋轉式燒瓶、滾瓶或中空纖維系統中培養宿主細胞，但對於大規模產生而言，較佳使用特定用於懸浮培養之攪拌槽反應器。較佳地，攪拌槽適於使用(例如)噴佈器、擋板或低剪切葉輪通氣。對於氣泡柱及氣舉式反應器而言，可利用空氣氣泡或氧氣氣泡直接通氣。若在無血清培養基中培養宿主細胞，則較佳用 細胞保護劑(例如普流尼克(Pluronic)F-68)補充該培養基，以幫助防止細胞因通氣過程而受到損害。視宿主細胞特徵而定，可使用微載體作為錨定依賴性細胞系之生長基質，或該等細胞可適於懸浮培養(此係典型作法)。可利用多種操作模式來培養宿主細胞，特定而言脊椎動物宿主細胞，該等模式係(例如)分批饋料、重複分批加工(參見Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103-109)、延續分批製程或灌注培養。儘管可在含血清培養基(例如胎牛血清(FCS))中培養經重組轉化哺乳動物宿主細胞，但較佳在無血清之合成培養基(例如Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163中所揭示)或市售培養基(例如ProCHO-CDM或UltraCHO(TM)(Cambrex NJ,USA))中培養該等宿主細胞，若需要，可補充能量來源(例如葡萄糖)及合成生長因子(例如重組胰島素)。宿主細胞之無血清培養可能要求彼等細胞可適應在無血清條件下生長。其中一種適應方法係於含血清培養基中培養該等宿主細胞，並重覆更換80%培養基為無血清培養基，以使得該等宿主細胞學會適應於無血清條件(例如參見Scharfenberg K等人(1995)，Animal Cell technology：Developments towards the 21st century(Beuvery E.G.等人編輯)，第619頁至第623頁，Kluwer Academic publishers)。
可回收分泌至培養基中之本發明結合分子並使用各種技術純化，以提供適於預期用途之純化程度。例如，用於治療人類患者之本發明分離抗體通常要求至少95%純度、更通常98%或99%或更高純度(相對於粗製培養基)。在第一情況下，使用離心、接著使用(例如)微濾、超濾及/或深層過濾上清液之澄清步驟，去除來自培養基之細胞碎片。可利用各種其他技術，例如透析及凝膠電泳及層析技術，例如羥磷灰石(HA)、親和力層析(視情況涉及親和力標記系統，例如聚組胺酸)及/或疏水相互作用層析(HIC，參見US5429746)。在一實施例中，在各種澄清步驟後，使用蛋白質A或G親和力層析，接著進行其 他層析步驟(例如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、粒徑排阻層析及硫酸銨沈澱)來捕捉本發明抗體。通常，亦採用各種病毒去除步驟(例如，使用(例如)DV-20過濾器之奈米過濾)。在該等各種步驟後，提供包含至少75mg/ml或更大(例如，100mg/ml或更大)之本發明分離抗體或其抗原結合片段之經純化(較佳地單株)製劑，且因此形成本發明之一實施例。適宜地，該等製劑實質上不含本發明抗體之聚集形式。
可使用細菌系統表現上文所闡述之非免疫球蛋白結合分子。細菌系統亦特別適於表現分離抗體片段。該等片段係定位於細胞內或周質內。可根據熟習此項技術者已知方法萃取並再摺疊不溶性周質蛋白質，以形成活性蛋白，參見Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72,13-20及Cu pit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol,29,273-277。
因此，在一態樣中，本發明提供產生結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子之方法，其中該方法包含在適於產生該結合分子之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含本文中所闡述之載體。
實施例95：一種產生根據實施例1至88中任一實施例之人類抗體或其片段之方法，其中該方法包含在適於產生該結合分子之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含本文中所闡述之載體。
6. 醫藥組合物
本發明提供包含結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該結合分子並非IL-18BP)及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
實施例96：一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至88中任一實施例之人類抗體或其片段及醫藥上可接受之載劑。
該組合物可另外含有適於治療或預防下文所述之人類疾病或病 症之其他治療劑。醫藥上載劑增強或穩定該組合物，或促進該組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。
本發明之醫藥組合物可藉由業內已知之各種方法投與。投與之途徑及/或模式視期望結果而變。投與較佳係靜脈內、肌內、腹膜內或皮下的，或毗鄰標靶位點投與。醫藥上可接受之載劑應適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。視投與途徑而定，可將活性化合物(特定而言低分子量化學實體)塗覆於材料中，以保護該化合物免於酸及可使該化合物不活化之其他自然條件之作用。
該組合物應為滅菌的且係流體。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由在分散液情形下維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，該組合物中較佳包括等滲劑，例如糖類、多元醇(例如甘露醇及山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由在該組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)達成可注射組合物之長期吸收。
可參照業內熟知且以常規方式實踐之方法製備本發明之醫藥組合物。例如參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing公司，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978。較佳在GMP條件下製造醫藥組合物。通常，本發明之醫藥組合物中採用治療有效劑量(effective dose或efficacious dose)之本文中所闡述之本發明抗體。通常根據熟習此項技術者已知之習用方法將其調配成醫藥上可接受之劑型。調整劑量方案以提供最佳期望反應(例如治療反應)。例如，可投與單一濃注，可隨時間投與若干分開劑量，或可如治療情況之緊急狀態所指示成比例減少 或增加該劑量。以劑量單元形式調配非經腸組合物對於投與容易性及劑量一致性尤其有利。本文中所使用之劑量單元形式意指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理分散單元；每一單元含有預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應之預定量之活性化合物。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量含量可有所變化，以便獲得對於特定患者、組合物及投與模式有效達成期望治療反應而對患者無毒性之活性成份量。所選劑量含量視各種藥物代謝動力學因素而定，該等參數包括所採用之本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所採用之特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、總體健康及先前病史以及類似因素。
內科醫師開始時所採用之本發明抗體在醫藥組合物中之劑量可低於達成期望治療效應所需量，且內科醫師逐漸增加該劑量直至達成期望效應為止。通常，本發明組合物有效治療本文中所闡述之纖維變性疾病或病症之劑量視許多不同因素而定，包括投與方式、標靶位點、患者之生理狀態、患者係人類還是動物、其他藥品投與及治療係預防性的還是治療性的。治療劑量需經調整以使安全性及效力最佳化。對於投與抗體，該劑量係在約0.0001mg/kg至100mg/kg、且更經常0.01mg/kg至5mg/kg之宿主體重之範圍內。例如，劑量可係1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1mg/kg至10mg/kg之範圍內。實例性治療方案使得投與為每兩週一次或每月一次或每3個月至6個月一次。
經常多次投與本發明之結合分子、尤其抗體及其片段。單一劑量間之間隔可係每週、每月或每年的。間隔亦可如藉由量測治療蛋白質在患者中之血液含量所指示為不規則的。在一些方法中，調整劑量 以達成1μg/ml至1000μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中達成25μg/ml至300μg/ml之血漿抗體濃度。或者，本發明之抗體可以持續釋放調配物形式投與，在此情形下需要較不頻繁投與。劑量及頻率視抗體在患者中之半衰期而變。通常，人類化抗體顯示較嵌合抗體及非人類抗體長之半衰期。投與之劑量及頻率可視治療係預防性的還是治療性的而變。在預防性(prophylactic，preventative)應用中，以相對較不頻繁間隔經長時間投與相對較低劑量。一些患者在其剩餘人生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時血藥相對較短間隔之相對較高劑量，直至減緩或終止疾病進展為止，且較佳直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善為止。其後，可向患者投與預防性方案。
該醫藥組合物可包含(例如作為其唯一治療活性成份)與IL18結合(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子，其中該結合分子並非IL-18BP，其中該結合分子係選自：分離抗體、分離抗體之片段、單一可變結構域抗體、雙特異性或多特異性抗體、多價抗體、雙重可變結構域抗體、免疫偶聯物、纖維連接蛋白分子、支架蛋白(adnectin)、DARPin、高親和性多聚體、親合體、抗運載蛋白、人泛素、蛋白質表位模擬物或其組合，且其中該組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑。
通常，該組合物將呈經靜脈內、可吸入或皮下可投與形式。在其他實施例中，該組合物可呈凍乾形式。
較佳地，該結合分子係抗體、較佳本文中所闡述之單株完整抗體(例如人類、人類化或嵌合)或其片段。
實施例97：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或其片段，其中該抗體包含：(a)SEQ ID NO：3之CDRH1； (b)SEQ ID NO：9之CDRH2；(c)SEQ ID NO：5之CDRH3；(d)SEQ ID NO：6之CDRL1；(e)SEQ ID NO：7之CDRL2及(f)SEQ ID NO：8之CDRL3。
實施例98：根據實施例97之醫藥組合物，其中該抗體與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例99：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或其片段，其中該抗體包含：(a)SEQ ID NO：3之CDRH1；(b)SEQ ID NO：10之CDRH2；(c)SEQ ID NO：5之CDRH3；(d)SEQ ID NO：6之CDRL1；(e)SEQ ID NO：7之CDRL2及(f) SEQ ID NO：8之CDRL3。
實施例100：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或其片段，其中該抗體包含：(a)SEQ ID NO：3之CDRH1；(b)SEQ ID NO：13之CDRH2；(c)SEQ ID NO：5之CDRH3；(d)SEQ ID NO：6之CDRL1；(e)SEQ ID NO：7之CDRL2及(f) SEQ ID NO：8之CDRL3。
實施例101：根據實施例100之醫藥組合物，其中該抗體與鼠類 抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例102：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或其片段，其中該抗體包含：(a)SEQ ID NO：106之CDRH1；(b)SEQ ID NO：107之CDRH2；(c)SEQ ID NO：108之CDRH3；(d)SEQ ID NO：109之CDRL1；(e)SEQ ID NO：110之CDRL2及(f)SEQ ID NO：111之CDRL3。
實施例103：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體，其中該抗體包含：a. SEQ ID NO：14之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變結構域，或b. SEQ ID NO：25之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變結構域，或c. SEQ ID NO：28之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變結構域，或d. SEQ ID NO：18之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：20之輕鏈可變結構域，或e. SEQ ID NO：37之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：20之輕鏈可變結構域，或f. SEQ ID NO：40之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：20之輕鏈可變結構域，或g. SEQ ID NO：112之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：114之輕鏈可 變結構域。
實施例104：根據實施例103之醫藥組合物，其中該抗體包含SEQ ID NO：14之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變結構域，或SEQ ID NO：18之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：20之輕鏈可變結構域。
實施例105：根據實施例104之醫藥組合物，其中該抗體與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例106：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體，其中該抗體包含：a. 能夠藉由與編碼SEQ ID NO：14或18或25或28或37或40或112之分離聚核苷酸具有至少90%一致性(例如95%或更大，例如96%、97%、98%或99%)之分離聚核苷酸編碼的重鏈可變結構域，及b. 能夠藉由與編碼SEQ ID NO：16或20或114之分離聚核苷酸具有至少90%一致性(例如95%或更大，例如96%、97%、98%或99%)之分離聚核苷酸編碼的輕鏈可變結構域。
實施例107：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體，其中該抗體包含：a. SEQ ID NO：43之重鏈及SEQ ID NO：45之輕鏈可變結構域，或b. SEQ ID NO：47之重鏈及SEQ ID NO：45之輕鏈可變結構域，或c. SEQ ID NO：50之重鏈及SEQ ID NO：45之輕鏈可變結構域，或d. SEQ ID NO：53之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：160之輕鏈可變結構域，或e. SEQ ID NO：100之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：160之輕鏈可變結構域，或 f. SEQ ID NO：158之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：160之輕鏈可變結構域，或g. SEQ ID NO：116之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：118之輕鏈可變結構域。
