WO2012124683A1 - 新規モノクローナル抗体、及びそのタグ抗体としての利用 - Google Patents

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WO2012124683A1
WO2012124683A1 PCT/JP2012/056384 JP2012056384W WO2012124683A1 WO 2012124683 A1 WO2012124683 A1 WO 2012124683A1 JP 2012056384 W JP2012056384 W JP 2012056384W WO 2012124683 A1 WO2012124683 A1 WO 2012124683A1
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amino acid
antibody
seq
monoclonal antibody
acid sequence
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浦野　健
香澄 辰巳
浄治 関根
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国立大学法人島根大学
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody. More specifically, the present invention relates to a novel monoclonal antibody that can be widely used as an immunodetection method using an antigen-antibody reaction, such as Western blotting, immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation, and immunostaining, as a tag antibody. The present invention also relates to an immunodetection method using the monoclonal antibody and its epitope as a tag.
  • an oligopeptide called a tag has been used to detect or separate and purify only a desired protein from a test sample containing a plurality of proteins.
  • the target protein is expressed as a fusion protein with an oligopeptide (labeled peptide) to be labeled, and the labeled peptide
  • an affinity molecule including an antibody
  • the oligopeptide (labeled peptide) to be labeled here is referred to as “affinity tag” or simply “tag” as described above, and among them, a tag used by utilizing an antigen-antibody reaction with an affinity molecule (antibody). Is called “epitope tag”.
  • labeled peptide FLAG tag, 3XFLAG tag, HA peptide, 3XHA peptide, myc peptide, 6XHis tag, GST polypeptide, MBP polypeptide, PDZ domain polypeptide, TAP (Tandem Affinity Purification) peptide, alkaline phosphatase, and adivine Etc.
  • These labeled peptides are usually used by being fused to the N-terminus or C-terminus of the target protein, but in some cases, they may be used by being inserted into the target protein. In any case, however, in order for these labeled peptides to function effectively as affinity tags in immunodetection methods, it is essential to use tag antibodies that specifically recognize and selectively bind to the labeled peptides. It is.
  • the present invention aims to provide a novel monoclonal antibody. More specifically, an object is to provide a monoclonal antibody that is effectively used as a tag antibody that specifically recognizes and binds a peptide having a specific amino acid sequence.
  • Another object of the present invention is to provide an immunodetection method characterized by using the above peptide as an epitope tag and using the monoclonal antibody of the present invention as the tag antibody.
  • GST Schistosoma japonicum glutathione S-transferase
  • the present inventors have used the gene product of the GST fusion protein expression vector pGEX-2T (GE Healthcare Japan).
  • a hybridoma G196 was prepared by immunizing a mouse, and a monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “G196 antibody”) was prepared from the hybridoma G196.
  • the G196 antibody was a GST fusion protein expression vector expressing GST. It was found that not all gene products could be recognized, but a part of the gene product of the GST fusion protein expression vector was specifically recognized.
  • the monoclonal antibody was not the amino acid sequence of GST in the amino acid sequence of the gene product of the GST fusion protein expression vector.
  • An amino acid sequence “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” (SEQ ID NO: 1) consisting of 5 amino acid residues in a linker sequence containing a protease recognition site bound to the terminal side (wherein Xa is Val, Ala, Ile or Any one amino acid residue of Thr, Xb means any one amino acid residue selected from 19 kinds of protein constituent amino acid residues other than Lys.
  • the present inventors use the above-mentioned monoclonal antibody (G196 antibody) as a tag antibody, using the peptide having the amino acid sequence of “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” as an “epitope tag”.
  • the above-mentioned peptides that are water-soluble are immunodetection methods frequently used in molecular biological research, specifically Western blotting, immune precipitation, chromatin immunoprecipitation and cell staining. It was confirmed that it can be widely applied to the above.
  • the present invention has been completed based on such findings, and includes the following embodiments.
  • the monoclonal antibody is an antibody that specifically binds to a peptide comprising, as an epitope region, an amino acid sequence in which the amino acid residue represented by Xa in SEQ ID NO: 1 is a valine residue (Val) ( The monoclonal antibody according to I-1).
  • the above-mentioned monoclonal antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more. And the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-3), comprising a light chain variable region.
  • reaction rate constant (Kd value) for the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is 0.1 to 10 nM, preferably 0.1 to 5 nM, more preferably 0.1 to 2 nM.
  • (I-6) The monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-5), which is an immunoglobulin G (IgG) derived from a mouse or an antigen-binding fragment thereof.
  • IgG immunoglobulin G
  • the scFv comprises a CDR1 comprising the 18th to 25th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a CDR2 comprising the 43th to 50th amino acid sequence, and a CDR3 comprising the 89th to 97th amino acid sequence.
  • a light chain comprising a peptide of a chain variable region (VH), CDR1 comprising the 18th to 23rd amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3, CDR2 comprising the amino acid sequences 41 to 43, and CDR3 comprising the 80 to 88 amino acid sequences
  • VH chain variable region
  • CDR1 comprising the 18th to 23rd amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3
  • CDR2 comprising the amino acid sequences 41 to 43
  • CDR3 comprising the 80 to 88 amino acid sequences
  • the monoclonal antibody according to (I-9) wherein the variable region (VL) peptide is linked via a peptide having a linker sequence.
  • (I-13) The monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-12), which is used as a tag antibody against an epitope tag comprising a peptide comprising the amino acid sequence represented by the following formula: X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 (SEQ ID NO: 31) (Wherein X 1 is Asp, Glu or Ser; X 2 is Leu, Ile or Met; X 3 is Val, Ala, Ile or Thr; X 4 is any one selected from 19 kinds of protein constituting amino acids other than Lys. the X 5 is Arg, respectively); Kano amino acid residues..
  • (I-14) characterized in that it comprises a step of immunizing a non-human animal using a gene product of GST fusion protein expression vector pGEX-2T (GE Healthcare Japan) as an antigen (immune antigen) ( The method for producing a monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-13).
  • (I-16) A gene encoding the monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-15), The base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the base sequence that hybridizes with the complementary sequence of the base sequence under stringent conditions is used as the base sequence encoding the heavy chain variable region of the monoclonal antibody, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 Or a gene comprising a nucleotide sequence that hybridizes with a complementary sequence of the nucleotide sequence under stringent conditions as a nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the monoclonal antibody.
  • the above epitope tag which consists of a peptide containing the amino acid sequence shown by the above as an epitope region (minimum recognition sequence).
  • epitope tag is a peptide comprising an amino acid sequence in which the amino acid residue represented by Xa is a valine residue (Val) in SEQ ID NO: 1. tag.
  • (II-3) An epitope tag used for an antigen-antibody reaction with the monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-11), Epitope tag comprising a peptide comprising the amino acid sequence shown in the following formula: X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 (SEQ ID NO: 31) (Wherein X 1 is Asp, Glu or Ser; X 2 is Leu, Ile or Met; X 3 is Val, Ala, Ile or Thr; X 4 is any one selected from 19 kinds of protein constituting amino acids other than Lys. the X 5 is Arg, respectively); Kano amino acid residues..
  • the epitope tag is Gly, Ser or at least one selected from these at the N and / or C terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31
  • the epitope tag according to any one of (II-1) to (II-3), which is an oligopeptide obtained by binding an amino acid sequence containing an amino acid residue.
  • oligopeptide comprises 7 to 40 amino acid residues, preferably 7 to 30, more preferably 7 to 20, particularly preferably 7 to 10.
  • (II-7) The epitope tag according to any one of (II-1) to (II-6), which is water-soluble.
  • being water-soluble means that the amount of water required to dissolve 1 g of the solute is less than 30 mL based on the provisions of the 16th revision of the Japanese Pharmacopoeia (slightly soluble to extremely soluble Easy to melt).
  • the amount of water required to dissolve 1 g of solute is less than 10 mL (easily soluble to very easily soluble), and the amount of water required to dissolve 1 g of solute may be less than 1 mL. (Very easy to dissolve).
  • (II-8) a step of transforming a host with an expression vector comprising DNA in which the base sequence encoding the epitope tag is artificially linked to the base sequence encoding the target peptide, and the traits obtained in the step
  • Test substance detection method III-1) Test substance detection method having the following steps: (1) Using the monoclonal antibody described in any of (I-1) to (I-13) as a tag antibody, labeling with the epitope tag described in any of (II-1) to (II-7) A step of performing an antigen-antibody reaction with a test substance comprising (2) A step of detecting a test substance using an antigen-antibody reaction product bound with a tag antibody as an index.
  • (IV) Method for isolating or collecting a test substance A method for isolating or collecting a test substance from a test sample having the following steps: (1) A test sample containing a test substance labeled with the epitope tag described in any of (II-1) to (II-7), and any of (I-1) to (I-13) A step of reacting the monoclonal antibody described in 1 as a tag antibody, (2) isolating or recovering the antigen-antibody reaction product to which the tag antibody is bound from a test sample; (3) a step of removing the tag antibody from the antigen-antibody reaction product to which the tag antibody is bound, and collecting the test substance; and (4) removing the epitope tag from the test substance labeled with the epitope tag, if necessary. Process.
  • test substance labeled with the epitope tag is a tag fusion peptide produced by the method described in (II-8).
  • a novel monoclonal antibody that can be widely used for immunodetection methods using antigen-antibody reactions such as Western blotting, immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation, and immunostaining can be provided as tag antibodies.
  • the monoclonal antibody of the present invention contains at least “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” (SEQ ID NO: 1) (Xa is any one amino acid residue of Val, Ala, Ile or Thr, Xb is It means any one amino acid residue selected from 19 kinds of protein constituent amino acid residues other than Lys.) Because it can specifically recognize and bind to a peptide containing the amino acid sequence shown in FIG. Using the peptide as an epitope tag, it can be widely applied to immunodetection methods using antigen-antibody reaction such as Western blotting, immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation and immunostaining.
  • the vector map of the pGEX-2T vector (GE Healthcare Japan) used as an immunizing antigen in the production of the monoclonal antibody (G196 antibody) of the present invention is shown.
  • the amino acid sequences of peptides fused to GST of the products (6P-12, 6P-14, 6P-16, 6P-15, 6P-17, 6P-19) are shown.
  • A GST of gene product (4T-2, 6P-1) of GST fusion protein expression vector (pGEX-4T-2 vector, pGEX-6P-1 vector) PGEX-6P-1 vector gene product (6P-15, 6P-24) into which the nucleotide sequence encoding the candidate amino acid sequence of the minimal recognition site used to identify the G196 antibody epitope and the amino acid sequence of the polypeptide fused to 6P-25, 6P-26, 6P-27, 6P-28, 6P-29) shows the amino acid sequences of polypeptides fused to GST.
  • the “peptide” means a peptide in which 5 or more amino acids are linked by peptide bonds, unless otherwise specified, an oligopeptide having 50 or less amino acid residues, and the number of amino acid residues. Any more than 50 polypeptides (including proteins) are included. In addition, glycopeptides (glycoproteins) formed by binding sugars are also included in the peptides targeted by the present invention.
  • monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population.
  • the individual antibodies contained in the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in trace amounts.
  • monoclonal antibodies are characterized by being specific for a particular antigenic site.
  • a monoclonal antibody can be distinguished from a polyclonal antibody, which is a collection of antibodies that recognize different antigenic determinants (epitopes), in that it specifically recognizes a single antigenic determinant in an antigenic peptide.
  • the monoclonal antibody targeted by the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to a peptide comprising the amino acid sequence of "Asp-Leu-Xa-Xb-Arg" (SEQ ID NO: 1) as an epitope region. .
  • Xa is any one amino acid residue of valine (Val), alanine (Ala), isoleucine (Ile) or threonine (Thr), and Xb Means any one amino acid residue selected from 19 types of protein-constituting amino acid residues other than lysine (Lys).
  • amino acid residues other than Lys 19 kinds of ⁇ amino acids other than Lys constituting the protein (for example, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val) can be mentioned arbitrarily, and is not particularly limited.
  • Xa is preferably Val, Ala, Ile, and Thr, more preferably Val.
  • Asp-Leu-Xa-Xb-Arg is not limited, but examples include Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6), Asp-Leu-Ala-Pro-Arg (SEQ ID NO: 7). ), Asp-Leu-Val-Ala-Arg (SEQ ID NO: 8), and Asp-Leu-Ala-Ala-Arg (SEQ ID NO: 9). Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6) is preferred.
  • the peptide having these amino acid sequences may be composed of an amino acid sequence represented by “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg”.
  • the amino acid sequence optionally has one or more arbitrary amino acid residues on the N-terminal side and / or C-terminal side. There may be.
  • the number of amino acid residues is not particularly limited as long as it includes the sequence consisting of the above 5 amino acid residues, and a polypeptide (protein) consisting of more than 50 amino acid residues Alternatively, it may be in the form of an oligopeptide consisting of 5 to 50 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues is preferably about 5 to 40, more preferably about 7 to 30, further preferably about 7 to 20, and particularly preferably about 7 to 10. Can do.
  • Such an epitope tag is not limited, but has one or more linker sequences such as Gly or Ser (for example, a GS linker sequence described later) before and after (N and C-terminal sides) the epitope region (minimum recognition sequence). Oligopeptides can be exemplified.
  • an oligopeptide consisting of the amino acid sequence represented by “Ser- Asp-Leu-Val-Pro-Arg- Gly-Ser” (SEQ ID NO: 29), and pronin (Pro) in the amino acid sequence is alanine (Ala)
  • An oligopeptide consisting of an amino acid sequence substituted with can be exemplified as an example.
  • a GS linker sequence represented by (GGGGS) n (SEQ ID NO: 10) or (GGGS) n (SEQ ID NO: 33) or the like (both of which n represents an integer of 1 to 3) is used. You can also.
  • the monoclonal antibody targeted by the present invention comprises at least CDR1 (complementarity determining region 1) consisting of the 18th to 25th amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 and CDR2 (complementarity determining region) consisting of the 43th to 50th amino acid sequences.
  • CDR3 complementarity determining region 3
  • CDR1 complementarity determining region consisting of the 18th to 23rd amino acid sequences described in SEQ ID NO: 3)
  • CDR2 complementarity determining region 2
  • CDR3 complementarity determining region 3
  • the immunoglobulin or antigen-binding fragment thereof includes an immunoglobulin or antigen-binding thereof having at least a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Fragments are included.
  • the immunoglobulin is not particularly limited as long as it is derived from a mammal, and examples include immunoglobulins derived from mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, monkeys, humans, goats, etc.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region have one or more arbitrary amino acid residues in the amino acid sequence substituted or missing, as long as specific binding to the epitope region described above is not impaired. It may be lost or added.
  • a heavy chain variable region modified heavy chain variable region
  • Such a heavy chain variable region is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the light chain variable region (modified light chain variable region) are 85% or more, preferably 90% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • one or more amino acid residues in regions other than CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region are preferably substituted, deleted or added.
  • examples of the region other than CDR1, CDR2, and CDR3 include a framework region of an immunoglobulin heavy chain variable region (hereinafter, also simply referred to as “FR”).
  • a modified heavy chain variable region one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the FR region are substituted, deleted or added, and as a result, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is 85% or more.
  • the amino acid sequence of the FR region includes a human-derived amino acid sequence or a variant thereof.
  • the monoclonal antibody of the present invention has the heavy chain variable region CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 2, respectively, amino acid sequences 18-25, 43-50, and 89
  • a humanized antibody having the amino acid sequence of ⁇ 97 and the amino acid sequence of FR1 to FR4 of the human heavy chain variable region is included as the amino acid sequence of FR1 to FR4 of the heavy chain variable region.
  • the FR or subregion sequence of a fully humanized antibody is listed on the NCBI website, for example, and can be referred to as appropriate.
  • the modified light chain variable region has one or more amino acid residues in the light chain variable region (SEQ ID NO: 3) other than CDR1, CDR2 and CDR3 substituted, deleted or added. And consisting of an amino acid sequence having 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more identity with the amino acid sequence corresponding to the above region described in SEQ ID NO: 3. is there.
