BR122019028128B1 - Anticorpo isolado que se liga especificamente a il-18, seu método de produção e seu uso, polinucleotídeo isolado, vetor de clonagem ou expressão, microrganismos transgênicos e seu método de produção, e composição farmacêutica e seu uso - Google Patents

Abstract

IL-18 participa tanto em imunidade inata quanto adquirida. A bioatividade de IL-18 é negativamente regulada por uma proteína de ligação de IL-18 (IL18BP), um inibidor de ocorrência natural e altamente específico. Esta proteína solúvel forma um complexo com a IL-18 livre impedindo sua interação com um receptor de IL-18, desse modo neutralizando e inibindo sua atividade biológica. A presente invenção descreve moléculas de ligação, em particular anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que se ligam à IL-18 e não se ligam à IL-18 ligada à IL-18BP (complexo IL-18/IL-18BP). Independentemente de seu papel fisiológico, a IL-18 foi mostrada mediar uma variedade de doenças autoimunes e inflamatórias. As moléculas de ligação da invenção podem ser usadas como moléculas terapêuticas para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias relacionadas com a IL-18 ou como ferramentas diagnósticas para caracterização, detecção e/ou mensuração da IL-18 não ligada à IL-18BP como componente do lago de IL-18 total.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se às moléculas de ligação, mais particularmente imunoglobulinas, tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que se ligam com a citocina Interleucina 18 (IL-18) porém não se ligam à IL-18 em complexo com o inibidor endógeno proteína de ligação de Interleucina 18 (IL-18BP). A presente invenção também diz respeito ao polinucleotídeo codificando as referidas moléculas de ligação, composições farmacêuticas compreendendo as referidas moléculas de ligação, métodos de tratamento e/ou prevenção de doenças usando as referidas moléculas de ligação e método para detectar e/ou mensurar a presença e/ou a quantidade de IL-18 não ligada à IL-18BP. Outros aspectos, objetivos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição abaixo.

Antecedentes da Invenção

[002] A interleucina-18 (IL-18) foi originalmente descrita em 1989 como fator de indução de interferon-gama (IGIF). A IL-18 está relacionada com a família de IL-1 e está estruturalmente relacionada com a IL-1β (Okamura H et al. (1995) Nature; 378:88-91). A IL-18 é produzida principalmente por macrófagos e células T como uma proteína precursora (pro-IL-18) e secretada como uma proteína ativa seguindo a clivagem por caspase-1 (Dinarello CA et al (1999) J Allergy Clin Immunol; 103:11-24). Em fisiologia normal a IL-18, em sinergia com a IL-12, está associada com a indução de imunidade mediada por célula após a infecção com produtos microbianos, tais como lipopolissacarídeo (LPS) (Sareneva T et al (2000) J Immunol; 165(4):1933-8). Após estimulação com IL-18, células exterminadoras naturais (NK) e células T liberam a citocina interferon gama (INF-y) que desempenha um importante papel na ativação de macrófagos e outras células. A IL-18 tem também várias funções além de uma capacidade de induzir o interferon gama. Estas propriedades biológicas incluem a ativação de NF-KB, expressão de ligante Fas, a indução de ambas as quimiocinas CC e CXC, e produção aumentada de vírus da imunodeficiência humana competente. Devido à capacidade de IL-18 de induzir a produção de INF-y em células T e macrófagos, ela desempenha um importante papel em respostas imunes do tipo Th1 e participa em imunidade tanto inata quanto adquirida.

[003] A IL-18 liga-se com alta afinidade e sinaliza por meio do receptor de IL-18 (IL-18R), um complexo heteromérico de cadeias alfa e beta codificadas pelos genes IL18R1 e IL18RAP, respectivamente (Torigoe K et al (1997) J Biol Chem; 272(41):25737-42). A bioatividade de IL-18 é negativamente regulada pela proteína de ligação de IL-18 (IL18BP), um inibidor de ocorrência natural e altamente específico. Esta proteína solúvel forma um complexo com IL-18 livre impedindo sua interação com o receptor de IL-18, desse modo neutralizando e inibindo sua atividade biológica (Dinarello CA (2000) Ann Rheum Dis; 59 Suppl 1:i17-20). A IL-18BP é uma proteína constitutivamente secretada com ligação de alta afinidade à IL-18. Variantes alternativas de IL-18BP de união a mRNA resultam em quatro isoformas. A proeminente isoforma ‘a’ está presente no soro de humanos sadios em excesso molar de 20 vezes em comparação com a IL-18 (Dinarello e Kaplanski (2005) Expert Rev Clin Immunol, 1(4), 619-632).

[004] Independentemente de seu papel fisiológico, a IL-18 foi mostrada mediar uma variedade de doenças autoimunes e inflamatórias. Foi demonstrado que a expressão de IL-18 é super- regulada em diversas doenças autoimunes, tais como doença de Crohn, psoríase, artrite reumatoide, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares (Braddock et al. (2004) Expert Opin Biol Ther; 4(6):847-860). A IL-18 é também super-regulada em certas doenças inflamatórias, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (Imaoka et al. (2008) Eur Respir; J31:287-297), fibrose pulmonary idiopática (IPF) (Kitasato et al. (2004) Am J Resp Cell Mol Biol; 31:619625), syndrome de ativação de macrófago (MAS) (Dinarello e Kaplanski (2005) Expert Rev Clin Immunol; 1(4): 619-632), doença de Still de início na idade adulta (AOSD) (Arlet JB et al. (2006) Ann Rheum Dis 65(12):1596-601) e Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA) (Akashi et al. (1994) Br J Haematol; 87(2):243-50).

[005] Estudos recentes mostraram que altas quantidades de IL-18 e INF-y em ambas as formas herdadas e adquiridas de linfohistiocitose hemofagocítica (HLH). HLH é caracterizada por linfócitos ativados e histiocitos secretando altas quantidades de citocinas inflamatórias (Janka GE et al (2007) Eur J Paediatr; 166:95-109) e por função prejudicada de células NK e células T citotóxicas. Mais importante, foi mostrado que ambas as formas são caracterizadas por desregulação IL-18 (Mazodier et al (2005) Immunobiology 106(10):3483-89).

[006] O desenvolvimento de moléculas terapêuticas para alvos, tais como IL-18 que são regulados por inibidores naturais pode ser muito desafiador. A presença de uma quantidade aumentada de IL-18 total sistêmica ou local nem sempre reflete o nível de proteína biologicamente ativa (IL-18 livre de IL-18BP). Um composto terapêutico ligando ambas IL-18 livre e IL-18 em complex a IL-18BP, embora potencialmente capaz de neutralizar a atividade de IL-18, seria requerida em maior dose do que uma que possa seletivamente ligar-se apenas IL-18 livre biologicamente ativa. Compostos terapêuticos que necessitam ser administrados em dose elevada podem levar a efeitos colaterais mais pronunciados ou tornarem-se imunogênicos. Altas dosagens também traduzir-se custos de produção elevados.

[007] Compostos terapêuticos que compete para IL-18 quando ligados à IL18BP podem atrapalhar os delicados equilíbrios de IL-18 ativa/livre e IL-18 inativa/ligada a IL-18BP existente em pacientes acometidos com doenças/distúrbios caracterizados por desregulação de IL-18.

[008] Finalmente, investigando doenças caracterizadas por desregulação de IL-18 livre, na ausência de uma ferramenta diagnóstica capaz de detector e/ou medir a IL-18 livre de IL-18BP como componente da IL-18 total seria muito difícil.

Sumário da Invenção

[009] Em um aspecto a presente invenção therefore fornece uma molécula de ligação que especificamente liga-se à IL-18, em que uma molécula de ligação não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP.

[0010] Em uma modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação liga-se a um epítopo de IL-18 em IL-18, como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo compreende aminoácidos Arg140 e Glu152.

[0011] Em outra modalidade deste aspecto, o epítopo pode também compreender qualquer um ou mais dos aminoácidos Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ou Glu177.

[0012] Em ainda outra modalidade deste aspecto, o epítopo pode também compreender qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ou Leu180.

[0013] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação não compete com IL-18BP para ligação a IL-18 quando IL-18BP é ligada a IL-18.

[0014] Em outra modalidade deste aspecto uma molécula de ligação é selecionada de: um anticorpo ilsolado, um fragmento de um anticorpo ilsolado, um único anticorpo de domínio variável, um anticorpo bi- ou multiespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo de domínio variável dual, um imunoconjugado, uma molécula de fibronectina, uma adnectina, uma DARPin, um avímero, um aficorpo, uma anticalina, uma afilina, um mimético de epítopo de proteína ou combinações dos mesmos.

[0015] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação liga-se à IL-18, em que IL-18 compreende de aminoácido 37 a aminoácido 193 de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

[0016] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação inibe interferon gama dependente de produção de IL-18 (INF-y).

[0017] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação liga-se à IL-18 com uma KD de 100pM ou menos.

[0018] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação de acordo com a invenção é um anticorpo isolado totalmente humano, humanizado ou quimérico ou um fragmento do mesmo, preferivelmente, um anticorpo totalmente humano isolado.

[0019] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação é um fragmento de anticorpo ou um único anticorpo de domínio variável, preferivelmente um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv, um dAb ou a VHH.

[0020] Em outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação é um anticorpo biespecífico isolado ou fragmento do mesmo compreendendo uma primeira especificidade para IL-18 e uma segunda especificidade para outro polipeptídeo, por exemplo, IL-12 ou IL-1β.

[0021] Em ainda outra modalidade deste aspecto, uma molécula de ligação é um anticorpo isolado compreendendo uma região Fc de aminoácido mutado ou quimicamente modificado, em que a região Fc de aminoácido mutado ou quimicamente modificado impede ou diminui a atividade de ADCC e/ou aumenta a meia-vida quando comparado com uma região Fc do tipo selvagem. Preferivelmente, a região Fc de aminoácido mutado ou quimicamente modificado é uma região Fc de IgG1 silenciosa.

[0022] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e ii. a região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou variantes conservativas da mesma e iii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[0023] Preferivelmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR 2 compreendendo SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 13.

[0024] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[0025] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 34 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma ou ii. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[0026] Preferivelmente, o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 14 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma e, opcionalmente, aminoácido lisina (Lys; K) na posição 30 com referência a SEQ ID NO:14 é substituído por um aminoácido selecionado de asparagina (Asn; N) ou serina (Ser; S) ou treonina (Thr; T) ou alanina (Ala; A) ou glutamato (Glu; E) ou histidina (His; H) ou leucina (Leu; L) ou glutamina (Gln; Q) ou arginina (Arg; R) ou valina (Val; V) ou tirosina (Tyr; Y) ou isoleucina (Ile; I).

[0027] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 18 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[0028] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 56 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 45 ou variantes conservativas da mesma ou ii. uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 158 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 160 ou variantes conservativas da mesma.

[0029] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 43 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 45 ou variantes conservativas da mesma ou ii. uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 158 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 160 ou variantes conservativas da mesma.

[0030] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e ii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 77 ou SEQ ID NO: 78 ou variantes conservativas da mesma e iii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[0031] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 85 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 93 ou variantes conservativas da mesma.

[0032] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 103 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 98 ou variantes conservativas da mesma.

[0033] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 106 ou variantes conservativas da mesma e ii. a região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 122 ou variantes conservativas da mesma e iii. a região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 108 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 109 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 126 ou variantes conservativas da mesma.

[0034] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 106 conservative variants dos mesmos e ii. a região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 107 ou variantes conservativas da mesma e iii. a região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 108 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 109 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 111 ou variantes conservativas da mesma.

[0035] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 112 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 114 ou variantes conservativas da mesma ou ii. um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 138 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 140 ou variantes conservativas da mesma.

[0036] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. a cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 116 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 118 ou variantes conservativas da mesma ou ii. a cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 142 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 144 ou variantes conservativas da mesma.

[0037] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende: i. uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 120 ou variantes conservativas da mesma e ii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121 ou variantes conservativas da mesma e iii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 123 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 124 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 127 ou SEQ ID NO: 128 ou SEQ ID NO: 129 ou variantes conservativas da mesma.

[0038] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 130 ou variantes conservativas da mesma e um domínio variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 132 ou SEQ ID NO: 147 ou SEQ ID NO: 153 ou variantes conservativas da mesma.

[0039] Em outra modalidade, quando uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo isolado que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 134 ou variantes conservativas da mesma e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 150 ou SEQ ID NO: 156 ou variantes conservativas da mesma.

[0040] Em outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo isolado codificando uma molécula de ligação de acordo com a invenção.

[0041] Em uma modalidade deste último aspecto, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152; ou ii. compreende SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152.

[0042] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154; ou ii. compreende SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154.

[0043] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica a cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 159; ou ii. compreende SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 159; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 159.

[0044] Em outra modalidade deste aspecto, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157 ou SEQ ID NO: 161; ou ii. compreende SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157 ou SEQ ID NO: 161; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157 ou SEQ ID NO: 161.

[0045] Em outro aspecto deste aspecto, é fornecido um vetor de clonagem ou expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos como reivindicado aqui.

[0046] Em uma modalidade, o vetor de clonagem ou expressão de acordo com a invenção compreende pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo de SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 159 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 161 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157.

[0047] A presente invenção também provê uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão como reivindicado aqui.

[0048] Em outro aspecto da presente invenção é fornecida uma célula hospedeira estavelmente transformada ou transfectada compreendendo um ou mais polinucleotídeos como reivindicado aqui.

[0049] A presente invenção também provê um método de produção de uma molécula de ligação, cujo método compreende cultivar uma célula hospedeira como reivindicado aqui sob condições adequadas para a produção da molécula de ligação.

[0050] Em outro aspecto a presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmacêutico e uma molécula de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP.

[0051] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a invenção está em forma intravenosamente, inalável ou subcutaneamente administrável.

[0052] A presente invenção também provê uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP ou a composição farmacêutica compreendendo aquela molécula de ligação para uso em terapia.

[0053] Em outro aspecto da presente invenção é fornecida uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP ou a composição farmacêutica compreendendo aquela molécula de ligação para uso em tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Artrite de Célula Gigante (GCA), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou aterosclerose e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero.

[0054] Em outro aspecto da presente invenção é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Artrite de Célula Gigante (GCA), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou aterosclerose e qualquer combinação das mesmas, em um paciente mamífero cujo método compreende administrar ao paciente mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP ou a composição farmacêutica compreendendo aquela molécula de ligação.

[0055] Em ainda outro aspecto da presente invenção é fornecido o uso de uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP ou a composição farmacêutica compreendendo aquela molécula de ligação na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Artrite de Célula Gigante (GCA), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou aterosclerose e qualquer combinação dos mesmos em um paciente mamífero.

[0056] Em uma modalidade de acordo com o uso da presente invenção, o paciente mamífero é um paciente humano.

[0057] Em outro aspecto, é fornecido um complexo compreendendo IL-18 e uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP de acordo com a invenção.

[0058] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL- 18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP para uso em diagnóstico ou para uso em um kit diagnóstico.

[0059] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP para uso em diagnóstico ou para uso na detecção e/ou mensuração da presença e/ou da quantidade de IL-18 livre (isto é, IL- 18 não ligada a IL-18BP) em uma amostra.

[0060] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a detecção e/ou mensuração da presença e/ou quantidade de IL-18 livre (isto é, IL-18 não ligada a IL-18BP) em uma amostra, em que a amostra é opcionalmente uma amostra humana, em que the method compreende contacting a amostra with uma molécula de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL- 18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP.

[0061] Em uma modalidade deste aspecto, a amostra é sangue humano.

[0062] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um kit diagnóstico compreendendo uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP e/ou o complexo compreendendo IL- 18 e aquela molécula de ligação em que o kit opcionalmente compreende um primeiro composto de controle.

[0063] Em uma modalidade deste aspecto, o primeiro composto de controle é IL-18 livre e o kit opcionalmente compreende um segundo composto de controle que é anticorpo murino 125-2H.

[0064] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido a medical ou diagnostic device compreendendo uma molécula de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP e/ou o complexo compreendendo IL-18 e aquela molécula de ligação.

Breve Descrição dos Desenhos

[0065] Figura 1: CDRs das regiões variáveis de cadeias pesadas dos anticorpos exemplificados aqui.

[0066] Figura 2: CDRs das regiões variáveis de cadeias leves dos anticorpos exemplificados aqui.

[0067] Figura 3 (A-D): Efeitos dos anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre a liberação de IFN-y de PBMCs induzida por LPS/IL-12 (estimulação por IL-18 nativa). Os dados mostram Inibição dependente da concentração de liberação de IFN-y induzido por IL-18 nativa de PBMCs humanas recentemente isoladas de doadores individuais, onde cada ponto dos dados representa a média ± SEM de n=4 cavidades. IL-18 nativa foi estimulada por tratamento com LPS/IL-12 e a linha pontilhada representa a extensão de dependência de IL-18, como determinado pela eficácia máxima de IL-18BPa-Fc humana.

[0068] Figura 4 (A-B): Efeito de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre a liberação de IFN-y de PBMCs induzida por IL-18 recombinante. Os dados mostram a Inibição dependente da concentração de liberação de IFN-y induzida por IL-18 humana recombinante (1nM) de PBMCs humanas recentemente isoladas de doadores individuais representativos, onde cada ponto dos dados representa a média ± SEM de n=4 cavidades.

[0069] Figura 5 (A-C): Efeito de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre a liberação de IFN-y de células KG-1 induzida por IL-18 humana. Os dados mostram a Inibição dependente da concentração de liberação de IFN-y induzida por IL-18 (1nM) humana recombinante de células KG-1, onde cada ponto dos dados representa a média ± SEM de n=4 cavidades.

[0070] Figura 6 (A-C): Efeito de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre a liberação de IFN-y de células KG-1 induzida por IL-18 de cinomolgo. Os dados mostram a inibição dependente da concentração de liberação de IFN-y induzida por IL-18 de cinomolgo recombinante (0,2 nM) de células KG-1, onde cada ponto dos dados representa a média ± SEM de n=4 cavidades.

[0071] Figura 7 (A-E): Efeito de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre IL-18 humana induzida por LPS/IL-12 (estimulação de IL-18 nativa) e subsequente liberação de IFN-y em sangue total humano.

[0072] Figura 8 (A-E): Efeito de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos da presente invenção sobre a liberação de IFN-y induzida por IL-18 humana em sangue total humano. Os dados mostram a inibição dependente da concentração de liberação de IFN-y induzido por IL-18 humana recombinante de sangue total tirado de doadores individuais, onde cada ponto dos dados representa a média ± SEM de n=4 cavidades.

[0073] Figura 9 (A-B): Ligação de anticorpos anti-IL-18 e fragmentos ao complexo de IL-18/IL-18BP. (A) MOR08775 e MOR08776 parentais não reconhecem o complexo de IL-18/IL-18BP. Neste experimento, MOR08775 e MOR08776 foram incubados com complexo biotinilado de IL-18/IL-18BP. (B) O experimento foi realizado de um modo similar como mostrado em A), exceto para usando IL-18 humana não biotinilada. MOR03207 é um anticorpo anti-lisozima e 1252H é IgG de camundongo anti-IL-18 que se liga ao complexo de IL-18/IL- 18BP.

[0074] Figura 10: Armazenamento de epítopo para anticorpos anti- IL-18 MOR8775, MOR8776(A)) e para anticorpos MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I e MOR14431 (B) Enchimentos celulares pretos indicam anticorpos competindo para um epítopo similar, embora nenhum enchimento celular indique nenhuma competição.

[0075] Figura 11 (A-B): A) Estrutura do complexo IL-1β/IL-1R sobreposta sobre o modelo da IL-18/IL-18Rα criado sobre a estrutura do complexo IL-1β/IL-1R. Todas as estruturas foram represaentadas como fita. As estruturas de IL-18 e IL-1β foram usadas para a sobreposição. B) Modelo do complexo de IL-18/IL-18Rα criado sobre a estrutura do complexo de IL-1β/IL-1R. IL-18Rα (mostrada em representação de superfície) compreende três domínios semelhantes à imunoglobulina, D1, D2 e D3. Nos sítios 1 e 2 de IL-18 (mostrados em representação de fita) são os sítios de ligação de IL-18Rα. O sítio 3 é o sítio de ligação IL-18Rβ.

[0076] Figura 12: Comparações dos aminoácidos relevantes ligados em IL-18. 1) Sequência de IL-18 com referência a SEQ ID NO:1 de aminoácidos 37 a 193, 2) de Kim et al., (2000) Proc Natl Acad Sci; 97(3):1190-1195 (modelagem de IL-18BP e seu complexo com IL-18 humana). 3) de Krumm et all., (2008) Proc Natl Acad Sci;, 2008 105(52):, 20711-2071552, Tabela 1. 4) de Kato et al.,( 2003) Nature Struct. Biol. 2003;, 10(11):, 966-971; resíduos envolvidos em ligação de IL-18Rα. 5) H/DxMS resulta em MOR9464 ligado à IL-18.

[0077] Figura 13: Visão geral da estrutura tridimensional do complexo entre IL-18 humana (mostrada em traço de Cα e superfície acessível a solvente) e MOR9464_N30K (mostrado em representação de desenho).

[0078] Figura 14: (A) alinhamento de sequências das sequências de IL-18 humana madura e de cinomolgo (de aminoácido 37 a 193); (B) Representação de enchimento de espaço dos 6 aminoácidos que diferem das duas espécies. E177 é o único presente na interface do complexo de anticorpo. IL-18 é mostrada em traço de Cα e superfície acessível a solvente e MOR9464_N30K é mostrado em representação de desenho.

[0079] Figura 15: Representação de Fita do complexo de IL18/MOR9464_N30K sobreposto sobre o modelo do complexo de IL- 18/IL-18Rα criado sobre a estrutura do complexo de IL-1β/IL-1R. A estrutura de IL-18Rα é mostrada com uma representação de superfície e as cadeias pesadas e leves de MOR9464_N30K estão em cinza escuro e claro respectivamente.

[0080] Figura 16: Representação de fita de IL-18 humana ligada à IL-18 BP de poxvírus (left) e ao fragmento de anticorpo de MOR9464_N30K (direita) e sua sobreposição (centro). A sobreposição baseia-se na estrutura de IL-18. A IL-18 é mostrada em traço de Cα e superfície acessível a solvente e MOR9464_N30K e IL-18 BP de poxvírus são mostrados em representação de desenho.

[0081] Figura 17: Representação de fita de IL-18 humana ligada a fragmento de anticorpo de MOR9464_N30K (direita) e a fragmento de anticorpo 125-2H murino (direita) e sua sobreposição (centro). A sobreposição baseia-se na estrutura de IL-18. A IL-18 é mostrada em traço de Cα e superfície acessível a solvente e MOR9464_N30K e 1252H são mostrados em representação de desenho

[0082] Figure 18: Representação de fita de IL-18 humana ligada a 125-2H sobreposto sobre IL-18 ligada a IL-18BP de poxvírus. A sobreposição baseia-se na estrutura de IL-18. IL-18 é mostrada em traço de Cα e superfície acessível a solvente e MOR9464_N30K, 1252H e IL-18BP de poxvírus são mostrados em representação de desenho.

[0083] Figure 19: Representação de fita de IL-18 humana ligada a Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30K, com resíduos de epítopo e parátopo representados em representação de bastão, mostrando a interação específica com o aminoácido lisina na posição 30 de MOR9464_N30K.

Descrição Detalhada da Invenção 1. Definições

[0084] Para os propósitos de interpretação desta especificação, as seguintes definições aplicar-se-ão e sempre que apropriado, os termos usados no singular incluirão também o plural e vice-versa. Definições adicionais são mencionadas em toda a descrição detalhada.

[0085] O termo "IL-18" é sinônimo de polipeptídeo de IL-18, Polipeptídeo de interleucina-18, Fator de indução de IFN-gama ou Fator de indução de interferon-gama ou fator de indução de INF-y. O termo "IL-18" refere-se à IL-18 humana compreendendo aminoácidos 37 a 193 de SEQ ID NO: 1. Em toda esta especificação, o termo IL-18 abrange tanto pro-IL-18 (precursor de IL-18 madura antaes da clivagem de protease) e IL-18 madura (pós clivagem de protease) alternadamente, a menos que seja especificado que a forma pró- ou madura seja entendida.

[0086] O termo cm IL-18 refere-se a IL-18 de macaco cinomolgocompreendendo aminoácidos 37 a 193 de SEQ ID NO:2.

[0087] O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta ou um fragmento funcional da mesma. Anticorpos de ocorrência natural tipicamente compreendem um tetrâmero que é geralmente composto de pelo menos duas cadeias pesadas (H) e pelo menos duas cadeias leves (L). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada, geralmente compreendidas de três domínios (CH1, CH2 ad CH3). Cadeias pesadas podem ser de qualquer isótipo, incluindo IgG (subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). Cadeia leve inclui cadeias kapa e cadeias lambda. A região variável de cadeia pesada e leve é tipicamente responsável pelo reconhecimento de antígeno, embora a região constante de cadeia pesada e leve possa mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico. As regiões VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

[0088] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antígeno"), como usado aqui, refere-se a tamanho natural ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de especificamente ligar-se a IL-18. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação à antígeno " de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dos fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um gragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature; 341:544546), que consiste em um domínio VH; e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).

