WO2020116423A1 - 活性型インターロイキン－１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用 - Google Patents

活性型インターロイキン－１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用 Download PDF

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裕子 成相
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that recognizes only the active form of interleukin-18 (interleukin-18, hereinafter referred to as IL-18) protein, which is an inflammatory cytokine, and its application.
  • interleukin-18 hereinafter referred to as IL-18
  • IL-18 interleukin-18
  • IL-18 is a cytokine of the IL-1 ⁇ family, and is mainly expressed in macrophages, but is expressed in various cells such as dendritic cells, epithelial cells, and keratinocytes.
  • the IL-18 receptor is expressed on various cells such as B cells, neutrophils, macrophages, vascular endothelial cells and smooth muscle cells in addition to NK cells, NKT cells and CD4 + T cells.
  • the diversity of IL-18-expressing cells and receptor-expressing cells shows the diversity of IL-18 functions and is known to be involved in various immune systems.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Although IL-18 was initially shown to play an important role in defense mechanisms against pathogens such as parasites and bacterial infections, it also plays an important role in allergic and autoimmune diseases. Are shown (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • IL-18 is not regulated at the mRNA level and is abundant in cells as an inactive precursor (pro-IL-18).
  • the precursor pro-IL-18 is cleaved by caspase-1 or caspase-4 into peptides at positions 37 to 193 to form a neoepitope, which becomes active and is released to the outside of the cell. .. Therefore, the measurement of mRNA expression level and intracellular precursor protein does not measure IL-18 activity.
  • IL-18 is involved in various immune systems, and there are many diseases that are considered to be caused by excessive release of activated IL-18 to the outside of cells. Therefore, if active IL-18 can be measured, it can be useful for diagnosis and treatment of IL-18-related diseases.
  • Patent Documents 1 to 10 Many antibodies that specifically recognize IL-18 have been reported (eg, Patent Documents 1 to 10). Most of these function as neutralizing antibodies, and few antibodies disclose their epitopes. In addition, although many antibodies have been disclosed, there is no report of an antibody that recognizes only activated IL-18.
  • the present inventors attempted to produce an antibody that recognizes only active IL-18 by cleaving pro-IL-18 with caspase 1/4 and immunizing with active IL-18.
  • an antibody that recognizes only activated IL-18 was not obtained.
  • Patent Documents 1 to 10 have neutralizing activity.
  • the antibodies disclosed in Patent Documents 1 to 4 are the binding sites of IL-18 binding protein (IL-18BP). , Or an antibody that binds to the vicinity thereof.
  • Patent Document 5 discloses an antibody that does not bind to IL-18 to which IL-18BP is bound.
  • Patent Document 6 discloses an antibody that inhibits IL-18 activity.
  • the peptide sequence at the N-terminus (amino acid positions 37 to 50) of active IL-18 is also disclosed as an epitope, the epitope of the actually obtained antibody is a different region, and only active IL-18 is recognized. It is not disclosed.
  • Patent Documents 7 and 8 disclose antibodies having a neutralizing activity against IL-18.
  • Patent Documents 9 and 10 describe antibodies that can be used for treatment. However, none of the antibodies disclosed in these documents recognize only activated IL-18.
  • active IL-18 has been analyzed by confirming its molecular weight by Western blotting. Since Western blotting requires time and labor, the presence of active IL-18 has not been examined clinically even in diseases in which IL-18 is suspected to be involved.
  • An object of the present invention is to obtain an antibody that specifically recognizes activated IL-18.
  • the present invention is a substance that binds to the following neoepitope, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a functional fragment of the antibody, and a kit containing these antibodies, and a gene, an amino acid sequence encoding the monoclonal antibody or the functional fragment, It relates to humanized antibodies, human antibodies and pharmaceutical compositions. It also relates to a new method for identifying the range of neoepitope and a kit used for the method.
  • the anti-IL-18 antibody that recognizes only activated IL-18.
  • the anti-IL-18 antibody according to (1) which recognizes a neoepitope of human IL-18.
  • the anti-IL-18 antibody is a monoclonal antibody, and the heavy chain variable domain has a CDR1H region consisting of the amino acid sequence of GFSLSSSGMG (SEQ ID NO: 24), a CDR2H region consisting of the amino acid sequence of IWWDDDK (SEQ ID NO: 25), and TRTRTYSNFGGGMAY.
  • the light chain variable domain has a CDR1L region consisting of the amino acid sequence of QSIAHSNGYTY (SEQ ID NO:27), a CDR2L region consisting of the amino acid sequence of KVS (SEQ ID NO:28), VQGSHVPLT
  • the anti-IL-18 antibody is a monoclonal antibody, and the heavy chain variable domain has a CDR1H region consisting of the amino acid sequence of GFSLTSYG (SEQ ID NO: 36), a CDR2H region consisting of the amino acid sequence of IWAGGST (SEQ ID NO: 37), and ARESSYDAMDY.
  • the anti-IL-18 antibody according to (4) wherein the amino acid sequence of the H chain variable region is SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of the L chain variable region is SEQ ID NO: 17.
  • a gene comprising a gene encoding the CDR sequence according to (3) or (4) or the variable region according to (5) or (6) as an open reading frame region.
  • the above-mentioned monoclonal antibody is a humanized antibody or a human antibody, comprising the CDR sequence according to (3) or (4), or the variable region according to (5) or (6) Anti-IL-18 monoclonal antibody.
  • a pharmaceutical composition for treating an IL-18-related disease comprising the anti-IL-18 monoclonal antibody according to (10) or the functional fragment according to (11) as an active ingredient.
  • An antibody that binds to the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 (YFGKLESK), or a fragment comprising a functional fragment thereof, or a binding substance.
  • a method for analyzing the neoepitope recognition range of an antibody which comprises starting from an amino acid at the N-terminal or C-terminal opposite to the neoepitope stump in a peptide having a length of 5 to 15 amino acids from the neoepitope stump A method for analyzing the neoepitope recognition range of an antibody by sequentially producing a peptide in which alanine or glycine is sequentially substituted, and measuring the binding between the antibody and the peptide.
  • the IL-18-related disease is adult Still's disease, macrophage activation syndrome/hemophagocytosis syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, interstitial lung disease, bronchial asthma, allergic rhinitis, type 2 diabetes, imaginary disease
  • FIG. 8 shows the human IL-18 function-inhibiting activity of monoclonal antibodies 9-10.2 and 8-4.1.
  • FIG. 1 A figure showing the result of epitope analysis by alanine scanning.
  • A Sensorgram of surface plasmon resonance analysis by monoclonal antibody 9-10.2 with IL-18 37-44 peptide by neoepitope microanalysis.
  • B Sensorgram of surface plasmon resonance analysis by alanine scanning.
  • C The figure which shows the position of the epitope on a three-dimensional structure. Sensorgram of surface plasmon resonance analysis of 9-10.2 antibody and IL-18 37-44 peptide The figure which shows the result of the competition experiment of the monoclonal antibodies 9-10. 2 and 8-4.1.
  • Epitope refers to a part of the antigen (in the case of the present invention, activated IL-18) recognized by an antibody.
  • the neoepitope refers to a newly formed protein stump that does not exist in the original protein due to the protein being cleaved by a proteolytic enzyme.
  • pro-IL-18 is cleaved with caspase 1/4 to become active IL-18.
  • the newly formed stump in activated IL-18 is called the IL-18 neoepitope.
  • Active IL-18 refers to a peptide at positions 37 to 193 of IL-18 having a neoepitope.
  • the antibody of the present invention refers to a monoclonal antibody or derivative that specifically binds to activated IL-18 as shown below. It also includes a polyclonal antibody that can be obtained by the same method as for a monoclonal antibody. Furthermore, it also includes a functional fragment of the antibody having substantially the same antigen specificity as the original antibody. Functional fragments of antibodies include Fab, Fab′, F(ab′) 2 , single chain antibodies (scFv), disulfide-stabilized V region fragments (dsFv), or functional fragments of antibodies such as CDR-containing peptides. included.
  • a humanized antibody such as a humanized chimeric antibody, a humanized CDR-grafted antibody, or the like, which is a monoclonal antibody that specifically binds to the active IL-18 specified in the present invention, is produced by using a gene recombination technique, Human antibodies produced using the phage display method are also included in the antibodies of the present invention.
  • humanized antibodies and human antibodies When administered to humans, have fewer side effects than antibodies from non-human animals, and their therapeutic effects last for a long time.