實施例108：根據實施例107之醫藥組合物，其中該抗體包含SEQ ID NO：43之重鏈及SEQ ID NO：45之輕鏈可變結構域，或SEQ ID NO：158之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：160之輕鏈可變結構域。
實施例109：根據實施例108之醫藥組合物，其中該抗體與鼠類抗體125-2H競爭結合IL-18。
實施例110：醫藥組合物包含(例如作為其唯一治療活性成份)結合IL18(例如特異性結合)但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體，其中該抗體包含：a. 能夠藉由與編碼SEQ ID NO：43或47或50或53或100或116或158之分離聚核苷酸具有至少90%一致性(例如95%或更大，例如96%、97%、98%或99%)之分離聚核苷酸編碼的重鏈，及b. 能夠藉由與編碼SEQ ID NO：45或160或118之分離聚核苷酸具有至少90%一致性(例如95%或更大，例如96%、97%、98%或99%)之分離聚核苷酸編碼的輕鏈。
7. 臨床使用。
已證明IL-18表現在若干自體免疫、心血管及發炎性疾病中上調。
因此，本發明之結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(且其中該等結合分子並非IL-18BP)可用於療法中。
實施例110：根據實施例1至88中任一實施例之抗體，其用於療法中。
在本發明之一態樣中，提供治療及/或預防自體免疫疾病之方法，包括類風濕性關節炎(RA)、全身性幼髮型關節炎(SOJA)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、關節黏連性脊椎炎、自體免疫內耳疾病(AIED)、自體免疫淋巴球增生症候群(ALPS)、貝賽特氏疾病(Behcet’s Disease)、伯格氏疾病(Berger’s Disease，IgA腎病)、大水皰性天孢瘡樣病、丘-施二氏症候群(Churg Strauss Syndrome)、結腸炎、克隆氏病(CD)、1型糖尿病、2型糖尿病、休格倫氏症候群(Sjögren’s Syndrome，SS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、腎小球性腎炎、狼瘡、多發性硬化症(MS)、牛皮癬、風濕熱、類肉瘤症、硬皮病、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎、噬血性淋巴組織球增多症(HLH，亦稱為噬血性症候群、巨噬細胞活化症候群)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞動脈炎(GCA)、冠狀動脈疾病(CAD)、冠狀血管病變(CV)、急性冠狀動脈症候群(ACS)、鬱血性心臟衰竭(CHF)、動脈粥樣硬化、動脈硬化、心肌梗塞(MI)、心腎症候群(CRS)、急性腎損傷(AKI)、糖尿病腎病、胰島素抗性、肥胖症及代謝症候群(MetS)、包括肺部類肉瘤症，特定而言肺部類肉瘤症肺纖維化、氣喘、尤其重度氣喘之肺疾病、眼色素層炎、地圖狀萎縮、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纖維性、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、呼吸器導致之肺損傷(VILI)、肺動脈高血壓(PAH)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)及敗血症及其任何組合，該方法包含向哺乳動物患者投與治療有效量之本文中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(例如抗體)或醫藥組合物。
實施例111：一種治療及/或預防哺乳動物患者之以下疾病之方法：類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、動脈粥樣硬化、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、巨細胞關節炎(GCA)、1型糖尿病、2型糖尿病及其任一組合，該方法包含向該哺乳動物患者投與治療有效量之本文中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子(例如抗體)或醫藥組合物且其中該結合分子並非IL-18BP。
實施例112：一種本發明之結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或醫藥組合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其用於治療及/或預防哺乳動物患者之類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、動脈粥樣硬化、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、巨細胞關節炎(GCA)、1型糖尿病、2型糖尿病及其任一組合。
實施例113：一種治療及/或預防自體免疫疾病之方法，包括類風濕性關節炎(RA)、全身性幼髮型關節炎(SOJA)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、關節黏連性脊椎炎、自體免疫內耳疾病(AIED)、自體免疫淋巴球增生症候群(ALPS)、貝賽特氏疾病、伯格氏疾病(IgA腎病)、大水皰性天孢瘡樣病、丘-施二氏症候群、結腸炎、克隆氏病(CD)、1型糖尿病、2型糖尿病、休格倫氏症候群(SS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、腎小球性腎炎、狼瘡、多發性硬化症(MS)、牛皮癬、風濕熱、類肉瘤症、硬皮病、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎、噬血性淋巴組織球增多症(HLH、亦稱為噬血性症候群、巨噬細胞活化症候群)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞動脈炎(GCA)、冠狀動脈疾病(CAD)、冠狀血管病變(CV)、急性冠狀動脈症候群(ACS)、 鬱血性心臟衰竭(CHF)、動脈粥樣硬化、動脈硬化、心肌梗塞(MI)、心腎症候群(CRS)、急性腎損傷(AKI)、糖尿病腎病、胰島素抗性、肥胖症及代謝症候群(MetS)、包括肺部類肉瘤症、肺纖維化、氣喘、尤其重度氣喘之肺疾病、眼色素層炎、地圖狀萎縮、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纖維性、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、呼吸器導致之肺損傷(VILI)、肺動脈高血壓(PAH)、阿茲海默氏病(AD)及敗血症及其任何組合，該方法包含向哺乳動物患者投與治療有效量之實施例1至88或96至110中之任一實施例中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或醫藥組合物。
實施例114：一種治療及/或預防哺乳動物患者之以下疾病之方法：類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、動脈粥樣硬化、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、巨細胞關節炎(GCA)、1型糖尿病、2型糖尿病及其任一組合，該方法包含向該哺乳動物患者投與治療有效量之實施例1至88或96至110中任一實施例中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或醫藥組合物。
實施例115：一種如實施例1至88或96至110中任一實施例中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之抗體或醫藥組合物，且其中該結合分子並非IL-18BP，其用於治療及/或預防哺乳動物患者之類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、動脈粥樣硬化、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、 巨細胞關節炎(GCA)、1型糖尿病、2型糖尿病及其任一組合。
8. 診斷用途及套組
本文中所闡述之結合分子或分離抗體或其片段之一優勢在於，其結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物且其並非IL-18BP。因此，本文中所闡述之結合分子或分離抗體或其片段能夠僅檢測未結合至IL-18BP之游離IL-18。由於游離IL-18係生物活性分子，故立即明瞭能夠僅識別該實體之結合分子可允許區分游離IL-18與結合至IL-18BP之IL-18(其係非活性的)。此外，由於本發明之結合分子不涵蓋IL-18BP(分離或天然存在)，故其自身不僅適宜作為治療劑且亦適宜作為許多其他應用(例如診斷)或診斷套組中之工具。
因此，在另一態樣中，本發明提供本文中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(其中該結合分子並非IL-18BP)，其用於診斷或用於診斷套組。
本文中所闡述之結合分子或該分離抗體或其片段可與檢測抗體組合用於ELISA分析、西方墨點等，且不僅可用於檢測游離IL-18之存在，且亦可用於量測游離IL-18之量。
因此，在另一態樣中，本發明提供結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(其中該結合分子並非IL-18BP)，其用於診斷或用於檢測及/或量測樣品中游離IL-18(例如位結合至IL-18BP之IL-18)之存在及/或量。
在本發明之再一態樣中，提供檢測及/或量測樣品中游離IL-18(即未結合至IL-18BP之IL-18)之存在及/或量之方法，其中該樣品視情況係人類樣品，其中該方法包含使該樣品與結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(其中該結合分子並非IL-18BP)接觸。
在本發明之再一態樣中，提供包含以下步驟之方法：a. 使自受試者(例如罹患發炎性疾病或病症之受試者)獲得之樣品與本文中所闡述結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物之結合分子或分離抗體或其片段(其中該結合分子並非IL-18BP)接觸；b. 量測游離IL-18之含量；c. 視情況，量測總IL-18及IL-18 BP之含量；d. 其中步驟b)及c)可同時或連續或以倒序實施(例如步驟b)在步驟c)之前或步驟c)在步驟b)之前)。
該樣品可係自哺乳動物身體、較佳自人類身體分離之樣品。該分離樣品可係：i. 來自可接觸身體部位，例如鼻、皮膚、結膜、口或喉、肛門、陰道、尿道、子宮頸之黏膜；及/或ii. 包含流體或半固體(例如體液或半固體(例如)排出物、嘔吐物、分泌物、排泄物、胃液及/或腸液、痰、血液、血清、血漿、尿、淚、滑液、精液、前列腺液、唾液、組織勻質物或黏液)；及/或iii. 包含固體(例如糞、組織或生檢樣品)；及/或iv. 包含培養物(例如巨噬細胞培養物)；該樣品可係人類血液或人類血液之一部分(例如血漿)。
該分離樣品可較佳選自人類全血、人類血液單核球源性巨噬細胞及人類肺巨噬細胞。
在另一態樣中，本發明進一步提供診斷套組，其包含結合分子或分離抗體或其片段(其結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，其中該結合分子並非IL-18BP)及/或包含IL-18及彼結合分子之複合物，其中該套組視情況包含第一對照化合物。
對照化合物係將指示該診斷套組正在工作之化合物。對照化合 物可係陽性或陰性的，且其將驗證任何結果係有效的。
該第一對照化合物可係游離IL-18，且該套組視情況可包含為鼠類抗體125-2H之第二對照化合物。
在本發明之另一態樣中，提供醫學或診斷裝置，其包含結合分子或分離抗體或其片段(其結合IL-18但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物)及/或包含IL-18及彼結合分子之複合物，其中該結合分子並非IL-18BP。
9. 例證
在本說明書結束時闡述本文所例示之本發明抗體之序列以及序列相關表。
9.1)材料
重組人類IL-18(於大腸桿菌(E.coli)中使用Liu等人(2000)Cytokine 12(10)：1519-25所闡述之方法生成)。
重組食蟹猴IL18(於大腸桿菌中使用美國專利第6,432,678號中所闡述之方法生成)
重組人類TNFα(R&D編號210-TA)
重組人類IL-18結合蛋白-IgG1 Fc(hIL-18BPa-Fc,R&D Systems，編號119-BP-100)
小鼠抗人類IL-18 IgG1(125-2H；R&D Systems編號D044-3)
人類抗溶菌酶抗體(MOR03207 Morphosys)
KG-1細胞系(ATCC編號CCL-246)
細胞培養基：補充有10%胎牛血清(Invitrogen編號10108-157)、1% L-麩醯胺酸(Invitrogen編號25030-03)、1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen編號15140-148)之RPMI 1640(Invitrogen編號31870)。
平底、經組織培養處理之96孔板(Costar編號3596)
人類IFN-γ DuoSet ELISA分析(R&D編號DY285)
Maxisorb微量滴定板(Sigma編號M9410)
肝素(Sigma編號H3393)
重組人類IL-12(R&D Systems編號219-IL-CF)
LPS(Sigma編號L4516)
Falcon管(Corning編號430829)
Ficoll-Paque TMPlus(GE Healthcare Life Sciences編號17-1440-02)
將KG-1細胞以2×105個活細胞/ml至1×106個活細胞/ml之密度維持於補充有10% FBS、1% L-麩醯胺酸及1%青黴素/鏈黴素之RPMI 1640中。
9.2)經選擇用於功能分析之抗體及其片段
藉由噬菌體展示生成該等抗體及其片段。所使用之噬菌粒文庫係基於HuCAL®概念(Knappik,A.等人(2000)J Mol Biol 296,57-86)，並採用用於於噬菌體表面上展示Fab之CysDisplayTM技術(WO 01/05950)。為增加所選擇抗體片段之親和力及生物活性，平行地藉由使用三核苷酸定向誘變之盒式誘變使L-CDR3及H-CDR2區最佳化(Virnekas,B等人(1994)Nucleic Acids Res 22,5600-5607)，同時使框架區保持恆定。選擇來自不同親代框架之抗體用於IgG轉變及功能表徵。該等抗體及其片段係顯示於下表1A中。
Figure TWI613217BD00001
Figure TWI613217BD00002
抗體MOR9464當調配於液體調配物中時發生效能隨時間而損失。假設該分子可能經受一些影響其效能之修飾。於高於生理學溫度之溫度下培育MOR9464，以加速效能損失之發生。藉由組合複雜生物物理學技術(包括質譜法及逆相HPLC)，分離MOR9464之兩種不同、尚且未知之形式。
當在在活體外操縱及活體內循環期間於細胞外培養基中進行修飾時，可對蛋白質進行許多種修飾。無論何種修飾，其可廣泛影響與基於蛋白質之醫藥相關之性質。因此，瞭解該等修飾之結構-功能聯繫變得至關重要。胞外修飾係在產生時期期間在治療性蛋白質完成運輸路徑，到達細胞表面且將其釋放於胞外培養基環境中並於其中培育後不久發生之修飾。其亦涵蓋在活體外操縱(例如於適宜緩衝液中之純化及調配)或甚至活體內循環期間發生之修飾(Zhong X.及Wright J.F.,Int J of Cell Biol.,2013,1-19)。蛋白水解加工係最常見且熟知之胞外修飾，此乃因其產物易於鑑別。單一胺基酸殘基之氧化可更難於表徵，且可涉及甲硫胺酸殘基以及色胺酸、半胱胺酸、組胺酸及酪胺酸殘基。N-端焦麩胺酸形成亦係熟知胞外修飾，其中N-端麩醯胺酸或麩胺酸殘基可容易地與其自身端基環化以形成吡咯啶酮羧酸。天冬醯 胺及天冬胺酸殘基之脫醯胺或天冬胺酸異構化亦為已知、尚未充分表徵之修飾。