[0089] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador flexível que os possibilita serem preparados como uma única cadeia de proteína em que o par de regiões VL e VH para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de única cadeia (scFv); veja, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; e Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sc;. 85:5879-5883). Tais anticorpos de única cadeia são também destinados a ser abrangidos no termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à utilidade da mesma maneira dos anticorpos intactos.

[0090] O termo "isolado" significa em toda esta especificação, que a imunoglobulina, anticorpo ou polinucleotídeo, como o caso pode ser, existe em um meio físico distinto daquele em que ele pode ocorrer na natureza.

[0091] An anticorpo isolado que especificamente liga-se ao polipeptídeo de IL18 pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como IL18 de outras espécies (por exemplo, IL-18 de macaco cinomolgo (cm)). Além disso, um anticorpo isolado pode ser sub stancialmente livre de outro material cellular e/ou químicas.

[0092] Em toda esta especificação, regiões de determinação de complementaridade ("CDR") são definidas de acordo com a definição Kabat, a menos que especificado que a CDR é definida de acordo com a definição Chothia ou por ambas as definições juntas. A definição Kabat é um padrão para numeração dos resíduos em um anticorpo e é tipicamente usada para identificar regiões de CDR (Kabat et al., (1991), 5a. edição, publicação NIH No. 91-3242). A definição Chothia é similar à definição Kabat, porém ela leva em consideração posições de certas alças estruturais (Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196:901-17; Al- Lazikani et al., (1997) J.Mol.Biol. 273:927-948).

[0093] Por convenção, as regiões CDR na Cadeia Pesada são tipicamente referidas como H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 e na cadeia leve como L-CDR1, LCDR2 e L-CDR3. Elas são numeradas sequencialmente na direção da terminação amino à terminação carbóxi.

[0094] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usado aqui se referem à preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação simples e afinidade para um epítopo particular.

[0095] O termo "anticorpo humano", como usado aqui, é destinado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linha germinativa humana, ou versões mutadas de sequências de linha germinativa humana ou anticorpo contendo sequências de estrutura de consenso derivadas de análise de sequências de estrutura humana, por exemplo, como descrito em Knappik, et al., (2000) J Mol Biol; 296:57-86).

[0096] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, não é destinado a incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tais como um camundongo, foram enxertadas sobre sequências de estrutura humana.

[0097] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma especificidade de ligação simples que têm regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências humanas.

[0098] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por métodos recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado deles, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatorial, recombinante, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros métodos que envolvem a união de todo ou uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinants podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e desse modo as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, ao mesmo tempo em que derivadas de, e relacionadas a sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vivo.

[0099] As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas alternadamente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[00100] Como usado aqui, uma molécula de ligação que "especificamente liga-se à IL-18" é destinada a referir-se a uma molécula de ligação que se liga à IL-18 humana com uma KD de 100nM ou menos, 10nM ou menos, 1nM ou menos.

[00101] Uma molécula de ligação que reage cruzado com um antígeno que não a IL-18 é destinada a referir-se a uma molécula de ligação que se liga àquele antígeno com uma KD de 100nM ou menos, 10nM ou menos, 1nM ou menos. Uma molécula de ligação que "não reage cruzado com um antígeno particular" é destinada a referir-se a uma molécula de ligação que exibe ligação essencialmente indetectável com estas roteínas em ensaios de ligação padrões.

[00102] Como usado aqui, o termo "antagonista" é destinado a referir-se a uma molécula de ligação que inibe a atividade de sinalização dependente de IL-18 na presença de IL-18 em um ensaio de célula humana, tal como ensaio de produção de interferon-gama dependente de IL-18 (IFN-y) em células sanguíneas humanas. Exemplos de um ensaio de produção de IFN-y dependente de IL-18 em células sanguíneas humanas são descritos em maiores detalhes nos exemplos abaixo.

[00103] Como usado aqui, um anticorpo sem "nenhuma atividade agonística" é destinado a referir-se a uma molécula de ligação que não aumenta significantemente a atividade de sinalização dependente de IL- 18 na ausência e/ou presença de IL-18 em um ensaio com base em célula, tal como ensaio de produção de IFN-y de células sanguíneas humanas. Tais ensaios são descritos em maiores detalhes nos exemplos abaixo.

[00104] O termo "Kassoc" ou "Ka", como usado aqui, é destinado a referir-se à taxa de associação de uma interação particular de molécula de ligação-antígeno, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd," como usado aqui, é destinado a referir-se à taxa de dissociação de uma interação particular de molécula de ligação-antígeno. O termo "KD", como usado aqui, é destinado a referir-se à constante de dissociação, que é obtida da relação de Kd a Ka (isto é, Kd/Ka) e é expresso como uma concentração molar (M). Valores KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para a determinação da KD de um anticorpo é usando a ressonância de plasmônio de superfície, tal como um sistema Biacore®.

[00105] Como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se à intensidade de interação entre a molécula de ligação e o antígeno em sítios antigênicos individuais.

[00106] Como usado aqui, o termo "alta afinidade" para um anticorpo refere-se a um anticorpo tendo uma KD de 1nM ou menos para um antígeno-alvo.

[00107] Como usado aqui, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano.

[00108] O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, frangos, anfíbios, répteis, etc.

[00109] Como usado aqui, o termo "sequências de nucleotídeo otimizada" significa que a sequências de nucleotídeo foi alterada para codificar uma sequência de aminoácido usando códons que são preferidos na célula ou organismo de produção, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia pastoris, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeo otimizada é construída para reter completamente a sequência de aminoácido originalmente codificada pela sequência de nucleotídeo de partida, que é também conhecida como a sequência "parental". As sequências otimizadas aqui foram construídas para ter codons que são preferidos em células mamíferas de CHO; entretanto a expressão otimizada destas sequências em outras células eucarióticas é também considerada aqui.

[00110] O termo "identidade" refere-se à similaridade entre pelo menos duas diferentes sequências. Esta identidade pode ser expressa como um percentual de identidade e determinada por algoritmos de alinhamento padrão, por exemplo, a Ferramenta de Alinhamento Local Básico (BLAST) (Altshul et al., (1990) J MoI Biol; 215:403-410); o algoritmo de Needleman et al., (1970) J MoI Biol; 48:444-453 ou o algoritmo de Meyers et al., (1988) Comput Appl Biosci; 4:11-17). Um conjunto de parâmetros pode ser a matriz de graduação Blosum 62 com uma penalidade de intervalo de 12, uma penalidade de extensão de intervalo de 4, e uma penalidade de intervalo de enquadramento de 5. O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácido ou nucleotídeo pode também ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, (1989) CABIOS; 4(1):1-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM 120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de interalo de 4. O percentual de identidade é geralmente calculado comparando-se sequências de comprimento similar.

[00111] O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentando antígeno, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou no fígado (incluindo anticorpos, ciocinas, e complemento) que resulta em dano seletivo a, destruição de, ou eliminação do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.

[00112] Uma "série de reação de transdução de sinal" ou "atividade de sinalização" refere-se a uma ligação causal bioquímica geralmente iniciada por uma interação de proteína-proteína, tal como ligação de um fator de crescimento a um receptor, resultando na transmissão de um sinal de uma parte de uma célula para outra parte de uma célula. Em geral, a transmissão envolve fosforilação específica de um ou mais resíduos de tirosina, serina, ou treonina em uma ou mais proteínas na série de reações causando a transdução de sinal. Os penúltimos processos tipicamente incluem eventos nucleares, resultando em uma mudança em expressão de gene.

[00113] O termo "neutraliza" e variações gramaticais do mesmo significam em toda esta especificação, que a atividade biológica do alvo é reduzida ou totalmente ou parcialmente na presença da proteína de ligação ou anticorpo, como o caso pode ser.

[00114] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se ao ácido deoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) e polímeros dos mesmos em forma de filamento único ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange variantes conservativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs, e sequências complementares bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códons degenerados podem ser obtidas por geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) são substituídos com resíduos de base mista e /ou deoxiinosina (Batzer et al., Nucleico Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[00115] O nucleotídeo no "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" pode compreender modificações incluindo modificações de base, tais como derivados de bromouridina e inosina, modificação de ribose, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato.

[00116] O termo "vetor" significa qualquer molécula ou identidade (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo, bacteriofago ou vírus) que é adequada para a transformação ou transfecção de uma célula hospedeira e contém sequências de ácido nucleico que direcionam e/ou controlam (em conjunto com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões de codificação heterólogas operativamente ligadas a elas.

[00117] Uma "variante conservativa" de uma sequência codificando uma molécula de ligação, um anticorpo ou um fragmento do mesmo refere-se a uma sequência compreendendo modificações de aminoácido. "Modificações de aminoácido conservativas" são destinadas a referir-se a modificações de aminoácido que nou alteram significantemente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácido. Substituições de aminoácido conservativas são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído pelo um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia laateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Modificações podem ser introduzidas em uma proteína de ligação da invenção por técnicas padrões conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituição de aminoácido conservativa pode também abranger resíduos de aminoácido de ocorrência não natural que são tipicamente incorporados por síntese de peptídeo química em vez de por síntese em sistemas biológicos. Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, porém não estão limitados a, formas peptidomiméticas, reversas ou invertidas de porções de aminoácido.

[00118] O termo "epítopo" é a parte do antígeno que é reconhecida pelo sistema imune, tais como um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Na presente especificação, o termo "epítopo" é usado alternadamente para ambos os epítopos conformacionais e epítopo lineares. Um epítopo conformacional é composto de seções descontínuas da sequência de aminoácido de antígeno, embora um epítopo linear seja formado por uma sequência contínua de aminoácidos do antígeno.

[00119] O termo "tratar", "tratando", "tratamento", "prevenir", "prevenindo" ou "prevenção" inclui tratamentos terapêuticos, tratamentos profiláticos e aplicações em que alguém reduz o risco de que um indivíduo desenvolva um distúrbio ou outro fator de risco. O tratamento não requer a cura complete de um distúrbio e abrange a redução dos sintomas ou fatores de risco subjacentes.

2. Moléculas de ligação

[00120] O termo "molécula de ligação" como usado aqui significa qualquer proteína ou peptídeo que se liga especificamente ao polipeptídeo de IL-18. "Molécula de ligação" inclui, porém não está limitada a, anticorpos e fragmentos dos mesmos, tais como fragmentos imunologicamente funcionais. O termo "fragmento imunologicamente funcional" de uma cadeia de anticorpo ou imunoglobulina como usado aqui é uma espécie de proteína de ligação compreendendo uma porção (independentemente de como aquela porção é obtida ou sintetizada) de um anticorpo que carece de pelo menos alguns dos aminoácidos presentes em uma cadeia de comprimento natural, porém é ainda capaz de especificamente ligar o polipeptídeo de IL-18. Tais fragmentos são biologicamente ativos, pelo fato de que eles ligam o polipeptídeo de IL- 18. "Molécula de ligação" refere-se a proteínas que especificamente ligam o polipeptídeo de IL-18 e que podem adicionalmente neutralizar a interação do polipeptídeo de IL-18 com o receptor de IL-18.

[00121] O termo "molécula de ligação" como usado aqui também exclui a proteína de ligação de IL-18 de ocorrência natural e a IL-18BP isolada, por exemplo, como descrito na WO2001/085201.

[00122] A molécula de ligação da presente invenção especificamente liga-se à IL-18, em que uma molécula de ligação não se aliga o complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP.

[00123] Como usado aqui, o termo "não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP)" é destinado a referir-se a uma molécula de ligação que se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) com uma KD de 1 x 10-5M ou maior.

[00124] Um meio de avaliar se uma molécula de ligação liga-se à IL- 18, porém não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) é descrito aqui na Exemplificação, seção 9.

[00125] Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ligação especificamente liga-se à IL-18, em que uma molécula de ligação não compete com à proteína de ligação de IL-18 (IL-18 BP) para ligação à IL-18 quando IL-18BP é ligada a IL-18.

[00126] Os termos "compete", "competindo" e "inter-compete" e variações gramaticais dos mesmos são usados alternadamente aqui para significar a capacidade de uma molécula de ligação competir com a IL-18BP para ligação a IL-18 quando a IL-18BP já está ligada à IL-18. As moléculas de ligação da invenção, tais como um anticorpo ou um fragmento do mesmo não compete neste sentido. A competição entre as moléculas de ligação é determinada por um ensaio no qual uma molécula de ligação é testada quanto à ligação específica à IL-18 quando a IL-18 é ligada a IL-18BP. Para evitar dúvida, se uma molécula de ligação pode pode deslocar IL18 de um complexo de IL-18/IL-18BP, então aquela molécula de ligação compete com a IL-18 BP para ligação a IL-18.

[00127] A molécula de ligação de acordo com a invenção não é IL- 18BP, ou IL-18BP isolada ou de ocorrência natural.

[00128] A molécula de ligação pode ser selecionada dos seguintes andaimes: um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um único anticorpo de domínio variável, um anticorpo bi- ou multiespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo de domínio variável dual, um imunoconjugado, uma molécula de fibronectina, uma adnectina, uma DARPin, um avímero, um aficorpo, uma anticalina, uma afilina, um mimético de epítopo de proteína ou combinações dos mesmos e como descrito aqui abaixo.

[00129] Preferivelmente a IL-18 compreende de aminoácido 37 a aminoácido 193 de SEQ ID NO:1 (human IL-18) ou SEQ ID NO:2 (IL-18 de macaco cinomolgo).

[00130] A estrutura de IL-18BP é caracterizada por um domínio semelhante a lg simples e assemelha-se ao segmento extracelular de receptores de citocina com estruturas semelhantes a Ig. A IL-18BP humana foi identificada em quatro diferentes isoformas. A isoforma a de IL-18BP (IL-18BPa) exibiu a maior afinidade para IL-18 com uma taxa rápida, um abrandamento da taxa, e uma constante de dissociação (KD) de 399 pM. A isoforma c de IL-18BP (IL-18BPc) compartilha o domínio de Ig de IL-18BPa exceto para os últimos 29 aminoácidos na terminação C. A KD de IL-18BPc é 10 vezes menor (2,94 nM) do que a IL-18BPa. Não obstante, as IL-18BPa e IL-18BPc neutralizam a IL-18 >95% em um excesso molar de dois. As isoforma b e d de IL-18BP carecem de um completo domínio de Ig e carecem da capacidade de ligar-se a ou neutralizar a IL-18. IL-18BP murina é conhecida em duas isoformas, as isoformas c e d, possuindo idênticos domínios de Ig e também neutraliza >95% de IL-18 murina em um excesso molar de dois. Entretanto, IL- 18BPd murina, que compartilha um motive de terminal C comum com IL-18BPa humana, também neutraliza a IL-18 humana (Kim et al. (2000) Proc Natl Acad Sci, 97(3):1190-1195).

[00131] Em toda esta especificação, o termo "IL-18BP" refere-se a proteínas de ligação de IL-18 humanas, murinas ou virais em toda isoforma, sejam de ocorrência natural, isoladas ou construídas, tais como uma IL-18BP descrita no WO2001/085201 que descreve análogos de IL-18BP ("muteínas") em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos por diferentes substituições conservativas ou deletados, a proteína fundida à IL-18BP (por exemplo, proteína fundida de uma IL-18BP e uma região de cadeia pesada de imunoglobulina ou Fc) e derivados funcionais, tal como IL-18BP PEG-ilada.

[00132] Em uma modalidade, uma molécula de ligação de acordo com a invenção, que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, em que uma molécula de ligação liga-se com um epítopo de IL-18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo: a. é compreendido dentro dos seguintes aminoácidos de IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1: i. aminoácidos 41 e 42 e aminoácidos 87 a 97; ou ii. aminoácidos 138 a 160; ou iii. aminoácidos 177 a 181; ou iv. aminoácidos 41 e 42, aminoácidos 87 a 97, aminoácidos 138 a 160 e aminoácidos 177 a 181; ou v. aminoácidos 41, 42, 87; 89; 90; ou vi. aminoácidos 93, 94; 95, 96; ou vii. aminoácidos 140; 141; 150; 177; ou viii. aminoácidos 92; 93; 94; 138; 140; 152; 157; ou ix. aminoácidos 142; 143; 150; 152; ou x. aminoácidos 143; 144; 145; 177; 180; ou xi. aminoácidos 41, 42, 87; 89; 90; 93, 94; 95, 96; 140; 141; 150; 177; ou xii. aminoácidos 92; 93; 94; 138; 140; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ou xiii. aminoácidos 41; 42, 87; 89; 90; 92; 93, 94; 95, 96; 138; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ou b. compreende de pelo menos um, dois, três, quatro dos aminoácidos como definido em qualquer um dos grupos (i) a (xiii) listados em a); ou c. compreende os aminoácidos, como definido em qualquer um dos grupos (iv) a (xii) listados em a).

[00133] Em outra modalidade, uma molécula de ligação de acordo com a invenção, que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, em que uma molécula de ligação liga-se com um epítopo de IL-18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo compreende aminoácidos Arg140 e Glu152. Em uma modalidade o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ou Glu177. Em outra modalidade o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ou Leu180.

[00134] Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de ligação especificamente liga-se à IL-18, em que uma molécula de ligação não se liga ao complexo de IL-18/isoforma a ou isoforma c de proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BPa ou IL-18BPc), em que uma molécula de ligação é selecionada de: um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um único anticorpo de domínio variável, um anticorpo biou multiespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo de domínio variável dual, um imunoconjugado, uma molécula de fibronectina, uma adnectina, a DARPin, um avímero, um aficorpo, uma anticalina, uma afilina, um mimético de epítopo de proteína ou combinações dos mesmos. Preferivelmente a IL-18 compreende de aminoácido 37 a aminoácido 193 de SEQ ID NO:1 (IL-18 humana) ou SEQ ID NO:2 (IL- 18 de macaco cinomolgo). Mais preferivelmente uma molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

[00135] Em outra modalidade, uma molécula de ligação de acordo com a invenção, que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/ isoforma a ou isoforma c da proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BPa ou IL-18BPc) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, em que uma molécula de ligação liga-se com um epítopo de IL-18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo compreende aminoácidos Arg140 e Glu152. Em uma modalidade o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ou Glu177 e em que uma molécula de ligação é selecionada de: um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um único anticorpo de domínio variável, um anticorpo biou multiespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo de domínio variável dual, um imunoconjugado, uma molécula de fibronectina, uma adnectina, a DARPin, um avímero, um aficorpo, uma anticalina, uma afilina, um mimético de epítopo de proteína ou combinações dos mesmos.

[00136] Em outra modalidade, uma molécula de ligação de acordo com a invenção, que se liga à IL-18 e não se liga à IL-18/ isoforma a ou isoforma c da proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BPa ou IL-18BPc) complex e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, em que uma molécula de ligação liga-se com um epítopo de IL-18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo compreende aminoácidos Arg140 e Glu152 e em que uma molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Nesta modalidade o epítopo pode também compreender qualquer um ou mais dos aminoácidos Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ou Glu177.

[00137] A molécula de ligação da invenção é capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas de IL-18, tais como modulação de Th1; modulação de Th2, modulação de NK, modulação de neutrófilo, modulação da linhagem de monócito-macrófago, modulação de eosinófilo, modulação de célula B, modulação de citocina, modulação de quimiocina; modulação da molécula de adesão, e modulação de recrutamento celular. Em uma modalidade uma molécula de ligação da invenção inibe a produção de interferon gama dependente de IL-18 (INF-y), preferivelmente em células KG-1 cells. Em outra modalidade da invenção, uma molécula de ligação inibe a produção de interferon gama dependente de IL-18 (INF-y) em células KG-1 com uma IC50 de 10nM ou menos ou de 1nM ou menos ou de 100pM ou menos em um ensaio, como definido aqui abaixo, nos exemplos.

[00138] A molécula de ligação da invenção que especificamente ligase à IL-18 tem uma constante de dissociação (KD) de 10nM ou menos em um ensaio, como definido aqui abaixo nos exemplos. Em uma modalidade a KD é de 1nM ou menos. Em outra modalidade uma molécula de ligação tem uma KD de 100pM ou menos e uma molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

[00139] A molécula de ligação de acordo com a invenção pode ser uma molécula de ligação cristalizada, preferivelmente uma molécula de ligação cristalizada de liberação controlada e/ou livre de veículo. Em uma modalidade, a molécula de ligação cristalizada é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em outra modalidade a molécula de ligação cristalizada tem uma meia-vida maior in vivo do que a contraparte solúvel e retém sua função biológica após a cristalização.

[00140] A molécula de ligação de acordo com a invenção pode também ser uma parte de um complexo que compreende uma molécula de ligação e IL-18. Preferivelmente uma molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo em complexo com IL-18.

[00141] Finalmente, uma molécula de ligação de acordo com a invenção pode também competir com anticorpo murino 125-2H para ligação à IL-18 humana.

2) Anticorpos

[00142] Moléculas de ligação de acordo com a presente invenção incluem anticorpos ou fragmentos dos mesmos, isolados e estruturalmente caracterizados como descrito a seguir e como mostrado nas figuras 1 e 2.

2.1) Anticorpos Humanos

[00143] Como usado aqui, um anticorpo humano ou um fragmento do mesmo compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de tamanho natural que são "o produto de" ou "derivadas de" uma sequência de linha germinativa particular se as regiões variáveis ou cadeias de tamanho natural do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linha germinativa humana. Tais sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico transportando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou avaliação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana exibidas em fagos com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano ou fragmento do mesmo que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser identificado como tal comparando-se a sequência de aminoácido do anticorpo humano às sequências de aminoácido de imunoglobulinas de linha germinativa humana e selecionando-se a sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana que é próxima em sequência (isto é, maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido quando compareado à sequência de linha germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado às sequências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linha germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico em sequência de aminoácido à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linha germinativa humana particular exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou mesmo não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.

[00144] Anticorpos humanos podem ser produzidos por diversos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Anticorpos humanos podem ser peparados pelo Método de hibridoma usando linhagens de células de mieloma humano ou heteromieloma de camundongo-humano (Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal anticorpo isolado Production Techniques e Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fago ou camundontos transgênicos ambos os quais utilizam repertórios de região variável humana (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:1123).

[00145] Diversas linhagens transgênicas de camundongos são agora disponíveis onde seus locos de imunoglobulina de camundongo foram substituídos por segmentos de gene de imunoglobulina humana (Tomizuka K, (2000) Proc Natl Acad Sci, 97:722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol 14:845-851; Mendez MJ, (1997) Nature Genetics 15:146-156). Em desafio de antígeno tais camundongtos são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos dos quais os anticorpos de interesse podem ser selecionados. De nota particular é o sistema TrimeraTM (Eren R et al, (1988) Immunology 93:154-161) onde linfócitos humanos são transplantados em camundongos irradiados, o Sistema de Anticorpo Isolado de Linfócito Selecionado (SLAM, Babcook et al, Proc Natl Acad Sci (1996) 93:7843-7848) onde linfócitos humanos (ou outras espécies) são efetivamente colocados em um procedimento de geração de anticorpo isolado in vitro reunidos maciços seguido por procedimento de seleção e diluição limitante, deconvoluído e o XenomouseTM (Abgenix Inc). Um Método alternative é disponível de Morphotek Inc usando a tecnologia MorphodomaTM.

[00146] Tecnologia de exibição de fago pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos dos mesmos, (McCafferty; (1990) Nature, 348:552-553 e Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260). De acordo com esta técnica, genes de domínio variável isolado de anticorpo são clonados em estrutura em ou revestimento maior ou menor de gene de proteína de um facteriofago filamentoso, tal como M13 ou fd e mostrado (geralmente com o auxílio de um fago auxiliar) como função de fragmentos isolados de anticorpo na superfície da partícula de fago. Seleções com base nas propriedades de função do anticorpo isolado resultam na seleção do gene codificando o anticorpo isolado exibindo estas propriedades. A Técnica de exibição de fago pode ser usada para selecionar anticorpos específicos de antígeno de bibliotecas preparadas de células B humanas tiradas de indivíduos acometidos com uma doença ou distúrbio ou alternativamente de doadores humanos não imunizados (Marks; J Mol Bio (1991) 222:581591,). Onde um anticorpo isolado humano intacto é desejado compreendendo um domínio Fc é necessário reclonar o fragmento derivado exibido de fago em um vetor de expressão compreendendo as regiões constantes desejadas e linhagens celulares expressando estável estabelecimento.