  • the region other than CDR1, CDR2, and CDR3 include a framework region of an immunoglobulin light chain variable region (hereinafter, also simply referred to as “FR”).
  • amino acid sequence of the FR region As a modified light chain variable region, one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the FR region are substituted, deleted, or added, and as a result, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 is 85% or more.
  • the amino acid sequence of the FR region includes a human-derived amino acid sequence or a variant thereof.
  • the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region are the 18th to 23rd amino acid sequences described in SEQ ID NO: 3, the 41st to 43rd amino acid sequences, and 80 Humanized antibodies having the amino acid sequence of ⁇ 88 and having the amino acid sequence of FR1-4 of the light chain variable region derived from human as the amino acid sequence of FR1-4 of the light chain variable region are included.
  • the FR or subregion sequence of a fully humanized antibody is listed on the NCBI website, for example, and can be referred to as appropriate.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be an immunoglobulin (IgG) itself or an antigen-binding fragment thereof.
  • antigen-binding fragments include variable region fragments (Fv) consisting of immunoglobulin (IgG) heavy and light chain variable regions, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 and scFv containing the regions. can do.
  • scFv includes, for example, a heavy chain comprising CDR1 consisting of the 18th to 25th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, CDR2 consisting of the 43th to 50th amino acid sequence, and CDR3 consisting of the 89th to 97th amino acid sequence.
  • Light chain variable comprising a variable region (VH) peptide, CDR1 consisting of the 18th to 23rd amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, CDR2 consisting of the amino acid sequence of 41 to 43, and CDR3 consisting of the amino acid sequence of 80 to 88
  • VH variable region
  • CDR1 consisting of the 18th to 23rd amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of 41 to 43
  • CDR3 consisting of the amino acid sequence of 80 to 88
  • a recombinant protein formed by linking a peptide in the region (VL) via a peptide having a linker sequence (for example, the GS linker sequence described above) can be exemplified.
  • the heavy chain variable region (VH) peptide contains 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence.
  • a peptide comprising an amino acid sequence having an identity of 98% or more is particularly preferable.
  • the light chain variable region (VL) peptide has 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence.
  • a light chain variable region peptide consisting of an amino acid sequence having an identity of 98% or more is particularly preferred.
  • the positions of the heavy chain variable region (VH) peptide and the light chain variable region (VL) peptide in the scFV are not particularly limited, and may be VH- “linker peptide” -VL or VL- “linker peptide”. It may be -VH.
  • VH- “linker peptide” -VL the monoclonal antibody (G196 (scFv) antibody) prepared in Experimental Example 6 can be mentioned.
  • the amino acid number 22 to 123 region of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) of the monoclonal antibody (G196 (scFv) antibody) is the amino acid number of the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 2) of the monoclonal antibody (IgG) of the present invention. It corresponds to the region 7 to 108 (CDR1: 18-25, CDR2: 43-50, CDR3: 89-97), and the region of amino acid numbers 148 to 245 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) is the monoclonal antibody of the present invention.
  • IgG corresponds to the region of amino acid number 1 to 98 (CDR1: 18-23, CDR2: 41-43, CDR3: 80-88) in the amino acid sequence of the light chain variable region (SEQ ID NO: 3), and these regions Have a structure formed by binding via a peptide having a GS linker sequence.
  • the region of amino acid numbers 1 to 21 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 is modified from the pET28-His-TEV vector (Novagen pET28) used in Example 6 for the production of the monoclonal antibody (G196 (scFv) antibody). This corresponds to the His-TEV sequence derived from
  • the binding of the monoclonal antibody of the present invention to the epitope region is evaluated for the binding to the peptide comprising the amino acid sequence of “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” (Xa and Xb are as described above). Can be judged.
  • the evaluation method is not limited, but preferably, an alanine scan using the Western blot method described in Experimental Example 2 (2) (2-2), a method using an isothermal calorimeter as shown in Experimental Example 3, or an experiment A method using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as shown in Example 4 can be mentioned.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a binding property to a peptide having an amino acid sequence of at least “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” (Xa and Xb are as described above).
  • Xa and Xb are as described above.
  • the amino acid sequence for example, at least the first amino acid residue (Asp) is substituted with a protein-constituting amino acid residue other than, for example, Asp, Glu, Gly, Gln and Ser; Leu) is replaced with a protein constituent amino acid residue other than Leu, Phe, His, Ile, Met and Asn, for example;
  • the third amino acid residue (Xa) is a protein other than Val, Ala, Ile, Ser and Thr, for example.
  • reaction rate constant (Kd value) for the peptide having the amino acid sequence “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” (Xa and Xb are as described above) of the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited.
  • Examples of the reaction rate constant (Kd value) for the peptide having the amino acid sequence shown in 30 include 0.1 to 10 nM, preferably 0.1 to 5 nM, and more preferably 0.1 to 2 nM.
  • the monoclonal antibody of the present invention comprises a step of immunizing a non-human animal using the gene product of GST fusion protein expression vector pGEX-2T (GE Healthcare Japan) as an immunizing antigen. It can be produced according to a method for producing a monoclonal antibody.
  • a vector map of the pGEX-2T vector is shown in FIG.
  • non-human animals for immunization with the gene product of the pGEX-2T vector include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, sheep, goats, etc., but preferably rodents such as mice and rats. Yes, more preferably a mouse.
  • the administration route of the mucus source during immunization is not particularly limited, and can be administered by any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, or intramuscular.
  • BALB / c mice are inoculated with the gene product of the pGEX-2T vector once or several times every few days to several weeks together with adjuvant.
  • the spleen is removed from a mouse immunized with the gene product of the pGEX-2T vector, and antibody-producing cells (spleen cells) are obtained by centrifugation. Since these cells do not have the ability to grow, they are fused with cells having the ability to self-proliferate. As the cell having self-proliferating ability, lymphocyte-like cells such as myeloma cells are particularly preferable. As myeloma cells, those of the same kind as the animal from which the antibody-producing cells were obtained are preferably used, and those that do not secrete antibodies are preferably selected.
  • myeloma cells examples include mouse myeloma cells P3 / NSI / 1-Ag4-1 (ATCC TIB-18), Sp2 / O-Ag14 (ATCC CRL-1581), P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL-1597) and the like. It is done. Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be carried out according to a conventional method, for example, by treating these cells with a solution (or suspension) containing a cell fusion agent such as polyethylene glycol.
  • the ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably about 1: 1 to 10: 1 in terms of cell number ratio.
  • the obtained fused cells are separated by a limiting dilution method, the separated fused cells are expanded, and the antibody produced in each well is treated with, for example, a gene product of the pGEX-2T vector (for example, a purified GST protein derived from the pGEX-2T vector) ) And, if necessary, a peptide having Asp-Leu-Xa-Xb-Arg (SEQ ID NO: 1), preferably Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6) The reactivity with the peptide is examined by an ELISA method using and a hybridoma producing a desired antibody is selected from the result.
  • an assay plate is prepared by immobilizing the above peptide in the presence of alkylenedialdehyde and a basic polypeptide or a basic synthetic polymer, and using this assay plate.
  • a method can be used in which the antibody produced by the fusion cell is tested by ELISA and a hybridoma that produces an antibody that reacts with the peptide is selected.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained from a culture supernatant obtained by culturing the hybridoma selected above using an appropriate medium (for example, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A). Etc.).
  • an appropriate medium for example, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A. Etc.
  • an appropriate medium for example, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A). Etc.
  • a desired monoclonal antibody can be collected from the ascites, serum, etc. of the mammal.
  • the obtained monoclonal antibody can be used as it is, but it can also be used after being fragmented as an antigen-binding fragment.
  • Antigen-binding fragments include various fragments such as Fv, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, scFv, etc., and specific to peptides having the amino acid sequence of Asp-Leu-Xa-Xb-Arg (SEQ ID NO: 1) As long as the binding activity is not lost.
  • These active fragments can be prepared by applying known methods such as papain, pepsin, and trypsin treatment to purified monoclonal antibodies (for example, “Immunobiochemistry Research Method (Second Life Chemistry Experiment Course 5)). ", Edited by Japan Biochemical Society, page 89 (1986)).
  • the monoclonal antibody of the present invention is prepared by a method of amino acid synthesis with reference to the amino acid sequence of the monoclonal antibody, and a genetic engineering method with reference to the base sequence of the gene encoding the monoclonal antibody. It can also be prepared by a method.
  • the base sequence encoding the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 2) of the monoclonal antibody of the present invention is shown in SEQ ID NO: 4, and the base sequence encoding the light chain variable region (SEQ ID NO: 3) is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the nucleotide sequences encoding the heavy chain variable region CDR1, CDR2 and CDR3 are the 52-75th nucleotide sequence, the 127-150th nucleotide sequence, and the 265-291st nucleotide sequence in SEQ ID NO: 4, respectively. .
  • the nucleotide sequences encoding CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region are the 52-69th nucleotide sequence, 121-129th nucleotide sequence, and 238-264th nucleotide sequence in SEQ ID NO: 5, respectively.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the monoclonal antibody of the present invention is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. It may have a base sequence that has homology and binds to a base sequence complementary to these base sequences under stringent conditions.
  • the nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the monoclonal antibody of the present invention is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more homologous to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • stringent conditions include, for example, hybridization in a buffer containing 50% formamide, 5 ⁇ SSC, and 1% SDS at 42 ° C., or 5 ⁇ SSC, and 1% SDS at 65 ° C. (Both accompanied by a wash of 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 65 ° C.).
  • the epitope tag targeted by the present invention is at least the amino acid sequence of “Asp-Leu-Xa-Xb-Arg” that is recognized and bound by the monoclonal antibody of the present invention (SEQ ID NO: 1). ) As a minimal recognition sequence.
  • the peptide is preferably water-soluble. The definition of water solubility is as described above.
  • the epitope tag can be suitably used for the antigen-antibody reaction with the monoclonal antibody of the present invention described above.
  • Xa is any one amino acid residue of valine (Val), alanine (Ala), isoleucine (Ile), or threonine (Thr).
  • Xb means any one amino acid residue selected from 19 kinds of protein-constituting amino acid residues other than lysine (Lys).
  • amino acid residues other than Lys 19 kinds of ⁇ amino acids other than Lys constituting the protein (for example, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val) can be mentioned arbitrarily, and is not particularly limited.
  • Xa is preferably Val, Ala, Ile, and Thr, more preferably Val.
  • Asp-Leu-Xa-Xb-Arg is not limited, but examples include Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6), Asp-Leu-Ala-Pro-Arg (SEQ ID NO: 7). ), Asp-Leu-Val-Ala-Arg (SEQ ID NO: 8), and Asp-Leu-Ala-Ala-Arg (SEQ ID NO: 9). Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6) is preferred.
  • the epitope tag targeted by the present invention includes the amino acid sequence X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 (SEQ ID NO: 31) represented by the following formula: Are included as a minimal recognition sequence.
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 and X 5 each mean the following amino acid residues: X 1 : an amino acid residue of any of Asp, Glu or Ser, X 2 : any amino acid residue of Leu, Ile or Met, X 3 : any one amino acid residue of Val, Ala, Ile or Thr, X 4 : any amino acid residue arbitrarily selected from 19 types of protein constituent amino acids other than Lys, X 5: Arg.
  • the amino acid sequence composed of such a combination of amino acid residues includes, but is not limited to, for example, the following amino acid sequences.
  • SEQ ID NO: 34 Asp-Leu-Val-X4-Arg
  • SEQ ID NO: 6 Asp-Leu-Val-Pro-Arg
  • SEQ ID NO: 8 Asp-Leu-Val-Ala-Arg
  • B Asp-Leu-Ala-X4-Arg
  • C Asp-Leu-Ile-X4-Arg
  • D Asp-Leu-Thr-X4-Arg
  • E Asp-Ile-Val-X4-Arg
  • SEQ ID NO: 39 Asp-Met-Val-X4-Arg
  • G Glu-Leu-Val-X4-Arg
  • amino acid sequence minimum recognition sequence
  • amino acid sequence include Asp-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 6).
  • a peptide having these amino acid sequences is represented by “Asp-Leu-Xa- Xb-Arg ”(SEQ ID NO: 1) or“ X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 ”(SEQ ID NO: 31) Good.
  • amino acid sequence as a minimum recognition sequence, as long as it has one or more arbitrary amino acid residues on the N-terminal side and / or C-terminal side of the amino acid sequence It may be.
  • the number of amino acid residues of the peptide constituting the epitope tag is not particularly limited as long as it includes the above-mentioned sequence consisting of 5 amino acid residues.
  • a polypeptide (protein) consisting of more than 50 amino acid residues.
  • it may be in the form of an oligopeptide consisting of 5 to 50 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues is preferably about 5 to 40, more preferably about 7 to 30, further preferably about 7 to 20, and particularly preferably about 7 to 10.
  • Examples of such epitope tags include, but are not limited to, oligopeptides having one or more linker sequences such as Gly or Ser (eg, GS linker sequences) before and after the minimum recognition sequence (N and C terminal sides). Can do.
  • an oligopeptide consisting of the amino acid sequence represented by “Ser-Asp-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser” (SEQ ID NO: 29), and proline (Pro) in the amino acid sequence is alanine (Ala)
  • An oligopeptide consisting of an amino acid sequence substituted with can be exemplified as an example.
  • a GS linker sequence represented by (GGGGS) n (SEQ ID NO: 10) or (GGGS) n (SEQ ID NO: 33) or the like (both of which n represents an integer of 1 to 3) is used.
  • the epitope tag of the present invention includes an oligo or polypeptide that repeats about 2 to 12 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 31 with the above linker sequence in between.
  • the epitope tag is used as a “tag” for modifying a test substance, preferably a peptide (including a polypeptide) (hereinafter collectively referred to as “test peptide”).
  • the test peptide modified with the tag can be detected using as an index the binding with the monoclonal antibody of the present invention that specifically recognizes the tag. That is, the epitope tag of the present invention can be used for interaction analysis, screening, quantification, expression profiling, etc. of a test peptide in combination with the above-described monoclonal antibody of the present invention.
  • the tag fusion peptide can be obtained using the affinity with the monoclonal antibody of the present invention that specifically binds to the tag. It can be isolated and recovered. That is, the epitope tag of the present invention can be used for isolation and recovery, purification, etc. of the test peptide using an antigen-antibody reaction in combination with the monoclonal antibody of the present invention described above.
  • the test peptide (tag fusion peptide) fused with the epitope tag of the present invention can be prepared by genetic engineering.
  • a “fusion peptide expression vector” having a base sequence encoding the epitope tag of the present invention and capable of being expressed in a state where the epitope tag is fused to the end of the test peptide or the like is used.
  • a nucleotide having a base sequence encoding the test peptide is incorporated into the fusion peptide expression vector, and the vector is used in an expression system suitable for the vector to express the tag fusion peptide.
  • the tag fusion peptide thus expressed and produced can be isolated and recovered by an affinity purification method utilizing affinity with the monoclonal antibody of the present invention, as described above.
  • a peptide containing a sequence recognized by an arbitrary protease (protease recognition sequence) between the tag and the test peptide can also be used, and the tag fusion peptide thus prepared is necessary. Accordingly, after purification, the tag and the test peptide are cleaved using the proteolytic enzyme, and the tag and the digested peptide are not digested again using the affinity purification method using the affinity with the monoclonal antibody of the present invention.
  • the test peptide can be isolated and recovered by removing the tag fusion peptide.
  • thrombin and TEV protease can be exemplified as the protease without limitation, but TEV protease can be preferably used from the viewpoint of high specificity.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in an immobilized state on an arbitrary support, and as such a solid-phased antibody, an antibody-immobilized column, an antibody-immobilized bead and an antibody-immobilized chip.
  • Etc. can be exemplified (for example, JP-A-2005-326165).
  • the epitope tag and the monoclonal antibody of the present invention can be used effectively for detecting a test substance.
  • the test substance may be any substance that can bind the epitope tag of the present invention or can be fused with the epitope tag, and preferably includes a peptide (including a polypeptide).