若胞外修飾發生在該抗體之具體區中，則其可對抗體之功能特徵具有深刻效應，例如效能之損失。若該等修飾發生在CDR中或很近之位置，則其可影響該抗體識別及/或特異性結合其抗原之能力。
實施MOR9464序列之分析以鑑別胞外修飾之可能位點。生成表1B中所顯示之突變體。
Figure TWI613217BD00003
Figure TWI613217BD00004
認為恰恰側接MOR9464之H-CDR1之天冬醯胺30連同H-CDR1中之絲胺酸31及H-CDR2中之甲硫胺酸54係修飾之可能位點。天冬醯胺及麩醯胺酸殘基至天冬胺酸及麩胺酸之非酶促脫醯胺發生在整個水解反應中，且係pH、溫度及離子強度依賴性的。其亦取決於在天冬醯胺及麩醯胺酸殘基之前之胺基酸殘基，其中絲胺酸及蘇胺酸增加脫醯胺速率。
大部分MOR10222_S31X突變體(具有或不具有甲硫胺酸突變)在產生後大量聚集。因此，未對該等突變體進行任何進一步表徵。
9.3)使用溶液平衡滴定(SET)對親和力之測定
對於藉由溶液平衡滴定(SET)進行之KD測定，使用抗體之單體部分(藉由分析型SEC所分析)。
基本上如文獻中所闡述實施於溶液中之親和力測定(Friguet B等人(1985)J Immunol Methods；77(2)：305-19)。為改良SET方法之靈敏度及準確度，將其自經典ELISA轉移至基於電化學發光(ECL)之技術(Haenel C等人(2005)Anal Biochem；339(1)：182-4)。
根據製造商說明書利用MSD SULFO-TAGTM NHS-Ester(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)標記山羊抗人類(Fab)2片段特異性抗體(Dianova)。於聚丙烯微量滴定板及基於磷酸鹽之分析緩衝液中實施實驗。連續稀釋未經標記之人類IL-18，以至少10倍於預期KD之濃度起始。使用不具有抗原之孔測定Bmax值；使用具有分析緩衝液之孔測定背景。在添加恆定量之抗體或其片段(例如於60μl最終體積中之10pM最終濃度)後，在室溫下將混合物培育過夜。所施加之抗體或其片段濃度與預期KD類似或低於其。
利用含有BSA之磷酸鹽緩衝液過夜阻斷鏈黴抗生物素MSD板。在阻斷該板後，添加經生物素化之人類IL-18並在室溫下培育1h。隨後，將經平衡之樣品轉移至彼等板，並在室溫下培育較短時間。
在洗滌後，將MSD SULFO-TAG標記之檢測抗體(山羊抗人類(Fab)2)添加至MSD板，並在室溫下培育較短時間。
在洗滌該板並添加具有表面活性劑之MSD讀數緩衝液T後，使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)檢測電化學發光信號。
利用應用定製擬合模型之XLfit(IDBS)軟體評價數據。對於Fab分子之KD測定，使用以下擬合模型(根據Haenel等人，2005，根據Abraham等人，1996修改)：
Figure TWI613217BD00005
[Fab]t：所施加之總Fab濃度
x：所施加之總可溶性抗原濃度(結合位點)
Bmax：在無抗原之情況下Fab之最大信號
KD：親和力
原則上，應用相同方案來測定該等抗體及片段之KD值，但具有 以下差異：將整個抗體添加至抗原之稀釋系列中，並在室溫下平衡過夜。隨後，如上文所闡述處理該等樣品。
對於數據評價(例如IgG分子之KD測定)，使用針對IgG之以下擬合模型(根據Piehler等人，1997修改)：
Figure TWI613217BD00006
[IgG]：所施加之總IgG濃度
x：所施加之總可溶性抗原濃度(結合位點)
Bmax：在無抗原之情況下IgG之最大信號
KD：親和力
使用上文所闡述之分析條件於溶液中測定抗IL-18抗體或其片段之親和力，並將其指示於表2A(第2行)中。若亦測試來自食蟹猴(cm IL-18)之IL-18，則將所得KD指示於括號中。
9.4)自IL-18刺激之人類PBMC之IFN-γ釋放之抑制
外周血液單核細胞(PBMCs)係剛使用標準技術自經肝素化之人類全血分離。簡言之，將含有肝素(15U/ml)作為抗凝劑之經稀釋血液於Ficoll-PaqueTMPlus上分層，並離心(800×g，20分鐘，18℃)。自血漿：Ficoll界面收集PBMC，並在再懸浮於培養基中之前洗滌兩次(600×g，10分鐘，4℃)。
將PBMC再懸浮於培養基中，並施加至96孔細胞培養板，以得到1.5×106個/ml之最終細胞密度(於200μl之最終分析體積中)。為確保本發明之抗體及其片段識別出可能經糖基化之天然IL-18，利用經由IL-18依賴性自分泌反饋誘導IFN-γ之LPS及IL-12刺激PBMC。
利用3nM人類重組IL-18加IL-12(1ng/ml)或LPS(3μg/ml)加IL- 12(10ng/ml)刺激細胞，以誘導天然IL-18蛋白質(所有最終濃度)之分泌。在重組人類IL-18之情形下，將所選擇濃度預定為此分析之近似EC80。在天然IL-18之情形下，LPS刺激IL-18之產生，而IL-12增加IL-18受體表現(Yoshimoto T等人(1998)J Immunol；161(7)：3400-7)。經由包含高度特異性蛋白質IL-18結合蛋白-IgG1 Fc(hIL-18BPa-Fc)作為陽性對照來測定在此分析中IL-18依賴性之程度(圖3(A至D)中之虛線)。
為評估其效能及效力，利用IL-12及LPS(天然條件)或IL-12及IL-18將抗體及其片段預平衡30min(重組條件)，然後施加至細胞，其最終濃度介於0.1nM與300nM之間。使用抗溶菌酶對照抗體MOR03207作為陰性對照。
自每一處理群組，自n=2個至5個孔測定平均值±SEM值(其中n=3或更多)。
在處理後將細胞於37℃及5% CO2下培育24小時，其後藉由離心(1200rpm，持續5min)收集上清液，並將其儲存於-20℃下用於後續分析。根據製造商說明書使用ELISA評估IFN-γ蛋白質含量。
所有抗體及其片段劑量依賴性地抑制IFN-γ產生，其中在最高濃度下達成之效力程度與針對重組IL-18BPa-Fc所見類似(表2A第5行至第6行、表2B第2行及圖3(A至D)，其中IL-18BPa之效力係藉由虛線表示)。對照抗體MOR03207(抗溶菌酶對照抗體)不抑制IL-18反應。種系化抗體(例如來自MOR09441之MOR10579及來自MOR09464之MOR10222)不顯著改變其中和能力。MOR9464及MOR10222之突變體，特定而言MOR9464_N30K及MOR10222_N30S_M54I具有與野生型抗體相當之中和能力。
Figure TWI613217BD00007
Figure TWI613217BD00008
9.5)自IL-18刺激之KG-1細胞之IFN-γ釋放之抑制
分析抗IL-18抗體及其片段抑制自IL-18-刺激之KG-1細胞之IFN-γ釋放之能力。在不存在拮抗劑之情況下，IL-18在存在共刺激物(例如TNFα及IL-12)之情況下藉助IL-18受體之上調促進IFN-γ釋放之最大刺激(Nakamura S等人(2000)Leukemia；14(6)：1052-9)。針對1nM之人類或食蟹猴IL-18(除非另有說明)評估抗體及片段之抑制活性，將該濃度預定為此基於細胞之系統之EC80。
將KG-1細胞再懸浮於培養基中，並施加至96孔細胞培養板，以 得到0.3×106個/ml之最終細胞密度(於200μl之最終分析體積中)。利用1nM人類或食蟹猴重組IL-18加TNFα(最終濃度20ng/ml)刺激細胞。將所選擇之重組IL-18濃度預定為此分析之大約EC80。
為評估該等抗體之效能及效力，利用TNFα及IL-18(人類或食蟹猴)將該等抗體及其片段預平衡30min，然後施加細胞，其最終濃度介於0.1nM與300nM之間。使用抗溶菌酶對照抗體MOR03207作為陰性對照。
自每一處理群組，自n=2個至5個孔測定平均值±SEM值(若可獲得)。
在處理後將細胞於37℃及5% CO2下培育24小時，其後藉由離心(885×g，持續5min)收集上清液，並將其儲存於-20℃下用於後續分析。根據製造商說明書使用ELISA評估IFN-γ蛋白質含量。
所有抗體及其片段劑量依賴性地抑制IFN-γ產生，其中在最高濃度下達成完全抑制。對於親和力成熟抗體，針對0.8nM人類IL-18，IC50值係在0.3nM至0.8nM之範圍內，從而代表1：1莫耳比抗體：抗原或更好莫耳比。VH4_3b框架抗體(MOR08776、MOR010501、MOR010502)對人類及食蟹猴IL-18展示類似效能，而VH1A_3框架抗體之效力稍低於食蟹猴IL-18(表2第3行及第4行)。對照抗體MOR03207不抑制IL-18反應。
9.6)人類全血中之IL-18誘導之INF-γ釋放
全血分析納入內源性IL-18BP之存在及功能二者，此乃因IL-18BP主要係由脾生成，且全身以約10ng/ml至20ng/ml之含量存在於健康個體中。IL-18BP以高親和力結合至IL-18，並中和其活性，且從而可代表識別此複合物之可接觸表位之抗體之彙集池。
評估抗IL-18抗體於取自健康志願者之經肝素化人類全血中之活性。使用無血清培養基以20倍最終期望濃度製備所有試劑。利用7 nM人類重組IL-18加IL-12(1ng/mL)或LPS(10μg/mL)加IL-12(10ng/mL)刺激細胞，以誘導天然IL-18蛋白質(所有最終濃度)之分泌。在重組人類IL-18之情形下，將所選擇濃度預定為此分析之近似EC80。在天然IL-18之情形下，LPS刺激IL-18之產生，而IL-12增加IL-18受體表現，且經由包含重組人類IL-18結合蛋白-IgG1 Fc(hIL-18BPa-Fc)作為陽性對照來測定IL-18依賴性之程度。
為評估該等抗體之效能及效力，利用相關刺激物將該等抗IL-18抗體及其片段預平衡30min，然後施加至細胞，其最終濃度介於0.1nM與1000nM之間。使用抗溶菌酶對照抗體MOR03207作為陰性對照。
將30μL刺激物混合物(+/-抗體或片段)添加至96孔組織培養滅菌微量滴定板之每一孔中，然後將170μL經肝素化全血添加至每一孔中，以使得每一孔中之最終體積係200μl。然後將該等板置回潮濕恒溫箱(37℃)。24h後，對該等板離心(885×g，4℃，5min)，且去除上清液，並使用市售ELISA套組針對hIFN-γ產生進行分析。將最終數據推導為3個至5個健康人類供體之平均值±平均值標準誤差。
針對任一刺激物，所有抗體及片段劑量依賴性地抑制IFNγ產生。在最高濃度下達成重組IL-18誘導之反應之完全抑制，而針對LPS/IL-12刺激所觀測到之效力與針對IL-18BPa-Fc所見類似(表3；圖7(A-E)及8(A-E))。種系化MOR09441及MOR09464不顯著改變其中和能力。對照抗體MOR03207不抑制IL-18反應。亦評估所選擇抗體抑制於來自食蟹猴之全血中之重組食蟹猴IL-18生物活性(7nM)之能力。MOR09441、MOR09464、MOR09465、MOR09466皆劑量依賴性地抑制IFN-γ產生，其中在最高濃度下觀測到完全抑制。所觀測到之IC50值分別係110±36nM、51±8nM、55±3nM、179±30nM。
Figure TWI613217BD00009
Figure TWI613217BD00010
MOR9464及MOR10222之突變體，特定而言MOR9464_N30K及MOR10222_N30S_M54I具有與野生型抗體相當之中和能力。
9.7)抗IL-18抗體與IL-18-IL-18BP複合物之ELISA結合
為證實本文中所闡述之抗IL18抗體或其片段不識別結合至IL-18BP之IL-18(IL-18/IL-18BP複合物)，以莫耳過量將IL-18與IL-18BP(rhIL-18BP/Fc，R&D Systems，目錄編號119)一起培育。如下文所闡述添加抗IL18抗體及片段，且檢測與該複合物之結合。通常，若抗IL-18抗體及片段結合抗原上與IL-18BP不同之可接觸表位(例如識別IL-18/IL-1BP複合物)，則檢測高濃度之抗IL-18抗體及片段下之信號。在第一設定中，使用PBST/0.5%BSA稀釋對照抗體及抗IL18抗體及片段，並將其添加至經生物素化之IL-18/IL18-BP複合物(在室溫下於聚丙烯板中培育30min並溫和搖動)中。對照抗體係作為陰性對照之MOR03207(抗溶菌酶)、作為陽性對照抗體之MOR08741以及小鼠125-2H(即抗人類IL-18小鼠IgG)(其皆識別IL-18/IL-18BP複合物)(Argiriadi MA等人(2009)J Biol Chem；284(36)：24478-89)。經由生物素部分將整個複合物捕獲至NeutrAvidin板上，利用1×ChemiBlocker-PBS阻斷過夜(o/n)該等NeutrAvidin板。
用PBST將板洗滌5×，並與20μl/孔檢測抗體抗Fab-AP(即山羊抗人類IgG(F(ab)2片段特異性，Jackson Immuno Research，109-055- 097，批號：69655)或抗小鼠IgG(整個分子)-AP(SIGMA，編號A4312)，二者皆於0.5% BSA/0.05%吐溫20(Tween20)/1×PBS中1：5000稀釋)一起培育1h。用TBST將板洗滌5×，添加20μl AttoPhos(Roche)溶液(於ddH2O中1：5稀釋)，且於Tecan讀數器上量測螢光。
對於不結合IL-18/IL-18BP複合物之抗IL-18抗體MOR8775及MOR8776，結合信號顯著降低或未觀測到信號(圖9(A))。相比之下，在存在小鼠125-2H之情況下觀測到強信號，此支持所報導之此對照抗體結合不同於IL-18BP之表位之表位的能力。類似地，在存在對照抗體MOR08741之情況下觀測到劑量依賴性信號。
在第二設定中，以類似方式進行該實驗，惟使用未經生物素化hu IL-18。使用山羊抗hu IgG(Fc γ片段特異性，Jackson ImmunoResearch編號109-005-098)經由rhIL-18BP/Fc之Fc標籤將IL-18/IL-18BP複合物捕獲至Maxisorp板上。針對對照MOR08741觀測到濃度依賴性信號，此再次強調此抗體識別IL-18/IL-18BP複合物之能力。相比之下，針對MOR09441、MOR09464、MOR09465、MOR09466未觀測到信號，此證實其不結合IL-18/IL-18BP複合物。
9.8)經由ELISA之抗IL18抗體及片段之表位框並法
對於表位框並法，使用兩種設定。對於第一設定，滴定抗體片段(Fab A)，並與生物素化人類IL-18一起培育。利用恆定濃度之抗體B(IgG B)測試Fab A。作為陽性對照，Fab A係利用自身以IgG格式進行分析。利用Chemiblocker(經PBS 1：1稀釋)阻斷NeutrAvidin板(Thermo Scientific目錄編號15402)，並在室溫下培育2h(或在4℃下過夜)。第二天，用PBST將板洗滌2×，且將Fab以500nM低至2nM滴定於含有10nM最終濃度經生物素化人類IL-18之PBS緩衝液中。將抗體片段與經生物素化IL-18之複合物添加至NeutrAvidin板中，並培育1小時。在用PBST洗滌3×後，將IgG B以20nM添加至NeutrAvidin板之相 應孔中。在20分鐘培育及3×PBST洗滌後，添加檢測抗體抗Fc-AP-山羊抗人類IgG(Fc γ-鏈特異性，Jackson Immuno Research,109-055-098)及抗小鼠IgG(整個分子)-AP(SIGMA，編號A4312，批號：067K4863)，1：5000稀釋於0.5% BSA/0.05%吐溫20/1×PBS中。
用PBST將板洗滌5×，添加20μl AttoPhos溶液(1：5稀釋於ddH2O中)，且於Tecan讀數器上量測板。在430nm下激發之情況下，記錄535nm下之螢光發射。
通常，僅當IgG B能夠結合至抗原上與所測試Fab A不同之可接觸表位(例如抗體結合至不同表位)時，可獲得信號。相比之下，對於部分重疊或相同表位之抗體，結合信號與對照相比顯著降低。