[00147] A Técnica de maturação de afinidade (Marks; Biotechnol (1992) 10:779-783) pode ser usada para fornecer afinidade de ligação em que a afinidade do anticorpo isolado humano primário é melhorada sequencialmente substituindo as regiões variáveis de cadeia H e L por variantes de ocorrência natural e seleção com base em afinidades de ligação melhorada. Variantes desta técnica, tais como ‘impreção de epítopo’ são atualmente também disponíveis (WO 93/06213; Waterhouse; Nucl Acids Res (1993) 21:2265-2266).

[00148] Várias modalidades (enumeradas) da invenção são descritas aqui. Será reconhecido que aspectos especificados em cada modalidade podem ser combinados com outros aspectos especificados para fornecer outras modalidades da presente invenção.

[00149] Modalidade 1: uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação é um anticorpo humano isolado ou um fragmento do mesmo; preferivelmente, um anticorpo monoclonal humano isolado ou um fragmento do mesmo.

[00150] Modalidade 2: O anticorpo humano isolado ou um fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 1, em que o anticorpo humano isolado ou um fragmento do mesmo liga-se com um epítopo de IL-18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo: a. é compreendido dentro dos seguintes aminoácidos de IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1: i. aminoácidos 41 e 42 e aminoácidos 87 a 97; ou ii. aminoácidos 138 a 160; ou iii. aminoácidos 177 a 181; ou iv. aminoácidos 41 e 42, aminoácidos 87 a 97, aminoácidos 138 a 160 e aminoácidos 177 a 181; ou v. aminoácidos 41, 42, 87; 89; 90; ou vi. aminoácidos 93, 94; 95, 96; ou vii. aminoácidos 140; 141; 150; 177; ou viii. aminoácidos 92; 93; 94; 138; 140; 152; 157; ou ix. aminoácidos 142; 143; 150; 152; ou x. aminoácidos 143; 144; 145; 177; 180; ou xi. aminoácidos 41, 42, 87; 89; 90; 93, 94; 95, 96; 140; 141; 150; 177; ou xii. aminoácidos 92; 93; 94; 138; 140; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ou xiii. aminoácidos 41; 42, 87; 89; 90; 92; 93, 94; 95, 96; 138; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ou b. compreende de pelo menos um, dois, três, quatro dos aminoácidos como definido em qualquer um dos grupos (i) a (xiii) listados em a); ou c. compreende os aminoácidos, como definido em qualquer um dos grupos (iv) a (xii) listados em a).

[00151] Modalidade 3: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 1, que se liga a um epítopo de IL- 18 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o epítopo compreende aminoácidos Arg140 e Glu152.

[00152] Modalidade 4: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 3, em que o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ou Glu177.

[00153] Modalidade 5: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 3 e 4, em que o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ou Leu180.

[00154] Modalidade 6: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que IL-18 compreende de aminoácido 37 a aminoácido 193 de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

[00155] Modalidade 7: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo inibe a produção de interferon gama dependente de IL-18 (INF-y).

[00156] Modalidade 8: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 com uma KD de 100pM ou menos.

[00157] Modalidade 9: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo também compete com anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00158] Modalidade 10: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00159] Modalidade 11: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00160] Modalidade 12: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 11, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00161] Modalidade 13: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 9 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00162] Modalidade 14: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 13, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 9 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00163] Modalidade 15: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 13 ou 14, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, em que o anticorpo isolado ou fragmento do mesmo compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e ii. a região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 9 ou variantes conservativas da mesma e iii. a região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00164] Preferivelmente este anticorpo humano isolado é um anticorpo totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo, Mais preferivelmente um anticorpo monoclonal totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo.

[00165] Modalidade 16: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 10 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00166] Modalidade 17: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 11 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00167] Modalidade 18: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 12 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00168] Modalidade 19: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 10, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00169] Modalidade 20: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 19, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00170] Modalidade 21: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 19 ou 20, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1 em que o anticorpo isolado ou fragmento do mesmo compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou variantes conservativas da mesma e ii. a região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13 ou variantes conservativas da mesma e iii. a região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou variantes conservativas da mesma e iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou variantes conservativas da mesma e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 7 ou variantes conservativas da mesma e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8 ou variantes conservativas da mesma.

[00171] Preferivelmente este anticorpo humano isolado é um anticorpo totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo.

[00172] Modalidade 22: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 77 ou SEQ ID NO: 78 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[00173] Modalidade 23: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 22, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 75 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[00174] Modalidade 24: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 22, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 76 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[00175] Modalidade 25: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 22, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 77 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[00176] Modalidade 26: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 22, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 74 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 78 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 79 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 80 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 81 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 82 ou variantes conservativas da mesma.

[00177] Modalidade 27: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 106 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 122 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 108 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 109 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 126 ou variantes conservativas da mesma.

[00178] Modalidade 28: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 27, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 106 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 107 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 108 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 109 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 111 ou variantes conservativas da mesma.

[00179] Preferivelmente este anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo é um anticorpo totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo. Mais preferivelmente um anticorpo monoclonal totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo.

[00180] Modalidade 29: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 106 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 122 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 108 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 109 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 126 ou variantes conservativas da mesma.

[00181] Modalidade 30: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 120 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 123 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 124 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 127 ou SEQ ID NO: 128 ou SEQ ID NO: 129 ou variantes conservativas da mesma.

[00182] Modalidade 31: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 30, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 120 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 123 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 124 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 127 ou variantes conservativas da mesma.

[00183] Modalidade 32: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 30, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 120 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 123 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 124 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 128 ou variantes conservativas da mesma.

[00184] Modalidade 33: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 30, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 120 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 123 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 124 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 129 ou variantes conservativas da mesma.

[00185] As regiões CDR representadas acima são delineadas usando o Sistema Kabat (Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, Publicação NIH No. 91-3242).

[00186] Em algumas outras modalidades da invenção, o anticorpo humano ou fragmento do mesmo compreende as regiões CDR delineadas usando a definição Chothia (Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-17).

[00187] Modalidade 34: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 65 ou SEQ ID NO: 66 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 67 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 61 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 62 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 63 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 ou variantes conservativas da mesma.

[00188] Modalidade 35: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 34, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 59 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 60 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 61 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 62 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 63 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 ou variantes conservativas da mesma.

[00189] Modalidade 36: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 35, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 1252H para ligação a IL-18.

[00190] Modalidade 37: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 34, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 65 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 60 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 61 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 62 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 63 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 ou variantes conservativas da mesma.

[00191] Modalidade 38: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 37, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 1252H para ligação a IL-18.

[00192] Modalidade 39: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 34, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 66 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 67 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 61 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 62 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 63 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 ou variantes conservativas da mesma.

[00193] Modalidade 40: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 39, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 1252H para ligação a IL-18.

[00194] Modalidade 41: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 34, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 68 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 69 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H- CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 70 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 71 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 72 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 73 ou variantes conservativas da mesma.

[00195] Modalidade 42: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 162 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 163 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 164 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 165 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 166 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 167 ou variantes conservativas da mesma.

[00196] Sob definição Kabat, como descrito acima, os resíduos de CDR de aminoácido no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2), e 95-102 (H-CDR3); e os resíduos de CDR de aminoácido no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2), e 89-97 (L-CDR3). Sob Chothia os aminoácidos de CDR em VH são numerados 26-32 (H- CDR1), 52-56 (H-CDR2), e 95-102 (H-CDR3); e os resíduos de aminoácido em VL são numerados 26-32 (L-CDR1), 50-52 (L-CDR2), e 91-96 (L-CDR3). Combinando-se as definições de CDR de ambos Kabat e Chothia e levando em consideração a inserção para alças mais longas, as CDRs consistem em resíduos de aminoácido 26-35 (H- CDR1), 50-65 (H-CDR2), e 95-102 (H-CDR3) em VH humana e resíduos de aminoácido 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2), e 89-97 (L-CDR3) em VL humano.

[00197] Modalidade 43: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo SEQ ID NO: 14 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma e em que a região variável de cadeia pesada (VH) compreende: i. a região variável de cadeia pesada H-CDR1 correspondendo aos aminoácidos 26 to 35 SEQ ID NO: 14; e ii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 correspondendo aos aminoácidos 50 to 66 SEQ ID NO: 14; e iii. a região variável de cadeia pesada H-CDR3 correspondendo aos aminoácidos 99 to 108 SEQ ID NO: 14; e em que a região variável de cadeia leve (VL) compreende: iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 correspondendo aos aminoácidos 23 a 35 SEQ ID NO: 16; e v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 correspondendo aos aminoácidos 51 a 57 SEQ ID NO: 16; e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 correspondendo aos aminoácidos 90 a 100 SEQ ID NO: 16.

[00198] Modalidade 44: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 43, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00199] Modalidade 45: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 43 ou 44, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157, Glu177 e Leu180.

[00200] Modalidade 46: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo SEQ ID NO: 18 ou variantes conservativas da mesma e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma e em que a região variável de cadeia pesada (VH) compreende: i. uma região variável de cadeia pesada H-CDR1 correspondendo aos aminoácidos 26 to 35 SEQ ID NO: 18; e ii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR2 correspondendo aos aminoácidos 50 to 66 SEQ ID NO: 18; e iii. uma região variável de cadeia pesada H-CDR3 correspondendo aos aminoácidos 99 to 108 SEQ ID NO: 18; e em que a região variável de cadeia leve (VL) compreende: iv. uma região variável de cadeia leve L-CDR1 correspondendo aos aminoácidos 23 to 35 SEQ ID NO: 20; and v. uma região variável de cadeia leve L-CDR2 correspondendo aos aminoácidos 51 to 57 SEQ ID NO: 20; e vi. uma região variável de cadeia leve L-CDR3 correspondendo aos aminoácidos 90 to 100 SEQ ID NO: 20.

[00201] Modalidade 47: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 46, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00202] Modalidade 48: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 46 ou 47, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1.

[00203] Devido ao fato de que cada um destes anticorpos humanos pode ligar-se à IL18 e que a especificidade de ligação a antígeno é fornecida primariamente pela CDR1, regiões 2 e 3, a H-CDR1, sequências 2 e 3 e L-CDR1, sequências 2 e 3 podem ser "misturadas e comparadas" (isto é, CDRs de diferentes anticorpos humanos podem ser misturadas e comparadas, cada anticorpo contendo um conjunto de H-CDR1, 2 e 3 e um conjunto de L-CDR1, 2 e 3 cria outras moléculas de ligação anti-IL18 da invenção. A ligação de IL18 de tais anticorpos "misturados e comparados" pode ser testada usando os ensaios de ligação nos exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando as sequências de CDR de VH são misturadas e comparadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VH particular deve ser substituída por uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Igualmente, sequências de CDR de VL são misturadas e comparadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VL particular deve ser substituída por uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Será facilmente evidente para o técnico versado que novas sequências VH e VL podem ser criadas substituindo- se uma ou mais sequências de região de CDR de VH e/ou VL por sequências estruturalmente similares das sequências de CDR mostradas aqui para anticorpos humanos da presente invenção (Figuras 1 e 2).

[00204] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano isolado ligando IL-18 e não ligando o complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreendendo sequências de aminoácido VH selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 83, 87, 90, 93, 112, 130 e 138 e sequências de aminoácido VL selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 16, 20, 85, 114, 132, 140, 147 e 153. Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados por deleção, inserção ou substituição de aminoácido, ainda têm pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade nas regiões de CDR com as regiões de CDR representadas nas sequências descritas acima. Em algumas modalidades, incluem sequências de aminoácido mutante em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados por deleção, inserção ou substituição de aminoácido nas regiões de CDR quando comparado com as regiões de CDR representadas nas sequências descritas acima.

[00205] Modalidade 49: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 28 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma.

[00206] Modalidade 50: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 49, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 28 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma, em que o aminoácido asparagina (Asn; N) na posição 30 com referência a SEQ ID NO: 28 é substituído por um aminoácido selecionado de lisina (Lys; K) ou serina (Ser; S) ou treonina (Thr; T) ou alanina (Ala; A) ou glutamato (Glu; E) ou histidina (His; H) ou leucina (Leu; L) ou glutamina (Gln; Q) ou arginina (Arg; R) ou valina (Val; V) ou tirosina (Tyr; Y) ou isoleucina (Ile; I) ou glicina (Gly; G).

[00207] Modalidade 51: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 49 ou 50, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00208] Modalidade 52: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 49 to 51, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00209] Modalidade 53: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 14 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma.

[00210] Modalidade 54: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 53, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00211] Modalidade 55: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 53 to 55, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00212] Modalidade 56: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 53, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 14 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma, em que o aminoácido lisina (Lys; K) na posição 30 com referência a SEQ ID NO: 14 é substituído por um aminoácido selecionado de asparagina (Asn; N) ou serina (Ser; S) ou treonina (Thr; T) ou alanina (Ala; A) ou glutamato (Glu; E) ou histidina (His; H) ou leucina (Leu; L) ou glutamina (Gln; Q) ou arginina (Arg; R) ou valina (Val; V) ou tirosina (Tyr; Y) ou isoleucina (Ile; I) ou glicina (Gly; G).

[00213] Modalidade 57: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 56, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00214] Modalidade 58: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 55 ou 57, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00215] Modalidade 59: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 18 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[00216] Modalidade 60: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 59, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00217] Modalidade 61: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 59 ou 60, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00218] Modalidade 62: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[00219] Modalidade 63: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 62, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma, em que i. aminoácido glutamato (Glu; E) na posição 1 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído pelo aminoácido glutamina (Gln; Q) e ii. em que o aminoácido asparagina (Asn; N) na posição 30 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de serina (Ser; S) ou treonina (Thr; T) ou aspartato (Asp; D).

[00220] Modalidade 64: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 63, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma, em que i. aminoácido glutamato (Glu; E) na posição 1 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído pelo aminoácido glutamina (Gln; Q); e ii. em que o aminoácido asparagina (Asn; N) na posição 30 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de serina (Ser; S) ou treonina (Thr; T) ou aspartato (Asp; D); and iii. em que o aminoácido metionina (Met; M) na posição 54 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de tirosina (Tyr; Y) ou asparagina (Asn; N) ou isoleucina (Ile; I).

[00221] Modalidade 65: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 62 a 64, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00222] Modalidade 66: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 65 a 66, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00223] Modalidade 67: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 62, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma, em que i. o aminoácido glutamato (Glu; E) na posição 1 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído pelo aminoácido glutamina (Gln; Q) e ii. em que o aminoácido serina (Ser; S) na posição 31 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de treonina (Thr; T) ou asparagina (Asn; N) ou alanina (Ala; A).

[00224] Modalidade 68: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 67, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 40 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma, em que i. o aminoácido glutamato (Glu; E) na posição 1 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído pelo aminoácido glutamina (Gln; Q); e ii. em que o aminoácido serina (Ser; S) na posição 31 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de treonina (Thr; T) ou asparagina (Asn; N) ou alanina (Ala; A). iii. em que o aminoácido metionina (Met; M) na posição 54 com referência a SEQ ID NO: 40 é substituído por um aminoácido selecionado de tirosina (Tyr; Y) ou asparagina (Asn; N) ou isoleucina (Ile; I).

[00225] Modalidade 69: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 67 ou 68, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00226] Modalidade 70: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 67 to 69, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00227] Modalidade 72: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada (VH) selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 34 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 ou variantes conservativas da mesma.

[00228] Modalidade 73: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) aminoácido sequence selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 37 e uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve (VL) selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variantes conservativas da mesma.

[00229] Modalidade 74: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 43, 47, 50, 53, 56, 96, 100, 103, 116, 134, 142 e 158 ou variantes conservativas da mesma; e uma sequência de aminoácido de VL selecionada das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 45, 98, 118, 136, 144, 150, 156 e 160 ou variantes conservativas da mesma.

[00230] Modalidade 75: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 43 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 45 ou variantes conservativas da mesma.

[00231] Modalidade 76: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 75, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00232] Modalidade 77: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 75 ou 76, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00233] Modalidade 78: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 158 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 160 ou variantes conservativas da mesma.

[00234] Modalidade 79: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a modalidade 78, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00235] Modalidade 80: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 78 ou 79, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00236] Modalidade 81: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 56 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 45 ou variantes conservativas da mesma.

[00237] Modalidade 82: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 100 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada das sequências mostradas na SEQ ID NO: 160 ou variantes conservativas da mesma.

[00238] Modalidade 83: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com as modalidades 81 ou 82, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação à IL-18.

[00239] Modalidade 84: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 81 a 83, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que o anticorpo ou fragmento do mesmo liga-se a um epítopo compreendendo Arg140 e Glu152 sobre IL-18 como definido com referência a SEQ ID NO:1, opcionalmente o epítopo também compreende qualquer um ou mais dos aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ou Leu180, preferivelmente o epítopo também compreende os aminoácidos Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 e Leu180.

[00240] Modalidade 85: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada das sequências mostradas na SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 103 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada das sequências mostradas na SEQ ID NO: 98 ou variantes conservativas da mesma.

[00241] Modalidade 86: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 116 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 118 ou variantes conservativas da mesma.

[00242] Modalidade 87: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 142 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 144 ou variantes conservativas da mesma.

[00243] Modalidade 88: O anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo humano isolado ou fragmento do mesmo liga-se à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e compreende uma sequência de aminoácido de VH selecionada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 134 ou variantes conservativas da mesma e uma sequência de aminoácido de VL selecionada das sequências mostradas na SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 150 ou SEQ ID NO: 156 ou variantes conservativas da mesma.

2.2) Anticorpos humanizados ou quiméricos

[00244] Uma alternativa óbvia para a invenção descrita aqui é o uso de anticorpos humanizados ou quiméricos em lugar de anticorpos humanos.

[00245] O uso de anticorpos não humanos intactos no tratamento de doenças ou distúrbios humanos transporta com ele o potencial para os problemas agora bem estabelecidos de imnogenicidade. Isto é, o sistema immune do paciente pode reconhecer o anticorpo isolado intacto não humano como não auto e montam uma resposta de anticorpo. Isto é particularmente evidente na administração múltipla do anticorpo não humano isolado a um paciente humano. Várias técnicas foram desenvolvidas durante anos para superar estes problemas e geralmente envolvem a redução da assinatura de imunogenicidade não humana no anticorpo isolado intacto, embora mantendo a facilidade relativa na obtenção de anticorpos não humanos de um animal imunizado, por exemplo, camundongo, rato ou coelho. Amplamente dois métodos foram usados para obter isto. O primeiro são anticorpos quiméricos (algumas vezes "quimérico"), que geralmente compreendem um domínio variável não humano (por exemplo, roedor, tal como camundongo) fundido a uma região constante humana. Por que o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo isolado é localizado dentro das regiões variáveis o anticorpo isolado quimérico mantém sua afinidade de ligação para o antígeno, porém adquire as funções efetoras da região constante humana e é, portanto, capaz de realizar funções efetoras, tal como descrito supra. Anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinante. DNA codificando os anticorpos (por exemplo, cDNA) é isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo isolado da invenção). Células de hibridoma servem como uma fonte típica de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA é colocado nos vetores de expressão que são então transfectados nas células hospedeiras, tais como E.coli, células COS, células CHO ou células de mieloma que não produzem de outro modo a proteína de imunoglobulina para obter a síntese do anticorpo isolado. O DNA pode ser modificado substituindo-se a sequência de codificação para cadeias L e H humanas para as correspondentes regiões constantes H e L não humanas (por exemplo, murinas) (Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)).

[00246] O Segundo Método envolve a geração de anticorpos humanizados, em que o teor não humano do anticorpo isolado é reduzido por humanização das regiões variáveis. Duas técnicas para humanização ganharam popularidade. A primeira é a humanização por enxerto de CDR. CDRs constroi alças próximas à terminação N do anticorpo isolado onde elas formam uma superfície montada em um andaime fornecido pela região de estrutura. A especificidade de ligação de antígeno do anticorpo isolado é principalmente definido pela topografia e pelas características químicas de sua superfície de CDR. Estes aspectos são, por sua vez, determinados pela conformação das CDRs individuais, pela disposição relativa das CDRs, e pela natureza e disposição das cadeias laterais dos resíduos compreendendo as CDRs. Um grande decréscimo em imunogenicidade pode ser obtido por enxerto apenas das CDRs de um anticorpo não humano (por exemplo, murino) (anticorpos ‘doadores’) na estrutura humana (‘estrutura aceptora’) e regiões constantes (Jones et al (1986) Nature 321:522-525 e Verhoeyen M et al (1988) Science 239:1534-1536). Entretanto, o enxerto de CDR em si, pode não resultar na retenção completa de propriedades de ligação de antígeno e sua frequência descobriu que alguns resíduos de estrutura (algumas vezes referido como ‘novas mutações’) do anticorpo isolado doador necessário para ser preservado no composto humanizado se afinidade de ligação a antígeno significante deve ser recuperada (Queen C et al., (1989) Proc Natl Acad Sci 86:10029-10033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, regiões variáveis humanas mostrando a maior homologia de sequências para o anticorpo isolado doador não humano são escolhidas de uma base de dados a fim de fornecer a estrutura humana (FR). A seleção de FRs humanas pode ser feita ou de anticorpos de consenso humano ou humanos individuais. Onde necessário, resíduos chave do anticorpo isolado doador são substituídos na estrutura aceptora humana para preservar conformações de CDR. Modelagem de comptador do anticorpo isolado pode ser usada para ajudar a identificar tais resíduos estruturalmente importantes.

[00247] Alternativamente, a humanização pode ser obtida por um processo de ‘veneering’. Uma análise estatística de regiões variáveis de única cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana e murina revelou que os padrões precisos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos humanos e murinos, e a maioria das posições de superfície individuais tem uma forte preferência para um pequeno número de diferentes resíduos (Padlan EA, et al; (1991) Mol Immunol 28:489-498 e Pedersen JT et al (1994) J Mol Biol 235:959-973). Portanto, é possível reduzir a imunogenicidade de uma Fv não humana substituindo resíduos expostos em suas regiões de estrutura que diferem daquelas geralmente encontradas em anticorpos humanos. Por que a antigenicidade de proteína pode estar correlacionada com a acessibilidade de superfície, a substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar a região variável de camundongo ‘invisível’ para o sistema imune humano (também Mark GE et al (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology vol 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134). Este procedimento de humanização é referido como ‘veneering’ por que apenas a superfície do anticorpo isolado é alterada, os resíduos de suporte permanecem não perturbados.

2.3) Fragmentos de anticorpo isolado e anticorpos de único domínio variável

[00248] Em outra modalidade da invenção, uma molécula de ligação é um fragmento de um anticorpo ou um único anticorpo de domínio variável que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP). Preferivelmente, uma molécula de ligação é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, a Fv, um scFv, um dAb ou a VHH.

[00249] Tradicionalmente, tais fragmentos são produzidos pela digestão proteolítica de anticorpos intactos, por exemplo, por digestão de papaína (veja, por exemplo, WO 94/29348), porém podem ser produzidos diretamente de células hospedeiras recombinantemente transformadas. Além disso, fragmentos de anticorpo isolado podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas de construção como descrito abaixo.