  • the detection method of the present invention is characterized by using the monoclonal antibody of the present invention as a tag antibody of the epitope tag of the present invention.
  • the detection method of the present invention comprises a test substance to which the epitope tag of the present invention is bound or fused and a monoclonal antibody (tag antibody) of the present invention that specifically recognizes and binds to the epitope tag.
  • the test substance is detected using an antigen-antibody reaction and can have the following steps.
  • test substance labeled with an epitope tag a test peptide preferably fused with an epitope tag (hereinafter referred to as “tag fusion peptide”) can be mentioned, and the tag fusion peptide
  • tag fusion peptide a test peptide preferably fused with an epitope tag
  • the conditions employed for the antigen-antibody reaction are not particularly limited as long as the monoclonal antibody of the present invention recognizes and binds to the tag region of the tag fusion protein.
  • the monoclonal antibody of the present invention and the peptide containing its epitope tag react with each other even in cells immobilized with 3.7% formalin.
  • the antigen-antibody reaction can also be carried out under the biological environment conditions in the cell in which the tag fusion protein is expressed, and thus can be applied to expression profiling of a desired protein.
  • the test substance (tag fusion protein) can be detected by an antigen-antibody reaction using the antigen-antibody reaction product to which the tag antibody is bound as an index (immunostaining).
  • the monoclonal antibody of the present invention labeled with a radioactive or non-radioactive isotope, a fluorescent dye, an enzyme, or the like as a tag antibody, the reaction with the labeled product or the labeled product (reaction between the enzyme and the substrate)
  • the antigen-antibody reaction product can be detected using as an index.
  • an immunoglobulin having an Fc region is used as the monoclonal antibody of the present invention
  • a second antibody that recognizes the Fc region is used, and the second antibody and the antigen-antibody reaction product produced by the antigen-antibody reaction are combined.
  • the body can be detected.
  • an antibody labeled with a radioactive or non-radioactive isotope, a fluorescent dye, an enzyme, or the like as the second antibody, the reaction with the labeled product or the labeled product (reaction between the enzyme and the substrate) is used as an index.
  • the antigen-antibody reaction product can be detected.
  • the detection method immunodetection method
  • interaction analysis, screening, quantification, expression profiling and the like of the test protein can be performed.
  • test substance isolation and recovery method (purification method) Further, as described above, the epitope tag and the monoclonal antibody of the present invention can be effectively used for isolation and recovery of a test substance (hereinafter simply referred to as “purification”).
  • the test substance may be any substance that can bind the epitope tag of the present invention or can be fused with the epitope tag, and preferably includes peptides (including polypeptides) and proteins.
  • the purification method of the present invention is characterized by using the monoclonal antibody of the present invention as a tag antibody of the epitope tag of the present invention.
  • the purification method of the present invention comprises a test substance (tag-labeled test substance) to which the epitope tag of the present invention is bound or fused, and the monoclonal of the present invention that specifically recognizes and binds to the epitope tag.
  • a tag-labeled test substance or test substance is isolated and recovered using an antigen-antibody reaction with an antibody (tag antibody), and can have the following steps.
  • a test substance labeled with an epitope tag can preferably include a test peptide (including a polypeptide) (tag fusion peptide) obtained by fusing an epitope tag.
  • the preparation method is as described above.
  • a test sample containing the said test substance the biological sample containing the cell which carries out expression production
  • the conditions employed for the antigen-antibody reaction are not particularly limited as long as the monoclonal antibody of the present invention recognizes and binds to the tag region of the tag fusion peptide, as described above.
  • the antigen-antibody reaction can also be performed under the biological environment conditions in the cell in which the tag fusion peptide is expressed.
  • the desired peptide can be isolated and recovered.
  • the recovery of the test substance is first performed by isolating and recovering from the test sample an antigen-antibody reaction product to which the tag antibody is bound by an antigen-antibody reaction.
  • the tag fusion peptide is separated from the test sample as an antibody-antigen reactant by precipitating it. It can be purified (immunoprecipitation method).
  • the test sample may be previously treated with nonspecific antibodies to remove nonspecifically adsorbed components.
  • the method can be used in a state where the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on an arbitrary support.
  • the solid-phased antibody as described above, an antibody-immobilized column, antibody-immobilized beads, and antibody-immobilized An example of such a chip is disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-326165.
  • a second antibody that recognizes the Fc region is used, and the second antibody is bound to the antigen-antibody reaction product generated by the antigen-antibody reaction. It is also possible to recover the antigen-antibody reaction product (pull-down assay).
  • the method for removing the tag antibody from the antigen-antibody reaction to which the tag antibody is bound is not limited.
  • a tag fusion peptide a sequence that recognizes a protease such as thrombin or TEV protease between the tag and the test peptide.
  • An example is a method in which a peptide in which is added, and after the antigen-antibody reaction, it is excised with the protease.
  • the tag and the peptide are cleaved using a protease such as thrombin or TEV protease, and the affinity purification method using the affinity with the monoclonal antibody of the present invention is used again. Then, the target peptide can be isolated and recovered by removing the tag and the non-digested tag fusion peptide.
  • a protease such as thrombin or TEV protease
  • a desired peptide can be selectively isolated and recovered from, for example, a biological sample in which various peptides coexist.
  • Example 1 Preparation of hybridoma G196 and monoclonal antibody (G196 antibody)
  • G196 antibody monoclonal antibody
  • pGEX-2T vector GE Healthcare Japan
  • GST protein was purified from E. coli lysate containing isopropylthiogalactoside (IPTG) derived GST protein using glutathione agarose beads (Sigma).
  • IPTG isopropylthiogalactoside
  • the purified GST protein was emulsified with Freund's complete adjuvant (DIFCO) and injected subcutaneously into BALB / c mice (8 weeks old, female) to initiate immunization.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • GST protein was emulsified using Freund's incomplete adjuvant (DIFCO) and used for immunization. After a total of 3 immunizations at 2-week intervals, blood was collected and the antibody titer was confirmed by immunoblotting (GST protein was run by SDS-PAGE, bovine serum albumin as a control) using the obtained serum.
  • DIFCO Freund's incomplete adjuvant
  • feeder cells peripheral exudate cells
  • FCS fetal calf serum
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • ICN RPMI1640 medium
  • hybridoma G196 the monoclonal antibody produced by the hybridoma
  • the monoclonal antibody (G196 antibody) produced by the hybridoma G196 prepared above was purified using a protein A column (GE Healthcare Japan). Specifically, the culture supernatant of hybridoma G196 was first purified by filtration through a 0.45 ⁇ m membrane, and the pH was adjusted to 8.0 with 1N NaOH. Next, this was passed through a protein A column, washed with PBS (pH 8), and then the antibody was eluted from the column using a 0.1 M citric acid solution. A purified G196 antibody was prepared and obtained by dialyzing the eluate containing the G196 antibody with PBS.
  • RNA was extracted from the hybridoma G196 obtained in Example 1 above, and then reverse transcribed using an oligo-dT primer to prepare cDNA.
  • cDNA was extracted from the hybridoma G196 obtained in Example 1 above, and then reverse transcribed using an oligo-dT primer to prepare cDNA.
  • PCR is performed using the heavy chain primer set and light chain primer set shown below, nucleotides encoding the heavy chain variable region and amino acid sequences thereof, and nucleotides encoding the light chain variable region and amino acids thereof The sequence was analyzed.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the monoclonal antibody (G196 antibody) produced by the known hybridoma G196 and the base sequence encoding it are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively.
  • the regions of amino acid numbers 18 to 25 and base numbers 52 to 75 correspond to CDR1 of the heavy chain variable region
  • the regions of amino acid numbers 43 to 50 and base numbers 127 to 150 are heavy chains. It corresponds to CDR2 of the variable region
  • the region of amino acid numbers 89 to 97 and base numbers 265 to 291 corresponds to CDR3 of the heavy chain variable region.
  • amino acid sequence of the light chain variable region of the G196 antibody and the base sequence encoding it are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5, respectively.
  • the region of amino acid numbers 18 to 23 and base numbers 52 to 69 corresponds to CDR1 of the light chain variable region
  • the region of amino acid numbers 41 to 43 and base numbers 121 to 129 are light chains.
  • the region corresponds to CDR2 of the variable region
  • the region of amino acid numbers 80 to 88 and base numbers 238 to 264 corresponds to CDR3 of the light chain variable region.
  • E. coli was transformed using the above-described GST fusion protein expression vectors, and each GST fusion protein was purified from the transformed E. coli lysate.
  • the gene product of the pGEX-4T-2 vector (hereinafter referred to as “gene product 4T-2” or simply “4T-2”) is located at the bottom of FIG. 2A on the C-terminal side of GST (display “4T-2”).
  • the gene product of the pGEX-6P-1 vector (hereinafter referred to as “gene product 6P-1” or simply “6P-1”) has the amino acid sequence shown in FIG. 2A has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) shown in the second row from the bottom (display “6P-1”).
  • the presence or absence of recognition binding of the G196 antibody to each purified GST fusion protein was evaluated using Western blotting. The amount of each protein was confirmed by Coomassie staining.
  • FIG. 2B The result is shown in FIG. 2B.
  • the result of “gene product 4T-2” is shown in the leftmost column of FIG. 2B, and the result of “gene product 6P-1” is shown in the second column from the left of FIG. 2B.
  • the G196 antibody recognized the gene product 4T-2 of the pGEX-4T-2 vector but not the gene product 6P-1 of the pGEX-6P-1 vector.
  • the G196 antibody is not the amino acid sequence of GST itself, but the C-terminal side of GST This suggests the possibility of recognizing a linker sequence containing the protease recognition site.
  • a GST fusion protein in which each candidate amino acid sequence was fused was purified from the transformed E. coli lysate.
  • GST fusion protein fused with each candidate amino acid sequence hereinafter simply “6P-12”, “6P-14”, “6P-16”, “6P-15”, “6P-17”, or “6P-19”
  • the amino acid sequence (SEQ ID NOs: 17 to 22) from GST to the C-terminal side is also shown in FIG. 2A including candidate amino acid sequences.
  • the G196 antibody recognizes “6P-15”, “6P-14”, and “6P-12”, but “6P-19”, “6P-17”, and “6P-16” I did not recognize. From this, it was found that the minimum recognition sequence of G196 antibody is “DLVPR” (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 3A The amino acid sequence (SEQ ID NO: 20, 23 to 28) from GST to C-terminal of “6P-29” is shown in FIG. 3A including candidate sequences.
  • FIG. 3B The results of Western blot and Coomassie staining are shown in FIG. 3B. From the right side “6P-29”, “6P-28”, “6P-27”, “6P-26”, “6P-25”, “6P-24”, “6P-15”, “6P-1” and The result of “4T-2” is shown.
  • the G196 antibody recognizes “6P-15”, “6P-26”, and “6P-27”, but “6P-24”, “6P-25”, “6P-28” and “ “6P-29” was not recognized. This revealed that the amino acid residue of “DL_ _R” is important in the minimal recognition sequence “DLVPR” (SEQ ID NO: 6) of the G196 antibody.
  • the Kd value is about 0.4-2 nM, specifically 1.25 ⁇ 0.77 ⁇ 10 ⁇ 9 M (1.25 ⁇ 0.77 nM), and the G196 antibody of the present invention is a peptide having the amino acid sequence of “DLVPR”. It was confirmed to have a high affinity for it.
  • the G196 antibody not only specifically binds to the amino acid sequence of “DLVPR” (SEQ ID NO: 6), but also Asp (D) in the amino acid sequence (DLVPR) is converted to Glu (E) or Ser ( Amino acid sequence substituted with S); amino acid sequence substituted with Leu (L) with Ile (I); amino acid sequence substituted with Val (V) with Ile (I) or Thr (T); 19 types of Pro (P) It was confirmed that all of the amino acid sequences substituted with any of the protein-constituting amino acids were recognized and selectively bound.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 6 A shows the detection result of the epitope tag (FHG and FHG-6P12) by the FLAG (M2) antibody (Sigma), and B shows the detection result of the epitope tag (FHG and FHG-6P12) by the G196 antibody.
  • M2 FLAG
  • G196 antibody can recognize FHG-6P12 expressed in HeLa cells without background and inferior to the existing FLAG (M2) antibody (Sigma). Met. It was also confirmed that the G196 antibody did not recognize the FHG site and selectively recognized the 6P12 site in FHG-6P12.
  • the sample was electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel, and then transferred to a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (Millipore) by a semi-dry method.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • each specific antibody solution is bound to the transfer membrane as a primary antibody, and excess with PBS containing 0.1% Tween-20.
  • the primary antibody was washed off well.
  • a secondary antibody labeled with HRP horseradish peroxidase
  • a fluorescent reagent that emits light when decomposed (Western lightning Chemiluminescence reagent, Perkin Elmer) as a substrate for HRP, it is exposed to X-ray film (Fuji Film) by fluorescence from the target protein band on the transfer film. And detected.
  • the lysate of Escherichia coli is bound to a metal chelate resin (Ni-NTA agarose, Qiagen) that specifically binds to the His tag even under denaturing conditions, and then urea is gradually removed.
  • a metal chelate resin Ni-NTA agarose, Qiagen
  • the amino acid sequence of the obtained 6X His tag fusion protein (G196 (scFv) antibody) is shown in SEQ ID NO: 32.
  • the region of amino acid numbers 22 to 123 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) corresponds to the region of amino acid numbers 7 to 108 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the heavy chain variable region of the monoclonal antibody (IgG) of the present invention.
  • the region of amino acid numbers 148 to 245 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) corresponds to the region of amino acid numbers 1 to 98 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the light chain variable region of the monoclonal antibody (IgG) of the present invention. These regions are linked through a peptide having a GS linker sequence.
  • G196 The amino acid sequence “GS DLVPR GS DLVPR GS DLVPR GS DLVPR GS” (SEQ ID NO: 43) containing three recognition sites “DLVPR” (SEQ ID NO: 6) of the G196 antibody at the C-terminus of Atf1, a transcription factor ATF / CREB protein family (Hereinafter referred to as “G196”) and GFP were fused (Atf1-G196-GFP) and expressed in fission yeast (fission yeast (Atf1-G196-GFP)).
  • Iws1 was fused to the C-terminus of GFP (GFP-Iws1) and expressed in fission yeast (fission yeast (GFP-Iws1)).
  • an HRP-labeled secondary antibody was bound to the transfer membrane, and the excess secondary antibody was thoroughly washed away with PBS containing 0.1% Tween-20.
  • a fluorescent reagent that emits light when decomposed (Western lightning Chemiluminescence reagent, Perkin Elmer) as a substrate for HRP, it is exposed to X-ray film (Fuji Film) by fluorescence from the target protein band on the transfer film. And detected.
  • Atf1 is known to recognize and bind to CREC (TGACGT) (SEQ ID NO: 48) present 300 bp upstream of the tdh1 gene (SPBC32F12.11) encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
  • TGACGT tdh1 gene
  • SPBC32F12.11 tdh1 gene
  • G196 antibody recognizes G196 (GS DLVPR GS DLVPR GS DLVPR GS: (SEQ ID NO: 43)) expressed in the cells of fission yeast (Atf1-G196-GFP) and can immunoprecipitate chromatin. .
  • Fission yeast (Atf1-G196-GFP) and wild type yeast cells were immobilized and permeabilized by the following procedure. 1. Add formaldehyde to a final concentration of 3% to fission yeast (Atf1-G196-GFP) and wild-type yeast that are growing exponentially in YES culture solution (0.5% yeast extract, 3% glucose). 2. After fixation, glycine is added to a final concentration of 250 mM and quenched.
  • the obtained cells were washed with PEMS ′ (PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 , 1.2 M sorbitol), and PEMS ′ (PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 , 1.2 M sorbitol, 5 mg). / ml Zymolyase 20T, 0.1% 2-ME) and leave at room temperature for 60 minutes. Four. This is resuspended in PEM '(PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1% Triton X-100) and left at room temperature for 30 minutes. Five.