於Maxisorp板上實施第二ELISA設定。將Fab A塗覆至存於PBS中之不同濃度，並在4℃下培育過夜。第二天，用PBST將板洗滌3×，並在室溫下利用5% MPBST(100μl/孔)阻斷2小時。在3×PBST洗滌步驟後，將人類IL-18以恆定濃度添加1h。用PBST將板洗滌3×，且滴定經生物素化抗體片段(經生物素化Fab B)(最大濃度5μg/mL、10μg/mL或20μg/mL)。對於Fab A與IL-18及經生物素化Fab B之複合物形成，將板培育1h，隨後用PBST洗滌3×，且將檢測抗體ZyMax鏈黴抗生物素-鹼性磷酸酶(Zymed，目錄編號：43-8322，批號51102099)1：2,000稀釋於PBST中，將20μL/孔添加至ELISA板中。用TBST將板洗滌5×，添加20μL AttoPhos(Roche)溶液(1：5稀釋於ddH2O中)，且於Tecan讀數器上量測板。
在此情形下，關於第一設定，僅當經生物素化Fab B能夠結合至抗原上與所測試Fab A不同之可接觸表位(例如抗體結合不同表位)時，可獲得信號。
如圖10A中所顯示，抗體MOR8775與鼠類抗體125-2H競爭(黑單元填充)，而MOR8776不與125-2H競爭結合至IL-18(無單元填充)。兩 種抗體皆與IL-18BP-Fc競爭結合IL-18(黑色單元填充)。MOR8775或MOR8776皆不與ABT325抗體競爭(美國專利申請案第09/780,035號及第10/988,360號)。視實驗設定而定，MOR8775及MOR8776彼此競爭(條紋單元填充)。
在第二組實驗中，使用Proteon XPR36儀器(即基於表面電漿子共振(SPR)之即時無標記生物感測器)測試抗體MOR9464、MOR9464_N30K、MOR10222_N30S_M54I及MOR13341在存在任一該等抗體(即IL-18BP-Fc、ABT325及鼠類抗體125-2H)之情況下結合IL-18之能力。在分析之前，證實蛋白質之完整性，且藉由LC-MS評估濃度。
藉由標準胺偶合將所有抗體及IL18BP-Fc固定化於GLC感測器晶片之相互作用斑點上。在第一步驟中，注射IL18作為分析物1，且在第二步驟中，注射抗IL18抗體或IL18BPa-Fc作為分析物2。
在存於10mM乙酸鹽緩衝液(pH 4.0)中20μg/mL(抗體)或10μg/mL(IL18BP-Fc)之濃度下製備欲固定化之配體。將分析物稀釋於含有0.005%吐溫20之PBS緩衝液(TEKNOVA)中，使用相同緩衝液溶液作為該儀器之電泳緩衝液。以50μL/mi之流速注射分析物1(25nM IL18)並持續180秒，其中解離時間為60秒。以50μL/min之流速注射分析物2(25nM IL18BPa-Fc或抗IL18抗體)並持續180秒，其中解離時間為180秒。利用10mM甘胺酸(pH 1.5)以100μL/min之流速實施再生，並持續20秒。實施兩組獨立實驗。數據評價係基於與分析物1之信號相比在注射分析物2時感應圖信號是否增強。若信號增強，則可得出結論：經固定化配體及所注射分析物2識別不同表位。若信號不增強，則可得出結論：該兩者共享相同或重疊表位。
如圖10B中所顯示，抗體MOR9464、MOR9464_N30K、MOR10222_N30S_M54I及MOR13341彼此競爭(黑色單元填充)，與IL- 18BP-Fc及鼠類抗體125-2H競爭。該等抗體中之任一者皆不與ABT325競爭(白色單元填充)。
顯示與IL-18BP-Fc及鼠類抗體125-2H雙重競爭之諸如MOR9464_N30K及MOR10222_N30S_M54I等抗體似乎不僅具有結合未結合至天然抑制劑IL-18BP-Fc之游離IL-18之優勢，且亦似乎具有防止IL-18與IL-18Rα/β結合之可能。如Wu等人(Wu C.等人，J.Immunol.2003,170：5571-5577)中所闡述，IL-18Rβ似乎不僅結合IL-18，且亦與IL-18Rα形成能夠因應IL-18而進行信號傳導之功能性高親和力受體複合物。生物化學數據與125-2H於IL-18上之表位定位之組合已揭露人類IL-18之C-端17個胺基酸對於藉助異源二聚體受體之信號轉導甚為重要。因此，能夠於125-2H表位內結合並同等地與IL-18 BP競爭結合IL-18之抗體似乎具有不僅藉助阻斷與IL-18Rα之結合且亦藉助阻斷IL-18與IL-18Rα/β複合物之結合來防止IL-18依賴性路徑活化之可能。如9.11部分中所顯而易見，抗體MOR9464_N30K尤其結合於17胺基酸段內之胺基酸Glu177及Leu180，如Wu等人中所闡述。
9.9)藉由模型化之IL-18表位定位
使用來自SwissProt條目Q14116之人類IL-18研究PDB中之結構資訊(Berman H.M等人(2000)Nucl Acids Res；28：235-242)。發現具有代碼1J0S(Kato Z等人(2003)Nat Struct Biol；10：966)、2VXT(Argiriadi MA等人(2009)J Biol Chem；284：24478)及3F62(Krumm B等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA；105：20711)之三種結構。1J0S係人類IL-18之NMR結構。2VXT係與小鼠125-2H抗體片段形成複合物之經改造人類IL-18之1.49Å解析度之晶體結構，且3F62係與痘病毒IL-18結合蛋白形成複合物之經改造人類IL-18之2.0Å解析度之晶體結構。
已藉由突變分析鑑別IL-18上之三個結合位點。其中之兩個(即位點1及2)對於結合IL-18Rα甚為重要，且第三個(即位點3)對於結合IL- 18Rβ甚為重要(Kato Z.等人(2003)Nat.Struct.Biol,10：966)。位點2對於結合IL-18BP亦甚為重要。
亦可獲得IL-1β與IL-1R1之間之結構複合物(1ITB，Vigers G.P等人(1997)Nature,386：190)。IL-1β與IL-1R1之間之複合物之結構顯示IL-1β具有兩個受體結合位點(即位點1及2)(圖11(A))。由於不能獲得IL-18與IL-18Rα之間之複合物之結構，故使用與IL-1R1形成複合物之IL-1β之晶體結構作為用於蛋白質模型化之模板(PDB代碼1ITB)。藉由使用IL-1R1之結構作為模板來構建IL-18Rα之模型。將IL-18之晶體結構(pdb代碼2VXT，Argiriadi M.A等人(2009)J.Biol.Chem.284：24478)及IL-18Rα之模型化結構以結構方式疊置至複合物IL-1β/IL-1R1，且細化如此獲得之IL-18/IL-18Rα模型，以獲得最終結構模型(圖11(B))。MOE v2009.1(Chemical Computing Group公司)係用於模型化IL-18與IL-18Rα之間之複合物之軟體。已使用同源性模型板藉由選擇AMBER99力場及缺省板參數來構建IL-18Rα之模型。已使用MOE中之能量最小化板來細化最終IL-18/IL-18Rα複合物。
人類IL-18之總體結構顯示與IL-1β之結構類似。特定而言，二級結構元件中之IL-18與IL-1β Cα原子間之RMSD(均方根偏差)指示其係屬於相同結構類別之相關蛋白質(Kato Z.等人(2003)Nat.Struct.Biol,10：966)。IL-1β與IL-18之結構間之比較揭露，IL-18中之位點1及2與IL-1β中之位點1及2相對應。在圖11(B)中，IL-18與IL-18Rα間之複合物之模型中顯示位點1及2，亦顯示位點3。位點3係經報導為IL-18Rβ之相互作用位點(Kato Z.等人(2003)Nat.Struct.Biol,10：966)。
IL-18BP之IL-18結合位點已藉由丙胺酸突變及藉由與IL-18形成複合物之痘病毒IL-18BP之X射線晶體結構以某種方式鑑別(Krumm等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA；105(52)：20711-20715)。此推定結合位點亦與IL-18上已鑑別為位點2(即IL-18與IL-18Rα之相互作用之兩 個區中之一者)之區相對應。
9.10)藉由氫/氘交換質譜法(H/DxMS)之IL-18表位定位
氫/氘交換質譜法係用於探測人類IL-18之關於MOR9464之表位之資訊。H/DxMS定位依賴於「正常」氫原子與「重」同位素氘間之質量差異，該「重」同位素氘除正常氫核中所存在之單一質子以外亦包含中子。
在自水轉移至基於氘之溶劑系統(重水)時，蛋白質將經歷質量增加，此乃因蛋白質主鏈上之醯基氫逐漸經氘核(氫之較重同位素)替代。氫/氘交換事件之可能性主要係藉由蛋白質結構及溶劑可接觸性來測定。H/DxMS技術係用於量測相對氫/氘交換且因此序列蛋白質結構及溶劑可接觸性。
當蛋白質結合配偶體結合至抗體(例如抗原/抗體相互作用)時，可觀測到其交換速率之實驗上可觀測變化。在複合物形成時排斥溶劑之表面區交換緩慢得多。溶劑排斥區係用於推斷結合位點之定位。在抗原-抗體相互作用之情形下，氘交換速率之變化可強調表位之定位，以及由抗體與抗原之結合導致之任何其他微擾。例如，於抗體結合後之給定交換時間處抗原中之氘攝取量之降低可代表歸因於抗體與此區之直接結合而增加之保護或由於抗體結合導致之結構之間接微擾(異位變化)。該兩種效應不能很容易地區分開來，但所觀測到之最強效應常歸因於來自抗體之直接保護。
抗體結合後氘核納入降低之定位可藉由氫/氘交換後標靶蛋白質之消化(例如利用適宜酶，例如胃蛋白酶)及然後測定相關片段之質量之質譜法來推斷。
藉由將IL-18與95%經氘化PBS緩衝液之儲備溶液稀釋至83.6% D之濃度，以3分鐘及25分鐘之氘交換時間，對316pmol IL-18抗原實施一式三份對照實驗。利用淬滅緩衝液(6M尿素及1M TCEP)使氘交換 淬滅。在淬滅後，藉由在線胃蛋白酶消化/LC-MS分析來分析小瓶。使用填充至2.0×20mm管柱中之Life Science’s Poroszyme固定化胃蛋白酶實施在線胃蛋白酶消化，且於Thermo C18 BioBasic管柱(1.0×50mm)上以100μL/min之流速使用快速梯度實施LC分離，由此所有肽於小於20分鐘內經溶析。流動相係標準逆相流動相：存於水中之0.1%甲酸及存於乙腈中之0.1%甲酸。在該等實驗中，暴露於IL-18表面之主鏈醯基氫將納入氘核。
接著，實施一式三份標記實驗。首先，使用標準技術將MOR9464抗體固定化於蛋白質G瓊脂糖珠粒(Thermo 22851)上。對抗體珠粒離心以去除PBS溶液。然後，將200μL之冷PBS(pH 7.4)及6μL(316pmol)之IL-18添加至經固定化MOR9464抗體，並在4℃下培育15min。在培育後，對該複合物離心，並用200μL PBS洗滌，並再次離心。對於氘交換，將200μL之83.6%氘PBS緩衝液添加至抗原-抗體複合物中，以在4℃下培育3min或25min。然後去除氘緩衝液，且立即添加125μL淬滅緩衝液(如上文)。在淬滅後，將流出物轉移至預冷凍HPLC小瓶中，並使用對照實驗中之相同的在線胃蛋白酶消化/LC-MS分析進行分析。相對與對照實驗，在給定交換時間處抗原-抗體界面中所存在之主鏈醯胺將納入較少氘核。藉由比較標記及對照實驗之H/Dx模式，揭露該表位為在標記實驗中免於離子交換之抗原區域。
當利用MOR9464實施時，此分析之結果揭露IL-18上之三個最顯著保護區。該等區係(參照SEQ ID NO：1)胺基酸87至99、胺基酸119至137及胺基酸138至160。顯示該等區含有參與IL-18BP之結合之胺基酸(圖12)。
9.11)IL-18/抗體片段之X射線結構表徵
藉由模型化及H/DxMS提供之一般表位鑑別證實本文中所闡述之抗體及其片段識別IL-18上之亦藉由IL-18BP識別之區(圖12)。為鑑別 IL-18上之於該等區中之相關胺基酸，實施IL-18/抗體複合物之X射線結構測定。
為製備該抗體片段，在室溫下在200min期間，利用存於100mM Tris-HCl pH 7.0、10mM DTT中之1/300(w/w)木瓜酶裂解13mg濃度為存於10mM組胺酸(pH 5.0)中18mg/mL之MOR9464_N30K。利用50μM之木瓜酶抑制劑E64中止該反應。然後經20mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0)平衡之蛋白質A管柱純化Fab片段。
與IL-18之Fab複合物之純化：將1.33倍過量之人類IL-18(1.6mg，存於PBS中)添加至3.2mg之MOR9464_N30K抗體片段(自蛋白質A流出物回收)中。藉由超濾濃縮與MOR9464_N30K抗體片段之IL-18複合物，將其裝載於SPX-75粒徑排阻層析上，並於10mM Tris-HCl pH 7.4、25mM NaCl中以等度方式溶析。
結晶：藉由超濾將IL-18/MOR9464_N30K抗體片段複合物濃縮至11.8mg/mL，且於96孔板中藉由坐滴形式之蒸氣擴散實施結晶篩選。利用Phoenix機器人系統設定該等實驗，並將其儲存於19℃之RockImager室(RockImager hotel)中。鑑別並表徵兩種晶體形式(形式A及形式B)：
1)晶體形式A自0.1M硫酸鋰、0.1M ADA pH 6.5、12% PEG 4,000生長。(低溫保護劑係儲積溶液(reservoir solution)與20% PEG 4,000、30%甘油之1：1混合物)
2)晶體形式B自59.5% 2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、15%甘油、85mM HEPES pH 7.5生長。(不需要低溫保護劑)。
在Swiss Light Source束線X10SA下利用Pilatus像素檢測器收集X射線數據。利用XDS(2010年12月6日版本)加工所有繞射影像，如APRV中所實踐。
對於晶體形式A，在460mm之晶體-至-檢測器距離處使用0.99999 Å波長之X射線輻射記錄720個0.25°振盪影像中之每一者。
對於晶體形式B，在430mm之晶體-至-檢測器距離處使用0.99984Å波長之X射線輻射記錄720個0.25°振盪影像中之每一者。
藉由利用程式Phaser之分子替代並使用PDB條目3GBM.pdb及2VXT.pdb分別作為MOR9464_N30K抗體片段及IL-18分子之起始模型來測定晶體形式A之結構。使用3GBM.pdb中之抗體片段之可變結構域及第一恆定結構域作為獨立搜索模型。容易獲得每個不對稱單元一種IL-18/MOR9464_N30K抗體片段複合物之澄清溶液。以相同方式測定晶體形式B之結構，但使用衍生自晶體形式A而非PDB條目之細化模型。
結構細化：藉由電子密度圖檢視及於Coot 0.6.2中之模型重建、接著使用autoBUSTER(1.11.2/buster 2.11.2)之自動化細化之多個循環來細化該結構。利用NCONT鑑別分子間接觸，且利用AREAIMOL分析經隱埋表面，兩種分析來自CCP4程序套(6.1.2版本)。X射線數據收集及細化統計係顯示於下表4中。
Figure TWI613217BD00011
Figure TWI613217BD00012
IL-18/MOR9464_N30K片段複合物之結構之全貌圖係顯示於圖13中。在複合物形成時，IL-18上具有減少之溶劑可接觸性之36個胺基酸係經鑑別在IL-18與抗體片段之結合界面處。該等殘基為Leu41、Glu42、Met87、Tyr88、Lys89、Asp90、Ser91、Gln92、Pro93、Arg94、Gly95、Met96、Ala97、Phe138、Gln139、Arg140、Ser141、Val142、Pro143、Gly144、His145、Asp146、Asn147、Met149、Gln150、Glu152、Ser153、Ser154、Glu157、Gly158、Phe160、Glu177、Asp178、Glu179、Leu180及Gly181。
複合物界面中所進行之相關接觸之進一步表徵確定，Arg140及Glu152係可能對此特定複合物形成貢獻最大之胺基酸。兩種殘基係定位於結合界面之中心，且有助於大量分子間接觸(分別21個及18個， 使用4.0Å之截斷距離)。Arg140與L-CDR3(Tyr94L)及H-CDR3(Tyr101H,His102H)殘基二者相互作用。Glu152與L-CDR2 Arg51L形成強(經隱埋)鹽橋相互作用，並接受來自L-CDR3 Tyr94L之H鍵。對抗體鏈中之所有殘基依序編號，殘基編號後面之字母L或H分別指示輕鏈或重鏈中之殘基。