[00250] Fragmentos Fv parecem ter menor energia de interação de suas duas cadeias do que os fragmentos de Fab. Para estabilizar a associação dos domínios de VH e VL, eles foram ligados com peptídeos (Bird et al, (1988) Science, 242:423-426, Huston et al, (1998) PNAS, 85:5879-5883), pontes de dissulfeto (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29:1362-1367) e mutações ‘botão em buraco’ (Zhu et al (1997), Protein Sci, 6:781-788). Fragmentos de ScFv podem ser produzidos por métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica (Whitlow et al (1991), Methods companion Methods Enzymol, 2:97-105 e Huston et al (1993) Int Rev Immunol 10:195-217). ScFv pode ser produzido em células bacterianas, tais como E.coli, porém são mais preferivelmente produzidas em células eucarióticas. Uma desvantagem de scFv é a monovalência do produto, que impossibilita uma avidez aumentada devido à ligação polivalente, e sua meia-vida curta. Tentativas para superar estes problemas incluem (scFv’)2 bivalente produzida de scFv contendo uma cisteína de terminal C adicional por acoplamento químico (Adams et al (1993) Can Res 53:4026-4034 e McCartney et al (1995) Protein Eng, 8:301-314) ou por dimerização específica do sítio espontânea de scFv contendo um resíduo de cisteína de terminal C não pareado (Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26:187204). Alternativamente, scFv pode ser forçado a formar multímeros por encurtamento do ligador de peptídeo aos resíduos 3 e 12 para formar ‘diacorpos’ (Holliger et al PNAS (1993), 90:6444-6448). A redução do ligador ainda também pode resultar em trímeros de scFv (‘triacorpos’, veja Kortt et al (1997) Protein Eng, 10:423-433) e tetrâmeros (‘tetracorpos’, Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453:164-168). Construção de compostos de scFv bivalentes pode também ser obtida por fusão genética com motivos de dimerização de proteína para formar ‘minianticorpos’ (Pack et al (1992) Biochemistry 31:1579-1584) e ‘minicorpos’ (Hu et al (1996), Cancer Res. 56:3055-3061). Tandens de ScFv-sc-Fv ((scFv)2) podem também ser produzidos por ligação de duas unidades de scFv por um terceiro ligador de peptídeo, (veja Kurucz et al (1995) J Immunol, 154:4576-4582). Diacorpos biespecíficos podem ser produzidos por meio da associação não covalente de dois produtos de fusão de cadeia simples consistindo em domínio de VH de um anticorpo isolado conectado por um ligador curto ao domínio de VL de outro anticorpo isolado, (veja Kipriyanov et al (1998), Int J Can 77:763772). A estabilidade de tais diacorpos biespecíficos pode ser realçada pela introdução de pontes de Dissulfeto ou mutações de ‘botão em buraco’ como descrito supra ou pela formação de diacorpos de cadeia simples (ScDb) em que dois fragmentos híbridos de scFv são conectados por meio de um ligador de peptídeo (veja Kontermann et al (1999) J Immunol Methods 226:179-188). Compostos biespecíficos tetravalentes estão disponíveis, por exemplo, fundindo um fragmento de scFv ao domínio de CH3 de um composto de IgG ou a um fragmentoatravés da região de articulação (veja Coloma et al (1997) Nature Biotechnol, 15:159-163). Alternativamente, compostos biespecíficos tetravalentes foram criados pela fusão de diacorpos de cadeia simples biespecífica (veja Alt et al (1999) FEBS Lett 454:90-94). Menores compostos biespecíficos tetravalentes podem também ser formados pela dimerização de ou tandens de scFv-scFv com um ligador contendo um motivo hélice-alça-hélice (DiBi miniantibodies, Veja, Muller et al (1998) FEBS Lett 432:45-49) ou um composto de cadeia simples, compreendendo quatro domínios variáveis de anticorpo isolado (VH e VL) em uma orientação prevenindo pareamento intramolecular (diacorpo tandem, veja Kipriyanov et al, (1999) J Mol Biol 293:41-56). Fragmentos biespecíficos F(ab’)2 podem ser criados por acoplamento químico de fragmentos Fab’ ou por heterodimerização através de zíperes de leucina (veja Shalaby et al (1992) J Exp Med 175:217-225 e Kostelny et al (1992), J Immunol 148:1547-1553).

[00251] O termo "anticorpo de domínio variável simples" refere-se a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que especificamente liga um antígeno ou epítopo independentemente de um diferente domínio ou região V. Um único anticorpo de domínio variável pode estar presente em um formato (por exemplo, homo- ou hetero-multímero) com outras, diferentes regiões variáveis ou domínios variáveis, onde as outras regiões ou domínios não são requeridos para ligação a antígeno pelo domínio variável simples (isto é, onde o anticorpo de domínio simples liga-se ao antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um "anticorpo de domínio" ou "dAb" é igual a um "anticorpo de domínio variável simples" que é capazble de ligação a um antígeno como o termo é usado aqui. Um único anticorpo de domínio variável pode ser um domínio variável de anticorpo humano, porém também inclui domínios variáveis de único anticorpo de outras espécies, tais como roedor (por exemplo, como descrito no WO 00/29004), nurse shark e camelid dAbs de VHH de tubarão enfermeira e camelídeos. VHH de camelídeos são polipeptídeos de domínio variávell simples que são derivados de espécies que incluem camelo, lhama, alpaca, dromedário, e guanaco que produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves. Tais domínios VHH podem ser humanizados de acordo com técnicas padrões disponíveis na técnica, e tais domínios são também considerados serem "anticorpos de domínio" de acordo com a invenção. Como usado aqui "VH" inclui domínios de VHH de camelídeo.

2.4) Anticorpos homólogos ou fragmentos dos mesmos e variantes conservativas

[00252] Em outra modalidade da presente invenção, uma molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve de região variável ou sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve que são homólogas às sequências de aminoácido dos anticorpos descritos aqui, e em que os anticorpos homólogos ou fragmentos dos mesmos retêm as propriedades funcionais desejadas de uma molécula de ligação de acordo com a invenção.

[00253] Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento do mesmo compreendendo uma VH e um VL, em que: o VH é pelo menos 80%, ou pelo menos 90% idêntico à uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14; 18; 22; 25; 28; 31; 34; 37; 40; 83; 87; 90; 93; 112; 130 ou 138; a VL é pelo menos 80%, ou pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:16; 20; 85; 114; 132; 140; 147 ou 153, em que o anticorpo homólogo especificamente liga-se à IL18 e não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP). O anticorpo homólogo pode exibir pelo menos uma propriedade funcional adicional, tal como inibição da ligação de IL18 à IL18R ou inibição de produção de IFN-y dependente de IL18.

[00254] Em outras modalidades, a VH e/ou sequências de aminoácidos VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências mencionadas acima. Em outras modalidades, as sequências de aminoácido VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto uma substituição de aminoácido em não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácido. Um anticorpo tendo regiões VH e VL tendo identidade elevada (isto é, 80% ou maior) para as regiões VH e VL de SEQ ID NOs 14; 18; 22; 25; 28; 31; 34; 37; 40; 83; 87; 90; 93; 112; 130 ou 138 e SEQ ID NOs 16; 20; 85; 114; 132; 140; 147 ou 153 respectivamente, podem ser obtidas por mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 15; 19; 23; 26; 29; 32; 35; 38; 41; 84; 88; 91; 94; 113; 131; 139; 146 ou 152 e 17; 21; 24; 27; 30; 33; 36; 39; 42; 86; 89; 92; 95; 115; 133; 141; 148 ou 154, respectivamente, seguida por teste do anticorpo alterado codificado para a função retida (isto é, as funções mencionadas acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

[00255] O anticorpo homólogo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo IgG1 silencioso totalmente humano.

[00256] Como usado aqui, o percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando em consideração o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que necessita ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de percentual de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, como descrito abaixo.

[00257] O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácido podem ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci 4:11-17 que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de interalo de 4. Alternativamente, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinado usando o Needleman e Wunsch (1970) J Mol Biol 48:444-453, algoritmo que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

2.5) Anticorpos de Domínio Variável Dual

[00258] Anticorpos de domínio variável dual (DVD) compreendem dois ou mais sítios de ligação de antígeno e são anticorpos tetravalentes ou multivalentes, como, por exemplo, divalente e tetravalente. O anticorpo multivalente é particularmente construído para ter dois ou mais sítios de ligação de antígeno, e não é geralmente um anticorpo de ocorrência natural. Os anticorpos DVD podem ser capazes de ligar dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados. Tais anticorpos DVD podem ser monoespecíficos, isto é, capazes de ligar um antígeno ou multiespecífico, isto é, capaz de ligar dois ou mais antígenos. Em algumas modalidades o anticorpo DVD compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada e cadeia leve compreende dois sítios de ligação a antígeno. Cada sítio de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com um total de 6 CDRs envolvidas em ligação de antígeno por sítio de ligação de antígeno.

[00259] Em uma modalidade, uma molécula de ligação da presente invenção é um anticorpo de domínio variável dual (DVD) que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL- 18 BP).

[00260] Particularmente o anticorpo de domínio variável dual, de acordo com a invenção, é capaz de ligação à IL-18 e um segundo alvo. O segundo alvo pode ser selecionado de IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β, TNF alfa/beta e IFN-y.

2.6) Moléculas e anticorpos biespecíficos e multiespecíficos

[00261] Em uma modalidade, uma molécula de ligação da presente invenção é um anticorpo biespecífico isolado ou fragmento do mesmo compreendendo uma primeira especificidade para IL-18 e uma segunda especificidade para outro polipeptídeo, por exemplo, IL-12; em que o anticorpo biespecífico não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00262] Particularmente, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é capaz de ligação à IL-18 e um segundo alvo. O segundo alvo pode ser selecionado de IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β, TNF alfa/beta e IFN-y.

[00263] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação que é um anticorpo multiespecífico isolado ou fragmento do mesmo compreendendo uma primeira especificidade para IL-18, uma segunda especificidade para outro polipeptídeo, por exemplo, IL-12 e pelo menos uma terceira especificidade para um outro polipeptídeo, em que o anticorpo multiespecífico não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00264] Particularmente, o anticorpo multiespecífico de acordo com a invenção é capaz de ligação à IL-18, um segundo e um terceiro alvo. O segundo e terceiro alvos podem ser selecionado de IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β, TNF alfa/beta e IFN-y.

[00265] Um anticorpo isolado biespecífico é um anticorpo isolado tendo especificidades de ligação durante pelo menos dois diferentes epítopos. Métodos de preparação de tais anticorpos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é com base na coexpressão de dois pares de cadeia H - cadeia L de imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm diferentes especificidades de ligação, (veja Millstein et al, (1983) Nature 305:537539, WO93/08829 e Traunecker et al, (1991) EMBO 10:3655-3659). Por causa da classificação aleatória de cadeias H e L, uma misura potencial de dez diferentes estruturas de anticorpo isolado é produzida, das quais apenas uma tem a especificidade de ligação desejada. Um Método alternative envolve a fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas à região constante de cadeia pesada compreendendo pelo menos parte da região de articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a região CH1 contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. O DNA codificando estas fusões e, se desejado, a cadeia L, são insseridos em vetores de expressão separados e são então cotransfectados em um organismo de hospedeiro adequado. É possível porém inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias em um vetor de expressão. Em um Método preferida, o anticorpo biespecífico isolado é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação em uma ramificação e um par de cadeia H-L, fornecendo uma segunda especificidade de ligação na outra ramificação, veja o WO94/04690. Também veja Suresh et al, Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

[00266] Anticorpos biespecíficos e multiespecíficos da invenção podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois diferentes sítios de ligação ou moléculas-alvo. Um anticorpo da invenção pode de fato ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais do que dois diferentes sítios de ligação e/ou moléculas-alvo; tais moléculas multiespecíficas são também destinadas a serem abrangidas pelo termo "molécula biespecífica" como usado aqui. Para criar a molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser functionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, tal que uma molécula biespecífica resulte.

[00267] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo dos mesmos, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia Fv simples. O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo fragmento do mesmo, tal como uma Fv ou uma construção de cadeia simples, como descrito em Ladner et al. Patente dos Estados Unidos No. 4.946.778.

[00268] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais de murino, quiméricos e humanizados.

[00269] As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação constituintes, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica podem ser gerada separadamente e em seguida conjugada a uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de acoplamento ou agentes de reticulação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sulfo-SMCC) (veja por exemplo, Karpovsky et al (1984) J Exp Med; 160:1686; Liu, MA et al (1985) Proc Natl Acad Sci USA; 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Inst Mitt; 78:118-132; Brennan et al (1985) Science; 229:81-83), e Glennie et al (1987) J Immunol; 139:2367-2375. Conjugating agents are SATA e sulfo-SMCC, both available from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00270] Quando as especificidades de ligação são anticorpos eles podem ser conjugados por ligação de sulfidrila das regiões de articulação de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfhidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

[00271] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este Método é particularmente, útil onde a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de única cadeia compreendendo um anticorpo de cadeia única e uma determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de única cadeia compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para a preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Número 5.260.203; Patente dos Estados Unidos Número 5.455.030; Patente dos Estados Unidos Número 4.881.175; Patente dos Estados Unidos Número 5.132.405; Patente dos Estados Unidos Número 5.091.513; Patente dos Estados Unidos Número 5.476.786; Patente dos Estados Unidos Número 5.013.653; Patente dos Estados Unidos Número 5.258.498; e Patente dos Estados Unidos Número 5.482.858.

[00272] Ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), Análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de particular interesse empregando-se um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

2.7) Anticorpos multivalentes

[00273] Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos multivalentes compreendendo pelo menos duas porções de ligação a antígeno idênticas ou diferentes dos anticorpos da invenção ligando à IL-18 e não ligando ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00274] Em uma modalidade, o anticorpo multivalente fornece pelo menos duas, três ou quatro porções de ligação a antígeno dos anticorpos descritos aqui. As porções de ligação a antígeno podem ser ligadas entre si por meio da fusão de proteína ou ligação covalente ou não covalente. Alternativamente, métodos de ligação foram descritos para as moléculas biespecíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos, por exemplo, por anticorpos de reticulação da invenção com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da invenção, por exemplo, a Fc ou região de articulação.

2.8) Imunoconjugados

[00275] Em outra modalidade, uma molécula de ligação da presente invenção é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga à IL- 18 porém não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo é conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunosupressor) ou uma radiotoxina.

[00276] Tais conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial às células (por exemplo, mata). Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, t. colquicina, doxorubicina, daunorubicina, di- hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de ablação (por exemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucila, meifalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, rstreptozotocins, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[00277] Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e derivados dos mesmos. Um exemplo de um conjugado de anticorpo caliqueamicina é comercialmente disponível (MylotargTM; Wyeth-Ayerst).

[00278] Citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção usando tecnologia de ligador disponível na técnica. Exemplos de tipos de ligador que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, porém não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligadores contendo peptídeo. Um ligador pode ser escolhido que seja, por exemplo, suscetível à clivagem por baixo pH dentro do compartimento lisossômico ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido de tumor, tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).

[00279] Para outra discussão de tipos de citotoxinas, ligadores e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, veja também Saito, G et al (2003) Adv Drug Deliv Rev; 55:199-215; Trail, PA et al (2003) Cancer Immunol Immunother; 52:328-337; Payne, G (2003) Cancer Cell; 3:207-212; Allen, TM (2002) NatRev Cancer; 2:750-763; Pastan, I e Kreitman, R J (2002) Curr Opin Investig Drugs; 3:1089-1091; Senter, PD e Springer, CJ (2001) Adv Drug Deliv Rev; 53:247-264.

[00280] Anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnosticamente ou terapeuticamente incluem, porém não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90, e lutétio177. Métodos para a preparação de radioimunoconjugados são estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados são comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção.

[00281] Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção de fármaco não deve ser construída como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, tais como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina difteria; ou fatores de crescimento.

[00282] Técnicas para a conjugação de tal porção terapêutica a anticorpos são bem conhecidas, veja, por exemplo, Amon et al "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Anticorpos e Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Anticorpo Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Anticorpo In Cancer Therapy", in Monoclonal Anticorpos For Cancer Detection e Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation e Cytotoxic Properties Of Anticorpo- Toxin Conjugates", (1982) Immunol Rev; 62:119-58.

2.9) Anticorpos Heteroconjugados

[00283] Anticorpos heteroconjugados também formam uma modalidade da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos covalentemente unidos formados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes, em que pelo menos um dos anticorpos unidos é um anticorpo de acordo com a invenção que se liga à IL-18, porém não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP). Veja, por exemplo, a US 4.676.980.

2.10) Construção de Estrutura

[00284] Anticorpos construídos da invenção incluem aqueles nos quais modificações foram feitas aos resíduos de estrutura dentro da VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um método é para "novamente mutar" um ou mais resíduos de estrutura para a correspondente sequência de linha germinativa. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da sequência de linha germinativa, da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências de estrutura de anticorpo às sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem ser "novamente mutadas" para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR. Tais anticorpos "novamente mutados" são também destindos a serem abrangidos pela invenção.

[00285] Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutar um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epítopo de célula T para desse modo reduzir o potencial da imunogenicidade do anticorpo. Este método é também referido como "desimunização" e é descrito em maiores detalhes na Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 20030153043 by Carr et al.

2.11) Outras modificações

[00286] Além de ou alternative às modificações feitas dentro das regiões de estrutura ou CDR, anticorpos da invenção podem ser construídos para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida de soro, fixação complementar, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente do antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificadas para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada destas modalidades é descrita em maiores detalhes abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.

[00287] Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modificada, de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este Método é descrito também na Patente dos Estados Unidos No. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00288] Em outra modalidade, a região de articulação Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação Fc, de modo que o anticorpo tenha ligação da proteína A estafilocócica (SpA) prejudicada com relação à ligação de SpA de domínio de articulação Fc nativa. Este Método é descrito em maiores detalhes na Patente dos Estados Unidos No. 6.165.745 por Ward et al.

[00289] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Vários métodos são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento tirado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de um IgG, como descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

[00290] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo pelo menos um resíduo de aminoácido com um diferente resíduo de aminoácido para alterar as funções efetoras do anticorpo. por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um diferente resíduo de aminoácido, de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, porém retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo origem. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada, pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de complemento. Este Método é descrito em maiores detalhes nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[00291] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionado de resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um diferente resíduo de aminoácido, de modo que o anticorpo tenha a ligação de C1q alterada e/ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou abolida. Este Método é descrito em maiores detalhes na Patente dos Estados Unidos No. 6.194.551 por Idusogie et al.

[00292] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para desse modo alterar a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Este método é descrito também na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[00293] Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo mediar a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy modificando um ou mais aminoácidos. Este método é descrito também na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação no IgG1 humano para FCYRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (veja Shields, R.L. et al, (2001) J Biol Chem 276:6591-6604).

[00294] Em certas modalidades, o domínio Fc de isótipo de IgG1 é usado. Em algumas modaliddes específicas, uma variante mutante de fragmento Fc de IgG1 é usada, por exemplo, um Fc de IgG1 silencioso que reduz ou elimina a capacidade do polipeptídeo de fusão mediar a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e/ou ligar-se a um receptor FCY. Um exemplo de um mutante silencioso de isótipo de IgG1 em que o resíduo de Leucina é substituído pelo resíduo de Alanina nas posições de aminoácido 234 e 235 como descrito por Hezareh et al, J. Virol (2001); 75(24):12161-8.

[00295] Em certas modalidades, o domínio Fc é um mutante prevenindo a glicosilação na posição 297 de domínio Fc. Por exemplo, o domínio Fc contém uma substituição de aminoácido de resíduo de asparagina na posição 297. Exemplo de tal substituição de aminoácido é a substituição de N297 por uma glicina ou uma alanina.

[00296] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser preparado (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas, que resultam em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável para desse modo eliminar a glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal Método é descrito em maiores detalhes na Patente dos Estados Unidos Nos. 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.

[00297] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tenha um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado, tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de dissetriz aumentada. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados para aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com mecanismo de glkicosilação alterado. Células com mecanismo de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras, nas quais expressam anticorpos recombinantes da invenção para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucosil transferase, tal que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exiba hipofucosilação. Portanto, em uma modalidade, os anticorpos da invenção são produzidos por expressão recombinante em uma linhagem elular que exibe padrão de hipofucosilação, por exemplo, uma linhagem de célula mamária com expressão deficiente do gene FUT8 codificando fucosiltransferase. Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem de célula CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida para ligar a fucose aos carboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (veja também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celulares construídas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que anticorpos expressos nas linhagens celulares construídas exibem estruturas GlcNac com bissetriz aumentada que resulta em atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (veja também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser produzidos em uma levedura ou um fungo filamentoso construído para padrão de glicosilação semelhante à mamária, e capazes de produzir anticorpos carecendo de fucose como padrão de glicosilação (see, por exemplo, EP1297172B1).

[00298] Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pela invenção é a pegilação. Um anticorpo podem ser pegilado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG tornam-se ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A pegilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado aqui, o termo "polietileno glicol" é destinado a abranger qualquer das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser pegilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para pegilação de proteínas são conhecidos na técnica e pdoem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

[00299] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela invenção é um conjugado ou uma proteína de fusão de pelo menos a região de ligação do antígeno do anticorpo da invenção à proteína de soro, tais como albumina de soro humano ou um fragmento da mesma para aumentar a meia-vida da molécula resultante. Tal métdo é, por exemplo, descrito em Ballance et al. EP0322094.

3. Enxerto dos domínios de ligação ao antígeno em estruturas ou andaimes alternativos

[00300] Uma ampla variedade de estruturas ou andaimes de anticorpo/imunoglobulina pode ser empregada, contanto que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se liga especificamente à IL18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP. Tais estruturas ou andaimes incluem os 5 principais idiotipos de imunoglobulinas humanas, ou fragmentos dos mesmos (tais como aqueles descritos em outro lugar aqui), e incluem imunoglobulinas de outras espécies animal, preferivelmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeia pesada simples, tais como aqueles identificados em camelídeos são de particular interesse a respeito disso. Novas estruturas, andaimes e fragmentos continuam a ser descobertos e desenvolvidos por aqueles versados na técnica.

3.1) Estruturas de não imunoglobulina

[00301] Estruturas e andaimes de não imunoglobulina conhecidos e futuros podem ser empregados, contanto que eles compreendam uma região de ligação específica para a IL-18 e não ligando o complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP. Tais compostos são referidos aqui como "polipeptídeos compreendendo uma região de ligação específica do alvo". Estruturas ou andaimes de não imunoglobulina conhecidos incluem, porém não estão limitados a, adnectinas (Adnectins® - Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), DARPins, avímeros, Affibodys® (Affibody AG, Suécia), anticalinas (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), Affilins® (gama-cristalina ou ubiquitina; Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha) e protein epitope mimetics (PEM; Polyphor® Ltd, Allschwil, Suíça).

3.2) Moléculas de Fibronectina e adnectinas

[00302] Em um aspecto da invenção uma molécula de ligação é uma molécula de fibronectina. A molécula de fibronectina tem um andaime com base preferivelmente no domínio tipo III de fibronectina (por exemplo, o décimo módulo do tipo III de fibronectina (10 Fn3 domain)). Em uma modalidade uma molécula de ligação é uma adnectina (Adnectins®).

[00303] O domínio tipo III de fibronectina tem 7 ou 8 filamentos beta que são distribuídos entre duas folhas beta, que se embalam um contra o outro para formar o núcleo da proteína, e ainda contendo alças (análogas às CDRs) que conectam os filamentos beta um ao outro e são expostos a solvente. Existem pelo menos três tais alças em cada extremidade do sanduíche de folha beta, onde a extremidade é o limiar da proteína perpendicular à direção dos filamentos beta (US 6.818.418).

[00304] Estes andaimes com base em fibronectina não são uma imunoglobulina, embora a dobra total esteja intimamente relacionada àquela do menor framento functional de anticorpo, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento de antígeno inteira em IgG de camelo e Lhama. Por causa desta estrutura, o anticorpo de não imunoglobulina imita as propriedades de ligação do antígeno, que são similares em natureza e afinidade àqueles de anticorpos. Estes andaimes podem ser usados em uma aleatorização de alça e estratégia de emaranhamento in vitro que é similar ao processo de maturação de afinidade de anticorpos in vivo. Estas moléculas com base em fibronectina podem ser usadas como andaimes onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas com CDRs da invenção usando técnicas de clonagem padrão.

[00305] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é uma molécula de fibronectina que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00306] Em outra modalidade uma molécula de ligação é uma adnectina que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP). 3.3) DARPins

[00307] A tecnologia é com base no uso de proteínas com módulos de repetição derivados de ancirina como andaimes para transportar regiões variáveis que podem ser usadas para ligação a alvos diferentes. O modulo de repetição de ancirina é um polipeptídeo de aminoácido 33 que consiste em duas hélices-a anti-paralelas e uma ligação de ciclo-β das regiões variáveis é principalmente otimizada usando exibição de ribossoma.

[00308] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é uma ancirina/DARPinas que se liga à IL-18 (por exemplo, ligase especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

3.4) Avímeros

[00309] Os avímeros são derivados de domínio A natural contendo proteína, tal como LRP-1. Estes domínios são usados por natureza para interações de proteína-proteína e em humanos acima de 250 proteínas são estruturalmente com base em domínios-A. Os avímeros consistem em diversos diferentes monômeros de "domínio-A" (2-10) ligados por meio de ligadores de aminoácido. Avímeros podem ser criados que se ligam ao antígeno-alvo usando a metodologia descrita, por exemplo, nas US20040175756; US20050053973; US20050048512; e US20060008844.

[00310] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é um avímero que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

3.5) Affibody®

[00311] Affibody® são proteínas simples, pequenas, compostas de três grupos com três hélices com base no andaime de um dosdomínios de ligação de IgG de Proteína A. A proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de andaime consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são aleatorizados para gerar bibliotecas de Affibody® com um grande número de variantes de ligante (veja por exemplo, a US 5.831.012). Moléculas de Affibody® imitam os anticorpos; elas têm um peso molecular de 6 kDa, comparado ao peso molecular de anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar de seu pequeno tamanho, o sítio de ligação de moléculas de Affibody® é similar àquele de um anticorpo.

[00312] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é um aficorpo que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

3.6) Anticalins®

[00313] Anticalins® são produtos desenvolvidos pela companhia Pieris ProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um grupo difundido de pequenas e robustas proteínas que estão eralmente envolvidas no transporte fisiológico ou armazenagem de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Diversas lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líquidos corporais.

[00314] A arquitetura da proteína é reminiscente de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis sobre o topo de uma estrutura rígida. Entretanto, ao contrário dos anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, as lipocalinas são compostas de uma única cadeia de polipeptídeo com 160 a 180 resíduos de aminoácido, sendo exatamente marginalmente maior do que um único domínio de imunoglobulina.