  • the obtained cells are washed 3 times with PEM ′ (PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 ). 6. The washed cells are suspended in PEMAL ′ (PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 , 0.1% Na azide, 0.1 M L-lysine HCl, 5% Milk) and left at room temperature for 30 minutes.
  • PEM ′ PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 .
  • the fission yeast (Atf1-G196-GFP) and wild-type yeast cells thus prepared were blocked with PBS containing 5% nonfat dry milk, followed by transmitted light observation, DAPI staining (nuclear staining), and anti-GFP antibody (rabbit (Bio Academia) or immunostaining using G196 antibody as a primary antibody. Immunostaining was performed by reacting an antibody solution with cells and then reacting with Alexa Fluor dye-labeled secondary antibody (Molecular Probes). After DAPI staining (nuclear staining) or immunostaining, the cells were fixed on a slide glass using an embedding buffer (Vector Laboratories) and then observed with a confocal laser microscope (Olympus).
  • the G196 antibody is comparable to the existing anti-GFP antibody and has a low background.
  • Atf1-G196-GFP protein expressed in fermenting yeast (Atf1-G196-GFP) It was possible to recognize and immunostain.
  • SEQ ID NOs: 1, 6-9, 31, 34-41 are the amino acid sequences of the epitope region (minimum recognition sequence) recognized by the monoclonal antibody G196 of the present invention
  • SEQ ID NOs: 10 and 33 are the unit region of the GS linker sequence
  • SEQ ID NOs: 11 to 14 are primer base sequences
  • SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of the gene product of the pGEX-4T-2 vector
  • SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence of the gene product of the pGEX-6P-1 vector
  • SEQ ID NO: 17 to 28 are amino acid sequences of peptides in the C-terminal region fused to GST of the GST fusion protein:
  • SEQ ID NOs: 29 to 30, 42 and 43 are peptides containing an epitope region (minimum recognition sequence) recognized by the monoclonal antibody G196 of the present invention
  • SEQ ID NOs: 44 to 47 represent the nucleotide sequences of primers used for quantitative PCR in the

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Abstract

タグ抗体として、ウエスタンブロット法、免疫沈殿法、クロマチン免疫沈降法及び免疫染色法など、抗原抗体反応を用いた免疫検出法に広く使用できる新規モノクローナル抗体を提供する。 配列番号１に示すアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドまたはタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、 配列番号２に示す１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに 配列番号３に示す１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４１～４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８０～８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域 を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。

Description

新規モノクローナル抗体、及びそのタグ抗体としての利用
　本発明は、新規モノクローナル抗体に関する。より詳細には、タグ抗体として、ウエスタンブロット法、免疫沈殿法、クロマチン免疫沈降法及び免疫染色法など、抗原抗体反応を用いた免疫検出法に広く使用できる新規モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、当該モノクローナル抗体、及びそのエピトープをタグとして用いた、免疫検出法に関する。
　従来より、複数のタンパク質が混在する被験試料の中から所望のタンパク質のみを検出または分離精製するために、タグと呼ばれるオリゴペプチドが使用されている。具体的には、例えば細胞培養系で得られるタンパク質を簡便且つ高純度に検出したり精製する方法として、目的タンパク質を標識となるオリゴペプチド（標識ペプチド）との融合タンパク質として発現させ、当該標識ペプチドを特異的に認識し結合するアフィニティー分子（抗体を含む）を用いて、融合タンパク質を検出し精製する技術が知られている。
　ここで標識となるオリゴペプチド（標識ペプチド）は、「アフィニティータグ」または前述するよう単に「タグ（Tag）」と称され、中でもアフィニティー分子（抗体）との抗原抗体反応を利用して用いられるタグを「エピトープタグ」という。
　標識ペプチドとして、従来からFLAGタグ、3XFLAGタグ、HAペプチド、3XHAペプチド、mycペプチド、6XHisタグ、GSTポリペプチド、MBPポリペプチド、PDZドメインポリペプチド、TAP（Tandem Affinity Purification）ペプチド、アルカリフォスファターゼ、及びアジビン等が知られている。これらの標識ペプチドは、通常目的のタンパク質のN末端またはC末端に融合して用いられるが、場合によっては目的のタンパク質内に挿入して使用される場合もある。しかし、いずれにしても、これらの標識ペプチドを、免疫検出法においてアフィニティータグとして有効に機能させるためには、当該標識ペプチドを特異的に認識し、それと選択的に結合するタグ抗体の使用が不可欠である。
特開2005-326165号公報
「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、89頁（1986年） Galfre, G. and Milstein, C.: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol., 73: 3-46, 1981
　本発明は新規なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。より詳細には、特定のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識し結合するタグ抗体として有効に用いられるモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
　また本発明は、上記ペプチドをエピトープタグとし、本発明のモノクローナル抗体をそのタグ抗体として用いることを特徴とする免疫検出法を提供することを目的とする。
発明が解決するための手段
　本発明者らは、日本住血吸虫グルタチオンSトランスフェラーゼ（以下、「GST」という）を認識する抗体を作製すべく、GST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-2T（GEヘルスケア・ジャパン社）の遺伝子産物をマウスに免疫してハイブリドーマG196を作製し、当該ハイブリドーマG196からモノクローナル抗体（以下、これを「G196抗体」ともいう）を調製したところ、当該G196抗体は、GSTを発現するGST融合タンパク質発現用ベクターの遺伝子産物のすべてを認識できるものではなく、GST融合タンパク質発現用ベクターの遺伝子産物の一部を特異的に認識することを見出した。
　かかる知見に基づいて、当該モノクローナル抗体（G196抗体）が認識するエピトープ領域を検討したところ、当該モノクローナル抗体は、GST融合タンパク質発現用ベクターの遺伝子産物のアミノ酸配列において、GSTのアミノ酸配列ではなく、その末端側に結合したプロテアーゼ認識部位を含むリンカー配列中の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（配列番号１）（配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）を特異的に認識することを確認した。
　本発明者らは、かかる知見に基づき、上記モノクローナル抗体（G196抗体）が、上記「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」のアミノ酸配列を有するペプチドを「エピトープタグ」として、タグ抗体として用いることができると考え、なかでも水溶性である上記ペプチドは、分子生物学的研究において頻繁に使用される免疫検出法、具体的にはウエスタンブロット法、免役沈降法、クロマチン免疫沈降法及び細胞染色法等に広く適用できることを確認した。
　本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであって、下記の実施形態を包含するものである。
　（Ｉ）モノクローナル抗体及びその製造方法
（I-1）下記に示すアミノ酸配列：
　Asp-Leu-Xa-Xb-Arg（配列番号１）
（配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）
で示されるアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
配列番号２に示す１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号３に示す１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４１～４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８０～８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
　（I-2）上記モノクローナル抗体が、配列番号１中、Xaで示されるアミノ酸残基がバリン残基（Val）であるアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合する抗体である、（I-1）記載のモノクローナル抗体。
　（I-3）配列番号６に示すアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体である、（I-1）または（I-2）記載のモノクローナル抗体。
　（I-4）上記モノクローナル抗体が、配列番号２に記載するアミノ酸配列またはそれと８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３に記載するアミノ酸配列またはそれと８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むものである、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
　（I-5）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応速度定数（Kd値）が０.１～１０ｎＭ、好ましくは０．１～５ｎＭ、より好ましくは０．１～２ｎＭである、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
　（I-6）マウスに由来する免疫グロブリンＧ（IgG）またはその抗原結合断片である、（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
　（I-7）抗体クラスがIgG1またはIgG2である、（I-5）に記載するモノクローナル抗体。
　（I-8）抗体クラスがIgG1κである、（I-5）に記載するモノクローナル抗体。
　（I-9）上記抗原結合断片がscFv（リンカー配列を有するペプチドで連結されたＶＨ－ＶＬヘテロ二量体）である、（I-5）に記載するモノクローナル抗体。
　（I-10）上記scFvが、配列番号２に示す１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）のペプチドと、配列番号３に示す１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４１～４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８０～８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）のペプチドとが、リンカー配列を有するペプチドを介して連結されてなるものである（I-9）に記載するモノクローナル抗体。
　（I-11）上記scFvが、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するものである、（I-10）に記載するモノクローナル抗体。
　（I-12）「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（配列番号１）
（配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）
で示されるアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドからなるエピトープタグに対するタグ抗体として用いられる、（I-1）乃至（I-11）のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
　（I-13）下式に示すアミノ酸配列を含むペプチドからなるエピトープタグに対するタグ抗体として用いられる、（I-1）乃至（I-12）のいずれかに記載するモノクローナル抗体：
　Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５（配列番号３１）
（式中、Ｘ１はAsp、GluまたはSer；Ｘ２はLeu、IleまたはMet；Ｘ３はVal、Ala、IleまたはThr；Ｘ４はLys以外の19種のタンパク質構成アミノ酸から選択されるいずれかのアミノ酸残基；Ｘ５はArgを、それぞれ示す。）。
　（I-14）GST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-2T（GEヘルスケア・ジャパン社）の遺伝子産物を抗原（免疫抗原）として用いて非ヒト動物を免疫する工程を有することを特徴とする、（I-1）乃至（I-13）のいずれかに記載するモノクローナル抗体の製造方法。
　（I-15）非ヒト動物がマウスである、（I-14）に記載する製造方法。
　（I-16）（I-1）乃至（I-15）のいずれかに記載するモノクローナル抗体をコードする遺伝子であって、
配列番号４に示す塩基配列または当該塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列として、また
配列番号５に示す塩基配列または当該塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列として
含むことを特徴とする、上記遺伝子。
　（II）エピトープタグ、及びそれを含有する融合タンパク質の製造方法
（II-1）（I-1）乃至（I-11）のいずれかに記載するモノクローナル抗体との抗原抗体反応に使用されるエピトープタグであって、
「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（配列番号１）
（配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）
で示されるアミノ酸配列をエピトープ領域（最小認識配列）として含むペプチドからなるものである、上記エピトープタグ。
（II-2）上記エピトープタグが、配列番号１中、Xaで示されるアミノ酸残基がバリン残基（Val）であるアミノ酸配列を含むペプチドからなるものである、（II-1）記載のエピトープタグ。
（II-3）（I-1）乃至（I-11）のいずれかに記載するモノクローナル抗体との抗原抗体反応に使用されるエピトープタグであって、
下式に示すアミノ酸配列を含むペプチドからなるエピトープタグ：
　Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５（配列番号３１）
（式中、Ｘ１はAsp、GluまたはSer；Ｘ２はLeu、IleまたはMet；Ｘ３はVal、Ala、IleまたはThr；Ｘ４はLys以外の19種のタンパク質構成アミノ酸から選択されるいずれかのアミノ酸残基；Ｘ５はArgを、それぞれ示す。）。
　（II-4）上記エピトープタグが、配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号３１に示すアミノ酸配列のＮ及び／またはＣ末端側に、Gly、Serまたはこれらから選択されるいずれか少なくとも１種のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を結合してなるオリゴペプチドである、（II-1）乃至（II-3）のいずれかに記載するエピトープタグ。
　（II-5）上記Gly及びSerから選択されるいずれか少なくとも１種のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列がＧＳリンカー配列である、（II-4）に記載するエピトープタグ。
　（II-6）上記オリゴペプチドがアミノ酸残基数７～４０、好ましくは７～３０、より好ましくは７～２０、特に好ましくは７～１０からなるものである、（II-4）または（II-5）に記載するエピトープタグ。
　（II-7）水溶性であることを特徴とする、（II-1）乃至（II-6）のいずれかに記載するエピトープタグ。
　なお、ここで水溶性であるとは、日本薬局方第１６改正の規定に基づいて、溶質１ｇを溶解するために必要な水の量が３０ｍＬ未満であることを意味する（やや溶けやすい～極めて溶けやすい）。好ましくは、溶質１ｇを溶解するために必要な水の量が１０ｍＬ未満（溶けやすい～極めて溶けやすい）であり、また溶質１ｇを溶解するために必要な水の量が１ｍＬ未満であってもよい（極めて溶けやすい）。
　（II-8）上記エピトープタグをコードする塩基配列が標的ペプチドをコードする塩基配列に人工的に結合されてなるＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換する工程、及び当該工程で得られた形質転換体を培養する工程を有する、上記エピトープタグを融合してなるペプチド（タグ融合ペプチド）の製造方法。
　（III）被験物質の検出方法
（III-1）下記の工程を有する被験物質の検出方法：
（1）（I-1）乃至（I-13）のいずれかに記載するモノクローナル抗体をタグ抗体として用いて、（II-1）乃至（II-7）のいずれかに記載するエピトープタグで標識してなる被験物質と抗原抗体反応を行う工程、
（2）タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を指標として、被験物質を検出する工程。
　（III-2）上記エピトープタグで標識してなる被験物質が、（II-8）に記載する方法で製造されてなるタグ融合ペプチドである、（III-1）記載の検出方法。
　（IV）被験物質の単離又は回収方法
（IV-1）下記の工程を有する、被験試料の中から被験物質を単離または回収する方法：