  • a substance that binds to the epitope of the activated IL-18 stump specified in the present invention can also be used for the detection of activated IL-18 and the like.
  • substances include substances other than antibodies, such as peptide aptamers and nucleic acid aptamers, which specifically bind to neoepitope.
  • a method for producing an aptamer a known method such as a two-hybrid method or a SELEX method may be used.
  • IL-18-related disease refers to a disease caused by excessive release of active IL-18 to the outside of the cell, or a disease that may be exacerbated by IL-18.
  • the IL-18-related disease is a disease that is developed and exacerbated by overexpression of IL-18.
  • IL-18-related diseases include malignant tumors such as adult Still's disease (AOSD), juvenile Still's disease, pancreatic cancer, lung cancer, and colon cancer, cryopyrin-related periodic heat syndrome, systemic lupus erythematosus (SLE), multiple sclerosis , Juvenile idiopathic arthritis (JIA), bronchial asthma, bronchiectasis, chronic obstructive pulmonary disease (CDPD), transfusion-related lung injury, bronchopulmonary dysplasia (BPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), ma Interstitial lung disease (ILD), idiopathic pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, metabolic bone disease, severe liver and intestinal organ damage, heart failure, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Dry eye disease (DED), keratitis, corneal neovascularization, pathological intraocular neovascularization, crizopril, glaucoma
  • IL-18-related diseases it is expected that a therapeutic effect will be obtained by a drug that inhibits the function of IL-18. Therefore, by examining the expression level of active IL-18 in patients suspected of having these IL-18-related diseases, it is possible to determine whether or not a drug that inhibits the function of IL-18 should be applied. Further, as shown in the following examples, since the antibody itself that recognizes the neoepitope suppresses the function of IL-18, it can be used for treatment.
  • the “kit” is not limited to the Western blotting method, capillary western immunoassay method, immunoprecipitation method, immunostaining method, and ELISA shown in the following Examples, and IL-containing the antibody disclosed in the present specification can be used.
  • a packaged combination having necessary reagents, instruments, etc. as constituent elements.
  • the kit for analyzing neoepitope refers to a combination in which components such as a substrate and a coloring reagent necessary for the method for analyzing neoepitope are packaged.
  • Example 1 Preparation of antibody Regarding preparation of antibody, an application for animal experiment plan approval was submitted to the Shimane University Animal Experiment Special Committee, and the approval was applied.
  • a peptide (SEQ ID NO: 1, YFGKLESKC) in which cysteine (C) was added to the C-terminal of the peptide at positions 37 to 44 located in the N-terminal sequence of active IL-18 protein was synthesized according to a conventional method.
  • KLH keyhole-limpet hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • Imject Maleimide-Activated BSA spin Kit Thermo Scientific
  • hybridoma 9-10. 2 and 8 -4.1 The antibodies produced by hybridomas 9-10.2 and 8-4.1 are referred to as 9-10.2. antibody and 8-4.1 antibody, respectively.
  • Monoclonal antibodies 9-10.2 and 8-4 that recognize active IL-18 produced by hybridomas 9-10.2 and 8-4.1 using IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Sigma) When the isotype of .1 was confirmed, both were IgG1 and ⁇ .
  • Example 2 Evaluation of 9-10.2 antibody and 8-4.1 antibody (capillary western immunoassay method) The performance was compared with anti-IL-18 antibodies having different recognition sites (11-4.1, epitope: region from 63rd position to 68th position of IL-18, SEQ ID NO: 2, RPLFED).
  • the 11-4.1 antibody is a monoclonal antibody produced by the hybridoma established by the present inventors, and has already been shown to detect IL-18 with high sensitivity.
  • IL-18 expressed and purified in Escherichia coli is expressed and purified in Escherichia coli as active caspase-4 105-377 (means peptides at positions 105 to 377 of caspase-4.
  • the amino acid position at the N-terminal, C The peptide may be described by specifying the terminal amino acid position), and the active IL-18 protein (IL-18 37-193 ) was purified and obtained.
  • the N-terminal sequence of the protein purified by the Edman degradation method was determined, it was YFGKL as expected. This corresponds to tyrosine at position 37, which is the N-terminus of active IL-18, to leucine at position 41.
  • the IL-18 protein (positions 37 to 193) with a start codon ATG and a His tag added to the C terminus was expressed and purified in E. coli.
  • Met the next amino acid in the synthesis initiation methionine (Met) is a tyrosine (37 Y)
  • Met-IL- 18 37-193-His protein When the N-terminal sequence of the purified protein was determined by the Edman degradation method, the synthetic initiation methionine was added as expected.
  • the 18 37-193 -His protein was detected by a capillary western immunoassay method using Wes (Protein Simple). As a primary antibody, each purified antibody was adjusted to 0.4 mg/mL and then diluted 125-fold. The other conditions such as the exposure time and the secondary antibody were all the same. The results are shown in Figure 1.
  • the 9-10.2 antibody and the 8-4.1 antibody recognize the activated IL-18 protein IL-18 37-193 , methionine was added to the N-terminus of the activated IL-18.
  • the Met-IL-18 37-193 -His protein was not recognized.
  • the 11-4.1 antibody having an epitope at positions 63 to 68 of IL-18 is the same as active IL-18 (IL-18 37-193 ) and Met-IL-18 37-193 -His protein. Recognized as
  • Both activated IL-18 and the Met-IL-18 37-193 -His protein contain the region from positions 37 to 193 of IL-18.
  • the 9-10.2 antibody and the 8-4.1 antibody did not recognize the Met-IL-18 37-193 -His protein. That is, these antibodies cannot recognize a peptide in which an amino acid is added to the N-terminal side of tyrosine at position 37, but recognize the IL-18 37-193 protein, that is, the neoepitope present in activated IL-18. Is shown.
  • Example 3 Evaluation of 9-10.2 antibody and 8-4.1 antibody using a clinical sample (capillary western immunoassay method)
  • AOSD ovarian cancer
  • IL-18 protein in patient serum was detected by capillary western immunoassay.
  • the patient serum was diluted 10-fold, the 9-10.2 antibody was adjusted to 0.4 mg/mL as the primary antibody, and then used at a 1:125-fold dilution.
  • the active IL-18 protein (IL-18 37-193 ) used in Example 2 was used, and the amount and the molecular weight of the activated IL-18 contained in the patient serum were the same as in Example 2. was analyzed. The results are shown in Figure 2. A band was detected in 10 patients of the same size as active IL-18, ie IL-18 37-193 used as a standard protein. In addition, the amount of active IL-18 present in the serum of the patient is shown at the bottom of FIG. 2, but a very small amount of activated IL-18 could be quantified.
  • active IL-18 can be detected by a very simple method. be able to.
  • FIG. 3 schematically shows full-length IL-18, active IL-18, and the sites recognized by each antibody.
  • full-length IL-18 and active form caspase-4 are expressed in 293T cells, the full-length IL-18 protein is cleaved by active form caspase-4, but full-length IL-18 that is not cleaved intracellularly. Existing.
  • the results of immunoprecipitation with the 11-4.1 antibody showed that the full-length IL-18 protein has been immunoprecipitated in a large amount, and a large amount of uncleaved pro-IL-18 is present in the cells. There is.
  • the full-length IL-18 was not immunoprecipitated, and more IL-18 37-193 was immunoprecipitated. That is, the 9-10.2 antibody and the 8-4.1 antibody specifically recognize active IL-18 37-193 protein cleaved by caspase-4 105-377 intracellularly and can efficiently immunoprecipitate. It was revealed to be a monoclonal antibody.
  • Example 5 Human IL-18 function-inhibiting activity of 9-10.2 antibody and 8-4.1 antibody Activated IL-18 protein expressed and purified in E. coli was used as an acute myelogenous leukemia cell line KG-1 (JCRB0065). It is known that IFN- ⁇ is produced when added to () (Non-Patent Document 6). If the antibody is an IL-18 function-inhibiting antibody, it inhibits IF-18- ⁇ production by IL-18 (see the schematic diagram in FIG. 4).
  • IFN- ⁇ detection ELISA method for the production of IFN- ⁇ by adding 0.5 ng of active IL-18 to KG-1 cells at various concentrations of 9-10.2 antibody and 8-4.1 antibody (IFN- ⁇ ELISA set, manufactured by Diaclone).
  • 9-10.2 and 8-4.1 antibodies showed inhibitory activity on IFN- ⁇ production in a dose-dependent manner (Fig. 4, bottom). Since both 9-10.2 and 8-4.1 antibodies act as antibodies that inhibit human IL-18 function, they can be used in diseases caused by overexpression of IL-18 or in diseases that are exacerbated. It can be used for treatment.