[00315] O conjunto de quatro alças, que compõem a bolsa de ligação, mostra plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode desse modo ser remodelado em um processo proprietário a fim de reconhecer compostos-alvo prescritos de diferente forma com alta afinidade e especificidade.

[00316] Uma proteína da família lipocalina, a proteína de likgação de bilina (BBP) de Pieris Brassicae foi usada para desenvolver anticalinas por mutagenização do conjunto de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente descrevendo "anticalinas" é o PCT WO 199916873.

[00317] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é uma anticalina que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

3.7) Affilin®

[00318] Moléculas de Affilin® são pequenas proteínas não imunoglobulina que são designadas para afinidades específicas das proteínas e pequenas moléculas. Novas moléculas de Affilin® podem ser muito rapidamente selecionadas de duas bibliotecas, cada das quais é com base em uma diferente proteína andaime derivada de humano.

[00319] Moléculas de Affilin™ não mostram qualquer homologia estrutural para proteínas de imunoglobulina. Proteínas Scil empregam dois andaimes de Affilin™, um dos quais é gama cristalina, uma proteína de lente de olho humano estrutural e o outro é proteínas da superfamíla "ubiquitina". Ambos os andaimes humanos são muito pequenos, mostram estabilidade em alta temperature e são quase resistentes a mudanças de pH e agentes de desnaturação. Esta alta estabilidade é principalmente devido à estrutura de folha beta expandida das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas cristalinas gama são descritos no WO200104144 e exemplos de proteínas "semelhantes à ubiquitina" são descritos no WO 2004106368.

[00320] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é uma afilina que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

3.8) Miméticos de Epítopo de Proteína

[00321] Miméticos de Epítopo de Proteína (PEM) são moléculas semelhantes ao peptídeo, cíclicas, de tamanho médio (aprox. 1 a 2 kDa) imitando estruturas de proteínas secundárias grampo de cabelo beta, a maior estrutura secundária envolvida em interações de proteína- proteína.

[00322] Consequentemente, em uma modalidade uma molécula de ligação é um mimético de epítopo de proteína que se liga à IL-18 (por exemplo, liga-se especificamente) e não se liga ao complexo de IL- 18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

4. Polinucleotídeos codificando as moléculas de ligação da invenção

[00323] Outro aspecto da invenção diz respeito aos polinucleotídeos isolados codificando as moléculas de ligação da invenção.

[00324] Polinucleotídeos de domínio variável de cadeia pesada codificando os anticorpos humanos isolados descritos aqui são mostrados nas SEQ ID NOs: 15, 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 84, 88, 91, 94, 113, 131, 139, 146 e 152. Polinucleotídeos de domínio variável de cadeia leve codificando os anticorpos humanos isolados descritos aqui são mostrados nas SEQ ID NOs: 17, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 86, 89, 92, 95, 115, 133, 141, 148 e 154. Outros polinucleotídeos codificando anticorpos da invenção incluem polinucleotídeos que foram mutados, ainda têm pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade para as sequências descritas acima, tais como polinucleotídeos que foram otimizados para expressão de proteína em células mamíferas, por exemplo, linhagens de célula CHO.

[00325] Modalidade 89: Ácidos nucleicos variantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos foram mudados por deleção, inserção ou substituição de nucleotídeo nas regiões variáveis, quando comparado com as regiões variáveis representadas nas sequências descritas abaixo.

[00326] Modalidade 90: o polinucleotídeo isolado que codifica o domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a invenção, em que o polinucleotídeo: a. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152 ou b. compreende SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152 ou c. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 152.

[00327] Modalidade 91: o polinucleotídeo isolado que codifica a domínio variável de cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção, em que o polinucleotídeo: a. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154 ou b. compreende SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154 ou c. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 154.

[00328] Modalidade 92: o polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção, em que o polinucleotídeo: a. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 159 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155; ou b. compreende SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 159 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155; ou c. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 159 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155.

[00329] Modalidade 93: o polinucleotídeo isolado codifica a cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção, em que o polinucleotídeo: a. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 161 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157; ou b. compreende SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 161 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157; ou c. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 161 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157.

[00330] O polinucleotídeo pode estar presente em células inteiras, em um lisado de célula, ou pode ser em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um polinucleotídeo é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento de alcalina/SDS, bandagem de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Veja, F. Ausubel, e outro, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque. Um polinucleotídeo da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não pode conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é uma molécula de cDNA. O polinucleotídeo pode estar presente em um vetor tal como um vetor de exibição de fago, ou em um vetor de plasmídeo recombinante.

[00331] Polinucleotídeos da invenção podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongo transgênico transportando genes de imunoglobulina humanos como descrito também abaixo), cDNAs codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), polinucleotídeos codificando o anticorpo podem ser recuperados de vários clones de fago que são membros da biblioteca.

[00332] Uma vez que fragmentos de DNA codificando segmentos de VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser também manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável para genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, para genes de fragmento de Fab ou para um gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA codificando VL ou VH é operativamente ligado a outra molécula de DNA, ou a um fragmento codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligador flexível. O termo "operativamente ligado", como usado neste contexto, é destinado a significar que os dois fragmentos de DNA são juntados de uma maneira funcional, por exemplo, de tal modo que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em estrutura, ou de tal modo que a proteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.

[00333] O DNA isolado codificando a região de VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total operativamente ligando o DNA codificando VH a outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e outro, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de padrão de PCR. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada é selecionada entre isotipos de IgG1. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA codificando somente a região constante de CH1 de cadeia pesada.

[00334] O DNA isolado codificando a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como em um gene de cadeia leve Fab) operativamente ligando o DNA codificando VL a outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e outro, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de padrão de PCR. Uma região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou uma lambda.

[00335] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificando VH e VL são operativamente ligados a outro fragmento codificando um ligador flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4 -Ser)3, de tal modo que, as sequências VH e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH juntadas pelo ligador flexível (veja, por exemplo, Bird e outro, 1988 Science 242:423-426; Huston e outro, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty e outro, (1990) Nature 348:552-554).

[00336] O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 89 a 93 pode ser modificado in vitro de uma tal maneira que quando injetado em células de mamíferos, previne digestão do polinucleotídeo e permite o mecanismo de translação da célula de mamífero para produzir um anticorpo iniciando do polinucleotídeo modificado (tal como descrito em Patente dos Estados Unidos No. 8.278.036 B2 em Kariko e outro). Um tal RNA modificado sintetizado in vitro pode em seguida ser injetado nas células de mamífero ou em um paciente como parte de uma terapia de gene.

[00337] Portanto, outro aspecto da presente invenção abrange um método para induzir uma célula de mamífero para produzir um anticorpo como descrito aqui, o método compreendendo: contactar referida célula de mamífero com RNA modificado sintetizado in vitro derivado de um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 89 a 93, em que o referido RNA modificado sintetizado in vitro compreende uma ou mais modificação como descrito em Patente dos Estados Unidos No. 8.278.036 B2.

5. Produção de anticorpos

[00338] Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, the standard somatic cell hybridization technique de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256: 495. Muitas técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

[00339] Protocolos de imunização e técnicas para isolação de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

[00340] Os anticorpos monoclonais humanizados ou quiméricos da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparada como descrito acima. DNA codificando a cadeia leve e pesada de imunoglobulinas pode ser obtido da hibridoma de murino de interesse e manipulado para conter sequências de imunoglobulina de não murino (por exemplo, humano) usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas às regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567 em Cabilly e outro). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR de murino podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5225539 em Winter, e Patente dos Estados Unidos Nos. 5530101; 5585089; 5693762 e 6180370 em Queen e outro

[00341] Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos transportando partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundongos de Ig humano."

[00342] O HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém minilocos de gene de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia leve K e pesada (μ e Y) humana não reorganizadas, juntamente com mutações alvejadas que inativam os locos de cadeia μ e k endógenos (veja, por exemplo, Lonberg e outro (1994) Nature; 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou k de camundongo, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesada humana introduzidos submetem-se a troca de classe e mutação somática para gerar monoclonal de IgGK humano de elevada afinidade (Lonberg, N e outro (1994) supra; revisado em Lonberg, N (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N e Huszar, D (1995) Intern Rev Immunol;13: 65-93, e Harding, F e Lonberg, N (1995) Ann N Y Acad Sci; 764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômicas realizadas por tais camundongos, são também descritas em Taylor, L e outro; (1992) Nucl Acids Res; 20:6287-6295; Chen, J e outro (1993) Int Immunol; 5: 647656; Tuaillon e outro (1993) Proc Natl Acad Sci USA; 94:3720-3724; Choi e outro (1993) Nature Gen; 4:117-123; Chen, J e outro (1993) EMBO J; 12: 821-830; Tuaillon e outro (1994) J Immunol; 152:2912-2920; Taylor, L e outro (1994) Int Immuno; 6:579-591; e Fishwild, D e outro (1996) Nature Biotech; 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são por este meio especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Veja também, Patente dos Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todos em Lonberg e Kay; Patente dos Estados Unidos No. 5.545.807 em Surani e outro; Publicação de PCT Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos em Lonberg e Kay; e Publicação de PCT No. WO 01/14424 em Korman e outro

[00343] Em uma modalidade, anticorpos humanos de acordo com a invenção podem ser elevados usando um camundongo que transporte sequências de imunoglobulina humana sobre transgenes e transcromos- somas tal como um camundongo que transporte um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano. Tais camundongos, referidos aqui como "camundongos KM", são descritos em detalhes em Publicação de PCT WO 02/43478 em Ishida e outro

[00344] Ainda mais, sistemas de animal transgênico alternativos expressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenocamundongo (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 em Kucherlapati e outro.

[00345] Além disso, sistemas de animal transcromossômico alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos da invenção. Por exemplo, camundongos transportando tanto um transcro- mossoma de cadeia pesada humano quanto um transcromossoma de cadeia leve humano, referidos como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka e outro, 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Além disso, vacas transportando transcromossomas de cadeia leve e pesada humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa e outro, 2002 Nature Biotech 20:889-894).

[00346] Anticorpos recombinantes humanos da invenção podem também ser preparados usando métodos de exibição de fago para bibliotecas de rastreio de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos são estabilizados na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Veja, por exemplo: Patente dos Estados Unidos Nos. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 em Ladner e outro; Patente dos Estados Unidos Nos. 5.427.908 e 5.580.717 em Dower e outro; Patente dos Estados Unidos Nos. 5.969.108 e 6.172.197 em McCafferty e outro; e Patente dos Estados Unidos Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 em Griffiths e outro.

[00347] Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados usando camundongos SCID em que células imunes humanas foram reconstituídas de tal modo que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada após imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 5.476.996 e 5.698.767 em Wilson e outro.

[00348] Anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[00349] Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DNAs codificando cadeias leves e pesadas de comprimento total ou parcial, podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expresse o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de clonagem ou expressão de tal modo que os genes sejam operativamente ligados às sequências de controle transcripcional e translacional. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é destinado a significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de tal modo que sequências de controle transcripcional e translacional dentro do vetor sirvam sua função pretendida de regular a transcripção e translação do gene de anticorpo. O vetor de clonagem ou expressão e sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementar sobre o fragmento de gene de anticorpo e vector, ou brusca ligação final se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isótipo de anticorpo inserindo-os nos vetores de expressão já codificando regiões constante de cadeia pesada e constante de cadeia leve do isótipo desejado, de tal modo que o segmento de VH seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e o segmento de VL seja operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilite secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor, de tal modo que o peptídeo de sinal seja ligado em estrutura ao terminal de amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína de não imunoglobulina).

[00350] Em um aspecto, a invenção fornece um vetor de clonagem ou expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos de acordo com a invenção.

[00351] Modalidade 94: O vetor de clonagem ou expressão que compreende pelo menos um polinucleotídeo selecionado de: SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 159 ou SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 149 ou SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 161 ou SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 157.

[00352] Além dos polinucleotídeos codificando as cadeias de anticorpo, os vetores de clonagem ou expressão da invenção transportam sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência regulatória" destina-se a incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlem a transcripção ou translação dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências regulatórias para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam níveis elevados de expressão de proteína em célula de mamíferos, tais como promotores e/ou realçadores derivados de citomegalovírus (CMV), Simian Vírus 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio maior de adenovírus (AdMLP)), e polioma. Alternativamente, sequências regulatórias não virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda mais, elementos regulatórios compostos de sequências de diferentes fontes, tal como o sistema promotor de SRa, que contém sequências do promotor precoce de SV40 e a repetição de terminal longa de tipo 1 do vírus da leucemia de célula T humana (Takebe, Y. e outro, 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[00353] Além disso, os vetores de clonagem ou expressão da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulem replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel e outro). Por exemplo, tipicamente gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis incluem o gene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

[00354] Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias leves e pesadas é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" são destinadas a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE- dextrano e similares. É teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. Expressão de anticorpos em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, levedura ou fungos filamentosos, é discutida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que células procarióticas para agrupar e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi reportada ser ineficaz para produção de produções elevadas de anticorpo ativo (Boss, M. A. e Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13).

[00355] Células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar vetores codificando anticorpos da invenção são células procarióticas, de levedura ou eucarióticas mais elevadas. Células procarióticas adequadas incluem eubactéria, por exemplo, enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E.coli (por exemplo ATCC 31, 446; 31, 537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia por exemplo, Serratia marcescens e Shigella bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (veja DD 266 710), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura ou fungos, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por exemplo, ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56.500), Yarrowia (EP402, 226), Pichia pastoris (EP183070, veja também Peng e outro (2004) J Biotechnol; 108:185-192), Cândida, Trichoderma reesei (EP244234), hospedeiros Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger são também contemplados.

[00356] Apesar de células hospedeiras procarióticas e de levedura serem especificamente contempladas pela invenção, preferivelmente entretanto, células hospedeiras da presente invenção são células eucarióticas mais elevadas.

[00357] Consequentemente, em um aspecto a presente invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo os polinucleotídeos como descrito aqui.

[00358] Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira estavelmente transformada ou transfectada compreendendo um ou mais polinucleotídeos como descrito aqui.

[00359] Modalidade 95: Uma célula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetor codificando uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo isolado ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 88. Preferivelmente tais células hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificando a cadeia leve e um segundo vetor codificando referida cadeia pesada.

[00360] Células hospedeiras eucarióticas mais elevadas adequadas incluem células de mamífero tais como COS-1 (ATCC No.CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem 293 de rim embriônico humano, células de rim de hamster bebê (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células de ovário de hamster chinês CHO (por exemplo, CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, linhagem celular DHFR-CHO tal como DG44 (veja Urlaub e outro, (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556)), particularmente aquelas linhagens celulares CHO adaptadas para cultura de suspensão, células Sertoli de camundongo, células de rim de macaco, células de rim de macaco verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células de rim canino (ATCC CCL 34), células de pulmão humano (ATCC CCL 75), Hep G2 e células de mieloma ou linfoma, por exemplo, NSO (veja US5807715), Sp2/0, YO.

[00361] Preferivelmente, as células hospedeiras de mamífero para expressar uma molécula de ligação da invenção incluem linhagens celulares de mamífero deficientes para expressão de gene FUT8, por exemplo, como descrito em US6946292.

[00362] Células hospedeiras transformadas com vetores codificando as moléculas de ligação podem ser cultivadas por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. Células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos giratórios, frascos rolantes ou sistemas de fibras ocas, porém, é preferido para produção em grande escala que reatores de tanque agitados sejam usados particularmente para culturas de suspensão. Preferivelmente, os tanques agitados são adaptados para arejamento usando, por exemplo, aspersores, defletores ou impulsores de baixo cisalhamento. Para colunas de bolhas e reatores de transporte aéreo, arejamento direto com ar ou bolhas de oxigênio pode ser usado. Onde as células hospedeiras são cultivadas em um meio de cultura livre de soro, é preferido que o meio seja suplementado com um agente protetivo celular, tal como F-68 plurônico para ajudar a prevenir dano celular como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, micro-veículos podem ser usados como substratos de desenvolvimento para linhagens celulares dependentes de ancoragem ou as células podem ser adaptadas para cultura de suspensão (que é típica). A cultivação de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de invertebráveis pode utilizar uma variedade de modos operacionais tais como batelada de alimentação, processamento de batelada repetida (veja Drapeau e outro (1994) cytotechnology 15: 103-109), processo de batelada estendido ou cultura por perfusão. Apesar de células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas poderem ser cultivadas em meio contendo soro, tal como soro fetal de vitelo (FCS), é preferido que tais células hospedeiras sejam cultivadas em meio livre de soro sintético tal como descrito em Keen e outro (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meio comercialmente disponível tal como ProCHO-CDM ou UltraCHO(TM) (Cambrex NJ, USA), suplementado onde necessário com uma fonte de energia tais como fatores de desenvolvimento de glicose e sintéticos, tal como insulina recombinante. A cultivação livre de soro de células hospedeiras pode requerer que aquelas células sejam adaptadas para desenvolver-se em condições livres de soro. Um método de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meio contendo soro e repetidamente trocar 80% do meio de cultura pelo meio livre de soro de modo que as células hospedeiras aprendam a se adaptar em condições livres de soro (veja, por exemplo, Scharfenberg K e outro (1995) em Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery, por exemplo, e outro eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

[00363] Moléculas de ligação da invenção secretadas no meio podem ser recuperadas e purificadas usando uma variedade de técnicas para fornecer um grau de purificação adequado para o uso pretendido. Por exemplo, o uso de anticorpos isolados da invenção para o tratamento de pacientes humanos tipicamente mandata pelo menos 95% de pureza, mais tipicamente 98% ou 99% ou maior, pureza (comparado ao meio de cultura bruta). No primeiro caso, os resíduos celulares do meio de cultura são tipicamente removidos usando centrifugação seguida por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando, por exemplo, microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração em profundidade. Uma variedade de outras técnicas tais como diálise e eletroforese em gel e técnicas cromatográficas tais como hidroxiapatite (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de marcação de afinidade tal como poliistidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, veja US5429746) estão disponíveis. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, seguindo várias etapas de clarificação, são capturados usando cromatografia de afinidade de proteína A ou G seguida por outras etapas de cromatografia tais como permuta de íon e/ou cromatografia de HA, permuta de ânion ou cátion, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação de sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoção de vírus são também empregadas (por exemplo, nanofiltração usando por exemplo, um filtro DV-20). Seguindo estas várias etapas, uma preparação purificada (preferivelmente monoclonal) compreendendo pelo menos 75 mg/ml ou maior, por exemplo, 100 mg/ml ou maior, do anticorpo isolado da invenção ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é fornecida e portanto forma uma modalidade da invenção. Adequadamente tais preparações são substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos da invenção.

[00364] Os sistemas bacterianos podem ser usados para a expressão de moléculas de ligação de não imunoglobulina descritas acima. Os sistemas bacterianos são também particularmente adequados para a expressão de fragmentos de anticorpo isolado. Tais fragmentos são localizados intracelularmente ou dentro do periplasma. Proteínas periplásmicas insolúveis podem ser extraídas e redobradas para formar proteínas ativas de acordo com métodos conhecido por aqueles versados na técnica, veja Sanchez e outro (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 e Cu pit PM e outro (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277.

[00365] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira sob condições adequadas para a produção da molécula de ligação, em que a célula hospedeira compreende um vetor como descrito aqui. Modalidade 95: O método de produzir um anticorpo humano ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira sob condições adequadas para a produção da molécula de ligação, em que a célula hospedeira compreende um vetor como descrito aqui.

6. Composições farmacêuticas

[00366] A invenção fornece para composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de ligação que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00367] Modalidade 96: As composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo humano ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 88 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00368] As composições podem adicionalmente conter outros agentes terapêuticos que são adequados para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio humano notado abaixo. Veículos farmaceuticamente realçam ou estabilizam a composição, ou facilitam a preparação da composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotônicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis.

[00369] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A rotina e/ou modo de administração varia(m) dependendo dos resultados desejados. É preferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, ou administrada próxima ao sítio do alvo. O veículo farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rotina de administração, o composto ativo (entidades químicas de peso molecular particularmente baixo) pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.

[00370] A composição deve ser estéril e fluida. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por uso de revestimento tal como lecitina, por manutenção de tamanho de partícula requerido no case de dispersão e por uso de surfactantes. Em muitos casos, é preverível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção a longo prazo das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[00371] Composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. Composições farmacêuticas são preferivelmente fabricadas sob condições de GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente efetiva ou dose eficaz de um anticorpo da invenção descrito aqui é empregada nas composições farmacêuticas da invenção. Elas são tipicamente formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a ótima resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem como usada aqui refere-se às unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o requerido veículo farmacêutico.

[00372] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados a fim de obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para ativar a resposta terapêutica desejada para uma paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a rotina de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares.

[00373] Um médico pode iniciar doses dos anticorpos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis menores do que aquele requerido para ativar o desejado efeito terapêutico e gradualmente aumentar a dosagem até o efeito desejado ser ativado. Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de uma doença ou distúrbio fibrótico descrito aqui variam dependendo de muitos diferentes fatores, incluindo meios de administração, sítio de alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento necessitam ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia. Para administração com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ter 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar acarreta administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses.

[00374] Moléculas de ligação da invenção, especialmente anticorpos e fragmentos dos mesmos, são usualmente administradas em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser semanalmente, mensalmente ou anualmente. Intervalos podem também ser irregulares quando indicado medindo níveis sanguíneos de proteína terapêutica no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para ativar uma concentração de anticorpo de plasma de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos 25-300 μg/ml. Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser administrados como uma formulação de liberação sustentada, em cujo caso administração menos frequente é requerida. Dosagem e frequência variam dependendo do meio-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanizados mostram meio-vida mais longo do que aquele de anticorpos quiméricos e anticorpos de não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas (preventivas), uma dosage relativamente menor é administrada em intervalos relativamente não frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento durante o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até a progressão da doença ser reduzida ou terminada, e preferivelmente até o paciente mostrar melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Depois disso, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

[00375] A composição farmacêutica pode compreender (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) uma molécula de ligação que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP), em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, em que uma molécula de ligação é selecionada de: um anticorpo isolado, um fragmento de um anticorpo isolado, um único anticorpo de domínio variável, um anticorpo bi- ou multiespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo de domínio variável dual, um imunoconjugado, uma molécula de fibronectina, uma adnectina, um DARPin, um avímero, um aficorpo, uma anticalina, uma afilina, um mimético de epítopo de proteína ou combinações dos mesmos e em que a composição pode também compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00376] Tipicamente a composição será de uma forma intravenosamente, inalável ou subcutaneamente administrável. Em outras modalidades, a composição pode ser em forma liofilizada.

[00377] Preferivelmente, uma molécula de ligação é um anticorpo, preferivelmente um anticorpo intacto monoclonal (por exemplo, humano, humanizado ou quimérico) ou um fragmento do mesmo como descrito aqui.

[00378] Modalidade 97: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende; (a) CDRH1 de SEQ ID NO:3; (b) CDRH2 de SEQ ID NO:9; (c) CDRH3 de SEQ ID NO:5; (d) CDRL1 de SEQ ID NO:6; (e) CDRL2 de SEQ ID NO:7 e (f) CDRL3 de SEQ ID NO:8.

[00379] Modalidade 98: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 97 em que o anticorpo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00380] Modalidade 99: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende; (a) CDRH1 de SEQ ID NO:3; (b) CDRH2 de SEQ ID NO:10; (c) CDRH3 de SEQ ID NO:5; (d) CDRL1 de SEQ ID NO:6; (e) CDRL2 de SEQ ID NO:7 e (f) CDRL3 de SEQ ID NO:8.

[00381] Modalidade 100: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende; (a) CDRH1 de SEQ ID NO:3; (b) CDRH2 de SEQ ID NO:13; (c) CDRH3 de SEQ ID NO:5; (d) CDRL1 de SEQ ID NO:6; (e) CDRL2 de SEQ ID NO:7 e (f) CDRL3 de SEQ ID NO:8.

[00382] Modalidade 101: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 100 em que o anticorpo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00383] Modalidade 102: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende; (a) CDRH1 de SEQ ID NO:106; (b) CDRH2 de SEQ ID NO:107; (c) CDRH3 de SEQ ID NO:108; (d) CDRL1 de SEQ ID NO:109; (e) CDRL2 de SEQ ID NO:110 e (f) CDRL3 de SEQ ID NO:111.

[00384] Modalidade 103: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende: a. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 ou b. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 ou c. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 ou d. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 20 ou e. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 20 ou f. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 40 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 20 ou g. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 114.

[00385] Modalidade 104: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 103, em que o referido anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 ou um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 20.