（1）（II-1）乃至（II-7）のいずれかに記載するエピトープタグで標識してなる被験物質を含有する被験試料と、（I-1）乃至（I-13）のいずれかに記載するモノクローナル抗体をタグ抗体として反応させる工程、
（2）上記タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を被験試料から単離または回収する工程、
（3）タグ抗体が結合した抗原抗体反応物からタグ抗体を除去し、被験物質を回収する工程、及び
（4）必要に応じて、エピトープタグで標識してなる被験物質からエピトープタグを除去する工程。
　（IV-2）上記エピトープタグで標識してなる被験物質が、（II-8）に記載する方法で製造されてなるタグ融合ペプチドである、（IV-1）記載の方法。
　本発明によれば、タグ抗体として、ウエスタンブロット法、免疫沈殿法、クロマチン免疫沈降法及び免疫染色法など、抗原抗体反応を用いた免疫検出法に広く使用できる新規モノクローナル抗体を提供することができる。より詳細には、本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（配列番号１）（XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）に示すアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドを特異的に認識し結合することができるため、当該ペプチドをエピトープタグとして、ウエスタンブロット法、免疫沈殿法、クロマチン免疫沈降法及び免疫染色法など、抗原抗体反応を用いた免疫検出法に広く応用可能である。
本発明のモノクローナル抗体（G196抗体）の製造に際して、免疫抗原として使用したpGEX-2Tベクター（GEヘルスケア・ジャパン社）のベクターマップを示す。 実験例２（１）及び（２）（2-1）において、Ａ：本発明のモノクローナル抗体（G196抗体）の認識部位の同定に使用したGST融合タンパク質発現用ベクター（pGEX-4T-2ベクター、pGEX-6P-1ベクター）の遺伝子産物（4T-2、6P-1）のGSTに融合したペプチドのアミノ酸配列、及びエピトープの候補アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを導入したpGEX-6P-1ベクターの遺伝子産物（6P-12、6P-14、6P-16、6P-15、6P-17、6P-19）のGSTに融合したペプチドのアミノ酸配列を示す。Ｂ：上記各遺伝子産物に対するG196抗体の結合反応をウエスタンブロット法で測定した結果、及び各遺伝子産物のタンパク量をクマシー染色により測定した結果を示す。 実験例２（２）（2-2）において、Ａ： GST融合タンパク質発現用ベクター（pGEX-4T-2ベクター、pGEX-6P-1ベクター）の遺伝子産物（4T-2、6P-1）のGSTに融合したポリペプチドのアミノ酸配列、及びG196抗体のエピトープの同定に使用した最小認識部位の候補アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを導入したpGEX-6P-1ベクターの遺伝子産物（6P-15、6P-24、6P-25、6P-26、6P-27、6P-28、6P-29）のGSTに融合したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。Ｂ：上記各遺伝子産物に対するG196抗体の結合反応をウエスタンブロット法で測定した結果、及び各遺伝子産物のタンパク量をクマシー染色により測定した結果を示す。 実験例３において、実施例１で作製した本発明のモノクローナル抗体（G196抗体）の、合成ペプチド（GSDLVPRGSC：配列番号３１）との結合性を、等温滴定カロリーメータを用いて測定した結果を示す。 実験例４において、実施例１で作製したG196抗体と結合するペプチドのアミノ酸配列を、酵素結合免疫吸着法（ELISA）により調べた結果を示す。 実験例５（１）において、FLAG-HA-EGFP（FHG）を発現するHeLa細胞、及びFHG-6P12を発現するHeLa細胞の細胞溶解液に対して、タグ抗体として「FLAG(M2)抗体（Sigma社）」（図Ａ）及び本発明の「G196抗体」（図Ｂ）を用いてウエスタンブロット法を行った結果を示す。 実験例５（２）において、FHGを発現するHeLa細胞、及びFHG-6P12を発現するHeLa細胞の細胞溶解液について、タグ抗体として「FLAG(M2)抗体（Sigma社）」及び本発明の「G196抗体」を用いて免疫沈降法を行った結果を示す。 実験例５（２）において、HeLa細胞に「FHG」（図Ａ）または「FHG-6P12」（図Ｂ）をそれぞれ導入し、抗体として「GFP抗体」及び本発明の「G196抗体」を用いて免疫染色を行った結果を示す。 実験例６（２）において、実施例１で調製したG196抗体、及び実験例６（１）で調製したG196（scFv）抗体をそれぞれ用いて、免疫沈降法により、FHG及びFHG-6P12に対する結合性を評価した結果を示す。 実験例７（１）において、タグ抗体として、本発明のG196抗体（上段の泳動像）及び抗GFP抗体（下段の泳動像）を用いて、（図の左から）野生型酵母、Atf1-G196-GFPタンパク質を発現させた分裂酵母、及びGFP-Iws1タンパク質を発現させた分裂酵母の細胞溶解液に対して、ウエスタンブロットを行った結果を示す。 実験例７（２）において、タグ抗体として、本発明のG196抗体を用いて、（図の左から）野生型酵母、及びAtf1-G196-GFPタンパク質を発現させた分裂酵母のそれぞれの細胞溶解液に対して、クロマチン免疫沈降法を行った結果を示す。 実験例７（３）において、野生型酵母、及びAtf1-G196-GFPタンパク質を発現させた分裂酵母について、透過光観察、DAPI染色（核染色）、及び抗GFP抗体（ウサギ）（バイオアカデミア社）またはG196抗体を一次抗体とした免疫染色を行った結果を示す。
Ｉ．本発明で使用する用語の定義
　本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
　また本明細書中において「ペプチド」とは、特に言及しない限り、５以上のアミノ酸がペプチド結合により連結してなるペプチドを意味し、アミノ酸残基数が５０以下のオリゴペプチド、及びアミノ酸残基数５０より多いポリペプチド（タンパク質を含む）がいずれも含まれる。また糖が結合してなる糖ペプチド（糖タンパク質）も本発明が対象とするペプチドに含まれる。
　また本明細書中において「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である。当該集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在しえる天然に生じる突然変異を除いて同一である。さらに、モノクローナル抗体は、特定の抗原性部位に対して特異的であることを特徴とする。モノクローナル抗体は、抗原ペプチド中の単一の抗原決定基を特異的に認識する点で、種々異なる抗原決定基（エピトープ）を認識する抗体の集合物であるポリクローナル抗体とは区別することができる。
　II．モノクローナル抗体
　本発明が対象とするモノクローナル抗体は、「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」のアミノ酸配列（配列番号１）をエピトープ領域として含むペプチドを特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体である。
　エピトープ領域に相当する上記アミノ酸配列（配列番号１）において、Xaは、バリン（Val）、アラニン（Ala）、イソロイシン（Ile）またはスレオニン（Thr）のいずれか一つのアミノ酸残基であり、またXbは、リジン（Lys）以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。
　ここでLys以外のアミノ酸残基としては、タンパク質を構成するLys以外の19種のαアミノ酸（例えば、Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val）を任意に挙げることができ、特に制限されない。
　Xaとして好ましくはVal, Ala，Ile, 及びThrであり、より好ましくはValである。
　「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」の配列として、制限されないものの、一例として、Asp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）、Asp-Leu-Ala-Pro-Arg（配列番号７）、Asp-Leu-Val-Ala-Arg（配列番号８）、及びAsp-Leu-Ala-Ala-Arg（配列番号９）を挙げることができる。好ましくはAsp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）である。
　これらのアミノ酸配列を有するペプチドは、「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、少なくとも当該アミノ酸配列をエピトープ領域として有するものであれば、その限りにおいて、また上記アミノ酸配列のＮ末端側及び／またはＣ末端側に任意に１乃至複数の任意のアミノ酸残基を有するものであってもよい。
　当該ペプチドを、エピトープタグとして用いる場合、そのアミノ酸残基数としては、上記５アミノ酸残基からなる配列を含むものである限り、特に制限はされず、５０より多いアミノ酸残基からなるポリペプチド（タンパク質）の形態にしてもよいし、また５～５０のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドの形態にしてもよい。
　オリゴペプチドの形態に設計する場合、そのアミノ酸残基数としては、好ましくは５～４０程度、より好ましくは７～３０程度、さらに好ましくは７～２０程度、特に好ましくは７～１０程度を挙げることができる。かかるエピトープタグとしては、制限されないが、上記エピトープ領域（最小認識配列）の前後（Ｎ及びＣ末端側）に１または複数のGlyあるいはSerなどのリンカー配列（例えば、後述するGSリンカー配列）を有するオリゴペプチドを例示することができる。かかるエピトープタグとして、「Ser-Asp-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser」（配列番号２９）で示すアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、及び当該アミノ酸配列においてプロニン（Pro）をアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを一例として例示することができる。また上記リンカー配列としては、（GGGGS）n（配列番号１０）または（GGGS）n（配列番号３３）等で示されるＧＳリンカー配列（いずれも、ｎは１～３の整数を意味する）を用いることもできる。
　本発明が対象とするモノクローナル抗体は、少なくとも配列番号２に記載する１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１（相補性決定領域１）、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２（相補性決定領域２）、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含む重鎖可変領域；並びに配列番号３に記載する１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１（相補性決定領域１）、４１～４３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２（相補性決定領域２）、及び８０～８８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含む軽鎖可変領域；を有することを特徴とする免疫グロブリンまたはその抗原結合断片である。
　当該免疫グロブリンまたはその抗原結合断片には、少なくとも配列番号２に記載するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および配列番号３に記載するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する免疫グロブリンまたはその抗原結合断片が含まれる。ここで免疫グロブリンは、哺乳動物に由来するものであれば、特に制限されず、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、サル、ヒト、ヤギなどに由来する免疫グロブリンを挙げることができるが、好ましくはマウスやラット等のげっ歯類、より好ましくはマウスに由来する免疫グロブリンＧ（IgG）であり、そのサブクラスとしてはIgG1及びIgG2を例示することができる。
　なお、当該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、前述するエピトープ領域に対する特異的な結合性が損なわれない限り、それらのアミノ酸配列の任意のアミノ酸残基が、１または複数個、置換、欠失または付加されていてもよい。かかる重鎖可変領域（改変された重鎖可変領域）としては、配列番号２に記載するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものを例示することができ、また軽鎖可変領域（改変された軽鎖可変領域）としては、配列番号３に記載するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものを例示することができる。改変された重鎖可変領域として、より好ましくは重鎖可変領域（配列番号２）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３以外の領域のアミノ酸残基が、１または複数個、置換、欠失または付加されており、配列番号２に記載する上記領域に対応するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものである。ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３以外の領域としては、免疫グロブリンの重鎖可変領域のフレームワーク領域（以下、単に「ＦＲ」ともいう)を挙げることができる。つまり、改変された重鎖可変領域として、そのＦＲ領域のアミノ酸配列のアミノ酸残基が１または複数個、置換、欠失または付加され、その結果、配列番号２に記載するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる領域を挙げることができる。当該ＦＲ領域（重鎖可変領域のＦＲ領域［FR1～4］）のアミノ酸配列には、ヒト由来のアミノ酸配列またはその変異体が含まれる。つまり、本発明のモノクローナル抗体には、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列として、それぞれ配列番号２に記載する１８～２５番目のアミノ酸配列、４３～５０番目のアミノ酸配列、及び８９～９７番目のアミノ酸配列を有し、且つ重鎖可変領域のＦＲ１～４のアミノ酸配列として、ヒト由来の重鎖可変領域のＦＲ１～４のアミノ酸配列を有するヒト型化抗体が含まれる。完全ヒト型化抗体のＦＲまたは準領域の配列は、例えばＮＣＢＩのウエブサイトに収載されているので、適宜参照することができる。
　また改変された軽鎖可変領域としてより好ましくは、軽鎖可変領域（配列番号３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３以外の領域のアミノ酸残基が、１または複数個、置換、欠失または付加されており、配列番号３に記載する上記領域に対応するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものである。ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３以外の領域としては、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のフレームワーク領域（以下、単に「ＦＲ」ともいう)を挙げることができる。つまり、改変された軽鎖可変領域として、そのＦＲ領域のアミノ酸配列のアミノ酸残基が１または複数個、置換、欠失または付加され、その結果、配列番号３に記載するアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる領域を挙げることができる。当該ＦＲ領域（軽鎖可変領域のＦＲ領域［FR1～4］）のアミノ酸配列には、ヒト由来のアミノ酸配列またはその変異体が含まれる。つまり、本発明のモノクローナル抗体には、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列として、それぞれ配列番号３に記載する１８～２３番目のアミノ酸配列、４１～４３番目のアミノ酸配列、及び８０～８８番目のアミノ酸配列を有し、且つ軽鎖可変領域のＦＲ１～４のアミノ酸配列として、ヒト由来の軽鎖可変領域のＦＲ１～４のアミノ酸配列を有するヒト型化抗体が含まれる。完全ヒト型化抗体のＦＲまたは準領域の配列は、前述するように、例えばＮＣＢＩのウエブサイトに収載されているので、適宜参照することができる。
　本発明のモノクローナル抗体は、免疫グロブリン（IgG）そのものであってもよいし、その抗原結合断片であってもよい。抗原結合断片としては、免疫グロブリン（IgG）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域からなる可変領域断片（Fv）、当該領域を含むFab、Fab’、 F（ab’）2、及びscFvを例示することができる。
　ここでscFvとしては、例えば、配列番号２に示す１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）のペプチドと、配列番号３に示す１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４１～４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８０～８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）のペプチドとが、リンカー配列（例えば、前述するＧＳリンカー配列）を有するペプチドを介して連結させてなるリコンビナントタンパク質を例示することができる。なお、上記重鎖可変領域（ＶＨ）のペプチドには、配列番号２に記載するアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。また上記軽鎖可変領域（ＶＬ）のペプチドには、配列番号３に記載するアミノ酸配列または当該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のペプチドが含まれる。
　当該scFVにおける重鎖可変領域（ＶＨ）のペプチドと軽鎖可変領域（ＶＬ）のペプチドの位置は、特に制限なく、ＶＨ-「リンカーペプチド」-ＶＬであっても、またＶＬ-「リンカーペプチド」-ＶＨであってもよい。前者ＶＨ-「リンカーペプチド」-ＶＬの一例として実験例６で作製したモノクローナル抗体（G196(scFv)抗体）を挙げることができる。当該モノクローナル抗体（G196(scFv)抗体）のアミノ酸配列（配列番号３２）のアミノ酸番号２２～１２３領域は、本発明モノクローナル抗体（IgG）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号７～１０８の領域（CDR1:18-25、CDR2:43-50、CDR3：89-97）に相当し、当該アミノ酸配列（配列番号３２）のアミノ酸番号１４８～２４５の領域が、本発明モノクローナル抗体（IgG）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号１～９８の領域（CDR1:18-23、CDR2:41-43、CDR3：80-88）に相当し、これらの領域が、ＧＳリンカー配列を有するペプチドを介して結合してなる構造を有している。なお、配列番号３２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１～２１の領域は、実験例６でモノクローナル抗体（G196(scFv)抗体）の作製に使用したpET28-His-TEVベクター（Novagen社のpET28を改変）に由来するHis-TEV配列に相当する。
　なお、本発明のモノクローナル抗体の上記エピトープ領域への結合性は、上記「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（Xa及びXbは前述の通り）のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を評価することで判断することができる。評価方法としては、制限されないが、好ましくは、実験例２（２）（2-2）に記載するウエスタンブロット法を用いたアラニンスキャン、実験例３に示すような等温カロリメータを用いる方法、または実験例４に示すような酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いる方法を挙げることができる。