  • 9-10. 2 showed a very strong inhibitory activity with an IC 50 of 2.8 nM.
  • the presence of active caspase-4 105-377 was detected by a rabbit polyclonal antibody that recognizes G196 (G196 pAb) (Fig. 5, left, upper right).
  • the presence of IL-18 in the absence of active caspase-4 was detected by a rabbit polyclonal antibody that recognizes IL-18 ( ⁇ IL-18 pAb) (Fig. 5, right, upper right).
  • ⁇ IL-18 pAb rabbit polyclonal antibody that recognizes IL-18
  • the presence of IL-18 was confirmed by the 9-10.2.
  • the absence of caspase-4 Fig. 5, right
  • IL-18 was not detected by the 9-10.2 antibody, although the presence of IL-18 was confirmed by the rabbit polyclonal antibody.
  • the 9-10.2 antibody is a monoclonal antibody capable of specifically recognizing the active IL-18 37-193 protein cleaved by caspase-4 105-377 intracellularly even in the cell immunostaining method. Shows.
  • the method for determining the range of neoepitope recognized by this antibody was named "neoepitope microanalysis method".
  • the neoepitope microanalysis method is a method of determining the epitope of an antibody by successive substitution with alanine, unlike the alanine scanning method in which one amino acid is substituted with alanine.
  • Neoepitope microanalysis is an excellent method for determining the binding region of an antibody on a neoepitope.
  • quantitative analysis is performed by ELISA as described below, but not limited to ELISA, analysis can also be performed by the SPR method or the like.
  • alanine is substituted for the analysis, but an amino acid having a small molecular weight and causing no significant structural change, such as glycine, can be used.
  • a peptide in which a cross-linking Cys is added to the C-terminal of a peptide in which the amino acid at the C-terminal of the neoepitope peptide (positions 37 to 44) (lysine (K44) at the 44th position) is sequentially replaced with alanine is usually used. It was synthesized according to the method. BSA was cross-linked to each peptide by Imject Maleimide-Activated BSA spin Kit, and the recognition sites of 9-10.2 antibody and 8-4.1 antibody were analyzed by ELISA method. On the right side of the ELISA plate photograph of FIG. 6(A), the absorbance obtained with a plate reader is shown together with the standard deviation, with the wild-type peptide as 100.
  • Neither antibody shows almost any reactivity to a peptide in which lysine at the 40th position to lysine at the 44th position was replaced with alanine, but the presence of lysine at the 40th position resulted in 1/100 of that of the wild-type peptide. It exhibits a reactivity of about 4. Furthermore, the reactivity of the antibody does not change so much even if the number of alanine substituted at positions 41 to 43 is reduced.
  • Both 9-10. 2 and 8-4. 1 antibodies were the peptides in which the first amino acid of the N-terminal sequence peptide of activated IL-18 protein (tyrosine (Y) at position 37 was changed to alanine (A) ( Y37A), G39A peptide and K40A peptide were hardly recognized, and showed weak binding to L41A and E42A mutants, and about 50% to F38A, S43A, and K44A mutants. Showed binding.
  • the peptide in which lysine at position 40 to lysine at position 44 was replaced with alanine did not bind at all, but the presence of lysine at position 40 allowed binding to be observed. Furthermore, the presence of lysine at the 40th position did not significantly change the reactivity of the antibody with respect to the deviation from the peptide even if the number of alanines substituted from the 41st position to the 43rd position was reduced.
  • the alanine mutant of each amino acid of the peptide (YFGKLESKC, SEQ ID NO: 1) in which cysteine was added to the C-terminal for cross-linking to the N-terminal sequence peptide (positions 37 to 44) of the active IL-18 protein was used as a ligand. It was immobilized on the sensor chip CM5 by the thiol coupling method. The purified antibody 9-10.2 was measured at a concentration of 50 nM by single-cycle using Biacore X100, and "alanine scanning analysis" was performed (Fig. 7(B)).
  • the 9-10.2 antibody could not recognize the peptide (G39A) in which the third amino acid (glycine (G) at position 39) of the N-terminal sequence peptide of active IL-18 protein was changed to alanine (A). It was It became easy to dissociate with respect to the Y37A and K40A mutants, and it was revealed that the dissociation was not affected with respect to the mutants of F38A, L41A, E42A, S43A, and K44A.
  • the surface plasmon resonance analysis was also able to obtain the same results as the analysis by ELISA shown in FIG.
  • the "neoepitope microanalysis” can provide information on core regions important for binding, and the “alanine scanning analysis” can provide information on amino acids important for binding.
  • Peptide YFGKLESK or YFGK is an epitope bound by an antibody that recognizes activated IL-18. Therefore, it is possible to use it as a therapeutic drug by combining a vaccine containing a peptide containing these sequences as an immunogen, or a region containing this peptide together with a peptide in another region of IL-18 that binds to the IL-18 receptor. There is.
  • IL-18 binding sites of 3F62 IL-18BP of poxvirus
  • 4EEE IL-18BP of yatapovirus
  • IL-18BP of yatapovirus The IL-18 binding sites of 3F62 (IL-18BP of poxvirus) and 4EEE (IL-18BP of yatapovirus) which have been structurally analyzed among IL-18BPs include Y37, F38, and G39 regions.
  • Non-patent documents 7 and 8 Although the structural analysis of human IL18BP has not been performed yet, the primary sequences are similar and it is highly likely that they bind to the same region. It is considered that the 9-18 antibody and the 8-4.1 antibody do not bind to IL-18 bound with IL-18BP. Therefore, by using these antibodies, free IL-18 to which IL-18BP is not bound can be measured.
  • IL-18BP-bound IL-18 cannot bind to the 9-10.2 antibody or the 8-4.1 antibody, and only captures the activated IL-18 having the exposed neoepitope. You can The captured IL-18 may be reacted with an antibody that recognizes another site, and measurement may be performed. It becomes possible to easily measure free IL-18 which is not bound to IL-18BP, which has been measured by a complicated method, by ELISA.
  • Example 8 Affinity analysis of 9-10.2 antibody and IL-18 37-44 peptide (surface plasmon resonance analysis) A peptide (YFGKLESKC, SEQ ID NO: 1) in which cysteine was added to the C-terminal for cross-linking to the neoepitope peptide (positions 37 to 44) of active IL-18 protein was immobilized on the sensor chip CM5 by the ligand thiol coupling method. did.
  • the purified antibody 9-10.2 was measured in a single-cycle using Biacore X100 in 5 concentrations in a range of 0.4 nM to 250 nM and a 5-fold dilution series (FIG. 8). The analysis was performed by bivalent analysis.
  • Example 9 Competitive experiment analysis of monoclonal antibodies 9-10.2 and 8-4.1 From the epitope analysis of Example 7, monoclonal antibodies 9-10.2 and 8-4.1 recognize the same epitope. It is thought that Furthermore, the results of Example 8 revealed that the 9-10.2 antibody binds to the neoepitope with very high affinity. Therefore, a competition experiment of monoclonal antibodies 9-10. 2 and 8-4.1 was carried out, and it was analyzed whether 9-10. 2 antibody and 8-4.1 antibody recognized the same epitope and competed with each other. (FIG. 9).
  • BSA was cross-linked to the peptide of SEQ ID NO: 1 (YFGKLESKC), adjusted to 5 ng/100 ⁇ l with 50 mM NaHCO 3, and coated on an ELISA plate at 4° C. overnight.
  • the ELISA plate is blocked and washed by a conventional method, and a 9-10.2 or 8-4.1 antibody solution adjusted to 0, 100, 300, 1000 ng/100 ⁇ l is added, and reacted at 25° C. for 1 hour. It was Only the washing solution was added to the wells containing no antibody (see FIG. 9, primary antibody without HRP added).
  • each HRP-labeled antibody (0.5 ⁇ g/ ⁇ l) was diluted 100-fold with a washing solution, and the wells in which the 8-4.1 antibody as a primary antibody was bound to the peptide were HRP-labeled 9-10.
  • HRP-labeled 8-4.1 antibody (100 ⁇ l/well) was added to the wells in which 2 antibody and 9-10.2 antibody were bound to the peptide, and incubated at 25° C. for 1 hour (FIG. 9, secondary with HRP added). See Antibodies.). After that, washing was performed, color was developed, and the absorbance was measured (see FIG. 9, absorbance 450 nm-620 nm).