[00386] Modalidade 105: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 104 em que o anticorpo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00387] Modalidade 106: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende: a. um domínio variável de cadeia pesada capaz de ser codificada por um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade (por exemplo, 95% ou maior, tais como 96%, 97%, 98% ou 99%) para um polinucleotídeo isolado codificando SEQ ID NO: 14 ou 18 ou 25 ou 28 ou 37 ou 40 ou 112 e b. um domínio variável de cadeia leve capaz de ser codificada por um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade (por exemplo, 95% ou maior, tais como 96%, 97%, 98% ou 99%) para um polinucleotídeo isolado codificando SEQ ID NO: 16 ou 20 ou 114.

[00388] Modalidade 107: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende: a. a cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 ou b. a cadeia pesada de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 ou c. a cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 ou d. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 53 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 160 ou e. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 100 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 160 ou f. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 158 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 160 ou g. um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 116 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 118.

[00389] Modalidade 108: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 107, em que o anticorpo compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 ou um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 158 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 160.

[00390] Modalidade 109: A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 108, em que o anticorpo compete com o anticorpo murino 125-2H para ligação a IL-18.

[00391] Modalidade 110: Uma composição farmacêutica compreende (por exemplo, como seu único ingrediente terapeuticamente ativo) um anticorpo que se liga à IL18 (por exemplo, especificamente liga-se) e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que o referido anticorpo compreende: a. a cadeia pesada capaz de ser codificada por um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade (por exemplo, 95% ou maior, tais como 96%, 97%, 98% ou 99%) para um polinucleotídeo isolado codificando SEQ ID NO: 43 ou 47 ou 50 ou 53 ou 100 ou 116 ou 158 e b. a cadeia leve capaz de ser codificada por um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade (por exemplo, 95% ou maior, tais como 96%, 97%, 98% ou 99%) para um polinucleotídeo isolado codificando SEQ ID NO: 45 ou 160 ou 118.

7. Usos Clínicos.

[00392] Foi demonstrado que expressão de IL-18 é super-regulada em diversas doenças autoimunes, cardiovasculares e inflamatórias.

[00393] Consequentemente, as moléculas de ligação da invenção, que se ligam à IL-18 e não se ligam ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que as moléculas de ligação não são IL- 18BP, podem ser usadas em terapia.

[00394] Modalidade 110: o anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 88 para uso em terapia.

[00395] Em um aspecto da presente invenção é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes, incluindo Artrite reumatoide (RA), Artrite Juvenil de Início Sistêmico (SOJA), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), Espondilite Ancilosante, Doença Ocular Interna Autoimune (AIED), Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS), Doença de Behcet, Doença de Berger (Nefropatia IgA), Pemfigoide Bolhoso, Síndrome Churg Strauss, Colite, Doença de Crohn (CD), Diabetes do tipo 1, Diabetes do tipo 2, Síndrome de Sjogren (SS), Doença do Enxerto Versus Hospedeiro (GVHD), Glomerulonefrite, Lúpus, Esclerose múltipla (MS), Psoríase, Febre Reumática, Sarcoidose, Escleroderma, Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE), Colite Ulcerativa, Linfohistiocitose hemofagocítica (HLH, também conhecida como síndrome hemofagocítica, síndrome de ativação de macrófago), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Arterite de Célula Gigante (GCA), doença de artéria coronariana (CAD), Vasculopatia Coronariana (CV), Síndromes Coronarianas Agudas (ACS), Insuficiência Cardíaca Congestiva (CHF), aterosclerose, arteriosclerose, infarto do miocárdio (MI), Síndrome Cardiorrenal (CRS), Insuficiência Renal Aguda (AKI), Nefropatia Diabética, resistência à insulina, obesidade e a síndrome metabólica (MetS), doenças do pulmão incluindo sarcoidose pulmonar, em particular sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar, asma, especialmente asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose cística, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto (ARDS), Dano Pulmonar Agudo (ALI), Dano de Pulmão Induzido por Ventilador (VILI), Hipertensão Arterial Pulmonar (PAH), Doença de Alzheimer (AD) e sepse e quaisquer combinações das mesmas cujo método compreende administrar a um paciente mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo) ou composição farmacêutica como descrito aqui que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00396] Modalidade 111: um método de tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), aterosclerose, Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Artrite de Célula Gigante (GCA), diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero cujo método compreende administrar ao paciente mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo) ou composição farmacêutica como descrito aqui que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP.

[00397] Modalidade 112: as moléculas de ligação ou as composições farmacêuticas da invenção que se ligam à IL-18 e não se ligam ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL-18BP, para uso em tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), aterosclerose, Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Artrite de Célula Gigante (GCA), diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero.

[00398] Modalidade 113: um método de tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes, incluindo Artrite reumatoide (RA), Artrite Juvenil de Início Sistêmico (SOJA), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), Espondilite Ancilosante, Doença Ocular Interna Autoimune (AIED), Síndrome Linfoproliferativa Autoimune (ALPS), Doença de Behcet, Doença de Berger (Nefropatia IgA), Pemfigoide Bolhoso, Síndrome Churg Strauss, Colite, doença de Crohn (CD), Diabetes do tipo 1, Diabetes do tipo 2, Síndrome de Sjogren (SS), Doença do Enxerto Versus Hospedeiro (GVHD), Glomerulonefrite, Lúpus, Esclerose múltipla (MS), Psoríase, Febre Reumática, Sarcoidose, Escleroderma, Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE), Colite Ulcerativa, Linfohistiocitose hemofagocítica (HLH, também conhecida como síndrome hemofagocítica, síndrome de ativação de macrófago), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Arterite de Célula Gigante (GCA), doença de artéria coronariana (CAD), Vasculopatia Coronariana (CV), Síndromes Coronarianas Agudas (ACS), Insuficiência Cardíaca Congestiva (CHF), aterosclerose, arteriosclerose, infarto do miocárdio (MI), Síndrome Cardiorrenal (CRS), Insuficiência Renal Aguda (AKI), Nefropatia Diabética, resistência à insulina, obesidade e a síndrome metabólica (MetS), doenças do pulmão incluindo sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar, asma, especialmente asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose cística, Síndrome da Angústia Respiratória de Adulto (ARDS) ), Dano Pulmonar Agudo (ALI), Dano de Pulmão Induzido por Ventilador (VILI), Hipertensão Arterial Pulmonar (PAH), Doença de Alzheimer (AD) e sepse e quaisquer combinações das mesmas cujo método compreende administrar a um paciente mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou composição farmacêutica como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 88 ou 96 a 110 que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00399] Modalidade 114: um método de tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), aterosclerose, Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Artrite de Célula Gigante (GCA), diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero cujo método compreende administrar ao paciente mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou composição farmacêutica como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 88 ou 96 a 110 que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP).

[00400] Modalidade 115: o anticorpo ou composição farmacêutica como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 88 ou 96 a 110 que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP, para uso em tratamento e/ou prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), aterosclerose, Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, Artrite de Célula Gigante (GCA), diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero.

8. Usos Diagnósticos e Kits

[00401] Uma das vantagens de uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou fragmento do mesmo como descrito aqui é que eles ligam-se à IL-18, porém não se ligam ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) e que eles não são IL-18BP. Portanto, uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou fragmento do mesmo como descrito aqui são cazes de apenas detectar a IL-18 livre, não ligada à IL-18BP. Como IL-18 livre é a molécula biologicamente ativa, torna-se imediatamente evidente que uma molécula de ligação capaz de reconhecer apenas tal entidade pode permitir a diferenciação de IL-18 livre de IL-18 ligada a IL-18BP, que é inativa. Além disso, como as moléculas de ligação da invenção não abrangem a IL-18BP, ou isolada ou de ocorrência natural, elas se prestam não apenas como agentes terapêuticos, porém também como ferramentas em muitas outras aplicações, tais como em diagnóstico ou em um kit diagnóstico.

[00402] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção provê a ligação às moléculas ou anticorpos isolados ou fragmentos dos mesmos como descrito aqui que se ligam à IL-18 e não se ligam ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação não é IL-18BP para uso em diagnóstico ou para uso em um kit diagnóstico.

[00403] As moléculas de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo como descrito aqui, podem ser usados em combinação com detecção de anticorpos em ensaios ELISA, western blots etc. e podem ser usados apenas para detectar a presença de IL- 18 livre, porém também para mensurar a quantidade de IL-18 livre.

[00404] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção provê a ligação às moléculas ou anticorpos isolados ou fragmentos dos mesmos que se ligam à IL-18 e não se ligam ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP para uso em diagnóstico ou para uso na detecção e/ou mensuração da presença e/ou da quantidade de IL-18 livre (isto é, IL- 18 não ligada à IL-18BP) em uma amostra.

[00405] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a detecção e/ou mensuração da presença e/ou quantidade de IL-18 livre (isto é, IL-18 não ligada à IL-18BP) em uma amostra, em que a amostra é opcionalmente uma amostra humana, em que o método compreende contatar a amostra com uma molécula de ligação ou um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação não é IL-18BP.

[00406] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método que compreende as etapas de: a. contatar uma amostra obtida de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo acometido com um distúrbio ou doença inflamatória) com uma molécula de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo como descrito aqui, que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação não é IL-18BP; b. mensurar o nível de IL-18 livre; c. opcionalmente, mensurar o nível de IL-18 total e IL-18 BP; d. em que as etapas b) e c) podem ser realizadas simultaneamente ou consecutivamente ou em ordem invertida (por exemplo, etapa b) antes da etapa c) ou etapa c) antes da etapa b).

[00407] A amostra pode ser uma amostra isolada de um corpo mamífero, preferivelmente de um corpo humano. A amostra isolada pode ser: i. de um local do corpo acessível, por exemplo, uma membrana mucosa do nariz, pele, conjuntiva, boca ou garganta, ânus, vagina, uretra, cérvix; e ou ii. compreende um fluido ou semissólido (por exemplo, um fluido corporal ou semissólido, por exemplo, descarga, vômito, secreção, excreta, sucos gástricos e/ou intestinais, esputo, sangue, soro sanguíneo, plasma, urina, lágrimas, fluido sinovial, sêmen, fluido da próstata, saliva, homogenado de tecido ou muco); e ou iii. compreende um sólido (por exemplo, fezes, tecido, ou amostra de biópsia); e/ou iv. compreende uma cultura (por exemplo, cultura de macrófago);

[00408] A amostra pode ser sangue humano ou uma parte de sangue humano, tal como o plasma.

[00409] A amostra isolada pode ser preferivelmente selecionada de sangue total humano, macrófagos derivados de monócito de sangue humano e macrófagos de pulmão humano.

[00410] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um kit diagnóstico compreendendo uma molécula de ligação ou anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo (que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP) em que uma molécula de ligação não é IL-18BP) e/ou o complexo compreendendo IL-18 e aquela molécula de ligação em que o kit opcionalmente compreende um primeiro composto de controle.

[00411] Um composto de controle é um composto que indicará que o kit diagnóstico está funcionando. Um composto de controle pode ser positive ou negative e verificará que qualquer resultado é válido.

[00412] O primeiro composto de controle pode ser IL-18 livre e o kit opcionalmente pode compreender um segundo composto de controle que é anticorpo murino 125-2H.

[00413] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um dispositivo médico ou diagnóstico compreendendo uma molécula de ligação ou o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo (que se liga à IL-18 e não se liga ao complexo de IL-18/proteína de ligação à IL-18 (IL-18 BP)) e/ou o complexo em que uma molécula de ligação não é IL- 18BP compreendendo IL-18 e aquela molécula de ligação.

9. Exemplificação

[00414] As sequências dos anticorpos da presente invenção exemplificadas aqui, juntamente com uma tabela de correlação de sequência são descritas para término desta especificação.

9.1) Materiais

[00415] IL-18 humana recombinante (gerada em E. coli usando o método descrito por Liu et al (2000) Cytokine 12(10):1519-25).

[00416] IL18 de cinomolgo recombinante (gerada em E. coli usando o método descrito em Patente dos Estados Unidos número 6.432.678).

[00417] TNFα humano recombinante (R&D #210-TA).

[00418] Fc de IgG1 de Proteína de Ligação humana IL18 recombinante (hIL-18BPa-Fc, R&D Systems # 119-BP-100).

[00419] IgG1 de IL-18 anti-humana de camundongo (125-2H; R&D Systems # D044-3).

[00420] Anticorpo anti-lisozima humano (MOR03207 Morphosys).

[00421] Linhagem celular KG-1 (ATCC #CCL-246).

[00422] Meio celular: RPMI 1640 (Invitrogen #31870) suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (Invitrogen #10108-157), 1% de L- Glutamina (Invitrogen #25030-03), 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen #15140-148).

[00423] Placas de 96 cavidades tratadas com cultura de tecido, de base plana (Costar #3596).

[00424] Ensaio ELISA DuoSet de IFN-y Humano (R&D #DY285).

[00425] Placas de microtítulo Maxisorb (Sigma #M9410).

[00426] Heparina (Sigma #H3393).

[00427] IL-12 humana recombinante (R&D Systems #219-IL-CF).

[00428] LPS (Sigma #L4516).

[00429] Tubos Falcon (Corning #430829).

[00430] Ficoll-Paque™Plus (GE Healthcare Life Sciences #17-1440- 02).

[00431] Células KG-1 foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 1% de L-Glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina em uma densidade de 2x105 a 1x106 células viáveis /ml.

9.2) Anticorpos e fragmentos dos mesmos selecionados para análise funcional

[00432] Os anticorpos e fragmentos dos mesmos foram gerados por exibição de fago. A biblioteca de fagemídeo usada é com base no conceito de HuCAL® (Knappik,A. at al. (2000) J Mol Biol 296, 57-86) e employs the CysDisplayTM technology for displaying the Fab on the superfície de fago (WO 01/05950). Para aumentar a afinidade e atividade biológica de fragmento selecionado de anticorpos, regiões L- CDR3 e H-CDR2 foram otimizadas em paralelo por mutagênese usando mutagênese direcionada a trinucleotídeo (Virnekas, B et al. (1994) ácidos nucleicos Res 22, 5600-5607), enquanto as regiões de estrutura foram mantidas constantes. Anticorpos de diferentes estruturas parentais foram selecionados de conversão de IgG conversão e caracterização funcional. Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos são mostrados na Tabela 1A abaixo. Tabela 1A: IgGs e Fabs selecionados para análise funcional

[00433] Anticorpo MOR9464 quando formulated em uma formulação líquida pareceu perder potência ao longo do tempo. Foi hipotetizado que a molécula pode sofrer algumas modificações que afetam sua potência. MOR9464 foi incubado em uma temperatura maior do que a temperatura fisiológica para acelerar o aparecimento da perda de potência. Combinando-se técnicas biofísicas complexas, incluindo espectrometria de massa e HPLC de fase reversa, duas formas distintas, ainda desconhecidas, de MOR9464 foram isoladas.

[00434] Diversas modificações podem ocorrer às proteínas quando elas estão no meio extracelular, durante manipulação in vitro e circulação in vivo. Seja qual for a modificação, ela pode impactar amplamente as propriedades relevantes para a técnica farmacêutica com base em proteína. Portanto, torna-se fundamental entender a ligação funcional da estrutura destas modificações. Modificações exocelulares são modificações que ocorrem logo após as proteínas terapêuticas completarem a série de reação de tráfico, atingem a superfície celular e elas são liberadas no ambiente do meio extracelular e incubadas ali durante o período de produção. Elas também abrangem modificação que ocorrem durante a manipulação in vitro, tais como purificação e formulação em tampões adequados, ou mesmo circulação in vivo (Zhong X. e Wdireita J.F., Int J of Cell Biol., 2013, 1-19). Processamento proteolítico é a mais comum e bem conhecida modificação exocelular visto que seus produtos são facilmente identificados. A oxidação de resíduos de aminoácido individuais pode ser mais difícil para caracterezar e pode envolver resíduos de metionina, bem como resíduos de triptofano, cisteína, histidina e tirosina. A formação de piroglutamato de terminação N é também uma modificação exocelular bem conhecida, por meio da qual os resíduos de glutamina ou glutamato de terminal N podem facilmente ciclizar com seu próprio grupo terminal para formar o ácido pirrolidona carboxílico. A desamidação de resíduos de asparagina e aspartato ou isomerização de aspartato são também modificações conhecidas, ainda não bem caracterizadas.

[00435] Se as modificações exocelulares ocorrerem em regiões específicas do anticorpo, elas podem ter um efeito profundo sobre as características funcionais de um anticorpo, tal como a perda de potência. Se a modificação ocorre na CDR ou em um local muito próximo, ela pode impactar a capacidade do anticorpo reconhecer e/ou especificamente ligar seu antígeno.

[00436] Análises da sequência de MOR9464 foram realizadas para identificar o local potencial de modificações exocelulares. Os mutantes mostrados na Tabela 1B foram gerados. Tabela 2B: Mutantes de MOR9464/MOR10222

[00437] Asparagina 30 exatamente flanqueando a H-CDR1 de MOR9464 foi considerada ser um possível local de modificação, juntamente com a serina 31 na H-CDR1 e metionina 54 na H-CDR2. Desamidação não enzimática de resíduos de asparagina e glutamina em aspartato e glutamato ocorre através da reação hidrolítica e é dependente do pH, temperatura e resistência iônica. Ela também depende dos resíduos de aminoácido que precedem os resíduos de asparagina e glutamina, com serina e treonina aumentando as taxas de desamidação.

[00438] A maioria dos mutantes de MOR10222_S31X, com ou sem a mutação de metionina, pesadamente agregados após a produção. Portanto, estes mutantes não foram mais caracterizados.

9.3) Determinação de Afinidades Usando Titulação de Equilíbrio da Solução (SET)

[00439] Para determinação de KD por titulação de equilíbrio da solução (SET), frações monômeras de anticorpos foram usadas (analisadas por SEC analítica).

[00440] A determinação de afinidade em Solução foi basicamente realizada como descrito na literatura (Friguet B at al. (1985) J Imunol Methods; 77(2):305-19). A fim de melhorar a sensibilidade e precisão do Método SET, ele foi transferido de ELISA clássico para tecologia com base em electro-quimioluminescente (ECL) (Haenel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-4.).

[00441] Anticorpos específicos de fragment (Fab)2 anti-humano de cabra (Dianova) foram rotulados com MSD SULFO-TAGTM NHS-Ester (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Experimentos foram realizados em placas de microtítulo de polipropileno e tampão de ensaio com base em fosfato. IL-18 humana não rotulada foi serialmente diluída, iniciando com uma concentração pelo menos 10 vezes maior do que a KD esperada. Cavidades sem antígeno foram usadas para determiner valores Bmax; cavidades com tampão de ensaio foram usadas para determinar a base. Após a adição de uma quantidade constante de anticorpos ou fragmento dos mesmos (por exemplo, concentração final a 10pM em volume final de 60 μl), a mistura foi incubada durante a noite em temperatura ambiente. A concentração dos anticorpos aplicados ou fragmentos dos mesmos foi similar a ou abaixo da KD esperada.

[00442] As placas MSD de estreptavidina foram bloqueadas com tampão de fosfato contendo BSA durante a noite. Após o bloqueio da placa, IL-18 humana biotinilada foi adicionada e incubada durante 1h em temperatura ambiente. Subsequentemente as amostras equilibradas foram transferidas para aquelas placas e incubadas durante um curto tempo em temperatura ambiente. Após lavagem, anticorpo de detecção rotulado MSD SULFO-TAG ((Fab)2 anti-humano de cabra) foi adicionado à placa MSD e incubado durante um curto tempo em temperatura ambiente.

[00443] Após lavar a placa e adicionar o Tampão T de Leitura MSD com tensoativo, sinais de eletroquimioluminescência foram detectados usando um Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA).

[00444] Os dados foram avaliados com o software XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste customizados. Para a determinação de KD de moléculas de Fab, o seguinte modelo de ajuste foi usado (de acordo com Haenel et al., 2005), modificado de acordo com Abraham et al,1996):

[Fab]t: concentração de Fab total aplicada x: concentração de antígeno solúvel total aplicada (locais de ligação) Bmax: sinal máximo de Fab sem antígeno KD: afinidade

[00445] Em princípio o mesmo protocol foi aplicado para determiknar os valores KD para anticorpos e fragmentos com as seguintes diferenças: anticorpos inteiros foram adicionados às séries de diluição de antígeno, e equilibrados durante a noite em temperatura ambiente. Subsequentemente, as amostras foram tratadas como descrito acima.

[00446] Para avaliação dos dados, isto é, a determinação de KD de moléculas de IgG, o seguinte modelo de ajuste para IgG foi usado (modificado de acordo com Piehler et al., 1997):

[IgG]: concentração de IgG total aplicada x: concentração de antígeno solúvel total aplicada (locais de ligação) Bmax: sinal máximo de IgG sem antígeno KD: afinidade

[00447] Afinidades dos anticorpos anti-IL-18 ou fragmentos dos mesmos foram determinadas em solução, usando as condições de ensaio descritas acima e são indicadas na Tabela 2A (coluna 2). Onde a IL-18 de macaco cinomolgo (cm IL-18) foi também testada, a KD resultante foi indicada entre parênteses. 9.4) Inibição de liberação de IFN-Y de PBMCs humanas estimuladas por IL-18

[00448] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram recenteente isoladas de sangue total humano heparinizado usando técnicas padrões. Em síntese, sangue diluído contend heparina (15U/ml) como um anti-coagulante foi colocado sobre Ficoll- Paque™Plus e centrifugado(800xg, 20 minutos, 18oC). As PBMCs foram coletadas da interface plasma:Ficoll e lavadas duas vezes (600xg, 10 minutos, 4oC), antes de ressuspender em meio.

[00449] As PBMCs foram ressuspensas em mekio e aplicadas a uma placa de cultura de cellular de 96 cavidades para fornecer uma densidade celular final de 1,5x106/ml (em um volume de ensaio final de 200μl). Para garantir os anticorpos e fragmento dos mesmos de acordo com a IL-18 nativa reconhecida da invenção, que pode ser glicosilada, as PBMCs foram estimuladas com LPS e IL-12 que induz IFN-y por meio de realimentação de autócrino dependente de IL-18.

[00450] As células foram estimuladas com IL-18 recombinante humana a 3nM mais IL-12 (1ng/ml) ou LPS (3μg/ml) mais IL-12 (10ng/ml) para induzir a secreção de proteína IL-18 nativa (todas as concentrações finais). No caso de IL-18 humana recombinante, a concentração selecionada foi predeterminada como uma EC80 aproximada neste ensaio. No caso de IL-18 nativa, LPS estimula a produção de IL-18, embora a IL-12 aumente a expressão de receptor de IL-18 (Yoshimoto T et al. (1998) J Imunol; 161(7):3400-7). A extensão de dependência de IL-18 neste ensaio foi determinada por meio da inclusão da proteína altamente específica, Fc de IgG1 de Proteína de Ligação de IL-18 (hIL-18BPa-Fc) como um controle positivo (linha pontilhada nas Figuras 3 (A-D).

[00451] Para avaliar sua potência e eficácia, os anticorpos e fragmentos dos mesmos foram pré-equilibrados durante 30 minutos com ou IL-12 e LPS (condições nativa) ou IL-12 e IL-18 (condições recombinantes) antes de aplicação às células com uma concentração final entre 0,1 e 300nM. O anticorpo MOR03207 de controle anti- lisozima MOR03207 foi usado como um controle negativo.

[00452] A partir de cada grupo de tratamento, um valor da média ± SEM (onde n=3 ou mais) foi determinado de n=2-5 cavidades.

[00453] As células foram incubadas a 37oC, 5% de CO2 durante 24 horas após o tratamento, após cujo tepo o sobrenadante foi coletado por centrifugação (1200rpm durante 5 min) e armazenado a -20oC para subsequente análise. Os níveis de proteína de IFN-y foram avaliados usando ELISA em conformidade com as instrulções do fabricante.

[00454] Todos os anticorpos e fragmentos dos mesmos dependen-temente da dose inibiram a produção de IFN-y com um nível similar de eficácia obtido nas maiores concentrações como aquela observada para IL-18BPa-Fc recombinante (Tabela 2A colunas 5-6, Tabela 2B coluna 2 e Figuras 3 (A-D) onde a eficácia da IL-18BPa é denotada por linha pontilhada). O anticorpo de controle, MOR03207 (anticorpo de controle anti-lisozima) não inibiu uma resposta de IL-18. Anticorpos de linhagem germinativa, (por exemplo, MOR10579 de MOR09441 e MOR10222) de MOR09464 não alteraram significantemente sua capacidade de neutralização. Mutantes de MOR9464 e MOR10222, em particular MOR9464_N30K e MOR10222_N30S_M54I não tiveram capacidade de neutralização comparável aos anticorpos do tipo selvagem. Tabela 2A: Valores KD de afinidade de IL-18 e valores de IC50 (nM) para inibição de liberação de IFNY induzida por IL-18 recombinante humana (hr) (1nM) e IL-18 nativa

9.5) Inibição de liberação de IFN-Y de células KG-1 estimuladas por IL-18

[00455] Anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos foram analisados quanto a sua capacidade de inibir a liberação de IFN-y de células KG-1 estimuladas por IL-18. Na ausência de um antagonista, a IL-18 promove a estimulação máxima de liberação de IFN-y na presença de um coestímulo, tal como TNFα e IL-12 por meio da super regulação de receptores de IL-18 (Nakamura S et al. (2000) Leukemia;14(6):1052- 9). Atividade inibitória dos anticorpos e fragmentos foi avaliada com 1nM de IL-18 humana ou de cinomolgo (a menos que de outro modo especificado), predeterminada como uma EC80 neste sistema com base em célula.