　実験例２及び４に示すように、本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（Xa及びXbは前述の通り）のアミノ酸配列を有するペプチドに対して結合性を有し、当該アミノ酸配列において、例えば少なくとも１番目のアミノ酸残基（Asp）を、例えばAsp、Glu、Gly、Gln及びSer以外のタンパク質構成アミノ酸残基に置換した場合；２番目のアミノ酸残基（Leu）を例えばLeu、Phe、His、Ile、Met及びAsn以外のタンパク質構成アミノ酸残基に置換した場合；３番目のアミノ酸残基（Xa）を例えばVal、Ala、Ile、Ser及びThr以外のタンパク質構成アミノ酸残基に置換した場合；４番目のアミノ酸残基（Xb）を例えばLysに置換した場合；及び５番目のアミノ酸残基（Arg）を例えばLys及びHis以外のタンパク質構成アミノ酸残基に置換した場合に、当該アミノ酸配列からなるペプチドに対して結合性が消失するか、または結合性が著しく低下する。
　本発明のモノクローナル抗体の「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（Xa及びXbは前述の通り）のアミノ酸配列を有するペプチドに対する反応速度定数（Kd値）は特に制限されないが、例えば、配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応速度定数（Kd値）として、０.１～１０ｎＭ、好ましくは０．１～５ｎＭ、より好ましくは０．１～２ｎＭを挙げることができる。
　本発明のモノクローナル抗体は、実施例１で説明するように、GST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-2T（GEヘルスケア・ジャパン社）の遺伝子産物を免疫抗原として用いて非ヒト動物を免疫する工程を有する、モノクローナル抗体の作製方法に従って製造することができる。pGEX-2Tベクターのベクターマップを図１に示す。
　pGEX-2Tベクターの遺伝子産物で免疫するための非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるが、好ましくはマウスやラットなどのげっ歯類であり、より好ましくはマウスである。免疫に際しての粘液源の投与経路は、特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内などのいずれの経路でも投与することができる。具体的には、例えばBALB/cマウスにpGEX-2Tベクターの遺伝子産物を、アジュバンドとともに、数日～数週間毎に１～数回接種する。pGEX-2Tベクターの遺伝子産物で免疫されたマウスより脾臓を摘出し、遠心分離により抗体産生細胞（脾臓細胞）を得る。この細胞は増殖能が無いので、自己増殖能を有する細胞と融合させる。自己増殖能を有する細胞としてはミエローマ細胞等のリンパ球様細胞が特に好ましい。ミエローマ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を分泌しないものを選択するのが好ましい。かかるミエローマ細胞としては、例えばマウスミエローマ細胞P3/NSI/1-Ag4-1（ATCC TIB-18）、Sp2/O-Ag14（ATCC CRL-1581）、P3X63Ag8U.1（ATCC CRL-1597）などが挙げられる。抗体産生細胞とミエローマ細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれら細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）で処理することにより実施できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数比で約１：１～１０：１とするのが好ましい。
　得られた融合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を増殖させ、各ウェルにおいて産生される抗体を、例えばpGEX-2Tベクターの遺伝子産物（例えば、pGEX-2Tベクター由来の精製GSTタンパク質）を用いたELISA法において試験し、さらに必要に応じて、Asp-Leu-Xa-Xb-Arg（配列番号１）、好ましくはAsp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）を有するペプチドを用いたELISA法によって、当該ペプチドとの反応性を調べ、その結果から所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択する。なお、上記ペプチドを用いたELISA法は、例えば、上記ペプチドをアルキレンジアルデヒドおよび塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマーの存在下に固相化させてアッセイプレートを調製し、このアッセイプレートを用いて、上記融合細胞が産生する抗体をELISA法で試験し、当該ペプチドに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法を用いることもできる。
　本発明のモノクローナル抗体は、上記において選択されたハイブリドーマを適当な培地を用いて培養して得られる培養上清から常法（例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィー等）により容易に取得することができる。また、上記ハイブリドーマを適当な哺乳動物（例えば、マウス等）の腹腔内に接種し、ハイブリドーマ細胞を増殖させた後、当該哺乳動物の腹水、血清等から所望のモノクローナル抗体を採取することもできる。
　得られたモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、抗原結合断片として断片化して使用することもできる。抗原結合断片としては、Fv、F（ab’）2、Fab’、Fab、scFv等の各種フラグメントで、Asp-Leu-Xa-Xb-Arg（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドへの特異的結合活性が失われていないものであればよい。これら活性フラグメントの調製は、精製モノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することで行うことができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、89頁（1986年）参照）。
　また本発明のモノクローナル抗体は、上記方法のほか、モノクローナル抗体のアミノ酸配列を参考にしてアミノ酸合成により調製する方法、並びにモノクローナル抗体をコードする遺伝子の塩基配列を参考にして遺伝子工学的手法により調製する方法によっても調製することができる。
　本発明のモノクローナル抗体の重鎖可変領域（配列番号２）をコードする塩基配列を配列番号４に、また軽鎖可変領域（配列番号３）をコードする塩基配列を配列番号５に示す。また重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする塩基配列は、配列番号４中、それぞれ５２～７５番目の塩基配列、１２７～１５０番目の塩基配列、及び２６５～２９１番目の塩基配列である。軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする塩基配列は、配列番号５中、それぞれ５２～６９番目の塩基配列、１２１～１２９番目の塩基配列、及び２３８～２６４番目の塩基配列である。
　なお、本発明のモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列は、配列番号４の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、ストリンジェントな条件でこれらの塩基配列と相補的な塩基配列に結合する塩基配列を有するものであってもよい。また本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列は、配列番号５の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、ストリンジェントな条件で当該塩基配列と相補的な塩基配列に結合する塩基配列を有するものであってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダーゼーション、または６５℃での５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダーゼーション（いずれも６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄を伴う）を挙げることができる。
　III.エピトープタグ、及びその利用
　本発明が対象とするエピトープタグは、上記本発明のモノクローナル抗体が認識し、結合する、少なくとも「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」のアミノ酸配列（配列番号１）を最小認識配列として含むペプチドである。当該ペプチドは、水溶性であることが好ましい。なお、水溶性の定義は、前述した通りである。
当該エピトープタグは、前述する本発明のモノクローナル抗体との抗原抗体反応に好適に使用することができる。
　ここで、前述するように、上記アミノ酸配列（配列番号１）において、Xaは、バリン（Val）、アラニン（Ala）、イソロイシン（Ile）またはスレオニン（Thr）のいずれか一つのアミノ酸残基であり、またXbは、リジン（Lys）以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。
　ここでLys以外のアミノ酸残基としては、タンパク質を構成するLys以外の19種のαアミノ酸（例えば、Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val）を任意に挙げることができ、特に制限されない。
　Xaとして好ましくはVal, Ala，Ile, 及びThrであり、より好ましくはValである。
　「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」の配列として、制限されないものの、一例として、Asp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）、Asp-Leu-Ala-Pro-Arg（配列番号７）、Asp-Leu-Val-Ala-Arg（配列番号８）、及びAsp-Leu-Ala-Ala-Arg（配列番号９）を挙げることができる。好ましくはAsp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）である。
　また本発明が対象とするエピトープタグには、下式で示されるアミノ酸配列
　Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５（配列番号３１）
を最小認識配列として含むペプチドが含まれる。
　これらの配列中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５はそれぞれ下記のアミノ酸残基を意味する：
Ｘ１：Asp、GluまたはSerのいずれかのアミノ酸残基、
Ｘ２：Leu、IleまたはMetのいずれかのアミノ酸残基、
Ｘ３：Val、Ala、IleまたはThrのいずれかのアミノ酸残基、
Ｘ４：Lys以外の19種のタンパク質構成アミノ酸のうち任意に選択されるいずれかのアミノ酸残基、
Ｘ５：Arg。
　かかるアミノ酸残基の組み合わせからなるアミノ酸配列としては、制限はされないものの、例えば下記のアミノ酸配列が含まれる。
（a）Asp-Leu-Val-X4-Arg（配列番号３４）、例えばAsp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）、Asp-Leu-Val-Ala-Arg（配列番号８）、
（b）Asp-Leu-Ala-X4-Arg（配列番号３５）
（c）Asp-Leu-Ile-X4-Arg（配列番号３６）
（d）Asp-Leu-Thr-X4-Arg（配列番号３７）
（e）Asp-Ile-Val-X4-Arg（配列番号３８）
（f）Asp-Met-Val-X4-Arg（配列番号３９）
（g）Glu-Leu-Val-X4-Arg（配列番号４０）
（h）Ser-Leu-Val-X4-Arg（配列番号４１）。
（上記配列中、X4は、Lys以外の19種のタンパク質構成アミノ酸のうちから任意に選択されるいずれかのアミノ酸残基を意味する）。
　これらのなかでも好ましいアミノ酸配列（最小認識配列）としては、Asp-Leu-Val-Pro-Arg（配列番号６）を挙げることができる
　これらのアミノ酸配列を有するペプチドは、「Asp-Leu-Xa-Xb-Arg」（配列番号１）または「X１-X２-X３-X４-X５」（配列番号３１）で示される５つのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、少なくとも当該アミノ酸配列を最小認識配列として有するものであれば、その限りにおいて、また上記アミノ酸配列のＮ末端側及び／またはＣ末端側に任意に１乃至複数の任意のアミノ酸残基を有するものであってもよい。エピトープタグを構成するペプチドのアミノ酸残基数としては、上記５アミノ酸残基からなる配列を含むものである限り、特に制限はされず、５０より多いアミノ酸残基からなるポリペプチド（タンパク質）の形態にしてもよいし、また５～５０のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドの形態にしてもよい。
　オリゴペプチドの形態に設計する場合、そのアミノ酸残基数としては、好ましくは５～４０程度、より好ましくは７～３０程度、さらに好ましくは７～２０程度、特に好ましくは７～１０程度を挙げることができる。かかるエピトープタグとしては、制限されないが、上記最小認識配列の前後（Ｎ及びＣ末端側）に１または複数のGlyあるいはSerなどのリンカー配列（例えば、GSリンカー配列）を有するオリゴペプチドを例示することができる。かかるエピトープタグとして、「Ser-Asp-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser」（配列番号２９）で示すアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、及び当該アミノ酸配列においてプロリン（Pro）をアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを一例として例示することができる。また上記リンカー配列としては、（GGGGS）n（配列番号１０）または（GGGS）n（配列番号３３）等で示されるＧＳリンカー配列（いずれも、ｎは１～３の整数を意味する）を用いることもできる。
　本発明のエピトープタグには、上記のようなリンカー配列を間に挟んで、配列番号１または配列番号３１で示されるアミノ酸配列を２～１２個程度繰り返して含むオリゴまたはポリペプチドが含まれる。
　当該エピトープタグは、被験物質、好ましくはペプチド（ポリペプチドを含む）（以下、これを「被験ペプチド」と総称する）を修飾する「タグ」として用いられる。そして、当該タグで修飾された被験ペプチドは、当該タグを特異的に認識する本発明のモノクローナル抗体との結合を指標として、検出することができる。つまり、本発明のエピトープタグは、前述する本発明のモノクローナル抗体と組み合わせて、被験ペプチドの相互作用解析、スクリーニング、定量、発現プロファイリングなどに用いることができる。また、目的とする被験ペプチドを、遺伝子工学を用いて上記タグとの融合ペプチドとして製造した場合、当該タグに特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体とのアフィニティーを利用して、タグ融合ペプチドを単離回収することができる。つまり、本発明のエピトープタグは、前述する本発明のモノクローナル抗体と組み合わせて、抗原抗体反応を利用して、当該被験ペプチドの単離回収、精製などに用いることができる。
　本発明のエピトープタグと融合した被験ペプチド（タグ融合ペプチド）の調製は、遺伝子工学的に行うことができる。具体的には、例えば、本発明のエピトープタグをコードする塩基配列を有し、当該エピトープタグを被験ペプチドの末端等に融合した状態で発現することが可能な「融合ペプチド発現用ベクター」を用いることによって実施することができる。この場合、まず被験ペプチドをコードする塩基配列を有するヌクレオチドを当該融合ペプチド発現用ベクターに組み込み、当該ベクターをそれに適した発現系に供してタグ融合ペプチドを発現させる。斯くして発現産生されたタグ融合ペプチドは、前述するように、本発明のモノクローナル抗体との親和性を利用したアフィニティー精製法により単離回収することができる。なお、ここでタグ融合ペプチドとして、タグと被験ペプチドとの間に任意のプロテアーゼが認識する配列（プロテアーゼ認識配列）を含むペプチドを用いることもでき、斯くして調製したタグ融合ペプチドは、必要に応じて、精製した後に、当該タンパク質分解酵素を用いてタグと被験ペプチドとを切断し、再度、本発明のモノクローナル抗体との親和性を利用したアフィニティー精製法を利用して、タグ及び消化されなかったタグ融合ペプチドを除去して、被験ペプチドを単離回収することもできる。例えばプロテアーゼとしては、トロンビンやTEVプロテアーゼ等を制限なく例示することができるが、特異性の高い点からTEVプロテアーゼを好適に用いることができる。
　なお、このような精製において、本発明のモノクローナル抗体は任意の支持体に固定化した状態で用いることができ、かかる固相化抗体として、抗体固定化カラム、抗体固定化ビーズ及び抗体固定化チップ等を例示することができる（例えば、特開2005-326165号公報）。
　IV. 被験物質の検出方法
　前述するように、本発明のエピトープタグ及びモノクローナル抗体は、被験物質の検出に有効に用いることができる。ここで被験物質は、本発明のエピトープタグを結合させるか、若しくはエピトープタグと融合させることができるものであればよく、好適にはペプチド（ポリペプチドを含む）を挙げることができる。
　本発明の検出方法は、本発明のモノクローナル抗体を本発明のエピトープタグのタグ抗体として用いることを特徴とする。具体的には、本発明の検出方法は、本発明エピトープタグを結合若しくは融合させた被験物質と、当該エピトープタグを特異的に認識してそれと結合する本発明のモノクローナル抗体（タグ抗体）との抗原抗体反応を利用して、被験物質を検出するというものであり、下記の工程を有することができる。
（1）本発明のモノクローナル抗体をタグ抗体として用いて、本発明のエピトープタグで標識してなる被験物質と抗原抗体反応を行う工程、
（2）タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を指標として、被験物質を検出する工程。
　ここで「エピトープタグで標識してなる被験物質」としては、好適にはエピトープタグを融合してなる被験ペプチド（以下、これを「タグ融合ペプチド」という）を挙げることができ、当該タグ融合ペプチドの調製方法は前述の通りである。
　また抗原抗体反応に採用される条件は、本発明のモノクローナル抗体がタグ融合タンパク質のタグ領域を認識し結合する条件であればよく、特に制限されない。例えば、実験例３（３）に示すように、本発明のモノクローナル抗体とそのエピトープタグを含むペプチドは、3.7％ホルマリンで固定化した細胞においても抗原抗体反応することが確認されている。なお、当該抗原抗体反応は、タグ融合タンパク質を発現させた細胞内の生体環境条件下で実施することもでき、斯くして、所望タンパク質の発現プロファイリング等に応用することができる。
　被験物質（タグ融合タンパク質）の検出は、抗原抗体反応により、タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を指標として行うことができる（免疫染色）。この場合、タグ抗体として、放射性若しくは非放射性同位体、蛍光色素、または酵素等で標識された本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、当該標識物また標識物による反応（酵素と基質との反応）を指標にして抗原抗体反応物を検出することができる。また、本発明のモノクローナル抗体としてFc領域を有する免疫グロブリンを用いる場合は、当該Fc領域を認識する第２抗体を用い、当該第２抗体と上記抗原抗体反応によって生じた抗原抗体反応物との複合体を検出することができる。この場合、第２抗体として、放射性若しくは非放射性同位体、蛍光色素、または酵素等で標識された抗体を用いることにより、当該標識物また標識物による反応（酵素と基質との反応）を指標にして抗原抗体反応物を検出することができる。
　斯くして本発明の検出方法（免疫検出方法）によれば、被験タンパク質の相互作用解析、スクリーニング、定量、発現プロファイリングなどを行うことができる。
　Ｖ．被験物質の単離回収方法（精製方法）
　また前述するように、本発明のエピトープタグ及びモノクローナル抗体は、被験物質の単離回収(以下、単に「精製」という)に有効に用いることができる。ここで被験物質は、本発明のエピトープタグを結合させるか、若しくはエピトープタグと融合させることができるものであればよく、好適にはペプチド（ポリペプチドを含む）及びタンパク質を挙げることができる。
　本発明の精製方法は、本発明のモノクローナル抗体を本発明のエピトープタグのタグ抗体として用いることを特徴とする。具体的には、本発明の精製方法は、本発明のエピトープタグを結合若しくは融合させた被験物質（タグ標識被験物質）と、当該エピトープタグを特異的に認識してそれと結合する本発明のモノクローナル抗体（タグ抗体）との抗原抗体反応を利用して、タグ標識被験物質または被験物質を単離し回収するというものであり、下記の工程を有することができる。
　（1）本発明のエピトープタグで標識してなる被験物質を含有する被験試料と、本発明のモノクローナル抗体をタグ抗体として反応させる工程、