IL-18/MOR9464_N30K抗體片段複合物之三維結構允許對人類IL-18與食蟹猴IL-18之間之不同交叉反應性進行一些進一步調查。與對人類IL-18之2pM相比，MOR9464_N30K對食蟹猴IL-18之反應性(20pM)弱至1/10(表2)。食蟹猴IL-18在6個位置不同於人類IL-18(人類與食蟹猴)：V47I；S86N；T99A；K115R；F170Y及E177K(圖14(A)。在該等位置中，僅麩胺酸177(Glu177；E177)係在IL-18/抗體片段複合物界面處(圖14(B))。因此，可斷然的係，食蟹猴IL-18之食蟹猴序列中之K177引起與MOR9464_N30K之親和力降低至1/10，如表2A第1行中所指示，其中對於人類IL-18而言MOR9464_N30K之KD(SET,pM)係2±1pM，而對於食蟹猴IL-18而言係20±10pM。
為鑑別IL-18Rα MOR9464_N30K抗體片段之何部分競爭，實施IL-18/MOR9464_N30K抗體片段複合物與IL-18/IL-18Rα複合物之疊加。簡言之，藉由使用PyMol(PyMol分子圖形系統，1.2r3pre版本，Schroedinger有限公司)中之比對命令，疊置IL-18/IL-18Rα複合物中之IL-18及IL-18/MOR9464_N30K複合物中之IL-18之結構。
如圖15中所顯示，似乎MOR9464_N30K抗體片段與IL-18Rα之用於結合IL-18之Ig結構域D3競爭。
類似地，使用PyMOL(PyMOL分子圖形系統，1.5.0.版本，Schrödinger有限公司)中之「比對」命令，將IL-18/MOR9464_N30K抗體片段複合物之結構重疊至與痘病毒IL-18BP形成複合物之人類IL-18之結構上(座標檔案使用3F62.pdb)。
如圖16中所顯示，痘病毒IL-18BP與MOR9464_N30K抗體片段之重鏈可變結構域衝突，並主要競爭結合IL-18上之胺基酸殘基Met87至Met96。
該等發現進一步證實本文中所限制之生物化學及表位框並法數據，並顯示本文所闡述之結合分子，特定而言該等抗體及其片段不結合IL-18/IL-18BP複合物。
最後，實施與先前技術鼠類抗體125-2H之比較。利用2VXT.pdb檔案中所發現之125-2H抗體片段之結構實施該分析。簡言之，使用PyMOL(PyMOL分子圖形系統，1.5.0.版本，Schrödinger有限公司)中之「比對」命令，將與MOR9464_N30K抗體片段形成複合物之IL-18之結構重疊至與125-2H Fab形成複合物之IL-18上。
如圖17中所顯示，MOR9464_N30K抗體片段(重疊之左側)及125-2H抗體片段(重疊之右側)在識別IL-18方面重疊。然而，125-2H抗體片段不結合藉由IL-18BP識別之表位，如圖18中所顯示，其中將125-2H/IL-18複合物與痘病毒IL-18BP/IL複合物疊置。該等數據進一步證實，關於125-2H之先前技術文獻(Argiriadi M.A等人(2009)J.Biol.Chem.284：24478)以及生物化學及表位框並法數據二者在本文中顯示鼠類抗體125-2H結合IL-18/IL-18BP複合物。
最後，如圖19中所顯示，MOR9464_N30K之重鏈之30-位置之離胺酸似乎與人類IL-18之Asp 146及Asn 147形成靜電/極性相互作用，此指示離胺酸30參與抗體-抗原複合物之形成。因此，顯而易見，本文9.2部分中所闡述之胞外修飾(例如天冬醯胺脫醯胺)可有助於MOR9464之效能隨時間之損失。MOR9464_N30K中天冬醯胺30經離胺酸之替代似乎提供具有增加之穩定性之MOR9464_N30K。
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<400> 2
Figure TWI613217BD00304
Figure TWI613217BD00305
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 3
Figure TWI613217BD00306
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 4
Figure TWI613217BD00307
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 5
Figure TWI613217BD00308
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 6
Figure TWI613217BD00309
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 7
Figure TWI613217BD00310
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 8
Figure TWI613217BD00311
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 9
Figure TWI613217BD00312
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 10
Figure TWI613217BD00313
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 11
Figure TWI613217BD00314
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 12
Figure TWI613217BD00315
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 13
Figure TWI613217BD00316
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 14
Figure TWI613217BD00317
Figure TWI613217BD00318
<210> 15
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 15
Figure TWI613217BD00319
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 16
Figure TWI613217BD00320
Figure TWI613217BD00321
<210> 17
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 17
Figure TWI613217BD00322
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 18
Figure TWI613217BD00323
Figure TWI613217BD00324
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 19
Figure TWI613217BD00325
Figure TWI613217BD00326
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 20
Figure TWI613217BD00327
<210> 21
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 21
Figure TWI613217BD00328
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 22
Figure TWI613217BD00329
Figure TWI613217BD00330
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 23
Figure TWI613217BD00331
<210> 24
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 24
Figure TWI613217BD00332
Figure TWI613217BD00333
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 25
Figure TWI613217BD00334
<210> 26
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 26
Figure TWI613217BD00335
<210> 27
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 27
Figure TWI613217BD00336
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 28
Figure TWI613217BD00337
<210> 29
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 29
Figure TWI613217BD00338
Figure TWI613217BD00339
<210> 30
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 30
Figure TWI613217BD00340
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 31
Figure TWI613217BD00341
Figure TWI613217BD00342
<210> 32
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 32
Figure TWI613217BD00343
<210> 33
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 33
Figure TWI613217BD00344
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 34
Figure TWI613217BD00345
Figure TWI613217BD00346
<210> 35
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 35
Figure TWI613217BD00347
<210> 36
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 36
Figure TWI613217BD00348
Figure TWI613217BD00349
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 37
Figure TWI613217BD00350
<210>38
<211>360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 38
Figure TWI613217BD00351
<210> 39
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 39
Figure TWI613217BD00352
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 多肽
<400> 40
Figure TWI613217BD00353
<210> 41
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 41
Figure TWI613217BD00354
Figure TWI613217BD00355
<210> 42
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 42
Figure TWI613217BD00356
<210> 43
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 43
Figure TWI613217BD00357
Figure TWI613217BD00358
Figure TWI613217BD00359
Figure TWI613217BD00360
<210> 44
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 44
Figure TWI613217BD00361
Figure TWI613217BD00362
<210> 45
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 45
Figure TWI613217BD00363
Figure TWI613217BD00364
<210> 46
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 46
Figure TWI613217BD00365
Figure TWI613217BD00366
<210> 47
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 47
Figure TWI613217BD00367
Figure TWI613217BD00368
Figure TWI613217BD00369
<210> 48
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 48
Figure TWI613217BD00370
Figure TWI613217BD00371
<210> 49
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 49
Figure TWI613217BD00372
<210> 50
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 50
Figure TWI613217BD00373
Figure TWI613217BD00374
Figure TWI613217BD00375
Figure TWI613217BD00376
<210> 51
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 51
Figure TWI613217BD00377
Figure TWI613217BD00378
<210> 52
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 52
Figure TWI613217BD00379
<210> 53
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 53
Figure TWI613217BD00380
Figure TWI613217BD00381
Figure TWI613217BD00382
<210> 54
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 54
Figure TWI613217BD00383
Figure TWI613217BD00384
<210> 55
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 55
Figure TWI613217BD00385
Figure TWI613217BD00386
<210> 56
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 56
Figure TWI613217BD00387
Figure TWI613217BD00388
Figure TWI613217BD00389
<210> 57
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 57
Figure TWI613217BD00390
Figure TWI613217BD00391
<210> 58
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 58
Figure TWI613217BD00392