[00456] Células KG-1 foram ressuspensas em meio de cultura e aplikcadas a uma placa de cultura celular de 96 cavidades para fornecer uma densidade celular final de 0,3 x106/ml (em um volume de ensaio final de 200μl). As células foram estimuladas com 1nM de IL-18 recombinante humana ou de cinomolgo mais TNFα (concentração final 20ng/ml). A concentração de IL-18 recombinante selecionada foi predeterminada como uma EC80 aproximada neste ensaio.

[00457] Para avaliar a potência e eficácia destes anticorpos, os anticorpos e fragmentos dos mesmos foram pré-equilibrados durante 30 minutos com TNFα e IL-18 (humana ou de cinomolgo) antes da aplicação às células com uma coentração final entre 0,1 e 300nM. Anticorpo MOR03207 de controle anti-lisozima foi usado como um controle negativo.

[00458] A partir de cada grupo de tratamento, um valor da média ± SEM (onde disponível) foi determinado de n = 2-5 cavidades. As células foram incubadas a 37oC, 5% de CO2 durante 24 horas após o tratamento, após cujo tempo o sobrenadante foi coletado por centrifugação (885 x g durante 5 minutos) e armazenado a -20oC para subsequente análise. Os níveis de proteína de IFN-y foram avaliados usando ELISA em conformidade com as instruções do fabricante.

[00459] Todos os anticorpos e fragmentos dos mesmos dependentemente da dose inibiram a produão de IFN-y com total inibição obtida nas maiores concentrações. Para anticorpos maduros de afinidade,valores IC50 variaram de 0,3 a 0,8 nM junto a 0,8 nM de IL- 18 humana, portanto, representando uma relação molar de 1:1 de anticorpo:antígeno ou melhor. Anticorpos de estrutura VH4_3b (MOR08776, MOR010501, MOR010502) demonstraram potência similar contra ambas IL-18 humana e de cinomolgo, embora anticorpos de estrutura VH1A_3 sejam ligeiramente menos potentes contra a IL-18 de cinomolgo (Tabela 2, colunas 3 e 4). O anticorpo de controle, MOR03207 não inibiu uma resposta de IL-18.

9.6) Liberação de INF--/ induzida por IL-18 em sangue total humano

[00460] O ensaio de sangue total incorpora tanto a presenças quanto a função da IL-18BP endógena visto que uma IL-18BP é primariamente gerada pelo baço e está presente sistemicamente em níveis em torno de 10 a 20 ng/ml em indivíduos sadios. A IL-18BP liga-se com alta afinidde à IL-18 e neutraliza sua atividade, e portanto, pode representar um dissipador para anticorpos que reconhece epítopo acessíveis deste complexo.

[00461] A atividade dos anticorpos anti-IL-18 foi avaliada em sangue total humano heparinizado de um voluntário sadio. Todos os reagentes foram preparados em vinte vezes a concentração final desejada usando meio sem soro. As células foram estimuladas com ou IL-18 recombinante humana a 7nM mais IL-12 (1ng/mL) ou LPS (10μg/mL) mais IL-12 (10ng/mL) para induzir a secreção de proteína IL-18 nativa (todas as concentrações finais). No case IL-18 humana recombinante, a concentração selecionada foi predeterminada como uma EC80 aproximada neste ensaio. No caso de IL-18 nativa, LPS estimula a produção de IL-18, embora IL-12 aumenta a expressão do receptor de IL-18 e a extensão de dependência de IL-18 é determinada por meio da inclusão de Fc de IgG1 de Proteína de Ligação de IL-18 humana recombinante (hIL-18BPa-Fc) como um controle positivo.

[00462] Para avaliar a potência e eficácia destes anticorpos, os anticorpos anti-IL-18 e fragmentos dos mesmos foram pré-equilibrados durante 30 min com o relevante estímulo antaes de aplicar às células com uma concentração final enre entre 0,1 e 1000nM. Anticorpo de controle anti-lisozima MOR03207 foi usado como um conrole negativo.

[00463] A mistura de estímulo (+/- anticorpo ou fragmento) foi adicionada a cada cavidade de uma placa de microtítulo estéril de cultura de tecido de 96 cavidades quando 30μL e 170μL de sangue total heparinizado foi então adicionado a cada cavidade, de modo que o volume Ifinal em cada cavidade fosse de 200μl. As placas foram então retornadas para uma incubadora umidificada (37oC). Após 24horas, as placas foram centrifugadas (885 x g, 4oC, 5 min) e os sobrrenadantaes removidos e ensaiados quanto à produção de hIFN-y usando um kit ELISA comercialmente disponível. Os dados finais foram derivados como uma média ± erro padrão da média de 3-5 doadores humanos sadios.

[00464] Todos os anticorpos e fragmentos dependentemente da dose inibiram a produção de IFNy junto a outro estímulo. Inibição total de resposta induzida por IL-18 recombinante foi obida nas maiores concentrações, embora eficácia similar fosse observada com a estimulação de LPS/IL-12 como aquela para a IL-18BPa-Fc (Tabela 3; Figuras 7(A-E) e 8(A-E)). MOR09441 e MOR09464 de linha germinativa não alteraram significanatemente sua capacidade neutralizante. O anticorpo de controle, MOR03207 não inibiu uma resposta de IL-18. Anticorpos selecionados foram também avaliados quanto a sua capacidade de inibir a bioatividade de IL-18 de cinomolgo recombinante (7nM) em sangue total do macaco cinomolgo. MOR09441, MOR09464, MOR09465, MOR09466 todos dependentemente da dose iknibiram a produção de IFN-y com total inibição observada nas maiores concenrações. Valores IC50 observados foram de 110±36nM, 51±8nM, 55±3 nM, 179±30 nM, respectivamente. Tabela 3: Valores IC50 (nM) para inibição de liberação de IFN-y induzida por IL-18-induceem sangue total

[00465] Mutantes de MOR9464 e MOR10222, em particular MOR9464_N30K e MOR10222_N30S_M54I não tiveram capacidade de neutralização comparável aos anticorpos do tipo selvagem.

9.7) Ligação ELISA de anticorpos anti-IL-18 ao complexo de IL-18-IL- 18BP

[00466] Para confirmar que os anticorpos anti-IL18 anticorpos ou fragmentos dos mesmos descritos aqui não reconhecem IL-18 ligada a uma IL-18BP (complexo de IL-18/IL-18BP) IL-18 foi incubada com IL- 18BP (rhIL-18BP/Fc, R&D Systems, Cat#119) em um excesso molar. Anticorpos anti-IL18 e fragmentos foram adicionados como descrito abaixo e a ligação ao complexo foi detectada. Em geral, sinais em altas concentrações dos anticorpos anti-IL-18 e fragmentos são detectadas onde elas ligam epíopos acessíveis no antígeno diferente a uma IL- 18BP (isto é, reconhecem o complexo IL-18/IL-1BP). Em uma primeira configuração, anticorpos de controle e anticorpos anti-IL18 e fragmentos foram diluídos usando PBST/0,5%BSA e adicionados ao complexo de IL-18/IL18-BP biotinilado (incubação em placas de polipropileno durante 30 min em temperatra ambiente e agitando suavemente). Anticorpos de controle foram MOR03207(anti-losozima) como o controle negativo, MOR08741 bem como 125-2H de camundongo, um IgG de camundongo de IL-18 anti-humana, como anticorpos de controle positivo (ambos reconhecem o complexo de IL-18/IL-18BP) (Argiriadi MA et al. (2009) J Biol Chem;284(36):24478-89). O complex total foi capturado por meio das porções de biotina em placas NeutrAvidin, que foram bloqueadas o/n com 1x ChemiBlocker-PBS.

[00467] As placas foram lavadas 5x com PBST e incubadas durante 1 h com 20 μl/cavidade de anticorpo de detecção IgG humano anti cabra - anti-Fab-A, fragmento F(ab)2 específico (Jackson Imuno Research, 109-055-097, lote: 69655) ou IgG anti-camundongo (molécula inteira)- AP (SIGMA, #A4312) ambos diluídos 1:5000 em 0,5% de BSA/0,05% de Tween20/1x PBS. As placas foram lavadas 5x com TBST, 20 μl de solução AttoPhos (Roche) (1:5 diluída em ddH2O) foram adicionados e a fluorescência foi medida na Leitora Tecan.

[00468] Para os anticorpos anti-IL-18 MOR8775 e MOR8776 que não se ligam ao complexo de IL-18/IL-18BP, sinais de ligação foram significantemente reduzidos ou nenhum sinal foi observado (Figura 9(A)). Em comparação, um forte sinal foi observado na presença de 1252H de camundongo suportando a capacidade reportada deste anticorpo de controle para ligar um epítopo distinto daquele da IL-18BP. Similarmente, um sinal dependente da dose foi observado na presença de anticorpo de controle MOR08741.

[00469] Em uma segunda configuração, o experiment foi feito de um modo similar, exceto para usando hu IL-18 não biotinilada. O complexo de IL-18/IL-18BP foi capturado sobre placa Maxisorp por meio do rótulo de Fc do rhIL-18BP/Fc usando um IgG anti hu de cabra (fragmento Fc gama específico, Jackson ImunoResearch #109-005-098). Um sinal dependente da concentração foi observado para controlar MOR08741, novamente realçando a capacidade deste anticorpo para reconhecer o complexo de IL-18/IL-18BP. Em comparação, nen hum sinal foi observado para MOR09441, MOR09464, MOR09465, MOR09466, confirmando que eles não ligam o complexo de IL-18/IL-18BP.

9.8) Armazenamento de epítopo de anticorpos anti-IL18 e fragmentos por meio de ELISA

[00470] Para armazenamento de epígopo duas configurações foram usadas. Para a primeira configuração, um fragmento de anticorpo (Fab A) foi titulado e incubado com IL-18 humana biotinilada. Fab A foi testado com uma concentração aconsante de um anticorpo B (IgG B). Como um controle positivo, Fab A foi analisado com ele próprio no formato IgG. Placas NeutrAvidin (Thermo Scientific Cat#15402) foram bloqueadas com Quimiobloqueador (1:1 diluído com PBS) e incubadas durante 2h em RT (ou durante a noite a 4°C). No dia seguinte as placas foram lavadas 2x com PBST e Fabs foram titulados de 500nM até 2nM em tampão de PBS contendo 10nM de concentração final de IL-18 humana biotinilada. O complexo de fragmento de anticorpos e IL-18 biotinilada foi adicionado às placas NeutrAvidin e incubados durante 1 hora. Após lavar 3x com PBST IgG B foi adicionado a 20nM às cavidades correspondentes das placas NeutrAvidin. Após 20 minutos de incubação, e 3x lavagem com PBST, anticorpos de detecção IgG anti-humano de cabra - anti-Fc-AP, cadeia gama de Fc específica (Jackson Imuno Research, 109-055-098) e IgG anti-camundono (molécula total)-AP (SIGMA, #A4312, Lote: 067K4863) foram adicionados diluídos 1:5000 em 0,5% deBSA/0,05% de Tween20/1x PBS.

[00471] As placas foram lavadas 5x com PBST, 20 μl de Solução AttoPhos (1:5 diluída em ddH2O) foram adicionados e as placas foram medidas na Leitora Tecan. Emissão de fluorescência a 535 nm foi registrada com excitação a 430 nm.

[00472] Em geral, os sinais podem apenas ser obtidos quando o IgG B foi capaz de ligar-se a epítopos acessíveis sobre o antígeno que são diferentes ao Fab A testado (isto é, ligação de anticorpo a um diferente epítopo). Ao contrário, para anticorpos com epítopos parcialmente sobrepostos ou idênticos, sinais de ligação foram significantemente diminuídos em comparação aos controles.

[00473] A segunda configuração ELISA foi realizada em placas Maxisorp. Fab A foi revestido para diferentes concentrações em PBS e incubado o/n a 4°C. No dia seguinte as placas foram lavadas 3x com PBST e bloqueadas durante 2 horas em RT com 5% de MPBST (100μl/cavidade). Após uma etapa de lavavem de 3x PBST, a IL-18 humana foi adicionada em uma concentração constante durante 1h. As placas foram lavadas 3x com PBST e fragmento biotinilado de anticorpo (Fab B biotinilado) foi titulado (conc. máx. 5μg/mL, 10μg/mL ou 20μg/mL). Para formação de complex de Fab A com IL-18 e Fab B biotinilado, as placas foram incubadas durante 1h, Subsequentemente lavadas 3x com PBST e detecção de anticorpo ZyMax Estreptavidin- Fosfatase Alcalina (Zymed, Cat. No. 43-8322, Lot 51102099) foram diluídas 1:2.000 em PBST e 20μL/cavidade foram adicionados às placas ELISA. As placas foram lavadas 5x com TBST, 20 μL de Solução de AttoPhos (Roche) (1:5 diluídas em ddH2O) foram adicionados e as placas foram medidas na Leitora Tecan.

[00474] Neste caso, em relação à primeira configuração, os sinais podem somente ser obtidos quando o Fab B biotinilado foi capaz de ligar-se aos epítopos accessíveis no antígeno que são diferentes para o Fab A testado (isto é, anticorpo ligando um epítopo diferente).

[00475] Como mostrado na Figura 10A, anticorpos MOR8775 competem com anticorpo de murino 125-2H (enchimentos celulares pretos) enquanto MOR8776 não compete com 125-2H para ligação à IL-18 (nenhum carregamento de célula). Ambos anticorpos competem com IL-18BP-Fc para ligação à IL-18 (enchimentos celulares pretos). Nem MOR8775 nem MOR8776 compete com o anticorpo ABT325 (Pedido de patente U.S. No. Ser. 09/780.035 e 10/988.360). Dependendo dos parâmetros experimentais, MOR8775 e MOR8776 competem um com outro (enchimento celular listrado).

[00476] Em um segundo conjunto de experimentos, anticorpos MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I e MOR13341 foram testados quanto a sua capacidade de ligar-se à IL-18 na presença de quaisquer dentes anticorpos, IL-18BP-Fc, ABT325 e anticorpo de murino 125-2H usando o instrumento Proteon XPR36, um biossensor livre de rótulo em tempo real, com base em ressonância de plasmônio superficial (SPR). Antes da análise, a integridade das proteínas foi confirmada, e a concentração ensaiada por LC-MS.

[00477] Todos os anticorpos e IL18BP-Fc foram imobilizados nos pontos de interação de um chip de sensor GLC por acoplamento de amina padrão. Em uma primeira etapa, IL18 foi injetada como analisado 1 e em uma segunda etapa um anticorpo anti-IL18 ou IL18BPa-Fc foi injetado como analisado 2.

[00478] Os ligantes a serem imobilizados foram preparados em uma concentração de 20 μg/mL (anticorpos) ou 10 μg/mL (IL18BP-Fc) em Tampão de Acetato a 10 mM, pH 4.0. Os analisados foram diluídos em tampão de PBS (TEKNOVA) contendo 0,005% de Tween 20, a mesma solução de tamponamento foi usada como tampão fluente para o instrumento. Analisado 1 (25 nM IL18) foi injetado em uma taxa de fluxo de 50 μL/min durante 180 segundos com um tempo de dissociação de 60 segundos. Analisado 2 (25 nM de IL18BPa-Fc ou anticorpo anti-IL18) foi injetado em uma taxa de fluxo de 50 μL/min durante 180 segundos com um tempo de dissociação de 180 segundos. A regeneração foi realizada com Glicina a 10 mM, pH 1,5 em uma taxa de fluxo de 100 μL/min durante 20 segundos. Dois conjuntos independentes de experiências foram realizados. A avaliação dos dados foi com base no sinal de sensograma aumentado na injeção do analisado 2 em comparação ao sinal do analisado 1. Se o sinal aumentou, foi concluído que o ligante imobilizado e o analisado 2 injetado reconheceu diferentes epítopos. Se o sinal não aumentou, foi concluído que os dois compartilharam os mesmos ou epítopos de sobreposição.

[00479] Como mostrado na Figura 10B, anticorpos MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I e MOR13341 competem entre si (enchimentos celulares pretos), com IL-18BP-Fc e com anticorpo de murino 125-2H. Nenhum destes anticorpos competem com ABT325 (enchimentos celulares brancos).

[00480] Anticorpos tais como MOR9464_N30K e MOR10222_N30S_M54I que mostram competir dualmente com o IL- 18BP-Fc e com anticorpo de murino 125-2H mostraram ter a vantagem de apenas não ligar-se à IL-18 livre, não ligada ao inibidor natural IL- 18BP-Fc, porém também mostraram ter o potencial de prevenir a ligação de IL-18 à IL-18Rα/β. Como descrito na Wu et al. (Wu C. et al., J. Imunol. 2003, 170: 5571-5577), IL-18Rβ não mostra ligar-se à IL-18 sozinha, porém forma um complexo do receptor de alta afinidade funcional com IL-18Rα que é capaz de sinalizar em resposta à IL-18. Os dados bioquímicoa combinados com o mapeamento de epítopo de 1252H sobre IL-18 têm revelado que os 17 aminoácidos de C-terminal da IL-18 humana são críticos para a transdução de sinal pelo receptor heterodimérico. Consequentemente, os anticorpos capazes de ligar-se dentro do epítopo 125-2H e igualmente competir com a IL-18 BP para ligação à IL-18 mostram ter o potencial de impedir a ativação da série de reação dependente de IL-18 não apenas pelo bloqueio da ligação à IL-18Rα porém também pelo bloqueio da ligação de IL-18 ao complexo IL-18Rα/β. Visto que ficará evidente na seção 9.11, anticorpo MOR9464_N30K liga, entre outros, aminoácidos Glu177 e Leu180 que estão dentro da extensão de 17 aminoácidos descrita em Wu et al.

9.9) Mapeamento de epítopo de IL-18 por modelagem

[00481] IL-18 humana de SwissProt entrada Q14116 foi testada para pesquisa para informação estrutural no PDB (Berman H.M et al (2000) Nucl Acids Res; 28:235-242). Três estruturas foram encontradas com o código 1J0S (Kato Z et al (2003) Nat Struct Biol;10:966), 2VXT (Argiriadi MA et al (2009) J Biol Chem; 284:24478) e 3F62 (Krumm B et al (2008) Proc Natl Acad Sci USA; 105:20711). 1J0S é a estrutura de RMN de IL- 18 humana. 2VXT é a estrutura de cristal da IL-18 humana construída no complexo com fragmento de anticorpo 125-2H de camundongo na resolução de 1,49 Â e 3F62 é a estrutura de cristal da IL-18 humana construída no complexo com a proteína de ligação de IL-18 de poxvírus na resolução de 2,0 Â.

[00482] Três locais de ligação em IL-18 foram identificadas por análise mutacional. Dois deles, local 1 e 2, são importantes para ligação à IL-18Rα e o terceiro, local 3, para ligação à IL-18Rβ (Kato Z. et al. (2003) Nat.Struct.Biol,10:966). Local 2 é também importante para ligação à IL-18BP.

[00483] Um complexo estrutural entre IL-1β e IL-1R1 está também disponível (1ITB, Vigers G.P et al (1997) Nature, 386:190). A estrutura do complexo entre IL-1β e IL-1R1 mostra que IL-1β tem dois locais de ligação para o receptor, local 1 e 2 (Figure 11(A)). Visto que nenhuma estrutura está disponível para o complexo entre IL-18 e IL-18Rα, a estrutura de cristal de IL-1β no complexo com IL-1R1 foi usada como padrão para a modelagem de proteína (PDB código 1ITB). O model de IL-18Rα foi construído usando-se a estrutura de IL-1R1 como padrão. A estrutura de cristal de IL-18 (pdb código 2VXT, Argiriadi M.A et al (2009) J.Biol.Chem. 284:24478) e a estrutura modelada de IL-18Rα foram estruturalmente sobrepostas ao complexo IL-1β/IL-1R1 e o modelo de IL-18/IL-18Rα desse modo obtido foi refinado para obter o modelo estrutural final (Figura 11(B)). MOE v2009.1 (Chemical Computing Group Inc.) é o software usado para modelar o complexo entre IL-18 e IL-18Rα. O painel do Modelo de Homologia foi usado para construir o modelo de IL-18Rα, selecionando-se o campo de força de AMBER99 e os parâmetros do painel básico. O painel de minimização de energia em MOE foi usado para o refinamento do complexo IL-18/IL-18Rα final.

[00484] A estrutura global de IL-18 humana mostra similaridade com aquela de IL-1β. Em particular, o RMSD (desvio da raiz quadrada médio) entre os átomos de Cα de IL-18 e IL-1β em elementos de estrutura secundários indica que eles são proteínas relacionadas que pertencem a mesma classe de estrutura (Kato Z. et al. (2003) Nat.Struct.Biol, 10:966). Uma comparação entre as estruturas de IL-1β e IL-18 revelaram que o local 1 e 2 em IL-18 correspondem ao local 1 e 2 em IL-1β. Na Figura 11(B), os locais 1 e 2 são mostrados no modelo do complexo entre IL-18 e IL-18Rα, local 3 é também mostrado. O local 3 é relatado como o local de interação para IL-18Rβ (Kato Z. et al. (2003) Nat.Struct.Biol, 10:966).

[00485] O local de ligação de IL-18 para IL-18BP foi de alguma maneira identificado por mutações de alanina e pela estrutura de cristal de raios X de uma IL-18BP de poxvírus no complexo com IL-18 (Krumm et al (2008) Proc Natl Acad Sci USA; 105(52):20711-20715). Este local de ligação putativo também corresponde à região sobre IL-18 que foi identificada como local 2, uma das duas regiões de interação de IL-18 com IL-18Rα.

9.10) Mapeamento de epítopo de IL-18 por Espectrometria de massa de troca de Hidrogênio/Deutério (H/DxMS)

[00486] Espectrometria de massa de troca de hidrogênio/Deutério foi usada para investigar IL-18 humana para informação com respeito ao epítopo para MOR9464. O mapeamento de H/DxMS depende de diferenças de massa entre átomos de hidrogênio "normais" e o deutério de isótopo "pesado" que também compreende um nêutron além do próton isolado presente no núcleo de hidrogênio normal.

[00487] Na transferência de água para um sistema de solvente com base em deutério (água pesada), uma proteína experimentará um aumento na massa visto que o hidrogênio de amina no esqueleto de proteína torna-se gradualmente substituído com dêuterons (isótopos mais pesados de hidrogênio). A probabilidade de um evento de troca de hidrogênio/deutério é amplamente determinada por estrutura de proteína e acessibilidade de solvente. A tecnologia de H/DxMS é usada para medir a troca de hidrogênio/deutério relativa e como uma consequência a estrutura de proteína e acessibilidade de solvente.

[00488] Quando um par de ligação de proteína liga-se a um anticorpo (por exemplo, interação de antígeno/anticorpo), mudanças experimentalmente observáveis em sua taxa de troca podem ser observadas. As regiões de superfície que excluem o solvente na formação de complexo trocam muito mais lentamente. As regiões excluídas do solvente são úteis para deduzir a localização de um local de ligação. No case de uma interação antígeno-anticorpo, mudanças na taxa de troca de deutério pode destacar a localização do epítopo, porém também qualquer outra perturbação resultante da ligação do anticorpo ao antígeno. Por exemplo, uma diminuição na quantidade da captação de deutério no antígeno em um dado tempo de troca após a ligação de anticorpo pode representar qualquer proteção aumentada devido à ligação direta do anticorpo a esta região ou perturbação indireta da estrutura (mudanças alostéricas) por causa da ligação de anticorpo. Estes dois efeitos não podem ser distinguidos muito facilmente, embora o efeito mais forte observado seja frequentemente atribuído à proteção direta do anticorpo.

[00489] A localização da incorporação de dêuteron diminuída após a ligação de anticorpo pode ser deduzida por digestão da proteína alvo seguindo troca de hidrogênio/deutério (por exemplo, com uma enzima adequada tais como pepsina) e em seguida espectrometria de massa para determinar a massa dos fragmentos relevantes.