  • the 9-10.2 antibody competed with the primary antibody 8-4.1 antibody. As a result, it was shown to bind to the peptide. Therefore, the 9-10.2 and 8-4.1 antibodies compete with each other, and the 9-10.2 antibody may have a higher affinity for activated IL-18 as compared with the 8-4.1 antibody. It became clear.
  • the sequence of the antibody gene in the hypervariable region and the amino acid sequence of the synthesized cDNA were determined by the direct sequencing method using the H-chain and L-chain primer sets.
  • H chain primer VH1-1S:5'-gg ggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3' SEQ ID NO: 6
  • s g+c
  • m a+c
  • r a+g
  • w a+t IgG2-1AS: 5'-gg gaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3'
  • L chain primer VK-1S:5'-gg ggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3 SEQ ID NO: 8)
  • y c+t
  • m a+c
  • s g+c
  • r a+g
  • w a+t CK-2AS: 5'-gg gaattc gaa gat gga tac agt tgg t
  • the base sequence of the H chain of 9-10.2 antibody SEQ ID NO: 10
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) the base sequence of the H chain of 8-4.1 antibody (SEQ ID NO: 12)
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) was determined.
  • the nucleotide sequence of the L chain of the 9-10.2 antibody SEQ ID NO: 14
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) was determined.
  • SEQ ID NO: 16 the amino acid sequence of the L chain of the 8-4.1 antibody
  • the antibody having the CDR is an antibody that specifically recognizes activated IL-18 with high sensitivity and specificity. Therefore, it becomes possible to detect the active form of IL-18 by a method such as ELISA that can be easily carried out even in clinical settings. As a result, it becomes possible to easily determine whether or not the disease is an IL-18-related disease in a clinical setting, which can be useful for formulating a treatment policy. Moreover, since it can be applied to various methods such as Western blotting, capillary Western immunoassay method, immunoprecipitation method, and cell immunostaining method, it can be widely applied as a research reagent. Furthermore, it has been revealed that it can inhibit the function of IL-18, and it is a very useful antibody as a drug for treating IL-18-related diseases.

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Abstract

前駆体であるｐｒｏ－ＩＬ－１８が、ｃａｓｐａｓｅ－１、あるいはｃａｓｐａｓｅ－４によって切断され、形成されるネオエピトープに存在する８アミノ酸、ＹＦＧＫＬＥＳＫを認識する９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体を作製した。活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体を提供することができる。

Description

活性型インターロイキン－１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用
　炎症性サイトカインであるインターロイキン１８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１８、以下ＩＬ－１８と記載する。）タンパク質の活性型のみを認識する抗体、及びその応用に関する。
　ＩＬ－１８は、ＩＬ－１βファミリーのサイトカインであり、主としてマクロファージで発現しているが、樹状細胞、上皮細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞で発現している。また、ＩＬ－１８受容体はＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞の他、Ｂ細胞、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞など様々な細胞で発現している。ＩＬ－１８発現細胞、受容体発現細胞の多様性は、ＩＬ－１８の機能の多様性を示しており、種々の免疫系に関与していることが知られている。
　ＩＬ－１８は、発見当初寄生虫や細菌感染などの病原体に対する防御機構において重要な役割を果たすことが示されてきたが、それだけではなく、アレルギー疾患や自己免疫疾患においても重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１、２）。
　ＩＬ－１８は、ＴＮＦなどのサイトカインとは異なり、ｍＲＮＡレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体（ｐｒｏ－ＩＬ－１８）として細胞内に豊富に存在する。前駆体であるｐｒｏ－ＩＬ－１８は、ｃａｓｐａｓｅ－１、あるいはｃａｓｐａｓｅ－４によって、３７位～１９３位のペプチドに切断されることで、ネオエピトープが形成され、活性型となり細胞外に放出される。したがって、ｍＲＮＡ発現量や、細胞内の前駆体タンパク質の測定を行っても、ＩＬ－１８の活性を測定することにはならない。
　ＩＬ－１８は種々の免疫系に関与し、活性型ＩＬ－１８が過剰に細胞外に放出されることにより惹起されると考えられている多くの疾患がある。そのため、活性型ＩＬ－１８を測定することができれば、ＩＬ－１８関連疾患の診断や治療に役立てることができる。
　ＩＬ－１８を特異的に認識する抗体は多数報告されている（例えば、特許文献１～１０）。これらの多くは中和抗体として機能するものであり、エピトープについて開示されている抗体は少ない。また、多くの抗体が開示されているにもかかわらず、活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体の報告はない。
国際公開第２０１６／１３９２９７号 国際公開第２０１５／０３２９３２号 国際公開第２０１４／０８０８６６号 国際公開第２０１２／０８５０１５号 国際公開第２０１４／０３７８９９号 特開２０１２－１３９２２４号公報 特開２０１２－１３９２２３号公報 国際公開第２０１１／０９８４２４号 国際公開第２０１０／０４８１８３号 国際公開第２０１０／０２０５９３号 国際公開第２０１２／１２４６８３号
Arend, W.P. et al., Immunol. Rev., 2008, Vol.223, p.20-38. Sanders, N.L. & Mishra, A., Cytokine Growth Factor Rev., 2016, Vol.32,pp.31-39. Hirel, P-H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, Vol.89,pp.8247-8251. Dalboge, H. et al., FEBS Lett., 1990, Vol.266(1-2), pp.1-3. Girard, C. et al., Rheumatology (Oxford), 2016, Vol.55(12),pp.2237-2247. Okamura, H. et al., Nature, 1995, Vol.378(6652), pp.88-91. Krumm, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, Vol.105,pp.20711-20715. Krumm, B. et al., PLOS Pathogens, 2012, Vol.8, Issue 8, e1002876.
　本発明者らのグループをはじめ、いくつかのグループが活性型のＩＬ－１８のみを認識する抗体の作製を試みてきた。しかしながら、今まで活性型のＩＬ－１８を認識する抗体は作製されていない。
　本発明者らは、ｐｒｏ－ＩＬ－１８をｃａｓｐａｓｅ１／４で切断し、活性型ＩＬ－１８を免疫することによって、活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体の作製を試みた。しかし、活性化ＩＬ－１８、ｐｒｏ－ＩＬ－１８の両方を認識するＩＬ－１８の６２位～７０位を認識するモノクローナル抗体が６種、１２８位～１４２位の領域を認識する抗体は２種得られたが、活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体は得られなかった。
　特許文献１～１０に開示されている抗体は多くは中和活性を示す抗体であり、例えば特許文献１～４に開示されている抗体は、ＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）の結合部位、又はその近傍に結合する抗体である。特許文献５には、ＩＬ－１８ＢＰが結合しているＩＬ－１８には結合しない抗体が開示されている。特許文献６には、ＩＬ－１８活性を阻害する抗体が開示されている。活性型ＩＬ－１８のＮ末（アミノ酸３７位～５０位）のペプチド配列もエピトープとして開示されているものの、実際に得られた抗体のエピトープは異なる領域であり、活性型ＩＬ－１８のみを認識することは開示されていない。特許文献７、８は、ＩＬ－１８に対して中和活性を備えた抗体が開示されている。特許文献９、１０には治療に使用し得る抗体が記載されている。しかしながら、これら文献に開示されている抗体は、いずれも活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体ではない。
　上述のように、活性型ＩＬ－１８のみを検出する抗体が得られていないことから、活性型ＩＬ－１８はウエスタンブロット法で分子量を確認することによって解析されている。ウエスタンブロット法は時間と手間を要することから、ＩＬ－１８の関与が疑われる疾患であっても、臨床現場で活性型ＩＬ－１８の存在が検査されるには至っていない。