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 59
Figure TWI613217BD00393
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 60
Figure TWI613217BD00394
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 61
Figure TWI613217BD00395
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 62
Figure TWI613217BD00396
<210> 63
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 63
Figure TWI613217BD00397
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 64
Figure TWI613217BD00398
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 65
Figure TWI613217BD00399
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 66
Figure TWI613217BD00400
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 67
Figure TWI613217BD00401
Figure TWI613217BD00402
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 68
Figure TWI613217BD00403
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 69
Figure TWI613217BD00404
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 70
Figure TWI613217BD00405
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 71
Figure TWI613217BD00406
<210> 72
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 72
Figure TWI613217BD00407
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 73
Figure TWI613217BD00408
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 74
Figure TWI613217BD00409
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 75
Figure TWI613217BD00410
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 76
Figure TWI613217BD00411
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 77
Figure TWI613217BD00412
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 胜肽
<400> 78
Figure TWI613217BD00413
<210> 79
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 79
Figure TWI613217BD00414
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 80
Figure TWI613217BD00415
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 81
Figure TWI613217BD00416
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 82
Figure TWI613217BD00417
<210> 83
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 83
Figure TWI613217BD00418
Figure TWI613217BD00419
<210> 84
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 84
Figure TWI613217BD00420
<210> 85
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 85
Figure TWI613217BD00421
Figure TWI613217BD00422
<210> 86
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 86
Figure TWI613217BD00423
<210> 87
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 87
Figure TWI613217BD00424
<210> 88
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 88
Figure TWI613217BD00425
Figure TWI613217BD00426
<210> 89
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 89
Figure TWI613217BD00427
<210> 90
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 90
Figure TWI613217BD00428
Figure TWI613217BD00429
<210> 91
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 91
Figure TWI613217BD00430
<210> 92
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 92
Figure TWI613217BD00431
<210> 93
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 93
Figure TWI613217BD00432
Figure TWI613217BD00433
<210> 94
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 94
Figure TWI613217BD00434
<210> 95
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 95
Figure TWI613217BD00435
Figure TWI613217BD00436
<210> 96
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 96
Figure TWI613217BD00437
Figure TWI613217BD00438
Figure TWI613217BD00439
<210> 97
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 97
Figure TWI613217BD00440
Figure TWI613217BD00441
<210> 98
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 98
Figure TWI613217BD00442
Figure TWI613217BD00443
<210> 99
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 99
Figure TWI613217BD00444
<210> 100
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 多肽
<400> 100
Figure TWI613217BD00445
Figure TWI613217BD00446
Figure TWI613217BD00447
<210> 101
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 101
Figure TWI613217BD00448
Figure TWI613217BD00449
<210> 102
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 102
Figure TWI613217BD00450
Figure TWI613217BD00451
<210> 103
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 103
Figure TWI613217BD00452
Figure TWI613217BD00453
Figure TWI613217BD00454
<210> 104
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 104
Figure TWI613217BD00455
Figure TWI613217BD00456
<210> 105
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 105
Figure TWI613217BD00457
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 106
Figure TWI613217BD00458
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 107
Figure TWI613217BD00459
Figure TWI613217BD00460
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 108
Figure TWI613217BD00461
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 109
Figure TWI613217BD00462
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 110
Figure TWI613217BD00463
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 111
Figure TWI613217BD00464
<210> 112
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 112
Figure TWI613217BD00465
Figure TWI613217BD00466
<210> 113
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 113
Figure TWI613217BD00467
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 114
Figure TWI613217BD00468
Figure TWI613217BD00469
<210> 115
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 115
Figure TWI613217BD00470
<210> 116
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 116
Figure TWI613217BD00471
Figure TWI613217BD00472
Figure TWI613217BD00473
Figure TWI613217BD00474
<210> 117
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 117
Figure TWI613217BD00475
Figure TWI613217BD00476
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 118
Figure TWI613217BD00477
Figure TWI613217BD00478
<210> 119
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 119
Figure TWI613217BD00479
Figure TWI613217BD00480
<210> 120
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 120
Figure TWI613217BD00481
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 121
Figure TWI613217BD00482
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 122
Figure TWI613217BD00483
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 123
Figure TWI613217BD00484
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 124
Figure TWI613217BD00485
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 125
Figure TWI613217BD00486
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 126
Figure TWI613217BD00487
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 127
Figure TWI613217BD00488
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 128
Figure TWI613217BD00489
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 129
Figure TWI613217BD00490
<210> 130
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 130
Figure TWI613217BD00491
Figure TWI613217BD00492
<210> 131
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 131
Figure TWI613217BD00493
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 132
Figure TWI613217BD00494
Figure TWI613217BD00495
<210> 133
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 133
Figure TWI613217BD00496
<210> 134
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 134