（2）上記タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を被験試料から単離または回収する工程、
（3）必要に応じて、タグ抗体が結合した抗原抗体反応物からタグ抗体を除去し、被験物質を回収する工程。
　ここで「エピトープタグで標識してなる被験物質」としては、好適にはエピトープタグを融合してなる被験ペプチド（ポリペプチドを含む）（タグ融合ペプチド）を挙げることができ、当該タグ融合ペプチドの調製方法は前述の通りである。また当該被験物質を含有する被験試料としては、タグ融合ペプチドを発現産生する細胞、組織、及びそれらの破砕物、並びにタグ融合ペプチドを含有する生体試料を例示することができる。
　また抗原抗体反応に採用される条件は、前述するように、本発明のモノクローナル抗体がタグ融合ペプチドのタグ領域を認識し結合する条件であればよく、特に制限されない。なお、当該抗原抗体反応は、タグ融合ペプチドを発現させた細胞内の生体環境条件下で実施することもでき、斯くして、遺伝子工学的手法により、タグ融合ペプチドを発現産生させた細胞から、所望のペプチドを単離回収することができる。
　被験物質（タグ融合ペプチド）の回収は、まず、抗原抗体反応により、タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を被験試料から単離回収することによって行なわれる。この場合、可溶性のタグ融合ペプチド（抗原）が本発明のモノクローナル抗体との抗原抗体反応により不溶化するようであれば、これを沈殿させることでタグ融合ペプチドを抗体抗原反応物として被験試料から分離及び精製することができる（免疫沈降法）。またこの場合、予め被験試料を特異性のない抗体と処理して、非特異的に吸着する成分を取り除いておいてもよい。また当該方法は、本発明のモノクローナル抗体を任意の支持体に固定化した状態で用いることができ、かかる固相化抗体として、前述するように、抗体固定化カラム、抗体固定化ビーズ及び抗体固定化チップ等を例示することができる（例えば、特開2005-326165号公報）。また、本発明のモノクローナル抗体としてFc領域を有する免疫グロブリンを用いる場合は、当該Fc領域を認識する第２抗体を用い、当該第２抗体と上記抗原抗体反応によって生じた抗原抗体反応物との結合を利用して抗原抗体反応物を回収することもできる（プルダウン法（Pull-down assay）。
　タグ抗体が結合した抗原抗体反応物からタグ抗体を除去する方法としては、制限はされないが、例えば、タグ融合ペプチドとして、タグと被験ペプチドとの間にトロンビンやTEVプロテアーゼ等のプロテアーゼを認識する配列を入れたペプチドを用い、抗原抗体反応後に、当該プロテアーゼで切り出すという方法を例示することができる。
　またタグ融合ペプチドからタグを除去する方法として、例えばトロンビンやTEVプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いてタグとペプチドとを切断し、再度、本発明のモノクローナル抗体との親和性を利用したアフィニティー精製法を利用して、タグ及び消化されなかったタグ融合ペプチドを除去して、目的のペプチドを単離回収することもできる。
　斯くして本発明の精製方法によれば、種々のペプチドが共存する、例えば生体試料の中から、所望のペプチドを選択的に単離し回収することができる。
　以下、本発明の構成及び効果を、下記の実施例及び実験例を例として説明する。但し、本発明はかかる実験例等によって何ら制限されるものではない。
　実施例１　ハイブリドーマG196及びモノクローナル抗体（G196抗体）の調製
（1）ハイブリドーマG196の調製
　GST（glutathione S-transferase）融合タンパク質発現用ベクターであるpGEX-2Tベクター（GEヘルスケア・ジャパン社）を用いて、大腸菌の形質転換を行った。イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）誘導されたGSTタンパク質を含む大腸菌溶解液からグルタチオンアガロースビーズ（Sigma社）を用いてGSTタンパク質を精製した。精製したGSTタンパク質をフロイント完全アジュバント(DIFCO社)でエマルジョン化し、BALB/c マウス（８週齢、メス）に皮下注射し、免疫を開始した。２回目以降はフロイント不完全アジュバント(DIFCO社)を用いて、精製したGSTタンパク質をエマルジョン化して免疫に使用した。２週間間隔で合計３回の免疫をした後、採血し、取得した血清を用いてイムノブロット（SDS-PAGEでGSTタンパク質を泳動、コントロールとしてウシ血清アルブミン）により抗体価を確認した。
　抗体価の上昇を確認した免疫済みのマウスから脾臓細胞を調整後、Galfreらによる方法（非特許文献１：Galfre, G. and Milstein, C.: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol., 73: 3-46, 1981）に準じて、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞P3/NSI/1-Arg-1（ATCC TIB-18）と融合を行った。混合させる脾臓細胞／ミエローマ細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ=10:1でおこなった。これを、前々日に96ウェル培養プレートに蒔き込んだフィーダー細胞（腹腔浸出細胞）に重層して、炭酸ガス培養器で培養（37℃、5%CO2）した。培養の翌日、20% FCS（fetal calf serum）およびHAT（ヒポキサンチン，アミノプテリン、チミジン）（ICN社）RPMI1640培地（ニッスイ社）を用いて細胞を培養し、選択を開始した。２週間後、HAT選択培地において増殖した細胞を含むウェルの培養上清を回収した後、pGEX-2Tベクター由来の精製GSTタンパク質を用いたELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法により、抗体生成を確認するとともに、抗体価を評価した。ELISA陽性の抗体を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）をさらに限界希釈法により３回のクローニングをおこない、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。以下、このハイブリドーマを「ハイブリドーマG196」といい、当該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を「G196抗体」と称する。
　（2）モノクローナル抗体の精製
　上記で調製したハイブリドーマG196が産生するモノクローナル抗体（G196抗体）を、プロテインＡカラム（GEヘルスケア・ジャパン社）を用いて精製した。具体的には、まずハイブリドーマG196の培養上清を0.45μmのメンブランを通じて濾過することによって浄化し、ｐＨを１N　NaOHで8.0に調整した。次いで、これをプロテインＡカラムに通液し、PBS（pH8）で洗浄した後、抗体を0.1M　クエン酸溶液を用いてカラムから溶出させた。G196抗体を含む溶出液を、PBSで透析することにより、精製G196抗体を調製取得した。
　（3）モノクローナル抗体のサブタイプの決定
　上記で取得したモノクローナル抗体（G196抗体）の抗体クラスを、サブクラスタイピングキット（HyCult Biotech社）を用いた酵素免疫測定法で評価したところ、IgG1κであることが確認された。
　実験例１　モノクローナル抗体（G196抗体）の遺伝子解析
　上記実施例１で取得したハイブリドーマG196からRNAを抽出した後、oligo-dTプライマーを用いて、逆転写し、cDNAを作製した。かかるcDNAを鋳型として、下記に示す重鎖プライマーセット及び軽鎖プライマーセットを用いてPCRを行い、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列、並びに軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド及びそのアミノ酸配列を解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　その結果、判明したハイブリドーマG196が産生するモノクローナル抗体（G196抗体）の重鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号２及び４に示す。これらのアミノ酸配列及び塩基配列のうち、アミノ酸番号１８～２５及び塩基番号５２～７５の領域が重鎖可変領域のＣＤＲ１に相当し、アミノ酸番号４３～５０及び塩基番号１２７～１５０の領域が重鎖可変領域のＣＤＲ２に相当し、またアミノ酸番号８９～９７及び塩基番号２６５～２９１の領域が重鎖可変領域のＣＤＲ３に相当する。
　またG196抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ配列番号３及び５に示す。これらのアミノ酸配列及び塩基配列のうち、アミノ酸番号１８～２３及び塩基番号５２～６９の領域が軽鎖可変領域のＣＤＲ１に相当し、アミノ酸番号４１～４３及び塩基番号１２１～１２９の領域が軽鎖可変領域のＣＤＲ２に相当し、またアミノ酸番号８０～８８及び塩基番号２３８～２６４の領域が軽鎖可変領域のＣＤＲ３に相当する。
　実験例２　G196抗体の認識部位の同定
（１）G196抗体とGST融合タンパク質発現用ベクターの遺伝子産物との結合性
　GST融合タンパク質発現用ベクターとして、pGEX-4T-2ベクターとpGEX-6P-1ベクター（いずれもGEヘルスケア・ジャパン社）を用いて、実施例１で調製したハイブリドーマG196から産生されるモノクローナル抗体（G196抗体）と当該GST融合タンパク質発現用ベクターの遺伝子産物との結合性を評価した。
　具体的には、上記各GST融合タンパク質発現用ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換した大腸菌の溶解液から、各GST融合タンパク質を精製した。pGEX-4T-2ベクターの遺伝子産物（以下、「遺伝子産物4T-2」または単に「4T-2」という）は、GSTのC末端側に、図２Ａの最下段（表示「4T-2」）に示すアミノ酸配列（配列番号１５）を有しており、pGEX-6P-1ベクターの遺伝子産物（以下、「遺伝子産物6P-1」または単に「6P-1」という）は、GSTのC末端側に、図２Ａの下から２段目（表示「6P-1」）に示すアミノ酸配列（配列番号１６）を有している。ウエスタンブロット法を用いて、精製した各GST融合タンパク質に対するG196抗体の認識結合の有無を評価した。なお、各タンパク質の量はクマシー染色により確認した。
　結果を図２Ｂに示す。「遺伝子産物4T-2」の結果を図２Ｂの最左列に、「遺伝子産物6P-1」の結果を図２Ｂの左から２番目の列に、それぞれ示す。これから分かるように、G196抗体は、pGEX-4T-2ベクターの遺伝子産物4T-2は認識するものの、pGEX-6P-1ベクターの遺伝子産物6P-1は認識しなかった。
　「遺伝子産物4T-2」と「遺伝子産物6P-1」のアミノ酸配列（図２Ａ：4T-2と6P-1）を比較し、G196抗体はGSTそのもののアミノ酸配列ではなく、GSTのC末端側のプロテアーゼ認識部位を含むリンカー配列を認識する可能性が示唆された。
　（２）G196抗体の認識部位の検討と同定
（2-1）最小認識アミノ酸配列の決定
　上記（１）の結果から、G196抗体が認識するエピトープの候補配列として、「遺伝子産物4T-2」が特有に有するアミノ酸配列「SDLVPRGSP」（配列番号１５のアミノ酸番号６～１４の領域）から３～９アミノ酸残基からなる複数のオリゴペプチドを作製し（図２Ａ参照）、それをコードするヌクレオチドをpGEX-6P-1ベクター（GEヘルスケア・ジャパン社）に導入して、大腸菌を形質転換した。なお、前述するように、pGEX-6P-1ベクターそのものの遺伝子産物は、G196抗体によって認識されない。形質転換した大腸菌の溶解液から、各候補アミノ酸配列を融合させたGST融合タンパク質を精製した。各候補アミノ酸配列を融合させたGST融合タンパク質（以下、単に「6P-12」、「6P-14」、「6P-16」、「6P-15」、「6P-17」、または「6P-19」ともいう。）のGSTからC端側までのアミノ酸配列（配列番号１７～２２）を、候補アミノ酸配列を含めて図２Ａに示す。
　次いで、ウエスタンブロット法を用いて、（１）と同様に、精製した各GST融合タンパク質に対するG196抗体の認識結合の有無を評価した。結果を図２Ｂに示す。右側から「6P-19」、「6P-17」、「6P-15」、「6P-16」、「6P-14」、及び「6P-12」の結果を示す。
　これからわかるように、G196抗体は「6P-15」、「6P-14」、及び「6P-12」を認識するものの、「6P-19」、「6P-17」、及び「6P-16」は認識しなかった。このことから、G196抗体の最小認識配列は、「DLVPR」（配列番号６）であることが判明した。
　（2-2）アラニンスキャン
　次いで、最小認識配列「DLVPR」（配列番号６）のうち、どのアミノ酸残基がG196抗体の認識に重要であるかを確認するために、アラニンスキャンを実施した。具体的には、最小認識配列「DLVPR」中のアミノ酸残基を一つずつアラニンに置換した５アミノ酸残基からなる複数のオリゴペプチドを作製し（図３Ａ中の候補配列参照）、それをコードするヌクレオチドをpGEX-6P-1ベクターに導入して、大腸菌を形質転換し、当該大腸菌が産生する候補配列を融合させたGST融合タンパク質を用いて、（2-1）と同様にウエスタンブロット法を行った。各候補配列を融合させたGST融合タンパク質（以下、単に「6P-15」、「6P-24」、「6P-25」、「6P-26」、「6P-27」、「6P-28」または「6P-29」ともいう。）のGSTからC端側までのアミノ酸配列（配列番号２０，２３～２８）を、候補配列を含めて図３Ａに示す。また、ウエスタンブロット及びクマシー染色の結果を図３Ｂに示す。右側から「6P-29」、「6P-28」、「6P-27」、「6P-26」、「6P-25」、「6P-24」、「6P-15」、「6P-1」及び「4T-2」の結果を示す。
　これからわかるように、G196抗体は「6P-15」、「6P-26」、及び「6P-27」を認識するものの、「6P-24」、「6P-25」、「6P-28」及び「6P-29」は認識しなかった。このことから、G196抗体の最小認識配列「DLVPR」（配列番号６）のうち、「DL_ _R」のアミノ酸残基が重要であることが判明した。
　実験例３　G196抗体の評価（その１）
　実施例１で作製したG196抗体について、「DLVPR」（配列番号６）を有するペプチド（GSDLVPRGSC：配列番号３０）との親和性を、等温滴定カロリーメータを用いて測定した。
　結果を図４に示す。この結果から、Kd値は、約0.4～2ｎＭ、具体的には1.25±0.77×10－９Ｍ（1.25±0.77ｎＭ）であり、本発明のG196抗体は「DLVPR」のアミノ酸配列を有するペプチドに対して高い親和性を有することが確認された。
　実験例４　G196抗体の評価（その２）
　Ｎ末端にビオチンを付加した合成ペプチド（GSGSDLVPRG）（配列番号４２）、およびその変異体（エピトープ部位であるDLVPR領域のアミノ酸残基を各々他の１９種類のタンパク質構成アミノ酸残基で置換した合成ペプチド）をストレプトアビジンでコートしたプレート上に結合させた。その後、実施例１で作製したG196抗体との結合を、常法に従い酵素結合免疫吸着法（ELISA）により確認し、G196抗体と結合するペプチドのアミノ酸配列を調べた。
　結果を、使用したペプチドのアミノ酸配列とともに、図５に示す。この結果から、G196抗体は、「DLVPR」（配列番号６）のアミノ酸配列に特異的に結合するのみならず、当該アミノ酸配列（DLVPR）のうち、Asp（D）をGlu（E）またはSer（S）に置換したアミノ酸配列；Leu（L）をIle（I）に置換したアミノ酸配列；Val（V）をIle（I）またはThr（T）に置換したアミノ酸配列；Pro（P）を１９種の全てのタンパク質構成アミノ酸のいずれかに置換したアミノ酸配列をいずれも認識し、選択的に結合することが確認された。
　実験例５　G196抗体の評価（その３）
　G196抗体の認識部位「DLVPR」（配列番号６）を含むアミノ酸配列「SDLVPRGS」（「6P12」という）（配列番号２９）を、FLAG-HA-EGFP（FHG）に融合させて（FHG-6P12）、HeLa細胞に発現させた（HeLa細胞（FHG-6P12））。また、比較対照のため、6P12を融合させないFLAG-HA-EGFP（FHG）そのものをHeLa細胞に発現させた（HeLa細胞（FHG））。
　以下、タグ抗体として、FHGのうちFLAG部位を認識するFLAG（M2）抗体（Sigma社）及び本発明のG196抗体を用いて、定法に従って、ウエスタンブロット法、免疫沈降法および細胞免疫染色法を実施した。
　（１）ウエスタンブロット法
（1-1）方法
　HeLa細胞（FHG）及びHeLa細胞（FHG-6P12）の各細胞溶解液を、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
　（1-2）結果
　結果を図６に示す。図６中、Ａは、FLAG（M2）抗体（Sigma社）によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果を、Ｂは、G196抗体によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果をそれぞれ示す。図からわかるように、ウエスタンブロット法において、G196抗体はバックグラウンドもなく、また既存のFLAG(M2)抗体（Sigma社）と遜色なく、HeLa細胞内で発現したFHG-6P12を認識することが可能であった。またG196抗体は、FHG部位を認識せず、FHG-6P12のうち6P12部位を選択的に認識することが確認された。
　（２）免疫沈降法
（2-1）方法
　それぞれの特異的抗体（FLAG（M2）抗体、G196抗体）をプロテインＡセファロースビーズ（GEヘルスケア・ジャパン社）に結合させ、余分な抗体をよく洗い落とした。特異的抗体を結合させたビーズをHeLa細胞（FHG）及びHeLa細胞（FHG-6P12）それぞれの細胞溶解液に加え結合させ、ビーズに特異的に結合するタンパク質以外をよく洗い落とした。ビーズを2×SDS サンプル緩衝液に懸濁後、100℃, 5分間処理してサンプルとした。そのサンプルを、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF（フッ化ポリビニリデン）膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP（horseradish peroxidase）標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
　（2-2）結果
　結果を図７に示す。FLAG(M2)抗体（Sigma社）によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果、及びG196抗体によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果をそれぞれ示す。図からわかるように、免疫沈降法において、G196抗体は既存のFLAG(M2)抗体（Sigma社）と遜色なく、細胞内で発現したFHG-6P12タンパク質を認識し、免疫沈降することが可能であった。またウエスタンブロット法と同様に、G196抗体は、FHG部位を認識せず、FHG-6P12のうち6P12部位を選択的に認識することが確認された。
　（３）細胞染色法
（3-1）方法
　3.7% ホルマリンと0.2% Triton X-100を含む緩衝液でそれぞれのHeLa細胞（HeLa細胞（FHG）及びHeLa細胞（FHG-6P12）を固定と透過処理をおこなった。5% 脱脂粉乳を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として細胞と反応させ、PBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにAlexa Fluor色素標識二次抗体（Molecular Probes社）を細胞に反応させ、PBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。包埋緩衝液（Vector Laboratories社）を用いて細胞をスライドガラス上に固定後コンフォーカルレーザ顕微鏡（オリンパス社）で観察した。
　（3-2）結果
　結果を図８に示す。αGFP抗体（ウサギ）（バイオアカデミア社）によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果（図８Ａ及びＢ共に右上欄に示す）、G196抗体によるエピトープタグ（FHG及びFHG-6P12）の検出結果（図８Ａ及びＢ共に左上欄に示す）をそれぞれ示す。図からわかるように、免疫染色法において、G196抗体は、既存のαGFP抗体（バイオアカデミア社）と遜色なく、またバックグラウンドも低く、細胞内で発現したFHG-6P12を認識し、免疫染色することが可能であった（図８Ｂ参照）。また、6P12をエピトープタグとして付加しても、FHGの細胞内局在は変わらなかった。また、図８Ａからわかるように、G196抗体は、FHG部位を認識せず、FHG-6P12のうち6P12部位を選択的に認識することが確認された。
　実験例６　G196（scFv）抗体の作製とその評価
（１）G196（scFv）抗体の作製