　活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗体を得ることができれば、ＥＬＩＳＡなどの簡便な方法によって、活性型ＩＬ－１８の量を測定することが可能となり、ＩＬ－１８関連疾患の診断に用いることができる。本発明は、活性型ＩＬ－１８を特異的に認識する抗体を得ることを課題とする。
　本発明は以下のネオエピトープに結合する物質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の機能的断片、及びこれら抗体を含むキット、また、前記モノクローナル抗体、又は機能的断片をコードする遺伝子、アミノ酸配列、及びヒト化抗体、ヒト抗体、医薬組成物に関する。また、ネオエピトープの範囲を同定する新しい方法、及び該方法に使用するキットに関する。
（１）活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗ＩＬ－１８抗体。
（２）ヒトＩＬ－１８のネオエピトープを認識する（１）記載の抗ＩＬ－１８抗体。
（３）前記抗ＩＬ－１８抗体がモノクローナル抗体であり、重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＳＳＳＧＭＧ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、ＩＷＷＤＤＤＫ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、ＴＲＴＲＴＹＳＮＦＧＧＧＭＡＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、ＱＳＩＡＨＳＮＧＹＴＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、ＫＶＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、ＶＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする（１）、又は（２）記載の抗ＩＬ－１８抗体。
（４）前記抗ＩＬ－１８抗体がモノクローナル抗体であり、重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、ＡＲＥＳＳＹＤＡＭＤＹ（配列番号３８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、ＥＮＶＶＴＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、ＧＱＧＹＳＹＰＹＴ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする（１）又は（２）記載の抗ＩＬ－１８抗体。
（５）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１であり、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１５であることを特徴とする（３）記載の抗ＩＬ－１８抗体。
（６）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３であり、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であることを特徴とする（４）記載の抗ＩＬ－１８抗体。
（７）（３）、もしくは（４）記載のＣＤＲ配列、又は（５）、もしくは（６）記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子。
（８）（３）～（６）いずれか１つ記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片。
（９）（１）～（６）いずれか１つ記載の抗ＩＬ－１８抗体、又は（８）記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片を含む、活性型ＩＬ－１８を検出、及び／又は定量するためのキット。
（１０）前記モノクローナル抗体が、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることを特徴とする（３）、又は（４）記載のＣＤＲ配列、又は（５）、又は（６）記載の可変領域を備えている抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体。
（１１）（１０）記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片。
（１２）（１０）記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体、又は（１１）記載の機能的断片を有効成分として含む、ＩＬ－１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
（１３）配列番号５（ＹＦＧＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
（１４）配列番号４（ＹＦＧＫＬＥＳＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
（１５）抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法であって、ネオエピトープ断端から５～１５アミノ酸の長さのペプチドにおいて、ネオエピトープ断端の反対のＮ末端、又はＣ末端のアミノ酸を起点に順次連続的にアラニン、又はグリシンに置換したペプチドを作製し、抗体とペプチドの結合を測定することによって抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法。
（１６）基板と、ペプチドをクロスリンクするための試薬と、抗体の結合を可視化するための試薬を含むことを特徴とする（１５）に記載の抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法に用いるキット。
（１７）対象に対して、（３）～（６）、（１０）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、（８）、（１１）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体の機能的断片を投与するＩＬ－１８関連疾患の治療方法。
（１８）前記対象は活性化型ＩＬ－１８が健常者に比べて高値である（１７）記載の治療方法。
（１９）前記ＩＬ－１８関連疾患が、成人スチル病、マクロファージ活性化症候群／血球貪食症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、間質性肺疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、２型糖尿病、虚血性腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、乾癬、痛風、関節リウマチのいずれかであることを特徴とする（１７）、又は（１８）に記載の治療方法。
（２０）（３）～（６）、（１０）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、（８）、（１１）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体の機能的断片、（９）記載のキットを用いて活性化型ＩＬ－１８量を検査し、活性化型ＩＬ－１８が健常者よりも高値を示す場合にはＩＬ－１８関連疾患であると判断する診断方法。
モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１が、活性型ＩＬ－１８を認識することをキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により解析した図。 成人スチル病（ ａｄｕｌｔ ｏｎｓｅｔＳｔｉｌｌ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＯＳＤ、あるいは成人発症スティル病とも言う。）患者血清中の活性型ＩＬ－１８の検出結果を示す図。 免疫沈降法への応用結果を示す図。 モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１のヒトＩＬ－１８機能阻害活性を示す図。 細胞免疫染色法への応用を示す図。 （Ａ）モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１のエピトープのネオエピトープ微分析法によるエピトープ解析結果を示す図。（Ｂ）アラニンスキャニングによるエピトープ解析結果を示す図。 （Ａ）モノクローナル抗体９－１０．２のＩＬ－１８３７－４４ペプチドとのネオエピトープ微分析法による表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム。（Ｂ）アラニンスキャニングによる表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム。（Ｃ）立体構造上のエピトープの位置を示す図。 ９－１０．２抗体とＩＬ－１８３７－４４ペプチドとの表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１の競合実験の結果を示す図。
　「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原（本発明の場合には活性型ＩＬ－１８）の一部をいう。また、ネオエピトープとは、タンパク質分解酵素によりタンパク質が切断され、元のタンパク質には存在しない新しく形成されたタンパク質断端のことをいう。ＩＬ－１８は、ｐｒｏ－ＩＬ－１８がｃａｓｐａｓｅ１／４で切断され、活性型ＩＬ－１８となる。活性型ＩＬ－１８に新しく形成された断端をＩＬ－１８のネオエピトープという。活性型ＩＬ－１８とは、ネオエピトープを有したＩＬ－１８の３７位～１９３位のペプチドをいう。
　本発明の抗体は、以下に示すように活性型ＩＬ－１８に特異的に結合するモノクローナル抗体、又は誘導体をいう。また、モノクローナル抗体と同様の方法で得ることのできるポリクローナル抗体も含むものとする。さらに、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の機能的断片をも含むものとする。抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。
　また、本発明で特定した活性型ＩＬ－１８に特異的に結合するモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト化ＣＤＲ移植抗体などとしたヒト化抗体、遺伝子改変マウス、ファージディスプレイ法を用いて作製したヒト抗体もまた本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体、ヒト抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ副作用が少なく、その治療効果が長時間持続する。
　さらに、本発明で特定した活性型ＩＬ－１８断端のエピトープに結合する物質も同様に活性化型ＩＬ－１８の検出等に使用することができる。そのような物質としては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマーなど抗体以外の物質で特異的にネオエピトープに結合する物質がある。アプタマーの作製方法は、ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法、ＳＥＬＥＸ法など、公知の方法を用いれば良い。