[00490] Experimentos de controle triplikcados foram realizados em 316 pmol de antígeno de IL-18 em vezes de permuta de deutério de 3 e 25 minutos diluindo uma solução de matéria prima de IL-18 com 95% de tampão de PBS deuterado para uma concentração de 83,6% D. Permuta de deutério foi saciada com tampão de saciamento (6M de Ureia e 1M de TCEP). Após saciamento, o frasconete foi analisado por digestão de pepsin on line/análise de LC-MS. A digestão de pepsina online foi realizada usando Life Science’s Poroszyme immobilized pepsin empacotada em colun a de 2,0x 20 mm, e separaçãol de LC foi realizada em uma coluna Thermo C18 BioBasic (1,0 x50 mm) em uma taxa de fluxo de 100 μL/min usando um gradiente rápido então todos os peptídeos eluíram em menos de 20 minutos. As fases móveis são fases móveis de fase reversa padrão: 0,1% de ácido fórmico em água e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Nestes experimentos hidrogênios de amida de esqueleto que são expostos sobre a superfície de IL-18 incorporarão deutérios.

[00491] Em seguida, experimentos de rotulagem triplicados foram realizados. Primeiramente, o anticorpo MOR9464 foi imobilizado sobre contas de agarose de proteína G (Thermo 22851) usando técnicas padrões. Contas de anticorpo foram centrifugadas para remover uma soluçãode PBS. Em seguida 200 μL de PBS frio (pH 7,4) e 6 μL (316 pmol) de IL-18 foram adicionados ao anticorpo imobilizado de MOR9464 e incubados durante 15 min a 4°C. Após incubação, o complexo foi centrifugado e lavado com 200 μL PBS e centrifugado novamente. Para permuta de deutério, 200 μL de 83,6% de tampão de PBS de deutério foram adicionados ao complexo de antígeno-anticorpo para incubação a 4°C durante 3 ou 25 min. Tampão de deutério foi então removido, e imediatamente, 125 μL de tampão de saciamento (como acima) foram adicionados. Após saciamento, o fluxo foi transferido para dentro de frasconete de HPLC pré-resfriado e analisado usando a digestão de pepsina on-line idêntica/análise de LC-MS que estava nos experimentos de controle. As amidas de esqueleto que estão presents na interface antígeno-anticorpo incororará deuterons menores em um dado tempo de permuta com relação aos experimentos de controle. Comparando-se os padrões de H/Dx dos experimentos de rotulagem e controle, o epítopo é revelado como aquela área do antígeno que é protegida de permuta nos experimentos de rotulagem.

[00492] Os resultados desta análise, quando conduzidos com MOR9464, revelaram três regiões mais significates de proteção em IL- 18. Estes foram (com referência à SEQ ID NO:1) de aminoácido 87 a 99, de aminoácido 119 a 137 e de aminoácido 138 a 160. Estas regiões são mostradas conter aminoácidos que estão envolvidos na ligação de uma IL-18BP (Figura 12).

9.11) Caracterização estrutural de raios X de IL-18/fragmento de anticorpo

[00493] A identificação de epígopo geral fornecida por modelagem e H/DxMS confirmou que os anticorpos e fragmentos dos mesmos como descrito aqui reconhecem uma região sobre IL-18 que é também reconhecida por uma IL-18BP (Figura 12). A fim de identificar os aminoácidos relevantes sobre IL-18 nestas regiões, a determinação de estrutura de raios X de um complexo de IL-18/anticorpo foi realizada.

[00494] Para preparar o fragmento de anticorpo, 13mg de MOR9464_N30K em uma concentração de 18mg/mL em 10mM de Histidina pH 5,0, foram clivados com 1/300 (p/p) papaína em 100mM de Tris-HCl pH 7,0, 10mM de DTT durante 200min em temperatura ambiente. A reação foi paralisada com 50μM de inibidor de papaína E64. O fragmento Fab foi então purificado sobre uma coluna de proteína A equilibrada com 20mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,0.

[00495] Purificação do complexo de Fab com IL-18: um excesso de 1,33 vezes de IL-18 humana (1,6 mg em PBS) foi adicionado a 3,2mg do fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko (recuperado de do fluxo de Proteína A). Um complexo de IL-18 com o fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko foi concentrado por ultrafiltração, carregado sobre uma cromatografia por exclusão de tamanho de SPX- 75 e eluído isocraticamente em 10mM de Tris-HCl pH 7,4, 25mM de NaCl.

[00496] Cristalização: O complex de IL-18/Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko foi concentrados por ultrafiltração para 11,8 mg/mL e avaliação de cristalização foi realizada por difusão de vapor em gotas de assentamento em placas de 96 cavidades. Os experimentos foram estabelecidos com um sistema robótico Phoenix e armazenados em um RockImager hotel a 19°C. Duas formas de cristal (forma A e forma B) foram identificadas e caracterizadas: 1) Forma de cristal A cinza de 0,1 M de sulfato de lítio, 0,1M fr ADA pH 6,5, 12% de PEG 4,000. (Crio-protetor foi uma mistura de 1:1 da solução de reservatório com 20% de PEG 4,000, 30% de glicerol) 2) Forma de cristal B cinza de 59,5% de 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD), 15% de glicerol, 85mM de HEPES pH 7,5. (Nenhum crioprotetor necessário).

[00497] Os dados de raios X foram coletados na Swiss Light Source, beamline X10SA, com um detector de píxel Pilatus. Todas as imagens de difração foram processadas com XDS (versão Dec. 6, 2010), como implementado em APRV.

[00498] Para a forma de cristal A, 720 imagens de 0,25° de oscilação cada uma foi registrada em uma distância de cristal para detector de 460mm, usando radiação de raios X de comprimento de onda de 0,99999Â.

[00499] Para a forma de cristal B, 720 imagens de 0,25° de oscilação cada uma foi registrada em uma distância de cristal para detector de 430mm, usando radiação de raios X de comprimento de onda de 0,99984Â.

[00500] A estrutura de forma de cristal A foi determinada por substituição molecolar com o programa Phaser, usando entrada PDB 3GBM.pdb e 2VXT.pdb como modelos de partida para o fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko e molécula de IL-18, respectivamente. Os domínios variável e de primeira constante de fragmento de anticorpo em 3GBM.pdb foram usados como modelos de pesquisa independente. Uma solução transparente para um complexo de IL-18/fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko por unidade assim étrica foi facilmente obtida. A estrutura de forma de cristal B foi determinada da mesma maneira, porém usando os modelos refinados derivados da forma de cristal A em vez das entradas de PDB.

[00501] Refinamento de Estrutura: A estrutura foi refinada por múltiplos ciclos de inspeção de mapa de densidade eletrônica e reconstrução modelo em Coot 0.6.2 seguidos por refinamento automatizado usando autoBUSTER (1.11.2/ buster 2.11.2). Os contatos intermoleculares foram identificados com NCONT e a superíficie embotada foi analisada com AREAIMOL, ambos do conjunto de programa CCP4 (versão 6.1.2). A coleção de dados de raios X e estatísticas de refinamento é mostrada na Tabela abaixo. Tabela 4: coleção de dados de raios X e refinamento de estatísticas

[00502] A visão geral da estrutura do complex de fragment de IL- 18/MOR9464_N30K é mostrada na Figura 13. Na formação de complexo, 36 aminoácidos sobre IL-18 com acessibilidade de solvente reduzida são identificados na interface de ligação de IL-18 com o fragmento de anticorpo. Estes resíduos são Leu41, Glu42, Met87, Tyr88, Lys89, Asp90, Ser91, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Ala97, Phe138, Gln139, Arg140, Ser141, Val142, Pro143, Gly144, His145, Asp146, Asn147, Met149, Gln150, Glu152, Ser153, Ser154, Glu157, Gly158, Phe160, Glu177, Asp178, Glu179, Leu180 e Gly181.

[00503] Outra caracterização dos contatos relevantaes feitos na interface do complex identificou que Arg140 e Glu152 são os aminoácidos, que são prováveis de contribuir o máximo para esta formação de complexo particular. Ambos os resíduos são localizados no centro da interface de ligação, e contribuem para um grande número de contatos intermoleculares (21 e 18, respectivamente, usando uma distância de interrupção de 4.0Â). Arg140 interage com ambos os resíduos de L-CDR3 (Tyr94L) e H-CDR3 (Tyr101H, His102H). Glu152 forma uma forte interação de ponte de sal (embotada) com L-CDR2 Arg51L e adota uma ligação H de L-CDR3 Tyr94L. Todos os resíduos nas cadeias de anticorpo são numerados sequencialmente, a letra L ou H seguinto o número do resíduo indica um resíduo na cadeia leve ou cadeia pesada, respectivamente.

[00504] A estrutura tridimensional de complexo de IL-18/ Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko permitiu algumas outras investigações sobre a diferente inter-reatividade entre IL-18 humana e a IL-18 de cinomolgo. MOR9464_N30K é 10 vezes mais fraca em comparação à IL-18 de cinomolgo (20pM) comparada a 2pM junto à IL- 18 humana (Tabela 2). IL-18 de cinomolgo difere da IL-18 humana em 6 posições (humana vs cinomolgo): V47I; S86N; T99A; K115R; F170Y e E177K (Figura 14(A). Destas posições apenas o ácido glutâmico 177 (Glu177; E177) está na interface do complexo de IL-18/fragmento de anticorpo (Figura 14(B)). Desse modo, é discutível que K177 na sequência de macaco cinomolgo de IL-18 de cinomolgo causa uma queda de 10 vezes em afinidade para MOR9464_N30K como indicado na Tabela 2A coluna 1, onde a KD (SET, pM) para MOR9464_N30K para IL-18 humana é 2±1 pM ao passo que para IL-18 de cinomolgo é de 20±10 pM.

[00505] A fim de identificar com qual parte do fragmento de anticorpo de IL-18 de MOR9464_N30Ko compete, uma sobreposição do complexo de IL-18/ Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko com a IL-18/IL-18Rα foi realizada. Em síntese, as estruturas de IL-18 no complex de IL-18/IL-18Rα e IL-18 no complexo de IL- 18/MOR9464_N30K foram sobrepostas usando o comando de alinhamento em PyMol (The PyMol Molecular Graphic system, versão 1.2r3pre, Schroedinger LLC).

[00506] Como mostrado na Figura 15, parece que o fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko compete com o domínio-Ig D3 de IL- 18Rα para ligação à IL-18.

[00507] Similarmente, a estrutura do complexo de IL-18/ Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko foi sobreposta sobre a estrutura do IL-18 humana em complexo com IL-18BP de poxvírus (arquivo coordenado usou 3F62.pdb) usando o comando de "alinhamento" em PyMOL (The PyMOL Molecular Graphic system, versão 1.5.0., Schrodinger LLC).

[00508] Como mostrado na Figura 16, a IL-18BP de poxvírus conflitam com o domínio variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko e compete predominantemente para a ligação a resíduos de aminoácidos Met87 a Met96 em IL-18.

[00509] Estas descobertas também confirmam os dados de armaze-namento bioquímico e de epítopo mostrados aqui e mostram que as moléculas de ligação como descrito aqui, em particular os anticorpos e os fragmentos dos mesmos, não se ligam ao complexo de IL-18/IL-18BP.

[00510] Finalmente, comparação com o anticorpo murino 125-2H da técnica anterior foi realizada. A análise foi realizada com a estrutura de fragmento de anticorpo 125-2H como encontrado no arquivo 2VXT.pdb file. Em síntese, a estrutura de IL-18 em complexo com Fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko foi sobreposta sobre a IL-18 em complexo com the 125-2H Fab usando o comando de "alinhamento" em PyMOL (The PyMOL Molecular Graphic system, versão 1.5.0., Schrodinger LLC).

[00511] Como mostrado na Figura 17, fragmento de anticorpo de MOR9464_N30Ko (lado esquerdo da sobreposição) e fragmento de anticorpo 125-2H (lado direito da sobreposição) sobrepõem-se em reconhecimento de IL-18. Entretanto, fragmento de anticorpo 125-2H não se liga ao epítopo reconhecido por uma IL-18BP como mostrado na Figura 18 onde o complexo 125-2H/IL-18 foi sobreposto com o complexo de IL-18BP de poxivírus/IL. Estes dados também confirmam, tando a literatura da técnica anterior com respeito a 1252H (Argiriadi M.A et al (2009) J.Biol.Chem. 284:24478) quanto também os dados de armazenamento bioquímico e de epítopo mostraram aqui que o that anticorpo murino 125-2H liga-se ao complexo de IL-18/IL-18BP.

[00512] Finalmente, como mostrado na Figura 19, Lisina na posição 30 na cadeia pesada de MOR9464_N30K parece formar interações eletrostáticas/polares com Asp 146 e Asn 147 de IL-18 humana indicando que a lisina 30 está envolvida na formação do complexo anticorpo-antígeno. É, portanto, evidente que uma modificação exocelular, como descrita na seção 9,2 aqui, tal como desamidação de asparagina, pode ter contribuído para a perda de potência em tempo prolongado de MOR9464. Substituição de asparagina 30 com a lisina em MOR9464_N30K parece fornecer MOR9464_N30K com estabilidade aumentada. Tabela de Correlação de Sequência

Listagem de Sequência SEQ ID NO:1 MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIR NLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGM AVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHD NKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED SEQ ID NO:2 MAAEPAEDNCINFVAMKPIDSTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSIIR NLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIINMYKDSQPRGM AVAISVKCEKISTLSCENRIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHD NKMQFESSSYEGYFLACEKERDLYKLILKKKDELGDRSIMFTVQNED SEQ ID NO:3 SYAIS SEQ ID NO:4 GIIPIYGTANYAQKFQG SEQ ID NO:5 AAYHPLVFDN SEQ ID NO:6 SGSSSNIGNHYVN SEQ ID NO:7 RNNHRPS SEQ ID NO:8 QSWDYSGFSTV SEQ ID NO:9 NIIPMTGQTYYAQKFQG SEQ ID NO:10 WINPFYIGETFYAQKFQG SEQ ID NO:11 NIIPHYGFAYYAQKFQG SEQ ID NO:12 NIIPYSGFAYYAQKFQG SEQ ID NO:13 NIIPITGQTYYAQKFQG SEQ ID NO:14 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFKSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPMTGQTYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:15 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGG CTCTAGCGTGAAAGTCAGCTGTAAAGCTAGTGGCGGCACCTTCAA GTCCTACGCTATTAGCTGGGTCAGACAGGCCCCAGGTCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCAATATTATCCCTATGACCGGTCAGACCTACTA CGCTCAGAAATTTCAGGGTAGAGTGACTATCACCGCCGACGAGTC TACTAGCACCGCCTATATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCAGAGGA CACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGCCGCCTATCACCCCCTGGT GTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC SEQ ID NO:16 DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGNHYVNWYQQLPGTAPKL LIYRNNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCQSWDY SGFSTVFGGGTKLTVL SEQ ID NO:17 GATATCGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGG TCAGAGAGTGACTATTAGCTGTAGCGGCTCTAGCTCTAATATCGG TAATCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCC TAAGCTGCTGATCTATAGAAACAATCACCGGCCTAGCGGCGTGCC CGATAGGTTTAGCGGATCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGC TATCACCGGACTGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCA GTCCTGGGACTATAGCGGCTTTAGCACCGTGTTCGGCGGAGGCA CTAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:18 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPITGQTYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:19 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGG CTCTAGCGTGAAAGTCAGCTGTAAAGCTAGTGGCGGCACCTTCTC TAGCTACGCTATTAGCTGGGTCAGACAGGCCCCAGGTCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCAATATTATCCCTATCACCGGTCAGACCTACTAC GCTCAGAAATTTCAGGGTAGAGTGACTATCACCGCCGACGAGTCT ACTAGCACCGCCTATATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCAGAGGAC ACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGCCGCCTATCACCCCCTGGTG TTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC SEQ ID NO:20 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNHYVNWYQQLPGTAPK LLIYRNNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSWD YSGFSTVFGGGTKLTVL SEQ ID NO:21 CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGCTAGTGGCACCCCTGG TCAGAGAGTGACTATTAGCTGTAGCGGCTCTAGCTCTAATATCGG TAATCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCC TAAGCTGCTGATCTATAGAAACAATCACCGGCCTAGCGGCGTGCC CGATAGGTTTAGCGGATCTAAGTCAGGGACTAGCGCTAGTCTGGC TATTAGCGGCCTGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCA GTCCTGGGACTATAGCGGCTTTAGCACCGTGTTCGGCGGAGGCA CTAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:22 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGL EWMGGIIPIYGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:23 CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTAA TTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCT CGAGTGGATGGGCGGTATCATTCCGATTTATGGCACTGCGAATTA CGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAA GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAA GATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGCTGCTTATCATCCTCTT GTTTTTGATAATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA SEQ ID NO:24 GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGG TCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAGCGGCAGCAGCAGCAACATTG GTAATCATTATGTGAATTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGC CGAAACTTCTGATTTATCGTAATAATCATCGTCCCTCAGGCGTGCC GGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTTG CGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCC AGTCTTGGGATTATTCTGGTTTTTCTACTGTGTTTGGCGGCGGCAC GAAGTTAACCGTCCTA SEQ ID NO:25 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGWINPFYIGETFYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:26 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGG CTCCTCCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTCA ACTCCTACGCTATCTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGACAGGGC CTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACCCTTTCTACATCGGCGAGACA TTCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATCACCGCCGA CGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGT CAGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGCCGCCTACCAC CCTCTGGTGTTCGACAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GTCCTCC SEQ ID NO:27 GATATCGTGCTGACCCAGCCTCCTTCTGTGTCTGGCGCCCCTGGC CAGAGAGTGACCATCTCCTGCTCTGGCTCCTCCTCCAATATCGGC AACCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGAACCGCCCC TAAGCTGCTGATCTACCGGAACAACCACCGGCCTTCCGGCGTGC CCGACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCTG GCCATCACCGGCCTGCAGTCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTG CCAGTCCTGGGACTACTCCGGCTTCTCAACCGTGTTCGGCGGAG GCACCAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:28 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPMTGQTYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:29 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGG CTCCTCCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTCA ACTCCTACGCTATCTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGACAGGGC CTGGAGTGGATGGGCAACATCATCCCTATGACCGGCCAGACCTA CTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATCACCGCCGACG AGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGTCA GAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGCCGCCTACCACCC TCTGGTGTTCGACAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGT CCTCC SEQ ID NO:30 GACATCGTGCTGACACAGCCTCCCTCTGTGTCTGGCGCCCCTGG CCAGAGAGTGACCATCTCCTGCTCTGGCTCCTCCTCCAATATCGG CAACCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGAACCGCCC CTAAGCTGCTGATCTACCGGAACAACCACCGGCCTTCCGGCGTG CCCGACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCT GGCCATCACCGGCCTGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTACT GCCAGTCCTGGGACTACTCCGGCTTCTCCACCGTGTTCGGCGGA GGCACCAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:31 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPHYGFAYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:32 GAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTAA TTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCT CGAGTGGATGGGCAATATTATTCCTCATTATGGTTTTGCTTATTAT GCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAG CACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAG ATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGCTGCTTATCATCCTCTTGT TTTTGATAATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA SEQ ID NO:33 GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGG TCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAGCGGCAGCAGCAGCAACATTG GTAATCATTATGTGAATTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGC CGAAACTTCTGATTTATCGTAATAATCATCGTCCCTCAGGCGTGCC GGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTTG CGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCC AGTCTTGGGATTATTCTGGTTTTTCTACTGTGTTTGGCGGCGGCAC GAAGTTAACCGTCCTA SEQ ID NO:34 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPYSGFAYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:35 GAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTAA TTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCT CGAGTGGATGGGCAATATTATTCCTTATTCTGGTTTTGCTTATTAT GCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAG CACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAG ATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGCTGCTTATCATCCTCTTGT TTTTGATAATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA SEQ ID NO:36 GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGG TCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAGCGGCAGCAGCAGCAACATTG GTAATCATTATGTGAATTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGC CGAAACTTCTGATTTATCGTAATAATCATCGTCCCTCAGGCGTGCC GGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTTG CGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCC AGTCTTGGGATTATTCTGGTTTTTCTACTGTGTTTGGCGGCGGCAC GAAGTTAACCGTCCTA SEQ ID NO:37 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGWINPFYIGETFYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:38 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGG CTCCTCCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTCA ACTCCTACGCTATCTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGACAGGGC CTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACCCTTTCTACATCGGCGAGACA TTCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATCACCGCCGA CGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGT CAGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGCCGCCTACCAC CCTCTGGTGTTCGACAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GTCCTCC SEQ ID NO:39 CAGTCCGTGCTGACCCAGCCTCCTTCTGCCTCTGGCACCCCTGG CCAGAGAGTGACCATCTCCTGCTCTGGCTCCTCCTCCAATATCGG CAACCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGAACCGCCC CTAAGCTGCTGATCTACCGGAACAACCACCGGCCTTCCGGCGTG CCCGACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCACCTCCGCCTCCCT GGCCATCTCTGGCCTGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTACT GCCAGTCCTGGGACTACTCCGGCTTCTCCACCGTGTTCGGCGGA GGCACCAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:40 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLE WMGNIIPMTGQTYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCARAAYHPLVFDNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:41 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTG GCTCCTCCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTC AACTCCTACGCCATCTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCAACATCATCCCTATGACCGGCCAGACCT ACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATCACCGCCGAC GAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGTC AGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGCCGCCTACCACC CTCTGGTGTTCGACAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTG TCCTCC SEQ ID NO:42 CAGTCCGTGCTGACCCAGCCTCCTTCTGCCTCTGGCACCCCTGG CCAGAGAGTGACCATCTCCTGCTCTGGCTCCTCCTCCAATATCGG CAACCACTACGTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGAACCGCCC CTAAGCTGCTGATCTACCGGAACAACCACCGGCCTTCCGGCGTG CCCGACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCACCTCCGCCTCCCT GGCCATCTCTGGCCTGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTACT GCCAGTCCTGGGACTACTCCGGCTTCTCCACCGTGTTCGGCGGA GGCACCAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO:43 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GAAGTTAACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCA CTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCA CACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAG TGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGA GACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCA GCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGA AGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAA GACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA SEQ ID NO:184 GGSISTGSY SEQ ID NO:185 NHMGI SEQ ID NO:186 TTRYWMSHILAYGMDY SEQ ID NO:187 SSSNIGNHY SEQ ID NO:188 ANT SEQ ID NO:189 YDGSQSI SEQ ID NO:190 GGSISTGSY SEQ ID NO:191 WHSGP SEQ ID NO:192 TTRYWMSHILAYGMDY SEQ ID NO:193 SSSNIGNHY SEQ ID NO:194 ANT SEQ ID NO:195 YDGSQSI SEQ ID NO:196 EIHGHGFTFYNPSLKS SEQ ID NO:197 GGSISTGSY SEQ ID NO:198 HGHGF SEQ ID NO:199 TTRYWMSHILAYGMDY SEQ ID NO:200 SSSNIGNHY SEQ ID NO:201 ANT SEQ ID NO:202 YDGSQSI SEQ ID NO:203 GGTFNSY SEQ ID NO:204 IPIYGT SEQ ID NO:205 AAYHPLVFDN SEQ ID NO:206 SSSNIGNHY SEQ ID NO:207 RNN SEQ ID NO:208 WDYSGFST SEQ ID NO:209 GGTFNSY SEQ ID NO:210 NPFYIGE SEQ ID NO:211 AAYHPLVFDN SEQ ID 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NO:257 HYQWLT SEQ ID NO:258 GFTFSSY SEQ ID NO:259 QSSGEN SEQ ID NO:260 VMIGYGFDY SEQ ID NO:261 SQSIFNY SEQ ID NO:262 DSS SEQ ID NO:263 YSGLLF

Claims (15)

1. Anticorpo isolado que se liga especificamente a IL-18, caracterizado pelo fato de que compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 18 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 20.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo isolado totalmente humano, humanizado ou quimérico.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento do anticorpo é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv, um dAb ou um VHH.

4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 158 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 160.

5. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 54 e a SEQ ID NO: 55, codificando o anticorpo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou suas sequências nucleotídicas degeneradas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

6. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos como definidos na reivindicação 5.

7. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão, como definidos na reivindicação 6.

8. Microrganismo transgênico estavelmente transformado ou transfectado, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos como definidos na reivindicação 5.

9. Método para produção de um anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo transgênico, como definido na reivindicação 7 ou 8, sob condições adequadas para produção do anticorpo isolado.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmacêutico, em que a referida composição farmacêutica opcionalmente compreende um segundo composto terapêutico.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que está na forma administrável intravenosa, inalável ou subcutânea.

12. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso em terapia.

13. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou na prevenção de sarcoidose, em particular sarcoidose pulmonar, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), linfohistiocitose hemofagocítica familiar (FHL) e outras síndromes da imunodeficiência, Artrite de Célula Gigante (GCA), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Doença de Still de início na idade adulta (AOSD), Artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), asma severa, Uveíte, Atrofia Geográfica, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou aterosclerose e qualquer combinação das mesmas em um paciente mamífero.

14. Método para produzir um microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de compreende transformar uma célula com um ou mais vetores de clonagem ou expressão, como definidos na reivindicação 6.

15. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para uso em terapia.

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