　pET28-His-TEVベクター（Novagen社のpET28を改変。6X Hisタグ配列の下流にTEVプロテアーゼ認識配列を有する。）を用いて、6X Hisタグ融合タンパク質としてG196のscFvを大腸菌で発現させた。この際、大腸菌中で発現産生した6X Hisタグ融合タンパク質は不溶分画に局在する。そこで８Ｍの尿素を含むＰＢＳ（denature条件）を用いて大腸菌を溶解し、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーに供した。具体的には、大腸菌の溶解物を、denature条件下でもHisタグと特異的に結合する金属キレート樹脂（Ni-NTA agarose, Qiagen社）に供して結合させた後、徐々に尿素を除去することで6X Hisタグ融合タンパク質をrenatureさせて精製した。
　得られた6X Hisタグ融合タンパク質（G196（scFv）抗体）のアミノ酸配列を、配列番号３２に示す。当該アミノ酸配列（配列番号３２）のアミノ酸番号２２～１２３領域は、本発明モノクローナル抗体（IgG）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号７～１０８の領域に相当し、当該アミノ酸配列（配列番号３２）のアミノ酸番号１４８～２４５の領域が、本発明モノクローナル抗体（IgG）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号１～９８の領域に相当する。これらの領域が、ＧＳリンカー配列を有するペプチドを介して結合している。
　（２）評価（免疫沈降法）
　実施例１で調製したG196抗体と、上記で調製したG196（scFv）抗体を用いて、実験例５（２）の方法と同様の方法で、免疫沈降法により、FLAG-HA-EGFP（FHG）及びFHG-6P12に対する結合性を評価した。
　結果を図９に示す。図からわかるように、G196（scFv）抗体は、実施例１で調製したG196抗体と遜色なく、細胞内で発現したFHG-6P12を認識し、免疫沈降することが確認された。また、G196（scFv）抗体は、G196抗体と同様には、FHG部位を認識せず、6P12部位を選択的に認識することが確認された。
　実験例７　G196抗体の評価（その４）
　転写因子であるATF/CREB タンパク質ファミリーであるAtf1のＣ末端に、G196抗体の認識部位「DLVPR」（配列番号６）を３個含むアミノ酸配列「GSDLVPRGSDLVPRGSDLVPRGS」（配列番号４３）（以下、これを「G196」という）と GFP を融合させて（Atf1-G196-GFP）、これを分裂酵母に発現させた（分裂酵母（Atf1-G196-GFP））。また、比較対照のため、GFPのＣ末端にIws1を融合させて（GFP-Iws1）、これを分裂酵母に発現させた（分裂酵母（GFP-Iws1））。
　以下、エピトープタグとして、分裂酵母に発現させた「Atf1-G196-GFP」及び「GFP-Iws1」、並びにタグ抗体として、抗GFP抗体（ウサギ）（バイオアカデミア社）及び実施例１で作製した本発明のG196抗体を用いて、定法に従って、ウエスタンブロット法、クロマチン免疫沈降法および細胞免疫染色法を実施した。
　（１）ウエスタンブロット法
（1-1）分裂酵母のlysateの調製法
　225 mg/L のadenine, leucine, uracil を添加したYE 培地 (0.5% yeast extract, 3% glucose) で培養した分裂酵母（野生型酵母、分裂酵母（Atf1-G196-GFP）、分裂酵母（GFP-lws1））を、protease inhibitor cocktail (SIGMA, P8215) を含むBuffer 1 (50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, and 0.1% Na-deoxycholate) に懸濁し、ガラスビーズ (BioSpec, 11079-105) とMulti-Beads Shocker (Yasui Kikai, MB400U)により破砕した。
　（1-2）方法
　上記で調製した各酵母の細胞溶解液（Lysate）を、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後（図１０中、左側カラムから順に、野生型酵母、分裂酵母（Atf1-G196-GFP）、分裂酵母（GFP-lws1））、PVDF膜（Millipore社）にセミドライ法により転写した。タンパク質が転写された膜を5% 脱脂粉乳および0.1% Tween-20を含むPBSによるブロッキング後、それぞれの特異抗体液を一次抗体として転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な一次抗体をよく洗い落とした。さらにHRP標識二次抗体を転写膜に結合させ、0.1% Tween-20を含むPBSにより余分な二次抗体をよく洗い落とした。HRPの基質として、分解されると発光する蛍光試薬（Western lightning Chemiluminescence試薬、パーキンエルマー社）を用いて、転写膜上の目的のタンパク質のバンドからの蛍光によりX線フィルム（富士フィルム社）に感光し、検出した。
　（1-3）結果
　結果を図１０に示す。図中、上段の電気泳動像は、本発明のG196抗体によるウエスタンブロット検出結果を、下段の電気泳動像は、抗GFP抗体によるウエスタンブロット検出結果をそれぞれ示す。この結果からわかるように、本発明のG196抗体は、G196を融合したAtf1-G196-GFPを発現させた酵母［分裂酵母（Atf1-G196-GFP）］の細胞溶解液に選択的に結合し、野生型酵母やGFPのみを融合させたGFP-Iws1を発現させた酵母［分裂酵母（GFP-Iws1）］の細胞溶解液には結合しないことが確認された。
　（２）免疫沈降法
（2-1）クロマチン免疫沈降法（図１１）
　YES培地で培養した分裂酵母［野生型、及び分裂酵母（Atf1-G196-GFP）］を、1% formaldehyde/PBSで固定後、125 mM glycineで反応を停止させた。ガラスビーズ (BioSpec, 11079-105) とMulti-Beads Shocker (Yasui Kikai, MB400U)により破砕後、Bioruptor (Cosmo-bio, UCD-250) によりDNA を断片化した。
　G196抗体により免疫沈降した後、proteinase K 処理し、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, 28106) を用いてDNAを精製した。標的配列は、SYBR Premix ExTaq (TaKaRa, PR041)を用いて, Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa, TP800)により解析した。定量的PCRに用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Atf1は、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseをコードするtdh1 遺伝子(SPBC32F12.11) の300bp上流に存在するCRE (TGACGT) （配列番号４８）を認識して結合することが知られている。その配列よりさらに 1 kbp 上流をネガティブコントロールとしてG196抗体によるクロマチン免疫沈降の検出結果をそれぞれ示す。
　結果を図１１に示す。この結果から、G196抗体は、分裂酵母（Atf1-G196-GFP）の細胞内で発現したG196（GSDLVPRGSDLVPRGSDLVPRGS：（配列番号４３）を認識して、クロマチン免疫沈降できることがわかった。
　（３）細胞染色法
　下記の操作により、分裂酵母（Atf1-G196-GFP）及び野生型酵母の細胞をそれぞれ固定化し透過処理を行った。
1．YES培養液（0.5% yeast extract, 3% glucose）で対数増殖中の分裂酵母（Atf1-G196-GFP）及び野生型酵母に、それぞれホルムアルデヒドを最終濃度3%になるよう加える。
2．固定処理の後、グリシンを最終濃度250 mMになるように加えてクエンチングする。
3．得られた細胞をPEMS'（PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1.2 M sorbitol）で洗い、PEMS'（PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1.2 M sorbitol,5 mg/ml Zymolyase 20T, 0.1% 2-ME）に再懸濁して室温で60分放置する。
4．これをPEM'（PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4、1% Triton X-100）に再懸濁して室温で30分放置する。
5．得られた細胞をPEM'（PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4）で３回洗う。
6．洗浄した細胞を、PEMAL'（PBS pH 7.5, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0.1% Na azide, 0.1 M L-lysine HCl,5% Milk）に懸濁して室温で30分放置する。
　斯くして調製した分裂酵母（Atf1-G196-GFP）及び野生型酵母の細胞を、5% 脱脂粉乳を含むPBSによるブロッキング後、透過光観察、DAPI染色（核染色）、及び抗GFP抗体（ウサギ）（バイオアカデミア社）またはG196抗体を一次抗体とした免疫染色を行った。免疫染色は、抗体液を細胞と反応させた後に、Alexa Fluor色素標識二次抗体（Molecular Probes社）を反応させて行った。DAPI染色（核染色）、または免疫染色後、包埋緩衝液（Vector Laboratories社）を用いて細胞をスライドガラス上に固定後コンフォーカルレーザ顕微鏡（オリンパス社）で観察した。
　結果を図１２に示す。図からわかるように、免疫染色法において、G196抗体は、既存の抗GFP抗体と遜色なく、またバックグラウンドも低く、分酵酵母（Atf1-G196-GFP）で発現したAtf1-G196-GFPタンパク質を認識し、免疫染色することが可能であった。
配列表のフリーテキスト
配列番号１、６～９、３１、３４～４１は、本発明のモノクローナル抗体G196が認識するエピトープ領域（最小認識配列）のアミノ酸配列；配列番号１０及び３３は、ＧＳリンカー配列の構成単位領域のアミノ酸配列；配列番号１１～１４はプライマーの塩基配列；配列番号１５はpGEX-4T-2ベクターの遺伝子産物のアミノ酸配列；配列番号１６はpGEX-6P-1ベクターの遺伝子産物のアミノ酸配列；配列番号１７～２８はGST融合タンパク質のGSTに融合したC末領域のペプチドのアミノ酸配列：配列番号２９～３０、４２及び４３は本発明のモノクローナル抗体G196が認識するエピトープ領域（最小認識配列）を含むペプチドのアミノ酸配列；配列番号４４～４７は実験例７のクロマチン免疫沈降法において定量的PCRに用いたプライマーの塩基配列をそれぞれ示す。配列番号４８はＣＲＥのアミノ酸配列を示す。配列番号３２は、6X Hisタグ融合タンパク質（G196（scFv）抗体）のアミノ酸配列を示す。

Claims (15)

  1. 　下記に示すアミノ酸配列：
    Asp-Leu-Xa-Xb-Arg（配列番号１）
    （配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）
    をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
    配列番号２に示す１８～２５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４３～５０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８９～９７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
    配列番号３に示す１８～２３番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、４１～４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び８０～８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
  2. 　上記モノクローナル抗体が、配列番号１中、Xaで示されるアミノ酸残基がバリン残基（Val）であるアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
  3. 　配列番号６に示すアミノ酸配列をエピトープ領域として含むペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
  4. 　上記モノクローナル抗体が、配列番号２に示すアミノ酸配列またはそれと８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３に示すアミノ酸配列またはそれと８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むものである、請求項１乃至３のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
  5. 　配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応速度定数（Kd値）が０．１～１０ｎＭである、請求項１乃至４に記載するモノクローナル抗体。
  6. 　マウスに由来する免疫グロブリンＧ（IgG）またはその抗原結合断片である、請求項１乃至５のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかに記載するモノクローナル抗体をコードする遺伝子であって、
    配列番号４に示す塩基配列または当該塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列として、また
    配列番号５に示す塩基配列または当該塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列として
    含むことを特徴とする、上記遺伝子。
  8. 　請求項１乃至６のいずれかに記載するモノクローナル抗体との抗原抗体反応に使用されるエピトープタグであって、
    Asp-Leu-Xa-Xb-Arg（配列番号１）
    （配列中、XaはVal、Ala、IleまたはThrのいずれか一つのアミノ酸残基、XbはLys以外の19種類のタンパク質構成アミノ酸残基から選択されるいずれか一つのアミノ酸残基を意味する。）
    で示されるアミノ酸配列をエピトープ領域（最小認識配列）として含むか、または
    X１- X２- X３- X４- X５（配列番号３１）
    （式中、Ｘ１はAsp、GluまたはSer；Ｘ２はLeu、IleまたはMet；Ｘ３はVal、Ala、IleまたはThr；Ｘ４はLys以外の19種のタンパク質構成アミノ酸から選択されるいずれかのアミノ酸残基；Ｘ５はArgを、それぞれ示す。）
    で示されるアミノ酸配列をエピトープ領域（最小認識配列）として含む
    ペプチドからなるエピトープタグ。
  9. 　エピトープタグが、配列番号１中、Xaで示されるアミノ酸残基がバリン残基（Val）であるアミノ酸配列を含むペプチドからなるものである、請求項８記載のエピトープタグ。
  10. 　上記ペプチドが、配列番号１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列のＮ及び／またはＣ末端側に、Gly、Serまたはこれらから選択されるいずれか少なくとも１種のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を結合してなるオリゴまたはポリペプチドである、請求項８または９に記載するエピトープタグ。
  11. 　上記Gly及びSerから選択されるいずれか少なくとも１種のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列がＧＳリンカー配列である、請求項１０に記載するエピトープタグ。
  12. 　請求項８乃至１１のいずれかに記載するエピトープタグを認識するタグ抗体として用いられる、請求項１乃至６のいずれかに記載するモノクローナル抗体。
  13. 　下記の工程を有する被験物質の検出方法：
    （1）請求項１乃至６のいずれかに記載するモノクローナル抗体をタグ抗体として用いて、請求項８乃至１１のいずれかに記載するエピトープタグで標識してなる被験物質と抗原抗体反応を行う工程、
    （2）タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を指標として、被験物質を検出する工程。
  14. 　下記の工程を有する、被験試料の中から被験物質を単離または回収する法：
    （1）請求項８乃至１１のいずれかに記載するエピトープタグで標識してなる被験物質を含有する被験試料と、請求項１乃至６のいずれかに記載するモノクローナル抗体をタグ抗体として反応させる工程、
    （2）上記タグ抗体が結合した抗原抗体反応物を被験試料から単離または回収する工程、及び
    （3）タグ抗体が結合した抗原抗体反応物からタグ抗体を除去し、被験物質を回収する工程。
  15. 　さらに下記の工程を有する請求項１４記載の方法：
    （4）(3)の工程で回収した被験物質からエピトープタグを除去する工程。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020116423A1 (ja) 2018-12-03 2020-06-11 株式会社ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ 活性型インターロイキン－１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用
WO2023014778A3 (en) * 2021-08-05 2023-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Photoreactive antibody binding domains with epitope tags for multiplexed antibody labeling, detection, and purification

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005326165A (ja) * 2004-05-12 2005-11-24 Hitachi High-Technologies Corp タンパク質相互作用解析のための抗タグ抗体チップ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005326165A (ja) * 2004-05-12 2005-11-24 Hitachi High-Technologies Corp タンパク質相互作用解析のための抗タグ抗体チップ

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JURONEN E. ET AL.: "Production and Characterization of Monoclonal Antibodies against Class Theta Glutathione S-Transferase T1-1", HYBRIDOMA, vol. 15, no. 1, 1996, pages 77 - 82 *
LIU J. ET AL.: "pPIC9-Fc: A Vector System for the Production of Single-Chain Fv-Fc Fusions in Pichia pastoris as Detection Reagents In Vitro", J. BIOCHEM., vol. 134, 2003, pages 911 - 917 *
VINOKUROV L. M. ET AL.: "Stability of functionally active fusion proteins during their biosynthesis and isolation from expressing bacterial cells", PROGRESS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 15, 1998, pages 645 - 650 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020116423A1 (ja) 2018-12-03 2020-06-11 株式会社ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ 活性型インターロイキン－１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用
WO2023014778A3 (en) * 2021-08-05 2023-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Photoreactive antibody binding domains with epitope tags for multiplexed antibody labeling, detection, and purification

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