　本明細書において「ＩＬ－１８関連疾患」とは、活性型ＩＬ－１８が過剰に細胞外に放出されることにより惹起される疾患、あるいはＩＬ－１８によって増悪する可能性のある疾患をいう。ＩＬ－１８関連疾患は、ＩＬ－１８の過剰発現で発症、増悪している疾患である。ＩＬ－１８関連疾患には、成人スチル病（ＡＯＳＤ）、若年性スチル病、膵がん、肺がん、大腸がんなどの悪性腫瘍、クリオピリン関連周期熱症候群、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）、気管支喘息、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＤＰＤ）、輸血関連肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、関節リウマチ、代謝性骨疾患、肝臓及び腸管での重篤な臓器傷害、心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、眼球乾燥症（ＤＥＤ）、角膜炎、角膜血管新生、病的眼球内血管新生、虹彩炎、緑内障、黄斑変性症、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、結膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼皮膚炎、アレルギー性鼻炎、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎、虚血再灌流傷害、家族性地中海熱、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、痛風、シュニッツラー症候群、顕微鏡的多発血管炎、肉芽腫性多発血管炎、好酸球肉芽腫性多発血管炎からなるＡＮＣＡ関連血管炎、橋本病、クローン病、潰瘍性大腸炎、免疫グロブリン－４（ＩｇＧ４）関連疾患、肺動脈高血圧症、アトピー性皮膚炎、ＮＬＲＣ４関連自己炎症性疾患（あるいはＮＬＲＣ４インフラマソーム症）などが含まれる。
　これらＩＬ－１８関連疾患ではＩＬ－１８の機能を阻害する薬剤によって治療効果が得られることが期待される。したがって、これらＩＬ－１８関連疾患が疑われる患者において、活性型ＩＬ－１８の発現量を検査することによって、ＩＬ－１８の機能を阻害する薬剤を適用すべきか否かを判断することができる。また、以下の実施例で示すように、ネオエピトープを認識する抗体自体がＩＬ－１８の機能を抑制することから、これを治療に用いることができる。
　本明細書において「キット」とは、以下の実施例で示すウエスタンブロット法、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡに限らず、本明細書で開示する抗体を用いてＩＬ－１８を検出、定量、あるいは、その機能を評価する目的のために、必要な試薬、器具などを構成要素とするパッケージングされた組み合わせをいう。また、ネオエピトープ解析するためのキットとしては、ネオエピトープを解析する方法に必要な基板、発色試薬などの構成要素がパッケージングされた組み合わせをいう。
　以下の実施例において、本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
［実施例１］抗体の作製
　抗体の作製に関しては、島根大学動物実験専門委員会に動物実験計画承認申請書を申請し、承認を受けたうえで施行した。
　活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列に位置する３７位～４４位のペプチドにシステイン（Ｃ）をＣ末端に付加したペプチド（配列番号１、ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ）を常法に従い合成した。
　感作抗原としてｋｅｙｈｏｌｅ－ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨ）をＩｍｊｅｃｔ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｍｃＫＬＨ　ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて配列番号１のペプチドにクロスリンク後、常法に従いマウスに免疫した。
　同じペプチドを牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）にＩｍｊｅｃｔ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＢＳＡ　ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてクロスリンクし、これを用いてＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行い、ハイブリドーマ９－１０．２、及び８－４．１を選別樹立した。なお、ハイブリドーマ９－１０．２、８－４．１が産生する抗体を、それぞれ９－１０．２抗体、８－４．１抗体と称する。
　ＩｓｏＳｔｒｉｐ　マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ハイブリドーマ９－１０．２、及び８－４．１が産生する活性型ＩＬ－１８を認識するモノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１のアイソタイプを確認したところ、共にＩｇＧ１，κであった。
　［実施例２］９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の評価（キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法）
　認識部位の異なる抗ＩＬ－１８抗体（１１－４．１、エピトープ：ＩＬ－１８の６３位から６８位の領域、配列番号２、ＲＰＬＦＥＤ）との性能比較を行った。１１－４．１抗体は、本発明者らが樹立したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であり、ＩＬ－１８を高感度に検出することがすでに示されている抗体である。
　大腸菌で発現し精製した全長ＩＬ－１８を、大腸菌で発現精製した活性型ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７（ｃａｓｐａｓｅ－４の１０５位～３７７位のペプチドを意味する。以下、Ｎ末端のアミノ酸位置、Ｃ末端のアミノ酸位置でペプチドを特定して記載することがある。）と混合し、活性型ＩＬ－１８タンパク質（ＩＬ－１８３７－１９３）を精製取得した。エドマン分解法により精製したタンパク質のＮ末端配列を決定したところ、予想通りＹＦＧＫＬであった。これは活性型のＩＬ－１８のＮ末端である３７位のチロシンから、４１位のロイシンに該当する。
　また、開始コドンＡＴＧ、及びＣ末端にＨｉｓタグを付加したＩＬ－１８タンパク質（３７位～１９３位）を大腸菌で発現精製した。この場合、合成開始メチオニン（Ｍｅｔ）の次のアミノ酸がチロシン（３７Ｙ）であるため、メチオニンアミノペプチダーゼが作用できないため合成開始メチオニンが脱離せず（非特許文献３、４）、Ｍｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質となると考えられる。エドマン分解法により精製タンパク質のＮ末端配列を決定したところ、予想通り合成開始メチオニンが付加していた。
　これらタンパク質を用いて、認識部位の異なる抗ＩＬ－１８抗体（１１－４．１、エピトープ：ＩＬ－１８の６３ＲＰＬＦＥＤ６８）と９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体との比較を行った。
　活性型ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７で切断した２００、１００、５０、２５ｎｇ／ｍＬ濃度の活性型ＩＬ－１８タンパク質、及び２００、１００ｎｇ／ｍＬ濃度のＮ末端に合成開始メチオニンが付加したＭｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質をＷｅｓ（プロテインシンプル社）を用いてキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。１次抗体として、各精製抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１２５倍希釈で使用した。露光時間、２次抗体など他の条件はすべて同一条件で行った。結果を図１に示す。
　９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体は、活性型ＩＬ－１８タンパク質ＩＬ－１８３７－１９３は認識するにもかかわらず、活性型ＩＬ－１８のＮ末端にメチオニンが付加されたＭｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質は認識しなかった。一方、ＩＬ－１８の６３位～６８位をエピトープとする１１－４．１抗体は、活性型ＩＬ－１８（ＩＬ－１８３７－１９３）、Ｍｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質も同じように認識した。
　活性型ＩＬ－１８もＭｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質も、ＩＬ－１８の３７位から１９３位の領域を含んでいる。しかし、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体は、Ｍｅｔ－ＩＬ－１８３７－１９３－Ｈｉｓタンパク質を認識しなかった。すなわち、これら抗体は３７位のチロシンのＮ末側にアミノ酸が付加しているペプチドは認識できず、ＩＬ－１８３７－１９３タンパク質、すなわち、活性型ＩＬ－１８に存在するネオエピトープを認識することを示している。
［実施例３］臨床検体を用いた９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の評価（キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法）
　成人スチル病（ＡＯＳＤ）は、ＩＬ－１８タンパク質が高値を示すことが報告されている疾患である（非特許文献５）。島根大学医学部の倫理委員会の承認を受け、患者血清中のＩＬ－１８タンパク質を、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。患者血清は１０倍希釈し、１次抗体として、９－１０．２抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１：１２５倍希釈で使用した。内部標準タンパク質として、実施例２で用いた活性型ＩＬ－１８タンパク質（ＩＬ－１８３７－１９３）を用い、患者血清中に含まれる活性化型ＩＬ－１８の量及び分子量を実施例２と同様にして解析を行った。結果を図２に示す。１０名の患者において活性型ＩＬ－１８、すなわち標準タンパク質として用いたＩＬ－１８３７－１９３と同じサイズにバンドが検出された。また、図２の下に患者血清中に存在した活性型ＩＬ－１８の量を示しているが、極めて微量の活性化型ＩＬ－１８も定量することができた。
　実施例３で示すように、活性型ＩＬ－１８を認識する抗体である９－１０．２、及び８－４．１抗体を用いれば、非常にシンプルな方法によって活性型ＩＬ－１８を検出することができる。
［実施例４］９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の免疫沈降法への応用
　免疫沈降法における有用性について、認識部位の異なる１１－４．１抗体と比較し評価した。全長ＩＬ－１８タンパク質を活性型ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７とともに２９３Ｔ細胞で発現させた。既存のＦｌａｇタグ抗体（Ｍ２）はネガティブコントロール抗体として使用した。免疫沈降産物は自家製の抗ＩＬ－１８ウサギポリクローナル抗体でウエスタンブロット法により検出した。結果を図３に示す。
　図３上段には、全長ＩＬ－１８、活性型ＩＬ－１８、各抗体が認識する部位を模式的に示している。２９３Ｔ細胞に全長ＩＬ－１８、及び活性形ｃａｓｐａｓｅ－４を発現させると、全長ＩＬ－１８タンパク質は、活性型ｃａｓｐａｓｅ－４で切断されるが、細胞内には切断されていない全長ＩＬ－１８が存在している。１１－４．１抗体で免疫沈降した結果は、全長ＩＬ－１８タンパク質が多く免疫沈降されてきており、細胞内には切断されていないｐｒｏ－ＩＬ－１８が多く存在していることを示している。一方、８－４．１、９－１０．２抗体で免疫沈降した場合には、全長ＩＬ－１８は免疫沈降されておらず、より多くのＩＬ－１８３７－１９３が免疫沈降されている。つまり、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体は細胞内でｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７により切断された活性型ＩＬ－１８３７－１９３タンパク質を特異的に認識し効率よく免疫沈降できるモノクローナル抗体であることが明らかとなった。