Figure TWI613217BD00497
Figure TWI613217BD00498
Figure TWI613217BD00499
<210> 135
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 135
Figure TWI613217BD00500
Figure TWI613217BD00501
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 136
Figure TWI613217BD00502
Figure TWI613217BD00503
<210> 137
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 137
Figure TWI613217BD00504
<210> 138
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 138
Figure TWI613217BD00505
Figure TWI613217BD00506
<210> 139
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 139
Figure TWI613217BD00507
<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 140
Figure TWI613217BD00508
Figure TWI613217BD00509
<210> 141
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 141
Figure TWI613217BD00510
<210> 142
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 142
Figure TWI613217BD00511
Figure TWI613217BD00512
Figure TWI613217BD00513
<210> 143
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 143
Figure TWI613217BD00514
Figure TWI613217BD00515
<210> 144
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 144
Figure TWI613217BD00516
Figure TWI613217BD00517
<210> 145
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 145
Figure TWI613217BD00518
<210> 146
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 146
Figure TWI613217BD00519
<210> 147
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 147
Figure TWI613217BD00520
<210> 148
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 148
Figure TWI613217BD00521
Figure TWI613217BD00522
<210> 149
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 149
Figure TWI613217BD00523
Figure TWI613217BD00524
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 150
Figure TWI613217BD00525
Figure TWI613217BD00526
<210> 151
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 151
Figure TWI613217BD00527
Figure TWI613217BD00528
<210> 152
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 152
Figure TWI613217BD00529
<210> 153
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 153
Figure TWI613217BD00530
<210> 154
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 154
Figure TWI613217BD00531
<210> 155
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 155
Figure TWI613217BD00532
Figure TWI613217BD00533
<210> 156
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 156
Figure TWI613217BD00534
Figure TWI613217BD00535
<210> 157
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 157
Figure TWI613217BD00536
Figure TWI613217BD00537
<210> 158
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 158
Figure TWI613217BD00538
Figure TWI613217BD00539
Figure TWI613217BD00540
<210> 159
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 159
Figure TWI613217BD00541
Figure TWI613217BD00542
<210> 160
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 160
Figure TWI613217BD00543
Figure TWI613217BD00544
<210> 161
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 161
Figure TWI613217BD00545
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 162
Figure TWI613217BD00546
Figure TWI613217BD00547
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 163
Figure TWI613217BD00548
<210> 164
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 164
Figure TWI613217BD00549
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 165
Figure TWI613217BD00550
<210> 166
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 166
Figure TWI613217BD00551
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 167
Figure TWI613217BD00552
<210> 168
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 168
Figure TWI613217BD00553
Figure TWI613217BD00554
Figure TWI613217BD00555
<210> 169
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 169
Figure TWI613217BD00556
Figure TWI613217BD00557
<210> 170
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 170
Figure TWI613217BD00558
Figure TWI613217BD00559
<210> 171
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 171
Figure TWI613217BD00560
Figure TWI613217BD00561
<210> 172
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 172
Figure TWI613217BD00562
Figure TWI613217BD00563
Figure TWI613217BD00564
<210> 173
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 173
Figure TWI613217BD00565
Figure TWI613217BD00566
<210> 174
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 174
Figure TWI613217BD00567
Figure TWI613217BD00568
Figure TWI613217BD00569
<210> 175
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 175
Figure TWI613217BD00570
<210> 176
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 176
Figure TWI613217BD00571
Figure TWI613217BD00572
Figure TWI613217BD00573
Figure TWI613217BD00574
<210> 177
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 177
Figure TWI613217BD00575
Figure TWI613217BD00576
<210> 178
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 178
Figure TWI613217BD00577
Figure TWI613217BD00578
<210> 179
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 179
Figure TWI613217BD00579
Figure TWI613217BD00580
<210> 180
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 180
Figure TWI613217BD00581
Figure TWI613217BD00582
Figure TWI613217BD00583
<210> 181
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 181
Figure TWI613217BD00584
<210> 182
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成多肽
<400> 182
Figure TWI613217BD00585
Figure TWI613217BD00586
<210> 183
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成聚核苷酸
<400> 183
Figure TWI613217BD00587
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 184
Figure TWI613217BD00588
<210> 185
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 185
Figure TWI613217BD00589
<210> 186
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 186
Figure TWI613217BD00590
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 胜肽
<400> 187
Figure TWI613217BD00591
<210> 188
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 188
Figure TWI613217BD00592
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 189
Figure TWI613217BD00593
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 190
Figure TWI613217BD00594
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 191
Figure TWI613217BD00595
<210> 192
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 192
Figure TWI613217BD00596
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 193
Figure TWI613217BD00597
<210> 194
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 194
Figure TWI613217BD00598
<210> 195
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 195
Figure TWI613217BD00599
<210> 196
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 196
Figure TWI613217BD00600
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 197
Figure TWI613217BD00601
<210> 198
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 198
Figure TWI613217BD00602
<210> 199
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 199
Figure TWI613217BD00603
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 200
Figure TWI613217BD00604
<210> 201
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 201
Figure TWI613217BD00605
Figure TWI613217BD00606
<210> 202
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 202
Figure TWI613217BD00607