［実施例５］９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体のヒトＩＬ－１８機能阻害活性
　大腸菌で発現精製した活性型ＩＬ－１８タンパク質を急性骨髄性白血病細胞株ＫＧ－１（ＪＣＲＢ００６５）に添加するとＩＦＮ－γが産生されることが知られている（非特許文献６）。抗体がＩＬ－１８機能阻害抗体であれば、ＩＬ－１８によるＩＦＮ－γ産生を阻害する（図４上模式図参照）。
　ＫＧ－１細胞に活性型ＩＬ－１８を０．５ｎｇ、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の濃度を変えて添加して、ＩＦＮ－γの産生をＩＦＮ－γ検出ＥＬＩＳＡ法（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡセット）により検出した。その結果、９－１０．２、及び８－４．１抗体は量依存的にＩＦＮ－γの産生に対し阻害活性を示した（図４下）。９－１０．２、及び８－４．１抗体はいずれもヒトＩＬ－１８機能を阻害する抗体として作用することから、ＩＬ－１８が過剰に発現することによって惹起される疾患や増悪する疾患の治療に用いることができる。特に、９－１０．２はＩＣ５０が２．８ｎＭと非常に強い阻害活性を示した。
［実施例６］９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の細胞免疫染色法への応用
　全長ＩＬ－１８タンパク質（ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１８）をＧ１９６タグ（ＤＬＶＰＲ、配列番号３、特許文献１１）が融合した活性型ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７（Ｇ１９６－Ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７）の存在下（図５左）あるいは非存在下（図５右）で２９３Ｔ細胞に発現させた。ホルマリン固定後、常法に従い９－１０．２抗体を用いて細胞免疫染色を行った。
　活性型ｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７の存在は、Ｇ１９６を認識するウサギポリクローナル抗体（Ｇ１９６　ｐＡｂ）により検出した（図５左、右上）。また、活性型ｃａｓｐａｓｅ－４非存在下においてＩＬ－１８の存在は、ＩＬ－１８を認識するウサギポリクローナル抗体（αＩＬ－１８　ｐＡｂ）により検出した（図５右、右上）。活性型ｃａｓｐａｓｅ－４存在下（図５左）では、９－１０．２抗体によってＩＬ－１８の存在が確認されている。一方、ｃａｓｐａｓｅ－４非存在下（図５右）では、ＩＬ－１８の存在がウサギポリクローナル抗体によって確認されているにもかかわらず、ＩＬ－１８は９－１０．２抗体によって検出されない。すなわち、９－１０．２抗体は、細胞免疫染色法においても細胞内でｃａｓｐａｓｅ－４１０５－３７７により切断された活性型ＩＬ－１８３７－１９３タンパク質を特異的に認識できるモノクローナル抗体であることを示している。
［実施例７］９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体のエピトープの検討
　上述のようにｃａｓｐａｓｅなどのタンパク質分解酵素によりタンパク質が切断されると、通常のタンパク質には存在しないタンパク質断端、ネオエピトープが形成される。抗体作製に用いたネオエピトープペプチドにおいて、抗体認識に重要なネオエピトープ断端とは反対のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドを作製し、抗体のネオエピトープ認識範囲を同定した。この抗体が認識するネオエピトープの範囲を決定する方法を「ネオエピトープ微分析法」と命名した。ネオエピトープ微分析法は、１アミノ酸ずつアラニンに置換するアラニンスキャニング法とは異なり、連続してアラニンに置換することにより抗体のエピトープを決定する方法である。ネオエピトープ微分析法は、ネオエピトープにおける抗体の結合領域を決定するのに優れた方法である。ここでは以下に示すようにＥＬＩＳＡによって定量的な解析を行っているが、ＥＬＩＳＡに限らず、ＳＰＲ法などによっても解析が可能である。また、以下の実施例ではアラニンに置換して解析を行っているが、分子量が小さく、構造的に大きな変化をもたらさないアミノ酸、例えば、グリシンなどを用いることもできる。
　ネオエピトープペプチド（３７位～４４位）のＣ末端のアミノ酸（４４位のリシン（Ｋ４４））を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドにクロスリンク用ＣｙｓをＣ末端に付加したペプチドを常法に従い合成した。各ペプチドにＢＳＡをＩｍｊｅｃｔ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＢＳＡ　ｓｐｉｎ　Ｋｉｔによりクロスリンクし、ＥＬＩＳＡ法により９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の認識部位の解析を行った。図６（Ａ）のＥＬＩＳＡプレート写真の右には、プレートリーダーで取得した吸光度を野生型のペプチドを１００として標準偏差と共に示した。
　４０位のリシンから４４位のリシンまでをアラニンに置換したペプチドに対しては、どちらの抗体もほとんど反応性を示さないが、４０位のリシンが存在することにより、野生型のペプチドの１／４程度の反応性を示す。さらに、４１位から４３位まで置換するアラニンの数が減っても抗体の反応性にはさほど変化はない。
　次に、アラニンスキャニング法により、エピトープ解析を行った。活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列ペプチド（３７位～４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）の各アミノ酸のアラニン変異体を常法に従い合成した。上記と同様に、ＢＳＡをクロスリンクした各ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法により９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体の認識部位解析を行った（図６（Ｂ））。
　９－１０．２、及び８－４．１抗体は共に、活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドの一番目のアミノ酸（３７位のチロシン（Ｙ）をアラニン（Ａ）に変えたペプチド（Ｙ３７Ａ）、Ｇ３９Ａペプチド及びＫ４０Ａペプチドをほとんど認識できなかった。また、Ｌ４１Ａ、Ｅ４２Ａの変異体に対しては弱い結合を示し、Ｆ３８Ａ、Ｓ４３Ａ、及びＫ４４Ａの変異体に対しては、５０％程度の結合を示した。
　さらに、同じペプチドを用い表面プラズモン共鳴解析を行った。ネオエピトープペプチド（３７位～４４位）のＣ末端のアミノ酸（４４位のリシン（Ｋ４４））を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドにクロスリンク用ＣｙｓをＣ末端に付加した各ペプチドをリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１０００１２）に固定化した。精製抗体９－１０．２を５０ｎＭの濃度で、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅで測定し「ネオエピトープ微分析」を行なった（図７（Ａ））。
　４０位のリシンから４４位のリシンまでをアラニンに置換したペプチドに対しては、まったく結合しなかったが、４０位のリシンが存在することにより、結合がみられるようになった。さらに、４０位のリシンが存在することにより、ペプチドからの乖離については４１位から４３位まで置換するアラニンの数が減っても抗体の反応性にはさほど変化はなかった。
　次に、活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列ペプチド（３７位～４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）の各アミノ酸のアラニン変異体をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製抗体９－１０．２を５０ｎＭの濃度で、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００を用いてｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅで測定し「アラニンスキャニング分析」を行なった（図７（Ｂ））。
　９－１０．２抗体は、活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドの三番目のアミノ酸（３９位のグリシン（Ｇ））をアラニン（Ａ）に変えたペプチド（Ｇ３９Ａ）をまったく認識できなかった。Ｙ３７Ａ、Ｋ４０Ａ変異体に対しては乖離しやすくなっており、Ｆ３８Ａ、Ｌ４１Ａ、Ｅ４２Ａ、Ｓ４３Ａ、及びＫ４４Ａの変異体に対しては、乖離には影響していないことが明らかとなった。
　表面プラズモン共鳴解析によっても、図６に示したＥＬＩＳＡによる解析と同様の結果を得ることができた。「ネオエピトープ微分析」によって結合に重要となるコア領域を、「アラニンスキャニング分析」によって、結合に重要なアミノ酸の情報を得ることができる。
　既知のヒトＩＬ－１８のＮＭＲ構造解析（ＰＤＢ：１Ｊ０Ｓ、図７（Ｃ））も併せて考えると、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体は、構造表面に露出している３７位のチロシン（Ｙ３７）から４４位のリシン（Ｋ４４）までの８アミノ酸が認識には重要であると考えられる。
　さらに、上記ネオエピトープ微積分法による結果から、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体が認識するためには、３７位から４０位までのペプチドが特に重要であることが明らかとなった。すなわち、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体はともにエピトープとしてＹＦＧＫＬＥＳＫ（配列番号４）、ミニマムエピトープとしてＹＦＧＫ（配列番号５）を認識することが明らかとなった。
　ペプチドＹＦＧＫＬＥＳＫ、あるいはＹＦＧＫは、活性化型ＩＬ－１８を認識する抗体が結合するエピトープである。したがって、これら配列を含むペプチドを免疫原とするワクチン、あるいはこのペプチドを含む領域とともに、ＩＬ－１８受容体と結合するＩＬ－１８の他の領域のペプチドとを組み合わせて治療薬として使用できる可能性がある。
　また、ＩＬ－１８ＢＰのうち構造解析されている３Ｆ６２（ｐｏｘｖｉｒｕｓのＩＬ－１８ＢＰ）、及び４ＥＥＥ（ｙａｔａｐｏｖｉｒｕｓのＩＬ－１８ＢＰ）のＩＬ－１８結合部位は、Ｙ３７、Ｆ３８、Ｇ３９の領域が含まれている（非特許文献７、８）。ヒトＩＬ１８ＢＰの構造解析はまだ行われていないが、一次配列が類似しており、同じ領域に結合する可能性が高い。ＩＬ－１８ＢＰが結合したＩＬ－１８には、９－１０．２抗体、及び８－４．１抗体は結合しないものと考えられる。したがって、これら抗体を使用することによって、ＩＬ－１８ＢＰが結合していないフリーのＩＬ－１８を測定することができる。
　具体的には、９－１０．２抗体、あるいは８－４．１抗体を基板にコートし、血清と反応させる。ＩＬ－１８ＢＰが結合したＩＬ－１８には９－１０．２抗体や８－４．１抗体は結合することができず、ネオエピトープが露出している活性化型ＩＬ－１８のみを捕捉することができる。捕捉されたＩＬ－１８を別の部位を認識する抗体と反応させ、測定を行えばよい。これまで、煩雑な方法で測定していたＩＬ－１８ＢＰと結合していないフリーのＩＬ－１８もＥＬＩＳＡによって簡便に測定することが可能となる。
［実施例８］９－１０．２抗体とＩＬ－１８３７－４４ペプチドとの親和性解析（表面プラズモン共鳴解析）
　活性型ＩＬ－１８タンパク質のネオエピトープペプチド（３７位～４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製抗体９－１０．２を０．４ｎＭ～２５０ｎＭの範囲で５濃度、５倍希釈系列でＢｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００を用いてｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅで測定した（図８）。解析はｂｉｖａｌｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓで行った。
　結果は、ＫＤ：１．９ｘ１０－１０Ｍ、Ｋａ：２．１ｘ１０５Ｍ－１ｓ－１、Ｋｄ：４．０ｘ１０－５ｓ－１であった。９－１０．２抗体は、非常に高い親和性で、活性型ＩＬ－１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドに結合していることが明らかとなった。
［実施例９］モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１の競合実験解析
　実施例７のエピトープ解析からモノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１は同じエピトープを認識していると考えられる。さらに、実施例８の結果から、９－１０．２抗体は非常に高い親和性でネオエピトープに結合していることが明らかになった。そこで、モノクローナル抗体９－１０．２、及び８－４．１の競合実験を行い、９－１０．２抗体、８－４．１抗体が同一のエピトープを認識し、競合するか解析を行った（図９）。
　配列番号１のペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ）にＢＳＡをクロスリンクさせ、５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３を用い５ｎｇ／１００μｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートに、４℃で一晩コーティングした。常法によりＥＬＩＳＡプレートはブロッキング、洗浄を行い、０、１００、３００、１０００ｎｇ／１００μｌに調整した９－１０．２、あるいは８－４．１抗体溶液を添加し、２５℃で１時間反応を行った。なお、抗体を入れないウェルには洗浄液のみを添加している（図９、ＨＲＰを付加していない１次抗体参照。）。
　次に、ＨＲＰラベルした各抗体（０．５μｇ／μｌ）を洗浄液にて１００倍希釈し、一次抗体として８－４．１抗体をペプチドに結合させたウェルには、ＨＲＰ標識した９－１０．２抗体を、９－１０．２抗体をペプチドに結合させたウェルにはＨＲＰ標識した８－４．１抗体を１００μｌずつ添加し、２５℃　１時間インキュベートした（図９、ＨＲＰを付加した２次抗体参照。）。その後、洗浄を行い、発色させ、吸光度を測定した（図９、吸光度　４５０ｎｍ－６２０ｎｍ参照。）。
　１次抗体として８－４．１抗体を、２次抗体としてＨＲＰ標識した９－１０．２抗体を用いると、９－１０．２抗体が１次抗体である８－４．１抗体と競合した結果、ペプチドに結合することが示された。したがって、９－１０．２、８－４．１抗体は互いに競合し、９－１０．２抗体は８－４．１抗体と比較して、活性形ＩＬ－１８に高い親和性を有することが明らかとなった。
［実施例１０］抗体遺伝子の解析
　次に、各抗体の遺伝子解析を行った。ハイブリドーマ９－１０．２、８－４．１よりＲＮＡを抽出後、ｏｌｉｇｏ－ｄＴプライマーを用いて逆転写しｃＤＮＡを作成した。合成したｃＤＮＡを、Ｈ鎖及びＬ鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。
　用いたＨ鎖及びＬ鎖のプライマーの配列は以下のとおりである。
Ｈ鎖プライマー
ＶＨ１－１Ｓ:5′-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw　gg-3′（配列番号６）
　　　　　　　s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
ＩｇＧ２－１ＡＳ:5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’（配列番号７）
Ｌ鎖プライマー
ＶＫ－１Ｓ:5′-ggggatcc　gay att gtg mts acm car wct mca -3（配列番号８）
　　　　　　　y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
ＣＫ－２ＡＳ：5’-gggaattc gaa gat gga tac　agt tgg
tgc-3’（配列番号９）
　なお、下線部は制限酵素の認識サイトを示す。
　Ｈ鎖の遺伝子解析によって、９－１０．２抗体のＨ鎖の塩基配列（配列番号１０）、アミノ酸配列（配列番号１１）、８－４．１抗体のＨ鎖の塩基配列（配列番号１２）、アミノ酸配列（配列番号１３）を決定した。また、Ｌ鎖の遺伝子解析によって、９－１０．２抗体のＬ鎖の塩基配列（配列番号１４）、アミノ酸配列（配列番号１５）、８－４．１抗体のＬ鎖の塩基配列（配列番号１６）、アミノ酸配列（配列番号１７）を決定した。
　９－１０．２抗体、８－４．１抗体の各相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、遺伝子配列について以下にまとめる。
［表１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
［表２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
［表３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
［表４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　本実施例で示したように、上記ＣＤＲを有する抗体は、感度、特異度良く活性型ＩＬ－１８を特異的に認識する抗体である。したがって、ＥＬＩＳＡなど臨床現場でも簡便に実施できる方法によって、活性型のＩＬ－１８を検出することが可能となる。その結果、臨床現場においてＩＬ－１８関連疾患か否かを簡便に判断することできることが可能となり、治療方針の策定に役立てることができる。また、ウエスタンブロッティング、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法、免疫沈降法、細胞免疫染色法など様々な方法に応用することができるので、研究用試薬としても広く応用することができる。さらに、ＩＬ－１８の機能を阻害することができることが明らかになっており、ＩＬ－１８関連疾患を治療する薬剤としても非常に有用な抗体である。

Claims (16)

  1. 　活性型ＩＬ－１８のみを認識する抗ＩＬ－１８抗体。
  2. 　ヒトＩＬ－１８のネオエピトープを認識する請求項１記載の抗ＩＬ－１８抗体。
  3. 　前記抗ＩＬ－１８抗体がモノクローナル抗体であり、
    　重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＳＳＳＧＭＧ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、
    　ＩＷＷＤＤＤＫ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、
    　ＴＲＴＲＴＹＳＮＦＧＧＧＭＡＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、
    　軽鎖可変ドメインが、ＱＳＩＡＨＳＮＧＹＴＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、
    　ＫＶＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、
    　ＶＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする請求項１、又は２記載の抗ＩＬ－１８抗体。
  4. 　前記抗ＩＬ－１８抗体がモノクローナル抗体であり、
    　重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、
    　ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、
    　ＡＲＥＳＳＹＤＡＭＤＹ（配列番号３８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、
    　軽鎖可変ドメインが、ＥＮＶＶＴＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、
    　ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、
    　ＧＱＧＹＳＹＰＹＴ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の抗ＩＬ－１８抗体。
  5. 　Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１であり、
    　Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１５であることを特徴とする請求項３記載の抗ＩＬ－１８抗体。
  6. 　Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３であり、
    　Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であることを特徴とする請求項４記載の抗ＩＬ－１８抗体。
  7. 　請求項３、もしくは４記載のＣＤＲ配列、又は請求項５、もしくは６記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子。
  8. 　請求項３～６いずれか１項記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片。
  9. 　請求項１～６いずれか１項記載の抗ＩＬ－１８抗体、又は請求項８記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片を含む、
    　活性型ＩＬ－１８を検出、及び／又は定量するためのキット。
  10. 　前記モノクローナル抗体が、
    　ヒト化抗体、又はヒト抗体であることを特徴とする請求項３、又は４記載のＣＤＲ配列、又は請求項５、又は６記載の可変領域を備えている抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体。
  11. 　請求項１０記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体の機能的断片。
  12. 　請求項１０記載の抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体、又は請求項１１記載の機能的断片を有効成分として含む、
    　ＩＬ－１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
  13. 　配列番号５（ＹＦＧＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
  14. 　配列番号４（ＹＦＧＫＬＥＳＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
  15. 　抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法であって、
    　ネオエピトープ断端から５～１５アミノ酸の長さのペプチドにおいて、
    　ネオエピトープ断端の反対のＮ末端、又はＣ末端のアミノ酸を起点に順次連続的にアラニン、又はグリシンに置換したペプチドを作製し、
    　抗体とペプチドの結合を測定することによって抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法。
  16. 　基板と、
    　ペプチドをクロスリンクするための試薬と、
    　抗体の結合を可視化するための試薬を含むことを特徴とする請求項１５に記載の抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法に用いるキット。
     
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