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 203
Figure TWI613217BD00608
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 204
Figure TWI613217BD00609
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 205
Figure TWI613217BD00610
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 206
Figure TWI613217BD00611
<210> 207
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 207
Figure TWI613217BD00612
<210> 208
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 208
Figure TWI613217BD00613
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 209
Figure TWI613217BD00614
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 210
Figure TWI613217BD00615
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 211
Figure TWI613217BD00616
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 胜肽
<400> 212
Figure TWI613217BD00617
<210> 213
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 213
Figure TWI613217BD00618
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 214
Figure TWI613217BD00619
<210> 215
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 215
Figure TWI613217BD00620
<210> 216
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 216
Figure TWI613217BD00621
<210> 217
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 217
Figure TWI613217BD00622
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 218
Figure TWI613217BD00623
<210> 219
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 219
Figure TWI613217BD00624
<210> 220
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 220
Figure TWI613217BD00625
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 221
Figure TWI613217BD00626
<210> 222
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 222
Figure TWI613217BD00627
<210> 223
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 223
Figure TWI613217BD00628
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 224
Figure TWI613217BD00629
<210> 225
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 225
Figure TWI613217BD00630
<210> 226
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 226
Figure TWI613217BD00631
Figure TWI613217BD00632
<210> 227
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 227
Figure TWI613217BD00633
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 228
Figure TWI613217BD00634
<210> 229
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 229
Figure TWI613217BD00635
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 230
Figure TWI613217BD00636
<210> 231
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 231
Figure TWI613217BD00637
<210> 232
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 232
Figure TWI613217BD00638
<210> 233
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 233
Figure TWI613217BD00639
<210> 234
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 234
Figure TWI613217BD00640
<210> 235
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 235
Figure TWI613217BD00641
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 236
Figure TWI613217BD00642
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 胜肽
<400> 237
Figure TWI613217BD00643
<210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 238
Figure TWI613217BD00644
<210> 239
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 239
Figure TWI613217BD00645
<210> 240
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 240
Figure TWI613217BD00646
Figure TWI613217BD00647
<210> 241
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 241
Figure TWI613217BD00648
<210> 242
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 242
Figure TWI613217BD00649
<210> 243
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 243
Figure TWI613217BD00650
<210> 244
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 244
Figure TWI613217BD00651
<210> 245
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 245
Figure TWI613217BD00652
<210> 246
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 246
Figure TWI613217BD00653
<210> 247
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 247
Figure TWI613217BD00654
<210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 248
Figure TWI613217BD00655
<210> 249
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 249
Figure TWI613217BD00656
<210> 250
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 250
Figure TWI613217BD00657
<210> 251
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成 胜肽
<400> 251
Figure TWI613217BD00658
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 252
Figure TWI613217BD00659
<210> 253
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 253
Figure TWI613217BD00660
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 254
Figure TWI613217BD00661
<210> 255
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 255
Figure TWI613217BD00662
<210> 256
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 256
Figure TWI613217BD00663
<210> 257
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 257
Figure TWI613217BD00664
<210> 258
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 258
Figure TWI613217BD00665
<210> 259
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 259
Figure TWI613217BD00666
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 260
Figure TWI613217BD00667
<210> 261
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 261
Figure TWI613217BD00668
<210> 262
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 262
Figure TWI613217BD00669
<210> 263
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 263
Figure TWI613217BD00670
<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列敘述：合成胜肽
<400> 264
Figure TWI613217BD00671

Claims (15)

  1. 一種分離之完全人類、人類化或嵌合抗體或其片段，其特異性結合IL-18，但不結合IL-18/IL-18結合蛋白(IL-18 BP)複合物，其中該分離抗體或其片段包含：i.包含SEQ ID NO：3之重鏈可變區H-CDR1，及ii.包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區H-CDR2，及iii.包含SEQ ID NO：5之重鏈可變區H-CDR3，及iv.包含SEQ ID NO：6之輕鏈可變區L-CDR1，及v.包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變區L-CDR2，及vi.包含SEQ ID NO：8之輕鏈可變區L-CDR3，及vii.重鏈框架胺基酸天冬醯胺30被取代成離胺酸之突變(N30K)。
  2. 如請求項1之分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段係分離之完全人類抗體。
  3. 如請求項1之分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段係選自由Fab、Fab’、F(ab’)2及scFv所組成之群。
  4. 如請求項1之分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：14之重鏈可變域及含有SEQ ID NO：16之輕鏈可變域。
  5. 如請求項1之分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段包含含有SEQ ID NO：43之重鏈及含有SEQ ID NO：45之輕鏈。
  6. 一種分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至5中任一項之分離抗體或其片段。
  7. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個如請求項6之聚核苷酸。
  8. 一種宿主細胞，其包含一或多個如請求項7之選殖或表現載體。
  9. 一種經穩定轉化或轉染之宿主細胞，其包含一或多個如請求項6之聚核苷酸。
  10. 一種產生結合分子之方法，該方法包括在適於產生該結合分子之條件下培養如請求項8之宿主細胞。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之分離抗體或其片段及醫藥載劑，其中該醫藥組合物視情況包含第二治療化合物。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其呈經靜脈內、可吸入或經皮下可投與形式。
  13. 如請求項1至5中任一項之分離抗體或其片段，其用於療法。
  14. 如請求項11或12之醫藥組合物，其用於療法。
  15. 一種如請求項1至5中任一項之分離抗體或其片段或如請求項11或12之醫藥組合物之用途，其係用於製造治療及/或預防哺乳動物患者之以下疾病之醫藥：類肉瘤症(特定而言肺部類肉瘤症)、噬血性淋巴組織球增多症(HLH)、家族性噬血性淋巴組織球增多症(FHL)及其他免疫缺陷症候群、巨細胞關節炎(GCA)、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人型史迪爾氏疾病(AOSD)、全身性幼年自發性關節炎(SJIA)、重度氣喘、眼色素層炎、地圖狀萎縮、1型糖尿病、2型糖尿病或動脈粥樣硬化及其任何組合。
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